JP4469401B2 - 化学的に明確な培地を用いた工業的規模での有用化合物の発酵生産 - Google Patents

Description

本発明は、発酵の分野、即ち、一次または二次代謝生成物、製薬用タンパク質またはペプチド、または工業用酵素等の有用化合物の発酵生産に関する。

多くの有用化合物が大規模な工業用ファーメンター内での発酵（培養）生産によって製造されている、即ち、興味ある有用化合物を産生する微生物を、１０〜３００ｍ^３のファーメンター内でコントロールされた条件下で増殖させている。現在の工業的規模の発酵方法においては、生産用微生物は、典型的に複合発酵培地内で培養している。複合培地（ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉｕｍ）は、大豆ミール、綿実ミール、とうもろこし浸漬液、酵母抽出物、カゼイン加水分解物、糖蜜等等の複合窒素および／または炭素源を含む培地として理解されている。

複合培地の利点は、構成複合原材料が高価でなく、容易に入手でき、且つ炭素および窒素源さらにビタミン類およびミネラル類を含有する微生物用の完全なあるいはほぼ完全な栄養源を構成することである。さらにまた、タンパク質、炭水化物、脂質等の複合原材料中に存在する生物学的巨大分子混合物は、その消費前に、微生物が分泌する酵素によって分解されることを必要とする。結果として、消費可能な小分子がファーメンター全体に亘ってまた発酵過程中に均一に利用でき、その結果、濃度勾配と混合問題を回避し、且つこれらの消費可能小分子レベルを抑制濃度以下に保っている。さらにまた、上記の巨大分子並びに複合培地中にこれまた存在する有機酸が培地に緩衝能力を与え、この方法でｐＨコントロールを容易にしている。

上記の利点に加えて、複合発酵培地は、幾つかの重要な欠点も有する。最も重要なことは、複合原材料が、季節的変動および産出地の違い等によって、化学的に不明確な組成と品質変動性を有することである。発酵培地の組成は粘度、熱伝導および酸素移動等の発酵パラメーターに重要な影響を与えるので、複合原材料は、プロセス変動性の主要原因である。さらに、複合原材料は、下流の処理加工性を妨げ、最終生成物の品質に悪影響を及ぼし得る。例えば、発酵培養液、とりわけ繊維状微生物は、複合原材料を用いた場合、ろ過性の低下を示し得る。

複合原材料は、最終生成物中に望まずとも蓄積して来るかあるいは最終生成物と共分離して来る化合物も含有し得る。重金属、殺虫殺そ剤または除草剤が、複合原材料中に存在し得る望ましくない化合物の例である。しかも、複合原材料は、毒素を含有するか、毒素の産生をもたらし得る。

更なる欠点は、複合培地が滅菌中に好ましくない臭いを発生させ、望ましくない排出流を発生させることである。

複合培地は、その使用に伴う上記の欠点にもかかわらず、工業的大規模発酵方法において依然として優先して用いられている。複合原材料を含有しない培地、即ち、化学的に明確な培地を工業的規模の発酵方法において使用することが考えれていないのは、種々の理由が存在する。１つの明らかな理由は、複合培地の使用における利点において見出される。より重要なことは、化学的に明確な培地を工業的規模で用いて得られる生成物収率は、典型的に、複合原材料を含有する培地を用いて得られる生成物収率よりも実質的に低いとみなされていることである。さらに、複合培地での工業的方法用に開発された高産生性微生物株は、化学的に明確な培地中ではその良好な性能を保持し得ない。化学的に明確な培地において不満足な性能である１つの理由は、現在の工業用株が、化学的に明確な培地においてその性能が考慮されずに、種々の範囲の変異誘発と選択を受けていることにあり得る。

化学的に明確な培地は、これまでのところ、研究目的のみに、即ち、ペトリ皿および／または振盪フラスコでの実験室培養においてあるいは典型的に約２０〜４０Ｌの容量を超えない比較的小規模において用いられている。例えば、ペニシリン［Ｊａｒｖｉｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６９，３０１０−３０１７（１９４７）；Ｓｔｏｎｅ ａｎｄ Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １０４，４４５−４４６（１９４６）；Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８，３０３−３０９（１９４５）］、クラブラン酸（ｄａｖｕｌａｎｉｃ ａｃｉｄ）［Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｈｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２，８９２−８９７（１９８６）］、およびエリスロマイシン［Ｂｕｓｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３，４７５−４８０（１９９７）］等の二次代謝物の発酵生産を参照されたい。

しかし、そのように小さい研究規模での化学的に明確な培地の使用に関する研究は、典型的に約１０ｍ^３以上の容量規模を有する生産目的の大規模な工業的発酵方法におけるこれら化学的に明確な培地の応用について当業者に何ら教示を与えていない。

Ｊａｒｖｉｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６９，３０１０−３０１７（１９４７） Ｓｔｏｎｅ ａｎｄ Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １０４，４４５−４４６（１９４６） Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８，３０３−３０９（１９４５）］ Ｒｏｍｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｈｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２，８９２−８９７（１９８６） Ｂｕｓｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３，４７５−４８０（１９９７）

現在の工業現場における複合培地の通常の使用方法に伴う問題を回避するために、工業的規模の発酵において化学的に明確な処方を適用することが望まれている。

今回、本発明者等は、工業的規模の発酵方法において化学的に明確な培地を用いて、一次または二次代謝物、製薬用タンパク質またはペプチド、または工業用酵素等の有用な化合物の発酵生産を経済的に魅力のある収率で可能にした（適切な株と組合せて）ことを開示する。

本発明は、化学的に明確な構成成分から本質的になる化学的に明確な培地である発酵培地中で微生物株を発酵させ、発酵培養液から有用化合物を回収する各工程を含む有用化合物の工業的生産方法に関する。

さらに、本発明は、化学的に明確な培地中で工業的規模で発酵させ得る、興味ある有用化合物を産生する微生物株の製造および／または改良方法に関し、その方法は、次の各工程を含む：適切な親株を、物理的手段および化学的変異誘発物質から選ばれた変異誘発処理、および／またはＤＮＡ形質転換に供すること、得られた変異株および／または形質転換株を、その化学的に明確な培地における増殖性能および上記興味ある有用化合物の産生レベルについてスクリーニングすること、上記親株と比較して、同様なまたは改良された化学的に明確な培地での増殖性能および／または改良された上記興味ある有用化合物の産生レベルを有する変異株を選択すること。

本発明は、有用化合物を産生し得る適切な微生物株の工業的規模での発酵における化学的に明確な発酵培地の使用に関する。

本発明の説明全体に亘って、工業的規模の発酵方法または工業的方法とは、≧１０ｍ^３、好ましくは≧２５ｍ^３、より好ましくは≧５０ｍ^３、最も好ましくは≧１００ｍ^３の容量規模での発酵方法に及ぶものと理解されたい。

“化学的に明確”なる用語は、化学的に明確な構成成分から本質的になる発酵培地において使用するものであることを理解されたい。化学的に明確な構成成分から本質的になる発酵培地は、複合炭素および／または窒素源を含有しない、即ち、化学的に不明確な組成を有する複合原材料を含有しない培地を含む。化学的に明確な構成成分から本質的になる発酵培地は、さらに、本質的に少量の、即ち、微生物の増殖を維持しおよび／または十分量のバイオマスの生成を保証するには典型的十分でない後述するような量の複合窒素および／または炭素源を含む培地を含み得る。

その点、複合原材料は、例えば、これらの原材料が複合ヘテロ高分子化合物における多くの種々の化合物を含有するという事実に基づき、化学的に不明確な組成を有し、さらに、季節的変動および産出地の違いに基づく組成の変動を有する。発酵における複合炭素および／または窒素源として機能する複合原材料の典型的な例は、大豆ミール、綿実ミール、とうもろこし浸漬液、酵母抽出物、カゼイン加水分解物、糖蜜等である。

本質的に少量の複合炭素および／または窒素源は、本発明による化学的に明確な培地中に、例えば、主発酵用の植込みからの持ち越し（ｃａｒｒｙ−ｏｖｅｒ）として存在し得る。主発酵用の植込み（ｉｎｏｃｕｌｕｍ）は、化学的に明確な培地での発酵によっては必ずしも得られない。殆どの場合、植込みからの持ち越しは、主発酵用の化学的に明確な培地中の少量の複合窒素源の存在によって検出可能であろう。

主発酵用の植込みの発酵過程における複合炭素および／または窒素源の使用は、例えば、バイオマス生成を促進させるため、即ち、微生物の増殖速度を速め、および／または内部ｐＨコントロールを容易にするために、有益であり得る。同じ理由で、本質的に少量の複合炭素および／または窒素源、例えば、酵母抽出物を主発酵の初期段階で添加することは、とりわけ発酵過程の早期段階でのバイオマス生成を促進するために、有益であり得る。

本発明による化学的に明確な培地中に存在し得る本質的に少量の複合炭素および／または窒素源は、化学的に明確な培地中に存在する炭素および／または窒素（ケルダールＮ）総量の多くとも約１０％の量、好ましくは上記炭素および／または窒素総量の多くとも５％の量、より好ましくは上記炭素および／または窒素総量の多くとも１％の量であるように制限される。最も好ましいは、複合炭素および／または窒素源は、本発明による化学的に明確な培地中には存在しないことである。

本発明において用いるときの“化学的に明確な培地”なる用語は、すべての必要成分を発酵過程の開始前に加えた培地、さらには必要な成分の１部を開始前に加え、１部を発酵過程中に加える培地も含むものと理解すべきである。

本発明は、さらに、微生物株が、工業的規模で、化学的に明確な培地の単純原材料を経済的に魅力ある量の有用な生成物に転化させ得ることも開示する。驚くべきことに、化学的に明確な培地中の微生物株の生産性が、工業的規模において測定したとき、複合培地中での生産性に匹敵するか、ある場合にはそれより幾分高いことを見出した。

化学的に明確な培地の使用による更なる利点は、酸素の気相から液相への移動および二酸化炭素の液相から気相への移動が、複合培地の使用と比較したとき、実質的に改善されていることである。当業者において公知のとおり、溶解酸素濃度と溶解二酸化炭素濃度は、発酵過程のスケールアップにおいて重要なファクターであり、工業的方法の経済的成否を決定し得る。化学的に明確な培地を用いて得られたこの改良された物質（ｍａｓｓ）移動は、これらの培地中に、気泡の凝集を促進する実質量の化合物が存在していないことに基づき得る。凝集促進性化合物は、例えば、複合原材料中に存在するある種の疎水性および／または高分子化合物において見出し得る。気泡の凝集は、低い物質移動係数を典型的にもたらす［ｖａｎ’ｔ Ｒｉｅｔ ａｎｄ Ｔｒａｍｐｅｒ，ｉｎ：Ｂａｓｉｃ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｄｅｓｉｇｎ，ｐｐ．２３６−２７３，（１９９１）］。

酸素移動は、多くの場合、発酵過程において特に繊維状微生物の培養において制限性のファクターである。発酵を本発明による化学的に明確な培地を用いて実施したときに得られる改良された酸素移動能力は、動力投入、導入空気の酸素富化またはファーメンター加圧等のハードウェアにおける投資によるよりもはるかに安価な生産性の最適化方法を提供する。

工業的発酵方法においては、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）等の繊維状バクテリア、またはペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）もしくはアスペルギラス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）等の糸状菌等の繊維状微生物は、典型的に、ペレット形態を示して増殖する。その点、複合発酵培地中に存在するタンパク質とペプチド類は、ふわふわしたペレットを産生する傾向を有し、このペレットは、複合培地を用いて典型的に得られる高増殖速度の結果として、極めて長く枝分かれした菌糸を有する分散菌糸体に簡単に離れ落ちる。従って、ふわふわしたペレット形態は、望ましくない高培養液粘度を一般に生じ得る。化学的に明確な培地の使用は、例えば発酵中に容易に離れ落ちない硬めのペレットを産生することにより、形態に好ましい影響を与える。この方法において、繊維状発酵培養液の有意の粘度低下を、化学的に明確な培地を使用することによって得ることができる。発酵培養液の低粘度は生成物の産生において有益であるので、粘度コントロールは、工業的規模の発酵過程において極めて重要である。

化学的に明確な培地使用のもう１つの利点は、生成物の下流加工処理において見出される。ある種の株−生成物の組合せにおいて、とりわけ繊維状株を培養するときに、下流加工処理が化学的に明確な培地の使用により著しく改善される。

本発明方法において使用する化学的に明確な培地は、いわゆる構成元素といわゆる触媒元素を典型的に含有すべきである。

構成元素は、微生物マクロ分子の構成成分である元素、即ち、水素、酸素、炭素、窒素、リンおよびイオウである。構成元素の水素、酸素、炭素および窒素は、炭素および窒素源内に典型的に含有されている。リンとイオウは、リン酸塩、硫酸塩および／またはチオ硫酸塩イオンとして典型的に添加する。

化学的に明確な培地において使用する炭素および窒素源の種類は、その炭素および窒素源が本質的に化学的に明確な特性を有する限り、本発明にとって臨界的ではない。

好ましくは、炭素源は、グルコース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトデキストリン類、スターチおよびイヌリン等の炭水化物；グリセリン；植物油；炭化水素類；メタノールおよびエタノール等のアルコール類；酢酸塩およびより高級なアルカン酸等の有機酸からなる群から選ばれる。より好ましくは、炭素源は、グルコース、スクロースおよび大豆油からなる群から選ばれる。最も好ましくは、炭素源はグルコースである。“グルコース”なる用語は、グルコースシロップ、即ち、明確な量でグルコースオリゴマーを含有するグルコース組成物を含むものと理解すべきである。

窒素源は、好ましくは、尿素；アンモニア；硝酸塩；硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム等のアンモニウム塩；並びにグルタミン酸塩およびリシン等のアミノ酸類からなる群から選ばれる。より好ましくは、窒素源は、アンモニア、硫酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウムからなる群から選ばれる。最も好ましくは、窒素源はアンモニアである。窒素源としてのアンモニアの使用は、アンモニアがｐＨ調整剤として付加的に作用し得るという利点も有する。硫酸アンモニウムおよび／またはリン酸アンモニウムを窒素源として用いる場合には、微生物のイオウおよび／またはリン要求量の一部または全部を満たし得る。

触媒元素は、酵素類または酵素共因子の構成成分である元素である。これらの元素は、例えば、マグネシウム、鉄、銅、カルシウム、マンガン、亜鉛、コバルト、モリブデン、セレン、ホウ素である。

上記の構成元素および触媒元素の次に、カリウムおよびナトリウムイオン等のカチオン類が、カウンターイオンとして作用し且つ細胞内ｐＨおよび浸透性のコントロールのために存在しなければならない。

化学的に明確な培地に任意成分として含ませ得る化合物は、クエン酸等のキレート化剤、およびモノ−およびジ−リン酸カリウム、炭酸カルシウム等の緩衝剤等である。緩衝剤は、好ましくは、外部からのｐＨコントロールなしでプロセス処理する場合に添加する。さらに、発泡防止剤も、発酵処理前および／または処理中に添加し得る。

複合培地中に存在するマクロ分子と有機酸類は、これらの培地中で緩衝能力を与える。化学的に明確な培地中にはこれらの化合物が存在しないために、ｐＨコントロールは、複合培地におけるよりも化学的に明確な培地においての方が難しい。本発明は、培養液中の発生ｐＨにもよるが、酸または塩基のいずれかを添加できるというｐＨコントロールにより、化学的に明確な工業的規模のプロセスにおいて適切なｐＨプロフィルを与えていることを示している。

ビタミン類は、微生物の正常な代謝に必要な構成的には無関係の有機化合物の一群である。微生物類は、その必要とするビタミン類を合成する能力において広く変化することが知られている。ビタミンは、そのビタミンを合成することのできない微生物の発酵培地に添加すべきである。典型的には、酵母またはバクテリア用の或いはある種の低級真菌、例えば、ムコラレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）用の化学的に明確な発酵培地は、１種以上のビタミンを補給し得る。高級真菌類は、ビタミンを必要としない。

ビタミン類は、チアミン、リボフラビン、ピリドキサール、ニコチン酸またはニコチンアミド、パントテン酸、シアノコバラミン、葉酸、ビオチン、リポ酸、プリン類、ピリミジン類、イノシトール、コリンおよびヘミン類からなる群から選ばれる。

構成元素および触媒元素、並びに任意成分としてのビタミン類は、微生物の増殖、即ち、バイオマスの生成において必要である。

本発明の化学的に明確な培地に添加すべき必要な化合物類、即ち、構成元素および触媒元素、並びに任意成分としてのビタミン類を含む化合物類の量は、主として、発酵過程において生成されるべきバイオマスの量に依存する。生成されるバイオマスの量は、広範に、典型的には約１０〜約１５０ｇ／ｌ発酵培養液で変動し得る。一般に、約１０ｇ／ｌ未満のバイオマス量を生成する発酵は、工業的価値はない。

さらに、明確な培地の各構成成分の最適量、並びにどの化合物が不可欠か不可欠でないかは、明確な培地で発酵に供せられる微生物の種類、バイオマスの量、および産生すべき生成物に依存する。化学的に明確な培地の使用は、それによって各培地成分の濃度変動を他の成分とは独立して有利に行い得、この方法により培地組成の最適化を容易にする。

生成物の産生においては、追加の化合物を含む化学的に明確な培地を補充することおよび／または化学的に明確な培地にすでに存在するある種の化合物濃度を微生物の増殖に必要である量以上に増大させることが必要であり得る。上記各化合物の機能は、各化合物が所望化合物の微生物による産生を誘起および／または促進させること、または各化合物が所望化合物の先駆体として機能することであり得る。

化学的に明確な培地に増大量で補充および／または添加すべき化合物の例は、次のとおりである：β−ラクタム化合物生産用の増大量の硫酸塩、アミノ酸特に塩基性アミノ酸生産用の増大量の窒素含有化合物、ペニシリンＧ生産用のフェニル酢酸、ペニシリンＶ生産用のフェノキシ酢酸、アジビル−７−ＡＤＣＡおよびアジピル−７−ＡＣＡ生産用のアジピン酸、エリスロマイシン生産用のプロピオン酸。

本発明による工業的発酵方法においては、化学的に明確な培地に添加する炭素源の総量は、培地１リットル当りの炭素量で示して、１０〜２００ｇ／ｌ好ましくは２０〜２００ｇ／ｌで変化し得る。

化学的に明確な培地に添加する窒素源の総量は、０．５〜５０ｇＮ／ｌ好ましくは１〜２５ｇＮ／ｌで変化し得る（Ｎは、ケルダール窒素として示す）。

発酵における炭素源と窒素源の比は、著しく変化し得るが、炭素源と窒素源の最適比決定要素の１つは、産生すべき生成物の元素組成である。リン酸塩、硫酸塩または痕跡量の元素類等の微生物の増殖に必要な追加化合物は、ガイドラインとして表１に示すような濃度範囲を用いて添加する。これら追加成分の濃度範囲は、微生物の種類間で、即ち、真菌、酵母およびバクテリア間で変化し得る。

ビタミン濃度は、０．１（ビオチン）〜５００（ミオ−イノシトール）ｍｇ／ｌの範囲内に一般にある。

典型的には、微生物の増殖に必要な培地成分の量は、発酵に用いる炭素源の量に関連して決定し得る。何故ならば、産生するバイオマス量は、主として使用する炭素源量により決定されるからである。

化学的に明確な培地を用いる本発明による工業的発酵方法は、バッチ、繰り返しのバッチ、給送バッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）、繰り返しの給送バッチまたは連続発酵方法として実施できる。

バッチ方法においては、全培地成分を、一緒に、発酵開始前の培地に直接加える。

繰り返しのバッチ方法においては、完全培地の一部補充によって得られた培養液の部分的収集が任意の繰り返しの数回で起きる。

給送バッチ方法においては、１種以上の構成元素および／または触媒元素を含む化合物を発酵開始前に培地に加えないかあるいは一部を加え、次いで、それぞれ、１種以上の構成元素および／または触媒元素を含む化合物の全部または残りを発酵過程中に給送する。給送用に選択した化合物は、一緒にまたは別々に発酵過程に給送できる。

特に、元の発酵培地が１種以上の構成元素を含む化合物の供給によりおよそ２倍以上に希釈される発酵方法においては、給送物は、構成元素に次いで、触媒元素および追加の培地成分をさらに含み得る。

繰り返しの給送バッチまたは連続発酵方法においては、完全出発培地を発酵中に付加的に給送する。出発培地は、構成元素給送物と一緒にまたは別々に給送してもよい。繰り返しの給送バッチ方法においては、バイオマスを含む発酵培養液の一部を定期的時間間隔で取出し、一方、連続方法においては、発酵培養液の一部取出しが連続して起きる。その発酵過程は、それによって取出した発酵培養液の量に相当する新鮮培地により補充される。

本発明の好ましい実施態様においては、給送バッチまたは繰り返し給送バッチ方法を用いて、炭素および／または窒素源、および／またはリン酸塩を発酵過程に急送する。より好ましい実施態様においては、炭素および窒素源を発酵過程に給送する。最も好ましくは、炭素および窒素源をリン酸塩と一緒に給送する。この点に関して、好ましい炭素源はグルコースであり、好ましい窒素源はアンモニアおよび／またはアンモニウム塩である。

給送バッチ方法の使用は、バッチ方法におけるよりも、かなり大量の炭素および窒素源の使用を典型的に可能にする。詳細には、給送バッチ方法において用いる炭素および窒素源の量は、バッチ方法において用いる最大量よりも少なくとも約２倍以上であり得る。このことは、給送バッチ方法においては著しく大量のバイオマス産生をもたらす。

本発明のさらなる局面は、発酵培養液の下流加工処理の選択に関する。発酵過程を終了した後、有用な生成物は、必要に応じて、興味ある有用化合物用に開発された標準の技術を用いて発酵培養液から回収し得る。そのために用いる適切な下流加工処理技術は、有用化合物の性質および細胞位置に依存している。結局のところ、バイオマスは、発酵液から、例えば遠心またはろ過を用いて分離している。次いで、有用化合物は、その有用生成物が微生物細胞内に集積しているか微生物細胞と会合している場合には、バイオマスから回収する。一方、有用生成物は、微生物細胞から分泌している場合には、発酵液から回収する。

興味ある有用化合物の工業的発酵生産においての化学的に明確な培地の使用は、副生成物の量が複合培地を用いたときよりも実質的に低いので、下流加工処理において多大な利点を提供している。しかも、生成物の品質は、望ましくない副生成物が興味ある化合物と共分離して来ないので、改善されている。

本発明のさらなる局面においては、化学的に明確な培地を用いる工業的発酵方法に適する株を同定する。

化学的に明確な培地を用いる工業的発酵方法に適する微生物株は、化学的に明確な培地において良好な増殖性能を有する限り、興味ある有用化合物を産生する任意の野性タイプの株であり得る。さらに、化学的に明確な培地を用いる工業的発酵方法に適する微生物株は、興味ある親株を古典的な変異誘発処理または組換えＤＮＡ形質転換に供することによって得られたおよび／または改良された株であってもよく、これら株においても、得られた変異株または形質転換微生物株が化学的に明確な培地において良好な増殖性能を有することを条件とする。得られた変異株または形質転換株が、親株と比較したとき、化学的に明確な培地において改良されたまたは同等な増殖性能を有すべきかどうかは、化学的に明確な培地における親株の増殖性能に依存している。

微生物株は、その株が≧０．０５ｈ^−１、好ましくは≧０．１ｈ^−１、より好ましくは≧０．２ｈ^−１、最も好ましくは≧０．４ｈ^−１である化学的に明確な培地での増殖速度比（ｓｐｅｃｉｆｉｃｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ）（μ）を有する場合、良好な増殖性能を有するものと理解する。化学的に明確な培地での微生物株の増殖性能は、比較的小規模の、例えば、振盪フラスコ培養または１０Ｌベンチ発酵でのその株の化学的に明確な培地での発酵により都合良く分析し得る。この増殖性能の分析においては、ｐＨ、温度および酸素濃度コントロールによる１０Ｌベンチ発酵を含むことが好ましい。

本発明の１つの実施態様においては、化学的に明確な培地中で培養し得る微生物株は、ＵＶ照射等の物理的手段、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンまたはエチルメタンスルホネート等の適切な化学変異誘発物質を用いて、興味ある親株を古典的な変異誘発処理に供することによって得られおよび／または改良される。本発明のもう１つの実施態様においては、化学的に明確な培地中で培養し得る微生物株は、興味ある親株を組換えＤＮＡ技術に供することによって得られおよび／または改良され、それによって親株は１種以上の興味ある機能性遺伝子により形質転換される。

一般に、本発明は、２つの群の興味ある親株を古典的変異誘発および／またはＤＮＡ形質転換に供することを意図する。本発明の１つの実施態様においては、興味ある親株は、化学的に明確な培地において良好な増殖性能を有するが興味ある化合物の産生レベルに関しては改良する必要のない株の群から選ばれる。本発明のもう１つの実施態様においては、興味ある親株は、興味ある化合物の高産生レベルを有するが化学的に明確な培地において比較的良くない増殖性能を有する株の群から選ばれる。約０．０５ｈ^−１未満の増殖速度比を有する微生物株は、化学的に明確な培地において比較的良くない増殖性能を有するものと理解する。

両方法、即ち、古典的変異誘発処理とＤＮＡ形質転換の後、得られた変異株または形質転換株を、双方の化学的に明確な培地における増殖性能と興味ある化合物の産生レベルについてスクリーニングする。親株に比較して、化学的に明確な培地における良好な増殖性能および／または興味ある化合物の改良された産生レベルを有する変異株または形質転換株を選択する。

幾つかの株、とりわけすでに広範な変異誘発処理に供されて産生レベルを改良されている工業的株は、化学的に明確な培地において良好に機能しないかあるいは全く増殖し得ないことに留意すべきである。変異誘発株のそ等の良好でない性能または増殖性の欠如は、化学的に明確な培地での増殖性が適切な変異株の選択基準として全く用いられていないという事実によって生じ得る。例えば、変異誘発株が未知の増殖要求を生ずる変異（未知の栄養素要求変異）を有することはあり得る。

化学的に明確な培地を用いる工業的発酵に適し得る微生物株には、繊維状および非繊維状の株がある。例えば、化学的に明確な培地での発酵に適する微生物株には、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）またはムコラレス（Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ）等の真菌株；サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、ファフィア（Ｐｈａｆｆｉａ）またはクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株等の酵母株；および放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）等のバクテリア株がある。本発明による化学的に明確な培地の使用は、繊維状微生物の工業的発酵において特に有利である。

化学的に明確な培地を用いる本発明による方法は、一次または二次代謝物、製薬用タンパク質またはペプチド類、または工業用酵素類等の任意の興味ある有用化合物の工業的規模での発酵生産において適している。好ましい有用化合物は、抗生物質またはβ−ラクタム化合物、特にβ−ラクタム抗生物質等の二次代謝物である。

株−生成物の組合せの例としては、アミログルコシダーゼ用のＡ．ｎｉｇｅｒ、例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ ＣＢＳ ５１３．８８；α−アミラーゼ用のＡ．ｏｒｙｚａｅ；ロバスタチン用のＡ．ｔｅｒｒｅｕｓ、例えば、Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ ＣＢＳ ４５６．９５；アラキドン酸またはアラキドン酸含有脂質用のＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ；プロテアーゼ用のＭｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ；β−ラクタム化合物類（ペニシリンＧまたはＶ）用のＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、例えば、Ｐ．ｃｈｌｙｓｏｇｅｎｕｍ ＣＢＳ ４５５．９５または他の適切な株；クラブラン酸（ｃｌａｖｕｌａｎｉｃ ａｃｉｄ）用のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ、例えば、Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ ＡＴＣＣ ２７０６４；テトラアセチル−フィトスフィンゴシン用のＰｉｃｈｉａ ｃｉｆｅｒｒｉｉ、例えば、Ｐ．ｃｉｆｅｒｒｉｉ ＮＲＲＬＹ−１０３１ Ｆ−６０−１０；アスタキサンチン用のＰｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ、例えば、Ｐ．ｒｈｏｄｏｚｙｍａ ＣＢＳ ６９３８；エリスロマイシン用のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａａｅａ；ラクターゼ用のＫ．ｌａｃｔｉｓ；ナタマイシン用のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎａｔａｌｅｎｓｉｓがある。

また、本発明は、微生物株を用い、この株を興味ある１種以上の機能性遺伝子で形質転換して、この株によりすでに産生されている生成物を重複発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）し得る形質転換株を得るか、あるいはこの株によっては本来産生されない生成物を発現し得る形質転換株を得ることも意図する。

どの株を形質転換用に選択するかは、選択した化合物が化学的に明確な培地で良好な増殖性能を有することを条件として、熟練者にゆだねる。例えば、すでに１回以上の変異誘発処理に供している株を形質転換用に選択し得る。また、変異誘発させてない株あるいは野性タイプの株を選択してもよい。所望化合物の発現レベル分析に次いで、興味ある１種以上の機能性遺伝子で選択株を形質転換した後に得られた形質転換株は、その化学的に明確な培地での増殖性能について分析すべきである。

上記選択する株によっては本来産生されない生成物を産生する組換え株の例としては、次のものがある：
・Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、例えば、グルコースイソメラーゼを発現し得る発現カセット、即ち、例えばＡｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ由来のグルコースイソメラーゼをコードする遺伝子を含有するＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ ＴＫ２１；
・Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、例えば、エクスパンダーゼ、および任意成分としてのヒドロキシラーゼおよび／またはアセチルトランスフェラーゼを発現し得る１個以上の発現カセット、即ち、例えばＡｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ由来のエクスパンダーゼ、ヒドロキシラーゼおよびアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含有するＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＣＢＳ ４５５．９５、または側鎖先駆体としてアジピン酸（ＥＰ ５３２３４１参照）または３−カルボキシメチルチオ−プロピオン酸（ＷＯ９５／０４１４８参照）を用いて、７−ＡＤＣＡまたは７−ＡＣＡ等のセファロスポリン化合物を産生し得るＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ；
・Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ、例えば、ヒトラクトフェリン（ＷＯ９３／２２３４８参照）またはウシキモシンを発現し得る発現カセットを含有するＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒＣＢＳ ５１３．８８；
・ウシキモシンまたはフォスフォィパーゼＡ２、インシュリンまたは組換えヒトアルブミンを発現し得る発現カセットを含有するＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ。

上記選択する株によってすでに産生されている酵素を重複産生する組換えの例としては、次のものがある：
・Ａ．ｎｉｇｅｒ、例えば、フィターゼ（ＥＰ ４２０３５８参照）またはエンドキシラナーゼＩ（ＥＰ ４６３７０６参照）を重複発現し得る発現カセットを含有するＡ．ｎｉｇｅｒ ＣＢＳ５１３．８８。

本発明を、化学的に明確な培地を用いての工業的規模の発酵方法により組換えストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）株によるグルコースイソメラーゼの産生にすいて、また複合培地に比べて化学的に明確な培地の有利な使用によるジャージ（ｊａｒｇｅ）規模のペニシリウム発酵について具体的に説明する。

さらなる実施例は、化学的に明確な培地において小規模で増殖させたときの像側性能および興味ある株の産生性を測定して、化学的に明確な培地において工業的規模で有用化合物の発酵生産に適する微生物株を同定し得るそ等の化学的に明確な培地に関する。

実施例１
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓを用いてのグルコースイソメラーゼの工業的生産
グルコースイソメラーゼを産生するストレプトマイセス株の構築

Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓのグルコースイソメラーゼ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋｌ２株ＪＭ １０１中の５．０ｋｂのＤＮＡフラグメントとして最初からクローン化した。

５．０ｋｂフラグメントに内在する１．７ｋｂフラグメントは、Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓグルコースイソメラーゼおよびその上流調節領域の完全コード配列を示すことが分った（Ａｍｏｒｅ ａｎｄ Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ（１９８９），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７，７５１５も参照されたい）。

改善された熱安定性を示すグルコースイソメラーゼ変異体を、グルコースイソメラーゼ遺伝子内でグルコースイソメラーゼタンパク質の２５３位置のリシンコードトリプレットＡＡＧをアルギニンコードＣＧＧに変えることによって得た（Ｑｕａｘ ｅｔ ａｌ．（１９９１），Ｂｉｏ／Ｔｅｄｍｏｌｏｇｙ ９，７３８−７４２）。

ストレプトマイセス中でクローニングするために、プラスミドｐＩＪ ４８６（Ｗｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８６），Ｍｏｌ．Ｇｅｎ，．Ｇｅｎｅｔ．，２０３，４６８−４７８）をベクターとして用いた。グルコースイソメラーゼをコードする１７３７塩基対Ａ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ ＤＮＡを、ｐＩＪ４８６のラージＰｓｔ Ｉ ＤＮＡフラグメントと結合させた。得られたプラスミド、いわゆるＰＷＧｘ．ＧＩＴは、プラスミド ＰＩＪ１０１の複製領域、チオストレプトン耐性遺伝子、およびＧＩＴをコードするＡ．ｍｉｓｓｏｕｒｉｅｎｓｉｓ ＤＮＡフラグメントを本質的に含有していた。ｐＷＧｘ．ＧＩＴの略図的マップを図１に示す。

グルコースイソメラーゼ産生株は、プラスミドｐＷＧｘ．ＧＩＴでＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ株ＴＫ２１（Ｈｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９８５），Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を形質転換することによって構築した。

グルコースイソメラーゼの工業生産
実施例１で述べたようにして構築した産生株の業務用セルバンクを、チオストレプトン耐性コロニーをピッキングし、これを１００ｍｌの振盪フラスコ内のチオストレプトン（５０ｍｇ／ｌ）を含有する２０ｍｌのトリプトン ソイトーン ブロス（Ｔｒｙｐｔｏｎｅ Ｓｏｙｔｏｎｅ Ｂｒｏｔｈ）中で３０℃４０〜４８時間増殖させ、２８０ｒｐｍで振盪させることによって調製した。

１ｍｌの上記業務用セルバンク（新鮮な、または−８０℃で凍結菌糸体として保存した）に等価の菌糸体を、５００ｍｌ振盪フラスコ内の１６ｇ／Ｌのバクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ ０１２３／０１）、４ｇ／Ｌのバクトソイトーン（Ｄｉｆｃｏ ０４３６／０１）、２０ｇ／Ｌのカゼイン加水分解物（Ｍｅｒｃｋ ２２３９）、１０ｇ／Ｌのリン酸二カリウム．３ａｑ（Ｍｅｒｃｋ分析級試薬）、１６．５ｇ／Ｌのグルコース．ｌａｑ、０．６ｇ／Ｌの大豆油および５０ｍｇ／Ｌのチオストレプトンを含有する１００ｍｌの接種物蔵相区培地中に接種する。この培地のｐＨを水酸化ナトリウムおよび／または硫酸で滅菌前に７．０に調整する。グルコースとチオストレプトンは、滅菌後に別々に加える。チオストレプトンは、ＤＭＳＯに５０ｇ／Ｌの濃度で溶解させ、０．２μｍのナルジーン（Ｎａｌｇｅｎｅ）フィルターでろ過滅菌する。培養物を２８０ｒｐｍのインキュベーターシェーカー内で２４時間、３０℃で増殖させる。

得られた完全増殖培養物の５０ｍｌを、グルコース濃度２倍（３３ｇ／Ｌのグルコース．ｌａｑ）、追加の発泡防止剤（ＳＡＧ５６９３、０．６ｇ／Ｌ；Ｂａｓｉｌｄｏｎ社からのシリコン発泡防止剤）およびチオストレプトン含まない以外は上述の培地と同じような組成を有する６０ｍｌの第２相接種物増殖培地に移す。グルコースをここでも別個に５０％溶液中で滅菌し、培地の滅菌（６０分、１２１℃）後に加える。培養物を、直径２ｍｍの孔４つを有するノズルにより滅菌空気８４０Ｌ／ｈでエアレーションしている滅菌気泡カラム内で３６時間増殖させ、温度を２２℃に維持する。また、この第２相は、振盪フラスコ内（例えば、２Ｌのじゃま板付きエーレンマイヤーフラスコ内の１２ｘ５００ｍｌ培地）で同様な接種比率で実施でき、軌道シェーカーインキュベーター内で２８０ｒｐｍで振盪させる。

得られた完全増殖培養物を、１６．３ｋｇのクエン酸．ｌａｑ、７０．８ｇの硫酸第１鉄．７ａｑ、１０９ｇの硫酸亜鉛．７ａｑ、１０９ｇの硫酸マンガン．１ａｑ、３２．７ｇの二塩化コバルト．６ａｑ、５．４５ｇのモリブデン酸二ナトリウム．２ａｑ、５．４５ｇのホウ酸、５．４５ｇの硫酸銅．５ａｑ、１０．９ｋｇの硫酸二アンモニウム、１０．９ｋｇの硫酸マグネシウム．７ａｑ、４６３ｇの塩化カルシウム．２ａｑ、１０９０ｇの大豆油、２１．８ｋｇのリン酸一カリウム、１３９ｋｇのグルコース．ｌａｑおよび５．９ｋｇの酵母抽出物（乾燥重量基準で１０％ケルダール窒素を含む醸造酵母）を含有する４．５ｍ３の接種物培地を含む接種物ファーメンターに無菌的に移す。培地は、次のようにして調製する：グルコースを除く全成分を指示された順序で約２７００Ｌの水道水中に入れる。ｐＨを水酸化ナトリウムおよび／またはリン酸で４．５にセットし、培地を１２２℃で６０分間滅菌した。グルコースは、ｐＨ４．５の水１０００Ｌ中で別の容器内で１２２℃で６０分間滅菌する。両方を冷却した後、グルコースを接種物容器に無菌的に移す。両成分を混合した後、ｐＨをアンモニアで７．０にセットし、容量を滅菌水により４．５ｍ３に調製した。発酵温度を３０℃にコントロールし、ファーメンターを０．５〜１．０ｖｖｍでエアレーションし、その間ｐＨをアンモニアガスで７．０±０．１に維持し、１．３〜１．４バールの過圧を維持する。発泡は、必要に応じて、大豆油とＳＡＧ５６９３等のシリコン発泡防止剤の３：１比滅菌混合物によりコントロールする。酸素濃度は、攪拌機速度（０．５〜３Ｋｗ／ｍ^３）を調整することによって空気飽和の２５％以上に維持する。培養物を、グルコースの全部が消費される前（前記の増殖各相におけるようにして）に、且つ酸素取込み速度が３０ミリモル／ｌ（培養液容量）．ｈを越える前に主発酵に移す。

主発酵培地は、２４５．１ｋｇのクエン酸．１ａｑ、１０６２ｇの硫酸第１鉄．７ａｑ、１６３４ｇの硫酸亜鉛．７ａｑ、１６３４ｇの硫酸マンガン．１ａｑ、４９０ｇの二塩化コバルト．６ａｑ、８２ｇのモリブデン酸二ナトリウム．２ａｑ、８２ｇのホウ酸、８２ｇの硫酸銅．５ａｑ、１６３．４ｋｇの硫酸二アンモニウム、１６３．４ｋｇの硫酸マグネシウム．７ａｑ、６．９４ｋｇの塩化カルシウム．２ａｑ、１６．３ｋｇの大豆油、３２７ｋｇのリン酸一カリウム、８８０ｋｇの醸造酵母抽出物（乾燥重量基準で１０％ケルダール窒素）、および５５６ｋｇのグルコース．１ａｑを含有する。培地は、接種物発酵において述べたようにして調製する（グルコースは別個に滅菌する）。グルコースにおいては、ＤＥ−９５シュガーシロップを代りに使用し得る。接種前の培地容量は、ｐＨをアンモニアで７．０に補正した後で６５ｍ^３である。

グルコース給送物は、グルコース．１ａｑとしてまたは〉９０−ＤＥ−シロップからのグルコース等価物として、２７５〜５５０ｇグルコースル給送溶液で調製する。ｐＨは、リン酸溶液で４．５〜５．０に調整する。滅菌は、バッチ（１２２℃、４５分間）で、あるいはヒートショックまたはフィルターセットにより連続して実施する。

主発酵は、３０±０．５℃およびｐＨ７．０±０．１（アンモニアおよびリン酸を用いてのｐＨコントロールによる）にコントロールする。空気流は０．５〜１．５ｖｖｍにセットし、過圧は０．５〜１．５バールであり、ファーメンターは、ルッシュトン（Ｒｕｓｈｔｏｎ）タービンで０．５〜３Ｋｗ／ｍ３の強度で攪拌して、酸素濃度が底部攪拌機高さで測定したときに０．２ミリモル／Ｌより低くなるのを防止する。グルコース給送は、酸素取込み速度の突然の落込みが生じ、溶解酸素濃度が上昇し、さらにｐＨが６．９から７．１になったときに開始する。培養液中のグルコース濃度は、この時点で＜＜０．２ｇ／Ｌであるべきである。

グルコース給送速度は、開始時で９３ｋｇグルコース／ｈであり、直線的に上昇して給送開始後６４時間で１８６ｋｇ／ｈに達する。１８６ｋｇ／ｈでの給送１００時間後、給送速度は、約２００給送時間までに２９８ｋｇグルコース／ｈに上昇する。

発泡は、滅菌大豆油を５．５ｋｇ／ｈｒで添加するか、または発酵の最初の１００時間においては８時間毎に４５ｋｇの投込みによりコントロールする。必要ならば、さらなるコントロールを、大豆油とＳＡＧ４７１（Ｂａｓｉｌｄｏｎ社からのシリコン発泡防止剤）等のシリコン発泡防止剤との３：１比混合物により行う。

アンモニア濃度は、１２時間毎に測定し、５００ｍｇアンモニア／Ｌに等価の割合の滅菌硫酸アンモニウムをアンモニアレベルが１０００ｍｇ／Ｌより低くなるや否や添加することによって、７５０〜１５００ｍｇ／Ｌに維持する。

培養物ろ液中のリン酸塩濃度は、５００ｍｇ／Ｌに等価の割合の滅菌リン酸一カリウムを添加することにより、５００ｍｇＰＯ_４／Ｌよりも高く維持すべきである。

グルコースイソメラーゼの産生は、収集し培養液から精製し次いで当該技術で公知のタンパク質測定方法で決定したタンパク質として同定でき、あるいは安定化した培養液サンプルで行った酵素アッセイにおいてアッセイできる。培養液サンプルは、培養液２ｇを秤量し、１２ｇ／Ｌのトリスヒドロキシメチルアミノメタンと２．４ｇ／ＬのＣｏＣｌ．６ａｑを含有する５ｍｌの安定剤溶液を添加し、その後７３℃で３０分間加熱することによって安定化する。冷却後、０．４２ｍｌの安定化サンプルを、０．８ｍｌのグルコース溶液（２７．２５ｇ／Ｌのトリス／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．２、グルコース６７．５６ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ_２．６ａｑ、２２．３３ｇ／ＬのＮａ_２−ＥＤＴＡ２ａｑ、および５ｍｇ／ＬのトリトンＸ−１００を含有する）と混合し、６０℃でインキュベートする。活性を、グルコースからフルクトースへの転換率を測定することによって測定し、ＧＵ／ｇとして表示する。（１ＧＵは、１μモル フルクトース／分の生成に必要な酵素の量である。）タンパク質ｍｇ当り１２単位の比活性を用いて、培養液ｋｇ当りのタンパク質量を測定できる。

図２においては、産生した酵素の総量を示す。

本実施例において示すように、８５０ｋｇの酵素を、１回の給送バッチ生産操作において製造できる。

実施例２
ペニシリンＶの生産

Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＣＢＳ ４５５．９５（または、好ましくは後述等の方法で変異誘発し高産生性について選択することによってＷｉｓｃｏｎｓｉｎ ５４．１２５５から誘導したもう１つの適切な株）の分生胞子柄を、以下の成分（ｇ／ｌ）を含有する生産培地中に１０Ｅ５−１０Ｅ６分生胞子器／ｍｌで接種する：グルコース．Ｈ_２Ｏ）５；ラクトース．Ｈ_２Ｏ、８０；ＮＨ_２）２ＣＯ、４．５；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、１．１；Ｎａ_２ＳＯ_４、２．９；ＫＨ_２ＰＯ_４、５．２；Ｋ_２ＨＰＯ_４．３Ｈ_２Ｏ、４．８；痕跡量元素溶液（クエン酸．Ｈ_２Ｏ、１５０；ＦｅＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、１５；ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ，１５０；Ｈ_３ＢＯ_３、０．００７５；ＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ、０．２４；ＣＯＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、０．３７５；ＺｎＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ）１．５；ＭｎＳＯ_４．Ｈ_２Ｏ、２．２８；ＣａＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ、０．９９）、１０（ｍｌ／ｌ）；１０％フェノキシ酢酸カリウム溶液、ｐＨ７、７５（ｍｌ／ｌ）。（滅菌前のｐＨ６．５）。

培養物を、２８０ｒｐｍの軌道シェーカー内で２５℃で１４４〜１６８時間インキュベートする。発酵の終了時に、菌糸体を遠心またはろ過により除去し、量を定量し、培地を、当該技術において周知のＨＰＬＣ方法により、産生したペニシリンについてアッセイする。

実施例３
複合および明確培地による大規模ペニシリウム発酵

Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５４．１２５５を、化学的に明確な培地での増殖およびペニシリン産生について、実施例２に述べたようにして変異誘発し化学的に明確な培地で選択することによって最適化した。給送バッチ発酵を、５０ｋｇ／ｍ３のとうもろこし浸漬液を含有するＨｅｒｓｂａｃｈ等により開示されたような複合培地（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｐｐ ４５−１４０，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．１９８４，Ｔａｂｌｅ ４；培地Ａで述べられているような塩類を含む培地Ｂ）で６０ｍ３規模で実施した。これと並行して、発酵を実施例２において述べたような明確培地において実施したが、各添加量は、これら給送バッチ発酵の高細胞密度特性故に、倍量であり、ラクトースとウレアム（ｕｒｅｕｍ）は省いた。グルコースは、ファーメンターに、グルコース濃度を２ｇ／Ｌより低く保って給送してグルコース抑制を回避した。アンモニア、硫酸二アンモニウムおよびフェニル酢酸をファーメンターに送って、ｐＨ並びにアンモニウム、硫酸塩およびフェニル酢酸の濃度を所望範囲にコントロールした（Ｈｅｒｓｂａｃｈ １９８４）。

酸素移動は工業的発酵方法の経済的成否を決定する重要なパラメーターであるので、上記各発酵方法の性能を、各方法の酸素移動度合を測定することによって分析した。

発酵過程において得られる酸素移動の良好な尺度は、１つの系統内で測定するような相対ｋ_Ｌａ値である。ｋ_Ｌａは、酸素移動係数として定義されており、ｖａｎ’ｔ ＲｉｅｔおよびＴｒａｍｐｅｒに従って算出する（Ｂａｓｉｃ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．（１９９１），ｐｐ．２３６−２７３）。

ｋ_Ｌａ値として算出した酸素移動能力は、発酵の主要部分において複合培地におけるよりも化学的に明確な培地において１０〜２０％高かった。

実施例４
７−ＡＤＣＡの生産

実施例２に記載した方法を、エクスパンダーゼ発現カセット（エクスパンダーゼコード領域は、ＥＰ ５３２３４１に記載されているように、ＩＰＮＳプロモーターにより得られる）で形質転換したＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ ＣＢＳ ４５５．９５（または、好ましくは後述等の方法で変異誘発し高産生性について選択することによってＷｉｓｃｏｎｓｉｎ ５４．１２５５から誘導したもう１つの適切な株）を用い、フェノキシ酢酸塩の代りに１０％アジピン酸カリウム溶液を用い、フェノキシ酢酸塩の代りに４００ｍｌの１０％アジピン酸カリウム溶液、ｐＨ５．５を含有する前記培地からの修正培地を用いて修正する（滅菌前の培地ｐＨは、６．５の代りに５．５である）。

その後、得られるアジポイル−７−ＡＤＣＡを、ＷＯ９５／０４１４８の実施例４または５に実質的に記載されているような酵素脱アシル化法によって７−ＡＤＣＡに転換する。

実施例５
ロバスタチンの生産

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ 株 ＣＢＳ ４５６．９５（または、好ましくは後述等の方法で変異誘発し高産生性について選択することによってこの株から誘導した株）の分生胞子柄を、以下の成分（ｇ／ｌ）を含有する生産培地中に１０Ｅ５−１０Ｅ６ 分生胞器／ｍｌで接種する：デクストロース、４０；ＣＨ_３ＣＯＯＮＨ_４、２．２；Ｎａ_２ＳＯ_４、４；ＫＨ_２ＰＯ_４、３．６；Ｋ_２ＨＰＯ_４．３Ｈ_２Ｏ、３５．１；痕跡量元素溶液（実施例２参照）、１０（ｍｌ／ｌ）。

培養物を、２２０ｒｐｍの軌道シェーカー内で２８℃で１４４〜１６８時間インキュベートする。発酵の終了時に、菌糸体を遠心またはろ過により除去し、量を定量し、培地を、当該技術において周知のＨＯＬＣ方法により、産生したロバスタチンについてアッセイする。

実施例６
クラブラン酸の生産

Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ株ＡＴＣＣ ２７０６４またはその変異株を、下記の成分（ｇ／ｌ）からなる予備培養培地に接種する：（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２．７５；ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５；ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、０．５；ＣａＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ、０．０１；３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸、２１；グリセリン、１９．９；コハク酸ナトリウム、５．５；痕跡量元素溶液（ＺｎＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ、２．８；クエン酸第二鉄アンモニウム、２．７；ＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ、０．１２５；ＭｎＳＯ_４．Ｈ_２Ｏ、１；ＣｏＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ、０．１；Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７．１０Ｈ_２Ｏ、０．１６；Ｎａ_２ＭｏＯ_４．２Ｈ_２Ｏ、０．０５４）、０．０６（ｍｌ／ｌ）。

培養物を、２２０ｒｐｍの軌道シェーカー内で２８℃で４８〜７２時間インキュベートし、２０容量の次の成分（ｇ／ｌ）を含有する生産培地に接種する（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２；アスパラギン、４；ＫＨ_２ＰＯ_４、１．５；ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、０．５；ＣａＣｌ_２．２Ｈ_２Ｏ、０．０１；３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸、２１；グリセリン、１９．９；コハク酸ナトリウム、５．５；痕跡量元素溶液（上記参照）、０．０６（ｍｌ／ｌ）；ＦｅＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、０．５；ＭｎＣｌ_２．４Ｈ_２Ｏ、０．１；ＺｎＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、０．１。

インキュベーションを、好ましくは５０ｍｌの培養物容量を含むじゃま板を備えた５００ｍｌエーレンマイヤーフラスコにおいて１４４時間続行する。発酵の終了時に、菌糸体を遠心またはろ過により除去し、量を定量し、炉液を当該技術において周知のＨＰＬＣ方法によりアッセイする。

実施例７
アミログルコシダーゼの生産

Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ株 ＣＢＳ ５１３．８８またはその変異株を、１０５〜１０６分生胞子柄数／ｍｌで、次の成分（ｇ／ｌ）からなる発芽培地に接種する：Ｋ_２ＨＰＯ_４．３Ｈ_２Ｏ、０．７５；ＫＨ_２ＰＯ_４、６．６；Ｎａ３シトレート．３Ｈ_２Ｏ、５．３；クエン酸．Ｈ_２Ｏ、０．４５；グルコース．Ｈ_２Ｏ、２５；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、８；ＮａＣｌ、０．５；ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、０．５；ＦｅＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、０．１；ＺｎＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、０．０５；ＣａＣｌ_２、０．００５；ＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ、０．００２５；ＭｎＳＯ_４．４Ｈ_２Ｏ、０．０００５；Ｈ_３ＢＯ_３、０．０００５；Ｎａ_２ＭｏＯ_４．２Ｈ_２Ｏ、０．０００５；ＥＤＴＡ、０．１３；Ｔｗｅｅｎ８０、３。必要に応じて、５０μｇ／ｍｌのアルギニンおよび／またはプロリンを添加して発芽を改善し得る。

培養物を、軌道シェーカー内で３３℃、２９５ｒｐｍで４８〜７２時間インキュベートし、１０〜２０容量の次の成分（ｇ／ｌ）からなる生産培地に接種する：Ｋ_２ＨＰＯ_４、１〜５；ＮａＨ_２ＰＯ４．Ｈ_２Ｏ、０．５；Ｎａ_３シトレート．３Ｈ_２Ｏ、５３；クエン酸．Ｈ_２Ｏ、４．０５；デキストロースポリマー、７０；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、８；（ＮａＣｌ、ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、ＦｅＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、ＺｎＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、ＣａＣｌ_２、ＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ、ＭｎＳＯ_４．４Ｈ_２Ｏ、Ｈ_３ＢＯ_３、Ｎａ_２ＭｏＯ_４．２Ｈ_２Ｏ、ＥＤＴＡ）：発芽培地に同じ。

インキュベーションを、好ましくは１００ｍｌの培地を含む５００ｍｌエーレンマイヤーフラスコにおいて９６時間続行する。発酵の終了時に、菌糸体を遠心またはろ過により除去し、量を定量し、ろ液をアミロース分解（ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃ）活性についてアッセイする。

実施例８
アスタキサンチンの生産

Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ株ＣＢＳ ６９３８またはその変異株を、酵母抽出物、１０；ペプトン、２０；グルコース、２０（ｇ／ｌ）を含有する２０ｍｌの予備培養培地に接種する。培養物を、２７５ｒｐｍの軌道シェーカー内のじゃま板を備えた１００ｍｌエーレンマイヤーフラスコでインキュベートする。

次いで、この予備培養物１ｍｌを用いて、下記の成分（ｇ／ｌ）を含有する１００ｍｌの生産培地に接種する：グルコース、３０；ＮＨ_４Ｃｌ、４．８３；ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、０．８８；ＮａＣｌ、０．０６；ＣａＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ、０．１５；痕跡量元素溶液（クエン酸．Ｈ_２Ｏ、５０；（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ_４）_２．６Ｈ_２Ｏ、９０；ＺｎＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、１６．７；ＣｕＳＯ_４．４Ｈ_２Ｏ、２．５；ＭｎＳＯ_４．４Ｈ_２Ｏ、２；Ｈ_３ＢＯ_３、２；Ｎａ_２ＭｏＯ_４．２Ｈ_２Ｏ、２；ＫＩ、０．５；０．４ＮのＨ_２ＳＯ_４中）、０．３（ｍｌ／ｌ）；ビタミン類溶液（ミオーイノシトール、４０；ニコチン酸、２；Ｃａ−Ｄ−パントテネート、２；ビタミンＢ１、２；ｐ−アミノ安息香酸、１．２；ビタミンＢ６、０．２；ビオチン、０．００８；０．０７ＮのＨ_２ＳＯ_４中）０．３（ｍｌ／ｌ）；プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、０．０４；ＫＨ_２ＰＯ_４、１；フタル酸水素カリウム、２０（滅菌前ｐＨ５．４）。

インキュベーションを、好ましくはじゃま板を備えた５００ｍｌエーレンマイヤーフラスコ中で９６時間続行する。発酵終了時に、バイオマスのアスタキサンチン含有量（定量）を、溶媒抽出し、抽出物の光学密度を４７０〜４９０ｎｍで測定することによって測定する。

実施例９
アラキドン酸の生産

−８０℃で保存したＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ株ＡＴＣＣ １６２６６の１ｍｌバイアル懸濁物１本を無菌的に開封し、内容物を用いて、次の成分（ｇ／ｌ）を含有する５００ｍｌの生産培地に接種する：グルコース、７０；酵母抽出物、０．５；ＮＨ_４ＮＯ_３、３．０；ＫＨ_２ＰＯ_４、７．２；ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、１．５；痕跡量元素溶液（クエン酸．Ｈ_２Ｏ、５０；（ＮＨ_４）_２Ｆｅ（ＳＯ_４）_２．６Ｈ_２Ｏ、９０；ＺｎＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、１６．７；ＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ、２．５；ＭｎＳＯ_４．４Ｈ_２Ｏ）、；Ｈ_３ＢＯ_３、２；Ｎａ_２ＭｏＯ_４．２Ｈ_２Ｏ、２；ＫＩ、０．５；０．４ＮのＨ_２ＳＯ_４中）、０．３（ｍｌ／ｌ）；（滅菌前のｐＨ７．０）。

培養物を、２５０ｒｐｍの軌道シェーカー内のじゃま板を備えた２リットル振盪フラスコ中で２５℃、７２時間インキュベートする。発酵終了時に、バイオマス量とバイオマスのアラキドン酸含有量を、遠心し、凍結乾燥し、溶媒抽出した後に、当該技術で周知のＧＣ法によって測定する。

実施例１０
エリスロマイシンの生産

Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ株ＮＲＲＬ２３３８またはその変異株（好ましくは後述ような方法で、増大した産生性について選択した）を、次の成分（ｇ／ｌ）を含有する２５ｍｌの予備培養培地に接種する：可溶性スターチ、１５；ＮａＣｌ、５；大豆ミール、１５；ＣａＣＯ_３、１０；酵母抽出物、５；とうもろこし浸漬液固形分、５；ＣｏＣｌ_２．６Ｈ_２Ｏ、１ｇ／ｌ溶液の６７０μｌ。

培養物を、じゃま板無しの１００ｍｌ振盪フラスコ中で３２〜３４℃で３日間、２５０ｒｐｍのシェーカー−インキュベーター内でインキュベートする。

培養物０．４ｍｌを、次の成分（ｇ／ｌ）を含有する２５ｍｌの滅菌生産培地に接種する：クエン酸．Ｈ_２Ｏ、２；（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２；ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、２；ＣａＣｌ２．２Ｈ_２Ｏ、０．０８５；ＫＨ_２ＰＯ_４、０．２５；ＨＥＰＥＳ［＝Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）］、５；グルコース、１．５；可溶性澱粉、２０；大豆油、０．４；痕跡量元素溶液（２５０ｍｌの蒸留水中のｇ：クエン酸．Ｈ_２Ｏ）、２．５；ＦｅＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、０．８２１５；ＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ、０．０６２５；ＣｏＣｌ_２．Ｈ_２Ｏ、０．３７５；Ｈ_３ＢＯ_３、０．０６２５；ＺｎＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、１．２５；ＭｎＳＯ_４．Ｈ_２Ｏ、１．２５；Ｎａ_２ＭｏＯ_４．２Ｈ_２Ｏ、０．０６２５）、３．６ｍｌ／ｌ。ｐＨ＝７．０。各フラスコには、０．２５ｍｌのｎ−プロパノールを加える。

培養物を、じゃま板を備えた１００ｍｌ振盪フラスコ中で３２〜３４℃で５日間、３００ｒｐｍのシェーカーインキュベーター内でインキュベートする。発酵終了時に、培養液を遠心し、バイオマス量を定量する。上清のエリスロマイシン含有量を、当該技術で公知のＨＰＬＣ法によって測定する。

実施例１１
β−カロチンの生産

Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ ＣＢＳ １３０．５９の胞子懸濁液を用いて、じゃま板なしの５００ｍｌ振盪フラスコ内の１１４ｍｌの予備培養培地（酵母抽出物１０ｇ／ｌ；ペプトン２０ｇ／ｌ；グルコース２０ｇ／ｌ）に接種する。予備培養物を、２５０ｒｐｍの回転シェーカー上で２６℃で４２時間インキュベートする。バイオマスをろ過により収集し、１００ｍｌの滅菌脱ミネラル水で３回洗浄して予備培養培地の成分を除去する。その後、バイオマスを、小片のみが残るまで混練して均質化し、４０ｍｌの脱ミネラル水に再懸濁させる。

生産培地を、５００ｍｌのじゃま板付き振盪フラスコ内で１００ｍｌ部で調製する。生産培地の組成は、次の如くである（ｇ／ｌ）：グルコース、４０；アスパラギンモノ水和物、２；ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５；ＭｇＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、０．２５。さらに、次の組成を有する痕跡量元素溶液を添加する（０．３ｍｌ／ｌ）：クエン酸．Ｈ_２Ｏ、５０；（ＮＨ_４）_２Ｆｅ（ＳＯ_４）_２．６Ｈ_２Ｏ、９０；ＺｎＳＯ_４．７Ｈ_２Ｏ、１６．７；ＣｕＳＯ_４．５Ｈ_２Ｏ、２．５；ＭｎＳＯ_４．４Ｈ_２Ｏ、２；Ｈ_３ＢＯ_３、２；Ｎａ_２ＭｏＯ_４．２Ｈ_２Ｏ、２；ＫＩ、０．５；０．４ＮのＨ_２ＳＯ_４中。滅菌前に、培地ｐＨを６．２に調整する。各フラスコを２０分間、１２０℃で滅菌し、滅菌後、脱ミネラル水（ろ過滅菌した）中の塩酸チアミン１ｍｇ／ｍｌ溶液０．０５ｍｌを加える。

生産培地培養物に、上記で調製したフラグメント化菌糸体懸濁液の０．５〜１０ｍｌを接種する。培養物を回転シェーカー上で１３９時間インキュベートする（２５０ｒｐｍ、２６℃）。真菌バイオマスをろ過により収集し、脱ミネラル水で洗浄して培地成分を除去し、定量する。

産生したβ−カロチンの量は、アセトン抽出を行い、分光光度計でアセトンフラクションの４５０ｎｍでの吸光を測定することによって測定する。

図１は、ｐＷＧｘ．ＧＩＴの概略を示す。 図２は、発酵中に産生した総グルコースイソメラーゼの展開を示す。

Claims (11)

1. 化学的に明確な構成成分からなる化学的に明確な培地である発酵培地において１０ｍ ^３ 以上の容量規模で繊維状微生物株の発酵を行うこと、および発酵培養液からアラキドン酸を含む脂質を回収することの各工程を含み、繊維状微生物株がモーティアレラ アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）である、アラキドン酸を含む脂質の生産方法。
2. 化学的に明確な培地が本質的に少量の複合炭素および／または窒素源を含有し、本質的に少量の複合炭素および／または窒素源とは、化学的に明確な培地中に炭素および／または窒素（ケルダールＮ）総量が多くとも１０％の量存在することを意味する、請求項１記載の方法。
3. 複合炭素および／または窒素源が主発酵用の植込みの発酵過程において使用される、請求項２記載の方法。
4. 主発酵の初期段階で複合炭素および／または窒素源が添加される、請求項２または３記載の方法。
5. 化学的に明確な培地の化学的に明確な構成成分が、炭水化物、グルコース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトデキストリン類、澱粉およびイヌリン；グリセリン；植物油；炭化水素類；アルコール類、メタノールおよびエタノール；有機酸、酢酸塩およびより高級なアルカン酸からなる群から選ばれる炭素源と、尿素；アンモニア；硝酸塩；アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウム；並びにアミノ酸類、グルタミン酸塩およびリシンからなる群から選ばれる窒素源とを含む請求項１ないし４のいずれか１項記載の方法。
6. 炭素源がグルコースであり、窒素源がアンモニアおよび／またはアンモニウム塩である請求項５記載の方法。
7. 発酵がバッチ、繰返しのバッチ、給送バッチ、繰返しの給送バッチまたは連続発酵過程で生ずる請求項１ないし６のいずれか１項記載の方法。
8. 発酵が給送バッチ過程で生ずる請求項７記載の方法。
9. 炭素および／または窒素源を給送バッチ過程に給送する請求項８記載の方法。
10. 炭素源がグルコースであり、窒素源がアンモニアおよび／またはアンモニウム塩である請求項９記載の方法。
11. アラキドン酸を含む脂質がトリグリセリドである請求項１ないし１０のいずれか１項記載の方法。

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