CN115594310A - 一种畜禽粪污沼液生产饲用单细胞蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种畜禽粪污沼液生产饲用单细胞蛋白的方法，包括以下步骤：(1)粪污沼液的制备：将养殖粪污经CSTR厌氧发酵，在固液分离后的液体中调节pH为5‑7，制备粪污沼液；(2)接种真菌：将混合真菌孢子接种到沼液中进行培养；(3)菌体回收及单细胞蛋白的生产：培养结束后，分离菌丝体在50‑60℃下烘干得到单细胞蛋白。本发明以畜禽养殖粪污沼液为底物发酵食用真菌，利用沼液中的有机物生成真菌菌丝体，并回收菌丝体生产单细胞蛋白用于饲料蛋白补充剂，同时降低沼液中的氨氮等污染物的含量，仅通过一级混合发酵反应，不仅获得高经济附加值的单细胞蛋白，还达到净化粪污沼液的目的，总体运行成本低，低碳环保，在养殖粪污沼液资源化利用领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵及污水处理技术领域，更具体地，涉及一种畜禽粪污沼液生产饲用单细胞蛋白的方法
背景技术
畜禽养殖是动物性食品原料的主要来源，贡献了全球卡路里摄入量的18％和蛋白质摄入量的25％，对世界粮食安全具有至关重要的作用。随着全球人口的持续增长以及发展中国家人们收入的提高，预计2020年至2050年期间全球肉类和牛奶需求将分别增长57％和48％，2025年全球畜牧业生产预计比2010年增长21％。按照目前畜禽饲料利用率计算，上述预期的扩张将导致全球饲料干物质的需求量从60增至73亿吨。然而，蛋白质补充剂一直都是动物饲料干物质中成本占比最高和最短缺的成分之一。目前，优质植物性蛋白(如豆粕)是全球(特别是中国)畜禽日粮中蛋白质的主要来源。每年约有85％的大豆被加工成豆油或其他食品，而产生的豆粕几乎全部(约97％)用于动物饲料。然而，利用这些人类可食用的植物性原料(如大豆、油籽和谷物)中的蛋白质饲喂动物，已经造成畜禽与人类的食物竞争，并势必进一步威胁人类的粮食安全。此外，全球有25亿公顷的农地用于生产畜禽饲料，其中约7亿公顷(相当于全球农业用地的14％和耕地的50％)正面临着土地用途转化的压力，单纯利用植物性蛋白作为动物饲料已经呈现不可持续的特征。因此，寻求替代饲料和新型饲用蛋白来取代或补充目前的植物性蛋白质供应，满足不断增长的需求，成为全球畜牧业亟待解决的问题。
畜牧业的发展不仅关系到粮食安全，也对环境产生巨大的影响，环境保护的压力已经与饲料成本一同成为制约全球特别是中国畜牧业发展的瓶颈问题，特别是养殖粪污废水的无害化处理与资源化利用成为亟待解决的重点。目前，利用生物处理法，通过厌氧消化只能达到对养殖粪污废水的初级利用，之后产生的沼液由于高氨氮、高CODcr，直接还田不仅利用率低，还对自然水体产生污染。而采用传统物化法或生物硝化-反硝化过程虽然可以对沼液进行排放达标处理，但这些方法的最大缺陷是将沼液中的高氨氮转化为氮气直接排放，不仅处理成本高，还对氮源造成极大的浪费，不符合资源化利用的目标。因此，如何实现畜禽粪污沼液的高效处理和资源化利用仍是值得关注的问题。
单细胞蛋白(SCP)是指具有高蛋白含量以及脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质的微生物干物质的总称。与植物源蛋白相比，单细胞蛋白最重要的优势是可以在不支持农业耕作的地理区域生产。据预测，到2050年，全球的单细胞蛋白产品将替代10-19％的传统植物或/和动物蛋白。
一般来说，蛋白质是由16％的氮(质量-N/质量-蛋白质)组成，理论上包括畜禽粪污沼液在内的各种有机废水均具有生产SCP的潜力。目前，已有成果表明细菌、真菌及藻类能够利用畜禽养殖粪污、餐厨垃圾或工业有机废水废渣生产SCP，但其中大多都是采用单一菌种发酵，不仅需要对废水底物进行灭菌，还要额外添加多种营养底物；且发酵时间长，产生的菌体干物质量及蛋白质含量不高；另外，菌种同化沼液氨氮的效率低，处理后氨氮量仍高于排放或再利用标准；特别是所用菌种多为新分离筛选的菌株，其未知代谢产物的安全性存在较大缺陷，需要对SCP进行无害化处理后才能使用，进一步提高了使用成本。因此，具有实际应用价值的成果鲜有报道。
利用有机废水生产单细胞蛋白可以通过单一微生物发酵产生，也可以基于混合微生物群落的发酵产生。相比于单一发酵，基于微生物混合发酵的SCP具有更多优势：首先，混合发酵的SCP是由不同类群微生物的生物质组成，虽然这些微生物的生长都是以废水作为主要营养源，但其蛋白种类不同，生产的SCP氨基酸类型更加丰富多样；其次，与单菌不同，基于混合培养的工艺不需要对废水进行预灭菌，当出现干扰时，混合菌群可以表现出较强的抗性和复原力，从而以较低的运营成本确保过程的稳定性；最后，混合菌群具有协同代谢作用，能够充分同化底物中存在的各类碳源和氮源，特别是多样化的细胞增殖和抑制物质的互补去除都对提高单细胞蛋白的产量和品质具有积极的作用。
真菌、细菌、微藻等微生物的生长速度快、生物效能高，在利用畜禽粪污沼液生产SCP方面均有较高的应用价值。然而从营养物分析可知，微藻与细菌SCP的粗蛋白含量最高，但微藻本身灰分含量高，消化性差，细菌的耐受性不足且SCP中核酸含量高，必须增加脱核酸的步骤，提高了使用成本。真菌中酵母的SCP含量高，但其个体太小不易分离，特别是在废水处理中采用酵母，将极大提高回收的成本。丝状真菌具有耐酸、耐糖、耐高盐的特性能够较好适应环境，特别是数百年来丝状真菌与食物发酵关系密切，代谢机理的研究已经非常清晰，在工业化应用方面具有较大的优势。另外，大部分丝状真菌蛋白都带有独特的香味物质，产生的菌丝体具有良好的肉质感，特别是在液体发酵中，菌丝在剪切力的作用下能够形成球状絮团结构，不仅无需离心分离，且对水体悬浮物具有生物絮凝作用。
一直以来，畜禽养殖行业最大的成本来自于饲料及粪污的处理，特别是当今粮食危机的压力和环境保护的需求越来越大，如何加强养殖业污染防治，推进畜禽粪污资源化利用及养殖尾水节水减排，发展生态循环养殖仍是亟待解决的问题。因此，本发明提供了一种运行成本低、操作简单、低碳环保的饲用单细胞蛋白生产方法，不仅有效提高畜禽粪污沼液的资源化利用，产生的单细胞蛋白和净化后的沼液还可以直接用于畜禽的蛋白质补充剂和养殖场的生产用水，实现循环养殖的目的。
发明内容
本发明提出一种畜禽粪污沼液生产饲用单细胞蛋白的方法，采用混合真菌利用沼液中的有机成分发酵制备单细胞蛋白，并直接作为饲料蛋白补充剂用于养殖场。另外，通过同化作用及生物絮凝有效去除沼液中的氨氮、磷等污染物，降低COD及悬浮物水平，使净化后的沼液可以直接补充养殖场的生产用水。本发明对沼液的处理方法低碳环保、工艺简单，成本低，可以有效提高畜禽粪污沼液的资源化利用效率，实现循环养殖。
本发明具体是通过以下技术方案来实现的：
(1)粪污沼液的制备：将养殖粪污导入厌氧发酵罐进行CSTR厌氧发酵，再经固液分离后的液体为粪污沼液，将沼液导入一级发酵池，调节pH为5-7，作为发酵底物；
(2)接种真菌：在粪污沼液中匀投入混合真菌孢子，25～30℃下培养2-3天；
(3)菌丝的回收和沼液排放：将步骤(2)中发酵完毕的沼液导入絮凝沉淀池，2-6小时后进行菌丝絮团的回收，净化后的上清沼液作为养殖场的生产用水；
(4)饲用单细胞蛋白的制备：将菌丝絮团在50-60℃条件下烘干即得到单细胞蛋白，作为饲料的蛋白补充剂供给回养殖场。
进一步地，步骤(1)所述的酸度调节剂可以包括富马酸、偏酒石酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、乙酸、磷酸、盐酸、柠檬酸钠、柠檬酸钾、乳酸钙、乙酸钠的一种或几种混合，优选的调节剂为乙酸钠。
进一步地，步骤(1)步骤中所述的沼液pH可以为4-7，优选的是5-6。
进一步地，步骤(2)所述的混合真菌选自腐生真菌而不是寄生真菌，优选腐生真菌是因为它们更适合菌丝生长，液体发酵更易产生菌丝絮团。
进一步地，步骤(2)所述的真菌选自发酵食品和/或用于食品加工的可食用真菌，是非病原性的丝状真菌，且不会产生色素和/或对动物健康不利的代谢产物。此外，几个世纪以来，其中几种真菌物种已被用于全球特别是亚洲发酵豆制品的生产，因此它们的食用安全性是肯定的，这也意味着本发明生产的单细胞蛋白可以直接作为蛋白补充剂完整地添加到饲料中。
进一步地，步骤(2)所述的真菌选自根霉属、根毛霉属、毛霉属、被孢霉属、镰刀菌属和青霉属，包括黑面包霉(Rhizopus stolonifer)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、少孢根霉(Rhizopus oligosporus)、戴尔根霉(Rhizopus delemar)、米曲霉(Aspergillusoryzae)等，优选的真菌是米根霉(Rhizopus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、总状毛霉(Mucor racemosus)和丝状镰刀菌(Fusariumvenenatum)。
进一步地，步骤(2)所述的优选真菌都是已发现的在液态培养中具有高生长速率，可以在许多不同的碳源和氮源上生长，具有广泛的底物灵活性。
进一步地，步骤(2)中所述的优选真菌自身碳氮比低，细胞中蛋白质的干物质占比至少为60％，甚至更多，因而发酵过程中沼液的碳氮比不是特别关键。特别是一般情况下鸡粪碳氮比为10:1，猪粪为13:1，黄牛粪为22:1，奶牛粪为20:1，而畜禽粪污沼液中还有冲洗场地残留的饲料、植物秸秆、麦麸等有机碳成分。因此，可以外加碳源调节碳氮比，优选为不加。
进一步地，步骤(2)中所述的发酵过程中沼液的温度不是特别关键，可以是10-40℃，优选为25至30℃。
进一步地，步骤(2)中所述的发酵时间可以是2-7天，优选为2-3天。
进一步地，步骤(2)中所述的发酵过程优选是有氧发酵，因此沼液的溶氧量和孢子的分散程度可能很重要，可以通过搅拌或/和鼓风曝气来为发酵提供氧气，同时该过程还能实现沼液和真菌孢子的充分混合。
进一步地，步骤(2)中所述的混合方式可以选择搅拌，如使用叶轮(包括轴向流搅拌器或径向流搅拌器)。虽然搅拌可以提高液体传质、传热效率，如：较快的搅拌可以促进氧气和营养素的传质，并使得发酵体系中物质和热量的分布更均匀。然而，较高的搅拌也产生较高的剪切力，会切掉球状菌丝絮团的外部区域或破坏整个球体。不仅影响真菌的生长速度还会大大增加后续回收的难度。因此，优选采用鼓风曝气。
进一步地，步骤(2)中所述沼液发酵过程中的含氧量是真菌生长速度的限制因素之一，特别是孢子萌发阶段需要消耗大量的氧气。另外，氧气在沼液中溶解度低，特别是在球状真菌絮团中的扩散也低，这都要求发酵过程中氧含量要保持相对较高的水平，就空气饱和度而言至少是20％以上。因此，通气量可以是0.2-2.0vvm，优选为0.8-1.0vvm。
进一步地，步骤(3)中所述的发酵后沼液在絮凝沉淀池，驻留时间可以是2-6小时，综合絮凝和净化效果，优选是3-5小时。
进一步地，步骤(3)中所述菌丝絮团的回收可以采用过滤、离心、重力沉降、加热等固液分离方式，综合成本和回收效果，优选是重力沉降法。
进一步地，步骤(4)中所述单细胞蛋白的平均含水量可以是20-80％，综合烘干成本、使用要求、储存条件，优选是30-40％。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明提供了一组混合真菌，能在不外加碳源的畜禽粪污沼液中良好生长，并在短期内(2～3天)高效生产单细胞蛋白。DCW浓度最终高达18g/L以上远优于一般的水平(4-8g/L)。
(2)与其他真菌发酵生产单细胞蛋白的方法相比，本发明涉及的真菌均来源自食用真菌，且蛋白含量占菌丝体干重的34％～52％，并含有9种畜禽必须的氨基酸，因此可作为安全、优质的饲用蛋白补充剂。
(3)与其他单细胞蛋白生产方法相比，本发明所涉及的发酵营养源均来自沼液中的“废弃物”如有机碳、氨氮、磷及其它元素，这些营养物质通常在畜禽粪污沼液中作为有害物质被处理丢弃，这意味着用于培养真菌的营养源(即沼液)实际上是“免费的”。因此，本发明实质上的生产成本更低，且获得的单细胞蛋白直接饲喂回动物，不额外增加环境中净CO2的水平，属于“碳中和”的方法。
(4)本发明还提供了快速去除沼液高氨氮的方法，可有效去除沼液中的氨氮，去除率达到90％以上，与传统沼液处理采用的硝化-反硝化两段式生物法相比，本发明只需一级生物发酵反应，处理时间与传统方法相同，整体运行成本低，工艺简单，不仅对沼液的处理效果好，同时可生产高经济附加值的蛋白质产品。
(5)与其他利用微生物净化沼液的方法相比，本发明涉及的微生物均是丝状真菌，在沼液发酵中，菌丝能够形成球状絮团结构，不仅无需离心回收，且对水体悬浮物具有生物絮凝作用，能够在不额外添加絮凝剂的情况下，获得具有低悬浮物和COD水平的“净化”沼液，直接用于养殖场的生产用水。因此，本发明为沼液资源化循环利用提供了更加低碳、环保的解决方案。
本发明中所涉及的“发酵食品和/或用于食品加工的”是指如纳豆、酒糟、毛豆腐、食醋、酱油、豆瓣酱、面酱、腌制蔬菜、醪糟、天贝、素肉、植物肉等国内外利用真菌培养制备的食品。
本发明中所涉及的“动物健康不利的代谢产物”是指如黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素、T2毒素、赭曲霉毒素、烟曲霉毒素等主要的真菌毒素。
本发明中所涉及的“菌丝体”、“絮团”、“菌丝絮团”、“球状菌丝絮团”、“絮团颗粒”在本文中可互换使用来指代菌丝球团。
附图说明
图1为本发明提供的一种利用畜禽粪污沼液生产饲用单细胞蛋白的方法流程示意图。
图2为各菌株在粪污沼液中培养后菌体干物质量的对比示意图。
图3为各菌株在粪污沼液中培养后沼液氨氮含量的对比示意图。
具体实施方式
首先，将冷冻保存的真菌进行活化(活化方法为常规技术，不再赘述)，在长满成熟孢子的斜面培养基中加入无菌水，振荡冲洗，将洗液倒入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，充分震荡20min，制得孢子悬液或离心干燥制备孢子粉，然后进行后续操作。
具体实施方式如下：
(1)粪污沼液的制备：将养殖粪污导入厌氧发酵罐进行CSTR厌氧发酵，再经固液分离后的液体为粪污沼液，将沼液导入一级发酵池，调节pH为5-7，制备发酵底物；
(2)接种真菌：在粪污沼液中均匀投入混合真菌孢子，接种量为发酵底物体积的2％～10％，25～30℃下培养2-3天；
(3)菌丝的回收和沼液排放：将步骤(2)中发酵完毕的沼液导入絮凝沉淀池，2-6小时后进行菌丝絮团的回收，净化后的上清沼液输送回养殖场作为生产用水；
(4)饲用单细胞蛋白的制备：将菌丝絮团在50-60℃条件下烘干即得到单细胞蛋白，作为饲料的蛋白补充剂供给回养殖场。
为了更好地理解本发明的内容，下面将结合实施例和附图来进一步阐述本发明。本实施例以本发明的技术为基础实施，给出了详细的实施方式和操作步骤，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
实施例一：菌种的筛选
候选的真菌需要是可食用的真菌，具有较高的蛋白质含量，生产的SCP可以直接作为蛋白补充剂完整地添加到饲料中。
食用丝状真菌的优点包括：1.不产生或极少产生毒素等有害物质；2.可以在多种不同的碳源和氮源上生长，自身碳氮比低，能够利用简单而廉价的发酵底物；3.在液体培养中生长速度快，形态为球状菌丝絮团；4.菌丝具有絮凝作用，便于分离回收。
实施例证明利用食用丝状真菌发酵畜禽粪污沼液生产单细胞蛋白是可行的，并且在根霉属、根毛霉属、毛霉属、被孢霉属、镰刀菌属和青霉属的丝状真菌中，均已经报道了一些潜在的菌株资源。
利用摇瓶培养实验，对属于根霉属、根毛霉属、毛霉属、被孢霉属、镰刀菌属和青霉属的食用丝状真菌进行测试，分析其在畜禽粪污沼液中的生长性能。
每个候选菌株(部分见表1)均在以下培养基中测试3次，筛选生长性能好的作为阳性。
表1
沼液培养基：取经过厌氧发酵及固液分离后的粪污沼液，混合后测定初始氨氮含量为2500mg/L，COD为15000mg/L，pH为7-8。使用60％乙酸钠(食品级)调节pH，待用。
摇瓶发酵：取沼液培养基100mL于500mL三角瓶中，调节pH为6，接种新鲜制备的孢子悬液终浓度为1×106-7CFU/ml，于28℃、150r/min振荡培养72h，每组3个平行。
对于有些菌株，需要特定的培养条件来迫使它们在液体中的生长形式是球状絮团而不是游离菌丝或分散团状。在适当的时候采取措施(如调整三角瓶的规格和/或振荡速率)以增加絮团颗粒的数量以及避免出现菌丝的分散状态。
每24h取出培养瓶，目测真菌的生长形式，显微检查菌丝状态，结果如表2所示。随后，用预干燥并称重的滤纸进行过滤，将滤纸放入干燥箱，105℃干燥至恒重，计算细胞干物质量DCW。同时，将滤液按照水杨酸分光光度法测定氨氮含量。
表2
+：指能够观察到菌丝
-：指不能观察到菌丝
*：指球状菌丝絮团的紧实程度
由表2所示，除5号外，其余各菌株在24h均出现浑浊，且显微镜下可以明显看到菌丝生长，表明大部分候选菌株能够适应高氨氮的环境。48h的结果显示各组均出现球状或颗粒状絮团，其中2、4、6、7号的菌丝絮团较紧实，且培养基基本澄清。72h后，各组均无色素产生，但3号、9号出现絮团之间的结合，呈现松散的团状，并且培养基变浑浊。
根据图2所示，48h各组DCW显著高于24h，其中DCW在10g/L以上的有2、4、6、7号这也与它们的生长状况一致。而图3显示，所有菌株均可在一定程度上同化底物中的氨氮。其中，2、4、6、7号氨氮去除率最高，均为80％以上。
实施例二：放大培养
本实施例在工作体积为2m3的微型曝气池中进行，对所有候选菌株进行扩大培养实验，并检测菌丝生长形式、沼液的成分以及在进一步放大培养过程中真菌生物质的含量。
将与实施例1相同的沼液导入曝气池，乙酸钠调节pH为6，待用；
在粪污沼液中均匀投入真菌孢子粉，接种量为发酵底物体积的2％～5％，25～30℃下培养2-3天；
将发酵后沼液导入絮凝沉淀池，5小时后回收菌丝絮团；
将菌丝絮团在50-60℃条件下烘干即得到单细胞蛋白。
每24小时取样3次，用于目测和显微观察，以及分析沼液成分、细胞干物质量和蛋白质的含量。
在发酵池的样品中，培养24h的显微观察结果显示所有真菌均为菌丝生长，目测2、4、6、7号出现肉眼可见的球状絮团颗粒，但大小不一。在培养48h后，这四种菌株的菌丝絮团直径为3-8mm，细胞干物质量的累积浓度超过13g/L(表3)。发酵结束后，四种菌株的菌丝絮团自然沉降到底部，取上层的沼液均为澄清状，且氨氮的去除率均在82％以上。进一步检测菌丝絮团的蛋白质含量，结果如表3所示，8号蛋白质含量最高为52.3％，而2、4、6、7号次之，但也都在40％以上。
表3
*是指真菌细胞干物质中蛋白质的含量
因此，综合上述结果可知，大部分菌株都能够较好的适应进一步扩大的培养，具有生产单细胞蛋白的潜力，结合氨氮去除率、菌丝絮团状态、干物质量及蛋白含量，优选2、4、6、7、8号菌株进行混合发酵。
实施例三：混合发酵
本实施例在工作体积为2m3的微型曝气池中进行，采用2、4、6、7、8号菌株进行混合发酵，并检测菌丝生长形式、沼液的成分以及在进一步混合培养过程中真菌总体生物质的含量。
将与实施例2相同的沼液导入曝气池，乙酸钠调节pH为6，待用；
在粪污沼液中均匀投入混合真菌孢子粉，接种量为发酵底物体积的2％～5％，25～30℃下培养2-3天；
将发酵后沼液导入絮凝沉淀池，5小时后回收菌丝絮团；
将菌丝絮团在50-60℃条件下烘干即得到单细胞蛋白。
每24小时取样3次，用于目测和显微观察，以及分析沼液成分、细胞干物质量和蛋白质的含量。
在发酵池的样品中，培养24h的显微观察结果显示所有真菌均为菌丝生长，目测混合发酵样品中有肉眼可见的球状絮团颗粒，但大小不一。在培养48h后，这五种菌株的菌丝絮团直径为4-10mm，细胞干物质量的累积浓度超过18g/L。发酵结束后，混合菌丝絮团自然沉降到底部，取上层的沼液为澄清状，且氨氮的去除率为90％。进一步对菌丝絮团的蛋白质含量检测，结果显示混合发酵的菌丝絮团干物质中蛋白质的含量为53.8％。
因此，混合发酵对沼液氨氮去除率、菌丝絮团状态、干物质量及蛋白含量，均优于单细胞发酵，证明菌株能够适应进一步的混合培养，且达到净化沼液和生产单细胞蛋白的目的。
实施例四：奶牛场粪污沼液的处理效果
粪污沼液的制备：将养殖粪污导入厌氧发酵罐进行CSTR厌氧发酵，再经固液分离后的液体为粪污沼液，将沼液导入一级发酵池，加入乙酸钠调节pH为6，待用；
接种真菌：在粪污沼液中均匀投入混合真菌孢子，接种量为发酵底物体积的2％～5％，25～30℃下培养2-3天；
将发酵后沼液导入絮凝沉淀池，2-6小时后回收菌丝絮团；
将菌丝絮团在50-60℃条件下烘干即得到单细胞蛋白，作为饲料的蛋白补充剂供给回养殖场。
需要说明的是奶牛场粪污沼液经过厌氧发酵、固液分离后，初始氨氮含量为1500mg/L，COD含量为13000mg/L，均低于实施例三。因此，将孢子接种量调整为3％，pH为6.5。
发酵2天后，测定絮凝池上清液的氨氮含量、COD，以及菌丝絮团的DCW、SCP含量。结果如表4所示，处理后的沼液中氨氮含量降至136mg/L，CODcr降至920mg/L。
表4
*是指真菌细胞干物质中蛋白质的含量
实施例五：猪场粪污沼液的处理效果
粪污沼液的制备：将养殖粪污导入厌氧发酵罐进行CSTR厌氧发酵，再经固液分离后的液体为粪污沼液，将沼液导入一级发酵池，加入乙酸钠调节pH为6，待用；
接种真菌：在粪污沼液中均匀投入混合真菌孢子，接种量为发酵底物体积的2％～5％，25～30℃下培养2-3天；
将发酵后沼液导入絮凝沉淀池，2-6小时后回收菌丝絮团；
将菌丝絮团在50-60℃条件下烘干即得到单细胞蛋白，作为饲料的蛋白补充剂供给回养殖场。
需要说明的是猪场粪污沼液经过厌氧发酵、固液分离后，初始氨氮含量为950mg/L，CODcr含量为10000mg/L，均低于实施例三。因此，将孢子接种量调整为2％，pH为6.5。
发酵2天后，测定絮凝池上清液的氨氮含量、COD，以及菌丝絮团的DCW、SCP含量。结果如表5所示，处理后的沼液中氨氮含量降至95mg/L，CODcr降至385mg/L。
表5
*是指真菌细胞干物质中蛋白质的含量
实施例六：鸡场粪污沼液的处理效果
粪污沼液的制备：将养殖粪污导入厌氧发酵罐进行CSTR厌氧发酵，再经固液分离后的液体为粪污沼液，将沼液导入一级发酵池，加入乙酸钠调节pH为6，待用；
接种真菌：在粪污沼液中均匀投入混合真菌孢子，接种量为发酵底物体积的2％～5％，25～30℃下培养2-3天；
将发酵后沼液导入絮凝沉淀池，2-6小时后回收菌丝絮团；
将菌丝絮团在50-60℃条件下烘干即得到单细胞蛋白，作为饲料的蛋白补充剂供给回养殖场。
需要说明的鸡场粪污沼液经过厌氧发酵、固液分离后，初始氨氮含量为2200mg/L，CODcr含量为14000mg/L。因此，将孢子接种量调整为4％，pH为6。
发酵2天后，测定絮凝池上清液的氨氮含量、COD，以及菌丝絮团的DCW、SCP含量。结果如表7所示，处理后的沼液中氨氮含量降至210mg/L，CODcr降至980mg/L。
表7
*是指真菌细胞干物质中蛋白质的含量
发酵3天后，处理后的沼液中氨氮含量降至110mg/L，CODcr降至390mg/L。
实施例七：饲用单细胞蛋白的制备及沼液净化
发酵结束后，真菌生长为直径3-10mm的球状菌丝絮团，在絮凝池中经过重力沉降，通常使用简单的筛子或适当开口的筛子就可以捕获球团，随后于50-60℃下烘干，即得到SCP。通过混合真菌发酵生产的SCP，不仅具有发酵食品特有的香味，还具有更丰富的氨基酸种类，本发明制备的单细胞蛋白具有9种畜禽必需的氨基酸(表9)，特别适合作为饲料的蛋白补充剂。絮凝池的上清为净化后的沼液，通过混合真菌的同化作用，去除了沼液中的氨氮、磷、有机碳等污染物，通过菌丝的生物絮凝作用降低了沼液中悬浮物、部分COD水平，获得符合生产用水标准的净化沼液。
实施例八：千头奶牛场粪污沼液的资源化利用
某地千头奶牛场，每日产生粪污废水约100吨。
将养殖粪污导入厌氧发酵罐进行CSTR厌氧发酵，再经固液分离后的液体为粪污沼液，将沼液导入一级发酵池，加入乙酸钠调节pH为6，待用；
在粪污沼液中均匀投入混合真菌孢子，接种量为发酵底物体积的2％～5％，25～30℃下培养2-3天；
将发酵后沼液导入絮凝沉淀池，2-6小时后回收菌丝絮团；
将菌丝絮团在50-60℃条件下烘干即得到单细胞蛋白，作为饲料的蛋白补充剂供给回养殖场。
需要说明的是如果冬季温度较低，可以按照图1-K路线，利用厌氧发酵的沼气进行加热，保持发酵池的温度。
需要说明的是一次发酵结束后，测定絮凝池上清沼液中氨氮含量、CODcr等指标，如果仍高于养殖场生产用水的标准，可按照图1-H将絮凝池中沼液回流至发酵池再次处理，直到絮凝池中上清沼液达到使用标准，输送回养殖场补充生产用水。
需要说明的是该奶牛场粪污沼液经过厌氧发酵、固液分离后，初始氨氮含量为1300mg/L，总氮为1500mg/L、总磷为300mg/L、CODcr为12000mg/L、悬浮物为18000mg/L。因此，将孢子接种量调整为4-5％，其他条件不变。发酵2天后，将发酵池中沼液全部引入絮凝池，4h后测定上清沼液结果如表8所示。
表8
100吨粪污废水净化后大约剩余86吨可以补充生产用水。
球状菌丝絮团在60℃条件下烘干约4-6小时后(冬季可适当延长时间)，装袋防止回潮。上述工艺制备的单细胞蛋白的分析结果如表9所示，SCP在菌丝体干物质的占比为52.63％，其中必需氨基酸的占比为51％。
将100吨沼液发酵制备的单细胞蛋白按照45％的添加量作为蛋白补充剂全部加入到磨碎的饲料配方中，然后饲喂奶牛，相当于真菌蛋白在饲料中最终贡献了约22％的总蛋白质。
因此，利用真菌发酵畜禽粪污沼液制备单细胞蛋白，可以有效的降低生产用水、环保、污染物处理、蛋白饲料等成本，为养殖业带来显着效益。
以上所述仅是本发明的实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，本发明还可以根据以上结构和功能具有其它形式的实施例。因此，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种饲用单细胞蛋白的制备方法，其特征在于：利用畜禽粪污沼液中的有机成分，采用混合真菌，发酵制备单细胞蛋白，制备方法包括以下步骤：
(1)粪污沼液的制备：将养殖粪污导入厌氧发酵罐进行CSTR厌氧发酵，再经固液分离后的液体为粪污沼液，将沼液导入一级发酵池；
(2)接种：在步骤(1)制备的发酵底物中均匀投入混合真菌孢子，进行发酵；
(3)回收和排放：将步骤(2)中发酵完毕的沼液导入絮凝沉淀池，回收菌丝絮团，净化后的上清沼液输送回养殖场作为生产用水；
(4)干燥：将步骤(3)所得菌丝絮团烘干既得饲用单细胞蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种饲用单细胞蛋白的制备方法，步骤(1)粪污沼液的制备，其特征在于制备的粪污沼液PH值使用酸度调节剂调整为4-7。
3.根据权利要求2所述的粪污沼液PH值，其特征在于：优选的PH值为5-7，所述的酸度调节剂可以包括富马酸、偏酒石酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、乙酸、磷酸、盐酸、柠檬酸钠、柠檬酸钾、乳酸钙、乙酸钠的一种或几种混合，优选的调节剂为乙酸钠。
4.根据权利要求1所述的一种饲用单细胞蛋白的制备方法，步骤(2)接种，其特征在于：接种的混合真菌选自腐生真菌而不是寄生真菌，接种量为发酵底物体积的2％～10％，10～40℃下培养2-7天，培养优选的是有氧发酵，在发酵过程通过搅拌或/和鼓风曝气来为发酵提供氧气，通气量是0.2-2.0vvm。
5.根据权利要求4所述的接种与培养，其特征在于：所述的真菌选自发酵食品和/或用于食品加工的可食用真菌，选自根霉属、根毛霉属、毛霉属、被孢霉属、镰刀菌属和青霉属，包括黑面包霉(Rhizopus stolonifer)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、少孢根霉(Rhizopus oligosporus)、戴尔根霉(Rhizopus delemar)、米曲霉(Aspergillus oryzae)等，优选的培养条件为25～30℃下培养2-3天。
6.根据权利要求5所述的混合真菌，其特征在于：进一步优选的真菌是米根霉(Rhizopus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、总状毛霉(Mucor racemosus)和丝状镰刀菌(Fusarium venenatum)。
7.根据权利要求4所述的有氧发酵，其特征在于：优选的采用鼓风曝气，优选的通气量0.8-1.0vvm。
8.根据权利要求1所述的一种饲用单细胞蛋白的制备方法，步骤(3)回收和排放，其特征在于：发酵后沼液在絮凝沉淀池，驻留时间是2-6小时；菌丝絮团的回收可以采用过滤、离心、重力沉降、加热等固液分离方式。
9.根据权利要求8所述的絮凝沉淀，其特征在于：综合絮凝和净化效果，优选的驻留时间是3-5小时；综合成本和回收效果，优选是重力沉降法。
10.根据权利要求1所述的一种饲用单细胞蛋白的制备方法，步骤(4)干燥，其特征在于：回收的菌丝絮团在50-60℃条件下烘干，得到饲用单细胞蛋白平均含水量是20-80％，优选的含水量是30-40％。
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