ES2262228T3 - Produccion fermentativa de compuestos valiosos a escala industrial empleando medios quimicamente definidos. - Google Patents

Produccion fermentativa de compuestos valiosos a escala industrial empleando medios quimicamente definidos.

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Abstract

La presente invención describe el uso de medios químicamente definidos para la producción fermentativa de compuestos valiosos a escala industrial. Las cepas microbianas que son adecuadas para fermentación a escala industrial utilizando un medio químicamente definido incluyen cepas fúngicas, de levaduras y bacterianas. Las cepas adecuadas pueden obtenerse como cepas de tipo natural o mediante cribado y selección después de tratamiento mutagénico o transformación de ADN.

Description

Producción fermentativa de compuestos valiosos a escala industrial empleando medios químicamente definidos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la fermentación, es decir a la producción fermentativa de compuestos valiosos, tales como metabolitos primarios o secundarios, péptidos o proteínas farmacéuticas, o enzimas industriales.
Antecedentes de la invención
Muchos compuestos valiosos son fabricados mediante producción fermentativa en grandes fermentadores, a escala industrial, es decir el microorganismo que produce un compuesto valioso de interés es cultivado bajo condiciones controladas en un fermentador de 10 a 300 m^{3}. En los procesos actuales de fermentación a escala industrial, típicamente el organismo de producción es fermentado en un medio de fermentación complejo. Se entiende por medio de fermentación complejo un medio que comprende una fuente compleja de nitrógeno y/o de carbono, tal como harina de soja, harina de semilla de algodón, licor de maíz macerado, extracto de levadura, hidrolizado de caseína, melaza, y similares.
Las ventajas de los medios complejos son que las materias primas complejas constituyentes no son costosas, son fáciles de adquirir y forman una fuente completa o casi completa de nutrientes para los microorganismos, conteniendo una fuente de carbono y nitrógeno así como de vitaminas y minerales. Además, la mezcla de macromoléculas biológicas, como las que se encuentran en las materias primas complejas, al igual que en las proteínas, carbohidratos, lípidos, y similares, necesitan ser degradadas por las enzimas excretadas por los microorganismos antes de su consumo. Como consecuencia, pequeñas moléculas consumibles pueden hacerse disponibles incluso a través del fermentador y durante el proceso de fermentación, evitando así los gradientes de concentración y los problemas de mezclado y manteniendo el nivel de esas pequeñas moléculas consumibles por debajo de concentraciones controlables. Además, esas macromoléculas así como los ácidos orgánicos también presentes en los medios complejos, proporcionan al medio una capacidad reguladora, que de esta manera facilita el control del pH.
Además de estas ventajas, los medios de fermentación complejos tienen varias desventajas importantes. La más significativa es que las materias primas complejas tienen una composición químicamente indefinida y una calidad variable, entre otras cosas debido a la variación de las estaciones y al origen geográfico diferente. Ya que la composición del medio de fermentación tiene una influencia importante en parámetros de la fermentación tales como la viscosidad, la transferencia de calor y la transferencia de oxígeno, los materiales de materias primas complejas son la causa principal de la variabilidad del proceso. Adicionalmente, obstaculizan el buen desarrollo del proceso y pueden influir negativamente en la calidad del producto final. Por ejemplo, los caldos de fermentación, en particular los microorganismos filamentosos, pueden mostrar una filtrabilidad disminuida cuando se emplean materias primas complejas.
Las materias primas complejas también pueden contener compuestos que involuntariamente se acumulan en o se aíslan conjuntamente con el producto final. Los metales pesados, los pesticidas o los herbicidas son ejemplos de los compuestos indeseables que pueden estar presentes en las materias primas complejas. Además, las materias primas complejas pueden contener o pueden conducir a la formación de toxinas.
Otras desventajas son que los medios complejos generan un olor desagradable durante la esterilización y producen corrientes de residuos no deseadas.
A pesar de las desventajas identificadas anteriormente asociadas al uso de los medios complejos, estos medios continúan siendo los preferidos para los procesos industriales de fermentación a gran escala. Existen varias razones por las que los medios que no contienen materias primas complejas, es decir los medios químicamente definidos, no han sido considerados para el uso en los procesos de fermentación a escala industrial. Una razón obvia es la encontrada en las ventajas asociadas con el uso de medios complejos. Lo que es más importante, se consideró que los rendimientos del producto que serían obtenidos usando medios químicamente definidos a escala industrial serían típicamente sustancialmente inferiores que aquellos obtenidos usando medios que contienen materias primas complejas. Además, las cepas microbianas de alta producción que han sido desarrolladas por procesos industriales en los medios complejos no pueden conservar su buen rendimiento en los medios químicamente definidos. Una razón para que tengan un rendimiento no satisfactorio en un medio químicamente definido, pudiera ser que las cepas industriales actuales han sufrido varias series de mutagénesis y selecciones, sin considerar su ejecución en los medios químicamente
definidos.
Los medios químicamente definidos de esta manera han sido muy aplicados sólo para fines investigativos, es decir en cultivos de laboratorio en placas Petri y/o frascos de agitación o a una escala fermentativa relativamente pequeña que típicamente no excede un volumen de alrededor de 20-40 L. Ver por ejemplo la producción fermentativa de metabolitos secundarios, tal como la penicilina (Jarvis y Johnson, J. Am. Chem. Soc. 69, 3010-3017 (1947); Stone, y Farrell, Science 104, 445-446 (1946); White y otros, Arch. Biochem. 8, 303-309 (1945)), clavulanic acid (Romero y otros, Appl. Env. Microbiol. 52, 892-897 (1986) y erythromycin (Bushell y otros, Microbiol. 143, 475-480 (1997)).
Sin embargo, las investigaciones sobre el uso de los medios químicamente definidos a tales escalas de investigación pequeñas no proporcionan ninguna enseñanza a la persona experta en el arte con respecto al campo de aplicación de esos medios en los procesos de fermentación industrial a gran escala con fines productivos, que típicamente tienen una escala de volumen de alrededor de 10 m^{3} o mayor.
Para evitar los problemas asociados con el uso de las recetas convencionales para los medios complejos en la práctica industrial actual, sería deseable aplicar las recetas definidas químicamente para las fermentaciones a escala industrial.
Aquí, se describe el uso de los medios químicamente definidos para los procesos de fermentación a escala industrial, permitiendo -en combinación con una cepa apropiada- la producción de compuestos valiosos, tales como metabolitos primarios o secundarios, péptidos o proteínas farmacéuticas, o enzimas industriales, con un rendimiento económicamente atractivo.
Resumen de la invención
La presente invención describe un proceso industrial para la producción de un compuesto valioso, que comprende los pasos de fermentación de una cepa microbiana en un medio de fermentación que es un medio químicamente definido compuesto esencialmente por constituyentes químicamente definidos y la recuperación del compuesto valioso a partir del caldo de fermentación.
La presente invención describe además un método para preparar y/o mejorar una cepa microbiana que produce un compuesto valioso de interés que es capaz de ser fermentado a escala industrial en un medio químicamente definido, que comprende los pasos de:
\bigstar
someter una cepa madre apropiada a un tratamiento mutagénico seleccionado del grupo de medios físicos y mutágenos químicos, y/o a la transformación del ADN,
\bigstar
clasificar los transformantes y/o mutantes resultantes según su grado de crecimiento en un medio químicamente definido y su nivel de producción de dicho compuesto valioso de interés.
\bigstar
seleccionar los mutantes que tienen un grado de crecimiento mejorado o similar en un medio químicamente definido y/o un nivel de producción mejorado de dicho compuesto valioso de interés en comparación con dicha cepa madre.
Descripción detallada de la invención
La presente invención describe el uso de los medios de fermentación químicamente definidos para la fermentación a escala industrial de una cepa microbiana apropiada, dicha cepa microbiana apropiada siendo capaz de producir un compuesto valioso.
A lo largo de la descripción de la invención, se entiende que un proceso de fermentación a escala industrial o un proceso industrial incluye un proceso de fermentación a una escala de volumen que es \geq 10 m^{3}, preferiblemente \geq 25 m^{3}, más preferiblemente \geq 50 m^{3}, lo más preferido \geq 100 m^{3}.
Se entiende que el término "químicamente definido" debe usarse para los medios de fermentación que están compuestos esencialmente por constituyentes químicamente definidos. Un medio de fermentación que está esencialmente compuesto por constituyentes químicamente definidos incluye un medio que no contiene una fuente compleja de carbono y/o nitrógeno, es decir que no contiene materias primas complejas que tengan una composición químicamente indefinida. Un medio de fermentación que esté compuesto esencialmente por constituyentes químicamente definidos puede incluir además un medio que comprenda una cantidad esencialmente pequeña de una fuente compleja de nitrógeno y/o de carbono, una cantidad como la que se define a continuación, la cual típicamente no es suficiente para mantener el crecimiento del microorganismo y/o para garantizar la formación de una cantidad suficiente de biomasa.
En tal sentido, las materias primas complejas tienen una composición químicamente indefinida debido al hecho de que, por ejemplo, esas materias primas contienen muchos compuestos diferentes, entre ellos los compuestos heteropoliméricos complejos, y tienen una composición variable debido a la variación de las estaciones y las diferencias en el origen geográfico. Ejemplos típicos de materias primas complejas que funcionan como una fuente compleja de carbono y/o nitrógeno en la fermentación son harina de soja, harina de semilla de algodón, licor de maíz macerado, extracto de levadura, hidrolizado de caseína, melaza, y similares.
Una cantidad esencialmente pequeña de una fuente compleja de carbono y/o nitrógeno pudiera estar presente en el medio químicamente definido de acuerdo a la invención, por ejemplo como arrastre desde el inóculo para la fermentación principal. El inóculo para la fermentación principal no es necesariamente obtenido por fermentación en un medio químicamente definido. Lo más frecuente, el arrastre del inóculo será detectado mediante la presencia de una pequeña cantidad de una fuente compleja de nitrógeno en un medio químicamente definido para la fermentación principal.
Puede ser ventajoso usar una fuente compleja de carbono y/o nitrógeno en el proceso de fermentación del inóculo para la fermentación principal, por ejemplo para agilizar la formación de la biomasa, es decir aumentar la tasa de crecimiento del microorganismo, y/o facilitar el control interno del pH. Por la misma razón, puede ser ventajoso adicionar una cantidad esencialmente pequeña de una fuente compleja de carbono y/o nitrógeno, por ejemplo extracto de levadura, a la etapa inicial de la fermentación principal, especialmente para agilizar la formación de biomasa en la etapa temprana del proceso de fermentación.
Una cantidad esencialmente pequeña de una fuente compleja de carbono y/o nitrógeno la cual puede estar presente en el medio químicamente definido de acuerdo con la invención es definida como una cantidad de a lo máximo alrededor de 10% de la cantidad total de carbono y/o nitrógeno (Kjeldahl N) que está presente en el medio químicamente definido, preferiblemente una cantidad de a lo máximo 5% de la cantidad total de carbono y/o nitrógeno, más preferiblemente una cantidad de a lo máximo 1% de la cantidad total de carbono y/o nitrógeno. Lo más preferido es que no esté presente ninguna fuente compleja de carbono y/o nitrógeno en el medio químicamente definido de acuerdo a la invención.
Se entiende que el término "medio químicamente definido" como es usado en la presente invención incluye un medio en el que todos los componentes necesarios son adicionados al medio antes de comenzar el proceso de fermentación, y además incluye un medio donde parte de los componentes necesarios son adicionados antes del comienzo y parte son adicionados al medio durante el proceso de fermentación.
La presente invención describe además que las cepas microbianas son capaces de convertir, a escala industrial, las materias primas simples del medio químicamente definido en una cantidad económicamente atractiva del producto valioso. Es sorprendente encontrar que la productividad de las cepas microbianas en el medio químicamente definido, cuando es medida a escala industrial, pueda ser comparable a o en algunos casos incluso mayor que su productividad en el medio complejo.
Una ventaja adicional del uso del medio químicamente definido en comparación con el uso del medio complejo es que la transferencia de oxígeno de la fase gaseosa a la fase líquida y la transferencia de dióxido de carbono de la fase líquida a la gaseosa es sustancialmente mejorada. Como es conocido por los expertos en el arte, las concentraciones de dióxido de carbono disuelto y oxígeno disuelto son dos factores importantes en el escalado de un proceso de fermentación, y pueden determinar la factibilidad económica de un proceso industrial. La transferencia de masa mejorada obtenida usando el medio químicamente definido puede ser atribuido a la ausencia en estos medios de cantidades importantes de compuestos que promueven la coalescencia de burbujas de gas. Los compuestos promotores de la coalescencia por ejemplo pueden ser encontrados entre ciertos compuestos hidrofóbicos y/o poliméricos presentes en las materias primas complejas. La coalescencia de burbujas de gas típicamente resulta en un coeficiente de transferencia de masa más bajo (van 't Riet y Tramper, en: Basic Bioreactor Design, pp 236-273 (1991)).
Frecuentemente la transferencia de oxígeno es un factor limitante en los procesos de fermentación, especialmente en las fermentaciones de microorganismos filamentosos. La capacidad de transferencia de oxígeno mejorada obtenida cuando la fermentación es realizada usando un medio químicamente definido de acuerdo con la invención proporciona una vía mucho más barata de optimización de la productividad que las inversiones en equipamiento, la entrada de energía, el enriquecimiento de oxígeno del aire de entrada o la presión del fermentador.
En los procesos de fermentación industriales, los microorganismos filamentosos, como las bacterias filamentosas tal como Actinomycetes u hongos filamentosos tales como el Penicillium o el Aspergillus, típicamente son cultivados teniendo una morfología de gránulo. En este sentido, las proteínas y los péptidos presentes en el medio de fermentación complejo tienen la tendencia a producir gránulos esponjosos, los cuales fácilmente se desintegran sobre el micelio dispersado con hifas muy largas y ramificadas como consecuencia de las altas tasas de crecimiento que típicamente son obtenidas usando medios complejos. Por tanto, una morfología de gránulo esponjosa generalmente puede causar una viscosidad del caldo indeseablemente alta. El uso de medios químicamente definidos tiene una influencia favorable en la morfología, por ejemplo produciendo un gránulo más rígido que no se desintegra fácilmente durante la fermentación. De esta forma, una disminución significativa de la viscosidad de los caldos de fermentación filamentosos puede ser obtenida usando medios químicamente definidos. Ya que una baja viscosidad del caldo de fermentación es ventajosa para la formación del producto, el control de la viscosidad es de suma importancia en el proceso de fermentación a escala industrial.
Otra ventaja del uso de los medios químicamente definidos es encontrada en el proceso aguas abajo del producto. Para ciertas combinaciones de producto-cepa, especialmente cuando las cepas filamentosas son fermentadas, el proceso aguas abajo es mejorado significativamente usando medios químicamente definidos.
Un medio químicamente definido a ser usado en el proceso de la invención típicamente debe contener los así llamados elementos estructurales y catalíticos.
Los elementos estructurales son aquellos elementos que están constituidos por macromoléculas microbianas, es decir hidrógeno, oxígeno, carbono, nitrógeno, fósforo y azufre. Los elementos estructurales hidrógeno, oxígeno, carbono y nitrógeno típicamente están contenidos dentro la fuente de carbono y nitrógeno. El fósforo y el azufre típicamente son adicionados como iones tiosulfatos y/o sulfatos y fosfatos.
El tipo de fuente de carbono y nitrógeno que es usada en el medio químicamente definido no es decisivo para la invención, a condición de que la fuente de carbono y nitrógeno tenga un esencialmente un carácter químicamente definido.
Preferiblemente, una fuente de carbono es seleccionada del grupo que consiste de carbohidratos tales como glucosa, lactosa, fructosa, sacarosa, maltodextrina, almidón e inulina, glicerol, aceites vegetales, hidrocarburos, alcoholes tales como el metanol y el etanol, ácidos orgánicos como el acetato y los ácidos alcanoicos superiores. Más preferiblemente, una fuente de carbono es seleccionada del grupo que consiste de glucosa, sacarosa y aceite de soja. Lo más preferido, la fuente de carbono es glucosa. Se entiende que el término "glucosa" incluye siropes de glucosa, es decir composiciones de glucosa que contienen oligómeros de glucosa en cantidades definidas.
Preferiblemente, una fuente de nitrógeno es seleccionada del grupo que consiste de urea, amoníaco, nitrato, sales de amonio tales como el sulfato de amonio, el fosfato de amonio y el nitrato de amonio, y aminoácidos tales como el glutamato y la lisina. Más preferiblemente, una fuente de nitrógeno es seleccionada a partir del grupo que consiste de amoníaco, sulfato de amonio y fosfato de amonio. Lo más preferido, la fuente de nitrógeno es amoníaco. El uso de amoníaco como fuente de nitrógeno tiene la ventaja de que el amoníaco adicionalmente puede funcionar como un agente controlador del pH. En el caso de que el sulfato de amonio y/o el fosfato de amonio se usen como fuente de nitrógeno, parte o todo el requerimiento de azufre y/o fósforo del microorganismo puede ser satisfecho.
Los elementos catalíticos son aquellos elementos los cuales son constituyentes de las enzimas o cofactores de enzimas. Estos elementos son por ejemplo magnesio, hierro, cobre, calcio, manganeso, zinc, cobalto, molibdeno, selenio, bario.
Junto a estos elementos estructurales y catalíticos, cationes tales como iones de potasio y sodio debieran estar presentes para actuar como ión contador y para el control del pH intracelular y la osmolaridad.
Los compuestos que pueden opcionalmente estar incluidos en un medio químicamente definido son los agentes quelatantes, tal como el ácido cítrico, y los agentes buffer tal como el fosfato de mono- y dipotasio, el carbonato de calcio, y similares. Los agentes buffer preferiblemente son adicionados cuando se trata de procesos sin un control de pH externo. Además, un agente antiespumante puede ser dosificado antes y/o durante el proceso de fermentación.
Las macromoléculas y los ácidos orgánicos que están presentes en los medios complejos proporcionan una capacidad buffer en estos medios. Debido a la ausencia de estos compuestos en los medios químicamente definidos, se el control del pH es más difícil en los medios químicamente definidos que en los complejos. La presente invención muestra que un control de pH donde un ácido o una base pueden ser dosificados, en dependencia del desarrollo del pH en el cultivo, permite un perfil de pH apropiado en los procesos químicamente definidos a escala industrial.
Vitaminas se refiere a un grupo de componentes orgánicos estructuralmente no relacionados necesarios para el metabolismo normal de los microorganismos. Los microorganismos son conocidos que varían ampliamente en cuanto a su capacidad de sintetizar las vitaminas que requieren. Una vitamina debe ser adicionada al medio de fermentación de un microorganismo incapaz de sintetizar dicha vitamina. Típicamente, los medios de fermentación químicamente definidos para levaduras o bacterias o para ciertos hongos inferiores, por ejemplo, Mucorales, pueden ser suplementados con una o más vitaminas. Los hongos superiores lo más frecuentemente no tienen requerimientos de vitaminas.
Las vitaminas son seleccionadas del grupo de tiamina, riboflavina, piridoxal, ácido nicotínico o nicotinamida, ácido pantoténico, cianocobalamina, ácido fólico, biotina, ácido lipoideo, purinas, pirimidinas, inositol, colina y hemina.
Los elementos estructurales y catalíticos y, opcionalmente, las vitaminas son necesarios para el crecimiento del microorganismo, es decir para la formación de la biomasa.
La cantidad de compuestos necesarios, es decir compuestos que comprenden elementos estructurales y catalíticos y, opcionalmente, vitaminas, a ser adicionadas al medio químicamente definido, dependerá fundamentalmente de la cantidad de biomasa a ser formada en el proceso de fermentación. La cantidad de biomasa formada puede variar ampliamente, típicamente desde alrededor de 10 a alrededor de 150 g/l del caldo de fermentación. En general, las fermentaciones que producen una cantidad de biomasa menor que alrededor de 10 g/l no tienen importancia desde el punto de vista industrial.
Además, la cantidad óptima de cada constituyente de un medio definido, así como los compuestos que son esenciales y los no esenciales, dependerán del tipo de microorganismo que se someta a la fermentación en un medio definido, o de la cantidad de biomasa y del producto que se forme. El uso de los medios químicamente definidos de esta manera ventajosamente permiten una variación de la concentración de cada componente del medio independientemente de los otros componentes, posibilitando así la optimización de la composición del medio.
Para la formación del producto, puede que sea necesario suplementar el medio químicamente definido con compuestos adicionales y/o aumentar la concentración de ciertos compuestos ya presentes en el medio químicamente definido por encima del nivel que es necesario para el crecimiento de los microorganismos. La función de dichos compuestos puede ser inducir y/o mejorar la producción de un compuesto deseado por el microorganismo, o hacer que funcionen como un precursor para un compuesto deseado.
Ejemplos de compuestos a ser suplementados y/o a ser adicionados en una cantidad incrementada a un medio químicamente definido son: sulfato en una cantidad incrementada para la producción de compuestos de \beta-lactama, compuestos que contengan nitrógeno en una cantidad incrementada para la producción de aminoácidos, especialmente aminoácidos básicos, ácido fenilacético para la producción de penicilina G, ácido fenoxiacético para la producción de penicilina V, ácido adípico para la producción de adipil-7-ADCA y adipil-7-ACA, ácido propiónico para la producción de eritromicina.
En un proceso de fermentación industrial de acuerdo con la invención, la cantidad total de fuente de carbono adicionada al medio químicamente definido, expresada como cantidad de carbono/litro del medio, puede variar desde 10 a 200 g C/l preferiblemente desde 20 a 200 g C/l.
La cantidad total de fuente de nitrógeno adicionada al medio químicamente definido puede variar desde 0.5 hasta 50 g N/l, preferiblemente desde 1 hasta 25 g N/l, donde N se expresa como nitrógeno de Kjekdahl.
La proporción entre la fuente de carbono y nitrógeno en una fermentación puede variar considerablemente, donde un determinante para la proporción óptima entre la fuente de carbono y de nitrógeno es la composición elemental del producto a ser formado.
Los compuestos adicionales requeridos para el crecimiento de un microorganismo, como el fosfato, el sulfato o los oligoelementos, deben ser adicionados usando los rangos de concentración indicados en la Tabla 1 como una guía. Los rangos de concentración de estos compuestos adicionales pueden variar entre las diferentes clases de microorganismos, es decir entre hongos, levaduras y bacterias.
Generalmente, las concentraciones de vitaminas caen dentro del rango de 0.1 (biotina) a 500 (mio-inositol) mg/l.
Típicamente, la cantidad de componentes del medio necesarios para el crecimiento de un microorganismo puede ser determinado en relación con la cantidad de fuente de carbono usada en la fermentación, ya que la cantidad de biomasa formada será determinada principalmente por la cantidad de fuente de carbono usada.
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TABLA 1 Rangos típicos de concentración de los componentes del medio, conjuntamente con la fuente de carbono y nitrógeno, necesarios para el crecimiento de varias clases de microorganismos (g/l)
Hongo Levaduras Bacteria
(Actinomycetes)
PO_{4}^{1,5} 1-20
SO_{4}^{2,5}
MgSO_{4}.7aq^{3} 0.5-10 0.5-2 0.5-2
CaCl_{2}.2aq^{3} 0.01-0.1 0.1-1 0.05-0.5
FeSO_{4}.7aq^{3} 0.1-1.0 0.1-0.5 0.1-0.5
ZnSO_{4}.7aq^{3} 0.0005-0.1 0.002-1 0.002-0.1
MnSO_{4}.1aq^{3} 0.0005-0.1 0.002-1 0.002-0.1
CuSO_{4}.5aq^{3,4} \leq 0.005 0.001-0.01 0.001-0.01
CoSO_{4}.7aq^{3,4} \leq 0.01 \leq0.01 \leq0.01
Na_{2}MoO_{4}.2aq^{4} \leq 0.0005 0.001-0.005 0.001-0.005
H_{3}BO_{3}^{4} \leq 0.0005 0.001-0.005 0.001-0.005
KI^{4} \leq0.002 \leq0.002
^{1} \begin{minipage}[t]{155mm} La cantidad basal de fosfato necesaria será de 0.5-1% del peso seco de la biomasa. Para los procesos por lote a escala relativamente pequeña, fosfato extra será requerido para el control del pH.\end{minipage}
^{2} El sulfato también puede ser dosificado a través del reactivo de valoración, como el K^{+} y Na^{+}.
^{3} \begin{minipage}[t]{155mm} El sulfato puede ser reemplazado (parcialmente) por cloruro como ión contador en los oligoelementos, o viceversa.\end{minipage}
^{4} \begin{minipage}[t]{155mm} Los límites inferiores son difíciles de definir para algunos oligoelementos. Por ejemplo sus requerimientos pueden conocerse por su presencia en otros componentes del medio, por ejemplo sulfato ferroso, agua, cantidades pequeñas de extracto de levadura, etc.\end{minipage}
^{5} \begin{minipage}[t]{155mm} El fosfato y el sulfato son adicionados como sales de potasio, amonio y/o sodio, con una preferencia de K > NH_{4} > Na.\end{minipage} 
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Un proceso de fermentación industrial de acuerdo a la invención que usa un medio químicamente definido puede ser realizado como un proceso de fermentación por lote, por lote repetido, por lote de alimentación, por lote de alimentación repetido, o como un proceso continuo.
En un proceso por lote, todos los componentes del medio son adicionados al medio directamente, como un todo, antes de comenzar el proceso de fermentación.
En un proceso por lote repetido, tiene lugar una cosecha parcial del caldo acompañada de una suplementación parcial del medio completo, opcionalmente repetida varias veces.
En un proceso por lote de alimentación, ninguno o parte de los compuestos que incluyen uno o más de los elementos estructurales y/o catalíticos es adicionada al medios antes del comienzo de la fermentación y/o todo o la parte remanente, respectivamente de los compuestos que comprenden uno o más de los elementos estructurales y/o catalíticos son alimentados durante el proceso de fermentación. Los compuestos que son seleccionados para la alimentación pueden ser alimentados juntos o separados uno del otro al proceso de fermentación.
Especialmente en un proceso de fermentación donde el medio de fermentación original es diluido alrededor dos veces o más mediante una alimentación de los componentes que comprenden uno o más de los elementos estructurales, la alimentación puede adicionalmente comprender, elementos catalíticos y componentes adicionales del medio, junto a los elementos estructurales.
En un proceso por lote de alimentación repetido o en un proceso de fermentación continua, el medio de partida completo es adicionalmente alimentado durante la fermentación. El medio de partida puede ser alimentado junto con o separado de la(s) alimentación(es) del (de los) elemento(s) estructural(es). En un proceso por lote de alimentación repetido, parte del caldo de fermentación que comprende la biomasa es eliminado a intervalos de tiempo regulares, mientras en un proceso continuo, la eliminación de parte del caldo de fermentación ocurre de manera continua. El proceso de fermentación es de esta manera rellenado con una porción nueva del medio que se corresponde a la cantidad de caldo de fermentación eliminado.
En una realización preferida de la invención, un proceso por lote de alimentación o lote de alimentación repetido es aplicado, donde la fuente de carbono y/o nitrógeno y/o el fosfato son alimentadas al proceso de fermentación. En una realización más preferida, la fuente de carbono y nitrógeno es alimentada al proceso de fermentación. Lo más preferido, la fuente de carbono y nitrógeno, así como el fosfato son alimentados. En este sentido, una fuente de carbono preferida es la glucosa y una fuente de nitrógeno preferida es el amoníaco y/o las sales de amonio.
Típicamente el uso de un proceso por lote de alimentación permite el uso de una cantidad considerablemente superior de fuente de carbono y nitrógeno que la que se usa en un proceso por lotes. Específicamente, la cantidad de fuente de carbono y nitrógeno aplicada en un proceso por lote de alimentación puede ser al menos alrededor de dos veces mayor que la cantidad máxima aplicada en un proceso por lote. Esto, a su vez, conduce a una cantidad considerablemente mayor de biomasa formada en un proceso por lote de alimentación.
Un aspecto adicional de la presente invención concierne a la opción del proceso aguas abajo del caldo de fermentación. Después que finaliza el proceso de fermentación, opcionalmente el producto valioso puede ser recuperado del caldo de fermentación, usando una tecnología estándar desarrollada para el compuesto valioso de interés. La tecnología del proceso aguas abajo relevante a aplicada depende de esta forma de la ubicación natural y celular del compuesto valioso. Ante todo, la biomasa es separada del fluido de fermentación usando por ejemplo centrifugación o filtración. El compuesto valioso entonces es recuperado de la biomasa, en caso de que el producto valioso se haya acumulado dentro o esté asociado a las células microbianas. Por el contrario, cuando el producto valioso es excretado de la célula microbiana, este es recuperado desde el fluido de fermentación.
El uso de un medio químicamente definido en la producción fermentativa industrial de un compuesto valioso de interés produce una gran ventaja en el proceso aguas abajo, ya que la cantidad de bioproductos es sustancialmente menor que cuando se usan medios complejos. Además, la calidad del producto es mejorada, debido a que ningún bioproducto indeseado es co-aislado con el compuesto de interés.
En aún otro aspecto adicional de la presente invención, una cepa apropiada para un proceso de fermentación industrial usando un medio químicamente definido es identificada.
Una cepa microbiana apropiada para un proceso de fermentación industrial, que usa un medio químicamente definido puede ser cualquier cepa de tipo natural que produzca un compuesto valioso de interés, a condición que dicha cepa de tipo natural tenga un buen grado de crecimiento en un medio químicamente definido. Además, una cepa microbiana apropiada para un proceso de fermentación industrial que usa un medio químicamente definido puede ser una cepa que es obtenida y/o mejorada sometiendo una cepa madre de interés a un tratamiento mutagénico clásico o a la transformación del ADN recombinante, también con la condición de que el mutante resultante o la cepa microbiana transformada tenga un buen grado de crecimiento en un medio químicamente definido. Por lo tanto dependerá del grado de crecimiento de la cepa madre en un medio químicamente definido el hecho de que el mutante resultante o las cepas transformadas tengan un grado de crecimiento similar o mejorado en un medio químicamente definido en comparación con aquel de la cepa madre.
Se entiende que una cepa microbiana tendrá un buen grado de crecimiento en un medio químicamente definido si dicha cepa tiene una tasa de crecimiento específico (\mu) en un medio químicamente definido que es \geq 0.05 h^{-1},preferiblemente \geq 0.1 h^{-1}, más preferiblemente \geq 0.2 h^{-1}, lo más preferido 0.4 h^{-1}. El grado de crecimiento de una cepa microbiana en un medio químicamente definido es analizado convenientemente mediante la fermentación de dicha cepa en un medio químicamente definido a una escala relativamente pequeña, por ejemplo en un cultivo en un frasco de agitación y/o una fermentación a escala de laboratorio de 10 L. Es preferido incluir una fermentación a escala de laboratorio de 10 L, con un control de pH, de temperatura y de concentración de oxígeno, en el análisis de dicho grado de crecimiento.
En una realización de la invención, cepas microbianas capaces de ser fermentadas en un medio químicamente definido son obtenidas y/o mejoradas sometiendo una cepa madre de interés a un tratamiento mutagénico clásico usando medios físicos, tales como irradiación UV, o un mutágeno químico apropiado, tal como el N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina o sulfonato de etilmetano. En otra realización de la invención, cepas microbianas que son capaces de ser fermentadas en un medio químicamente definido son obtenidas y/o mejoradas sometiendo una cepa madre de interés a la
tecnología del ADN recombinante, donde la cepa madre es transformada con uno o más genes funcionales de interés.
En general, la presente invención prevé dos grupos de cepas madres de interés que serán sometidas a la mutagénesis clásica y/o a la transformación del ADN. En una realización de la invención, una cepa madre de interés es seleccionada del grupo de cepas que tienen un buen grado de crecimiento en un medio químicamente definido, pero que necesita ser mejoradas con respecto a su nivel de producción de un compuesto de interés. En otra realización de la invención, una cepa madre de interés es seleccionada del grupo de cepas que tiene un nivel de producción alto de un compuesto de interés, pero que tiene un grado de crecimiento relativamente malo en un medio químicamente definido. Se considera que las cepas microbianas con una tasa de crecimiento específico menor a alrededor de 0.05 h^{-1} tienen un grado de crecimiento relativamente malo en un medio químicamente definido.
Ambos procesos, el tratamiento mutagénico clásico así como el proceso de transformación de ADN, son seguidos por una clasificación de los transformantes o mutantes resultantes por su grado de crecimiento en un medio químicamente definido así como por su nivel de producción de un compuesto de interés. Las cepas mutantes o los transformantes son seleccionados que tengan un buen grado de crecimiento en un medio químicamente definido y/o un mejor nivel de producción mejorado de un compuesto de interés en comparación con la cepa madre.
Debe ser notado que algunas cepas microbianas, en particular cepas industriales, que ya han sido sometidas a un tratamiento mutagénico extensivo para mejorar sus niveles de producción, pueden tener un mal desempeño o puede que no crezcan en lo absoluto en un medio químicamente definido. Tal mal desempeño o la falta de crecimiento de una cepa mutagenizada puede ser provocado por el hecho de que el crecimiento en un medio químicamente definido nunca fue aplicado como un criterio para la selección de mutantes apropiados. Por ejemplo, es posible que una cepa mutagenizada
posea una mutación que provoque un requerimiento de crecimiento desconocido (mutación auxotrópica desconocida).
Cepas microbianas que son apropiadas para la fermentación industrial usando un medio químicamente definido incluyen las cepas filamentosas y no filamentosas. Por ejemplo, cepas microbianas que son apropiadas para la fermentación en un medio químicamente definido incluyen cepas de hongos, tales como Aspergillus, Penicillium o Mucorales, cepas de levadura, tales como cepas Saccharomyces, Pichia, Phaffia o Kluyveromyces y cepas bacterianas, tal como Actinomycetes. El uso del medio químicamente definido de acuerdo a la invención es especialmente ventajoso para la fermentación industrial de microorganismos filamentosos.
El proceso de acuerdo a la invención que usa un medio químicamente definido es apropiado para la producción fermentativa a una escala industrial de cualquier compuesto valioso de interés, incluyendo los metabolitos primarios o secundarios, péptidos o proteínas farmacéuticas, o enzimas industriales. Los compuestos valiosos preferidos son los metabolitos secundarios, tal antibióticos o compuestos \beta-lactama, especialmente los antibióticos \beta-lactama.
Ejemplos de combinaciones producto-cepa incluyen A. niger, por ejemplo A. niger CBS 513.88, para amiloglucosidasa, A. oryzae para \alpha-amilasa, A. terreus, por ejemplo A. terreus CBS 456.95, para lovastatina, Mortierella alpina para ácido araquidónico o lípido que contiene ácido araquidónico, Mucor miehei para proteasa, P. chrysogenum, por ejemplo P. chrysogenum CBS 455.95 u otras cepas apropiadas, para los compuestos \beta-lactama (penicilina G o V), Streptomyces clavuligerus, por ejemplo S. clavuligerus ATCC 27064, para ácido clavulánico, Pichia ciferrii, por ejemplo P. ciferrii NRRL Y-1031 F-60-10, para tetracetil-fitosfingosina, Phaffia rodozima, por ejemplo P. rodozima CBS 6938, para astaxantina, Sacaropoliespora eritraea para eritromicina, K. lactis para lactasa, Streptomyces natalensis para natamicina.
La presente invención también considera el uso de cepas microbianas que son transformadas con uno o más genes funcionales de interés, que trae como resultado una cepa transformada que puede sobre-expresar un producto que ya es producido por dicha cepa, o trae como resultado una cepa transformada que puede expresar un producto que no es producido de forma natural por dicha cepa.
De esta manera se deja a elección de la persona experta qué cepa será seleccionada para la transformación, a condición de que dicha cepa seleccionada tenga un buen grado de crecimiento en un medio químicamente definido. Por ejemplo, una cepa puede ser seleccionada para la transformación que ya ha sido sometida a uno o más tratamientos mutagénicos. Alternativamente, una cepa no mutagenisada o de tipo natural puede ser seleccionada. Junto al análisis del nivel de expresión de un compuesto deseado, los transformantes obtenidos después de la transformación de una cepa seleccionada con uno o más genes funcionales de interés deben ser analizados por su grado de crecimiento en un medio químicamente definido.
Ejemplos de cepas recombinantes que producen un producto que de manera natural no son producidos por dicha cepa son:
\bigstar
Streptomyces lividans, por ejemplo S. lividans TK21, que contiene un casete de expresión que permite la expresión de glucosa isomerasa, el gen que codifica para la glucosa isomerasa originándose a partir de por ejemplo Actinoplanes missouriensis,
\bigstar
Penicillium chrysogenum, por ejemplo P. chrysogenum CBS 455.95, que contiene uno o más casetes de expresión que permiten la expresión de una expandasa, y opcionalmente, una hidroxilasa y/o una acetiltransferasa, los genes que codifican para la expandasa, hidroxilasa y acetiltransferasa originándose a partir de por ejemplo Acremonium chrysogenum o Streptomyces clavuligerus, permitiendo la producción de compuestos de cefalosporina, tales como el 7-ADCA ó 7-ACA, usando ácido adípico (ver EP 532341) o ácido 3-carboximetiltio-propiónico (vea WO95/04148) como precursor de la cadena lateral,
\bigstar
Aspergillus níger, por ejemplo Aspergillus níger CBS 513.88, que contiene un casete de expresión que permite la expresión de lactoferrina humana (vea WO93/22348) o de quimosina bovina.
\bigstar
Kluyveromyces lactis, que contiene un casete de expresión que permite la expresión de la quimosina bovina o fosfolipasa A_{2,} insulina o albúmina humana recombinante.
Ejemplos de cepas recombinantes que sobre-producen una enzima ya producida por dicha cepa, son:
\bigstar
A. niger, por ejemplo A. niger CBS 513.88, que contiene un casete de expresión que permite la sobre-expresión de fitasa (ver EP 420358) o de endoxilanasa I (ver EP 463706).
La presente invención es ejemplificada por un proceso de fermentación a escala industrial usando un medio químicamente definido para la producción de glucosa isomerasa por una cepa de Streptomyces recombinante, y por el uso ventajoso de medios químicamente definidos para una fermentación de Penicillium a gran escala en comparación con los medios complejos.
Ejemplos adicionales están dirigidos a medios químicamente definidos que pueden ser usados para medir el grado de crecimiento y la productividad de una cepa de interés cuando es cultivada en dicho medio a pequeña escala, para identificar las cepas microbianas que son apropiadas para la producción fermentativa de un compuesto valioso a escala industrial en un medio químicamente definido.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Esquema de pWGx.GIT.
Figura 2. Desarrollo de una glucosa isomerasa total producida durante la fermentación.
Ejemplo 1
Producción industrial de glucosa isomerasa usando Streptomyces lividan Construcción de una cepa de Streptomyces que produce glucosa isomerasa
El gen de la glucosa isomerasa de Actinoplanes missouriensis fue clonado originalmente como un fragmento ADN de 5.0 kb en la cepa K12 de E. coli JM101.
Un fragmento de 1.7 kb dentro del fragmento de 5.0 kb, fue encontrado que representa la secuencia de codificación completa de glucosa isomerasa de A. missouriensis y su región reguladora aguas arriba (ver también a Amore y Hollenbert (1989), Nucl. Acids Res. 17, 7515).
Un mutante de glucosa isomerasa que exhibe termo-estabilidad mejorada fue obtenido cambiando dentro del gen de la glucosa isomerasa la tripleta AAG que codifica para la lisina en la posición 253 de la proteína de glucosa isomerasa por la CGG que codifica para la arginina (Quax y otros (1991), Bio/Technology 9, 738-742).
Para la clonación el plásmido pIJ486 de Streptomyces fue usado como un vector (Ward y otros (1986), Mol. Gen. Genet. 203, 468-478). El fragmento de ADN del par base 1737 de A. missouriensis que codifica para la glucosa isomerasa fue combinado con el fragmento de ADN largo Pst I de pIJ486. El plásmido resultante, llamado pWGx.GIT contenía esencialmente la región de replicación del plásmido pIJ101, el gen resistente a la tiostreptona, y el fragmento de ADN de A. missouriensis que codifica para GIT. Un mapa esquemático de pWGx.GIT es dado en la Figura 1.
La cepa que produce glucosa isomerasa fue costruida mediante la transformación de la cepa TK21 de Streptomyces lividans (Hopwood y otros (1985), Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, Inglaterra) con el plásmido pWGx.GIT.
Producción industrial de glucosa isomerasa
Un banco de células de trabajo de una cepa de producción construida como se mencionó en el Ejemplo 1 fue preparada tomando una colonia resistente a la tiostreptona y cultivándola en 20 ml de Caldo de Tryptone Soytone que contiene tiostreptona (50 mg/L) en un frasco de agitación de 100 ml a 30ºC durante 40-48 horas y agitando
280 rpm.
El micelio equivalente a 1 ml del banco de células de trabajo (fresco o almacenado como micelio congelado a -80ºC) es inoculado en 100 ml de un medio de crecimiento inóculo en un frasco de agitación de 500 ml, que contiene 16 g/L de Bactopeptona (Difco 0123/01), 4 g/L de Bacto soitona (Difco 0436/01), 20 g/L de hidrolizado de Caseína (Merck 2239), 10 g/L de fosfato de dipotasio.3aq (Merck. Reactivo de Anal.), 16.5 g/L de glucosa.laq, 0.6 g/L de aceite de soja y 50 mg/L de tiostreptona. El pH del medio es ajustado a 7.0 con hidróxido de sodio y/o ácido sulfúrico antes de la esterilización. La glucosa y la tiostreptrona son adicionadas por separado después de la esterilización, la Tiostreptona se disuelve en DMSO en una concentración de 50 g/l y se filtra esterilizada a través de un filtro de Nalgene 0.2 \mum. El cultivo es cultivado durante 24 horas a 30ºC en un agitador de incubadora a 280 rpm.
50 ml del cultivo completamente crecido es transferido a 6 L del medio de crecimiento inóculo de la segunda fase que tiene una composición similar al medio mencionado previamente, con excepción de una doble concentración de glucosa (33 g/L de glucosa.laq), antiespumante extra (SAG5693, 0.6 g/L; un antiespumante de silicio de la compañía Basildon) y sin tiostreptona. La glucosa es esterilizada de nuevo por separado en una solución al 50% y adicionada después de la esterilización del medio (60 minutos, 121ºC). El cultivo es cultivado durante 36 horas en una columna de burbujas esterilizada aireada con 840 L de aire esterilizado/h con un inyector que contiene 4 orificios con un diámetro de 2 mm y la temperatura es mantenida a 22ºC. Alternativamente, esta fase puede llevarse a cabo en frascos de agitación (por ejemplo, 12x 500 ml del medio en frascos Erlenmeyer con deflector de 2 L) con proporciones de inoculación similares y agitadas a 280 rpm en un incubador agitador orbital.
El cultivo completamente crecido es transferido asépticamente a un fermentador inóculo que contiene 4.5 m^{3} del medio inóculo que contiene 16.3 kg de ácido cítrico.laq, 70.8 gr de sulfato ferroso.7aq, 109 gr de sulfato de zinc.7aq, 109 gr de sulfato de manganeso.laq, 32.7 gr de dicloruro de cobalto.6aq, 5.45 gr de molibdato de disodio.2aq, 5.45 gr de ácido bórico, 5.45 gr de sulfato de cobre.5aq, 10.9 kg de sulfato de diamonio, 10.9 kg de sulfato de magnesio.7aq, 463 gr de cloruro de calcio.2aq, 1090 gr de aceite de soja, 21.8 kg de fosfato de monopotasio y 139 kg de glucosa.1aq y 5.9 kg de extracto de levadura (levadura para la fabricación de cerveza con 10% de nitrógeno Kjeldahl en base al peso seco). El medio se prepara como sigue: todos los componentes excepto la glucosa son cargados en la secuencia indicada en aproximadamente 2700 L de agua corriente. El pH es fijado en 4.5 con hidróxido de sodio y/o ácido fosfórico y el medio es esterilizado a 122ºC durante 60 minutos. La glucosa es esterilizada en 1000 L de agua a pH 4.5 durante 60 minutos a 122ºC en un recipiente separado. Después de enfriadas ambas porciones, la glucosa es transferida asépticamente al recipiente inóculo. Después de la mezcla de ambas porciones el pH es ajustado en 7.0 con amoníaco y el volumen es ajustado con agua esterilizada a 4.5 m^{3}. La temperatura de la fermentación es controlada a 30ºC y el fermentador es aireado a 0.5-1.0 vvm, mientras el pH es mantenido a 7.0 +/- 0.1 con amoníaco gaseoso y la sobre-presión es mantenida a 1.3-1.4 bar. La espuma es controlada si es necesario con una mezcla esterilizada de aceite de soja y antiespumante de silicio, como el SAG5693, en una proporción de 3:1. La concentración de oxígeno es mantenida por encima de 25% de la saturación del aire ajustando la velocidad del agitador (0.5 a 3 Kw/ m^{3}). El cultivo es transferido a la fermentación principal antes de que se consuma toda la glucosa (al igual que en todas las fases de crecimiento previas) y antes de que la tasa de entrada de oxígeno exceda el nivel de 30 mmol/l del volumen.h. de caldo.
El medio de fermentación principal contiene 245.1 kg de ácido cítrico.1aq, 1062 gr de sulfato ferroso.7aq, 1634 gr de sulfato de zinc.7aq, 1634 gr de sulfato de manganeso.1aq, 490 gr de dicloruro de cobalto.6aq, 82 gr de molibdato de disodio.2aq, 82 gr de ácido bórico, 82 gr de sulfato de cobre.5aq, 163.4 kg de sulfato de di-amonio, 163.4 kg de sulfato de magnesio.7aq, 6.94 kg de dicloruro de calcio.2aq, 16.3 kg de aceite de soja, 327 kg de fosfato de monopotasio, 880 kg de extracto de levadura para cerveza (10% Kj-N en base al peso seco) y 556 kg de glucosa.1aq. El medio es preparado como es descrito para la fermentación inócula (la glucosa se esteriliza por separado). Para la glucosa un sirope de azúcar DE-95 puede ser usado alternativamente. El volumen del medio antes de la inoculación es de 65 m^{3} después que se corrija el pH a 7.0 con amoníaco.
Una alimentación de glucosa es preparada a 275 a 550 g de glucosa/L de solución de alimentación, ya sea como glucosa.1aq o como equivalentes de glucosa de un sirope DE >90. El pH es ajustado a 4.5-5.0 con una solución de ácido fosfórico. La esterilización es hecha por lote (122ºC, 45 minutos) o de manera continua mediante un choque de calor o un conjunto de filtros.
La fermentación principal es controlado a 30ºC +/- 0.5 y pH 7.0 +/- 0.1 (mediante un control de pH usando amoníaco y ácido fosfórico). El flujo de aire es fijado a 0.5-1.5 vvm, preferiblemente 0.7 vvm, la sobrepresión es de 0.5-1.5 bar y el fermentador es agitado con turbinas de Rushton a una intensidad de 0.5 a 3 Kw/m^{3} para evitar que la concentración de oxígeno disminuya a menos de 0.2 mmol/L, medida en la altura inferior del agitador. La alimentación de glucosa comienza cuando tiene lugar un descenso repentino de la tasa de entrada de oxígeno, y aumenta la concentración de oxígeno disuelto, así como el pH que aumenta de 6.9 a 7.1. En este momento, la concentración de glucosa en el caldo debería ser de <<0.2 g/L.
La tasa de alimentación de glucosa es equivalente a 93 kg de glucosa/h aumentando inicialmente de manera lineal a 186 kg/h en 64 horas después de iniciado la alimentación. Después de 100 horas de alimentación a 186 kg/h la tasa de aliemtación es aumentada a 298 kg de glucosa/h hasta aproximadamente las 200 horas de alimentación.
La espuma es controlada dosificando aceite de soja estéril a 5.5 kg/h o alternativamente en disparos de 45 kg cada 8 horas durante las primeras 100 horas de la fermentación. Si fuera necesario un control adicional de la espuma es efectuado con una mezcla de aceite de soja y un antiespumante de silicio como el SAG471 (antiespumante de silicio de Basildon) en una proporción de 3:1.
La concentración de amoníaco es mantenida entre 750 y 1500 mg/L midiendo cada 12 horas y adicionando sulfato de amonio estéril en porciones equivalentes a 500 mg de amoníaco/L, tan pronto como el nivel haya descendido por debajo de 1000 mg/L.
La concentración de fosfato en el filtrado del cultivo debe ser mantenida por encima de 500 mg PO_{4}/L adicionando fosfato de monopotasio estéril en porciones equivalentes a 500 mg/L.
La producción de glucosa isomerasa puede ser medida como proteína cosechada y purificada a partir del caldo seguida por los métodos de determinación de la proteína conocidos en el arte o ensayados en un ensayo enzimático aplicado en una muestra de caldo estabilizada. Las muestras de caldo son estabilizadas pesando 2 gr de caldo y adicionando 5 ml de solución estabilizadora que contiene 12 g/L de trishidroximetilaminometano y 2.4 g/L de CoCl_{2}.6aq que es subsiguientemente calentada durante 30 minutos a 73ºC. Después de enfriar 0.42 ml de muestra estabilizada son mezclados con 0.8 ml de solución de glucosa (que contiene 27.25 g/L de Tris/buffer de HCl pH 8.2, 67.56 g/L de glucosa, MgCl_{2.}6aq, 22,33 g/L Na_{2}-EDTA.2aq y 5 mg/L Triton X-100) e incubada a 60ºC. La actividad es determinada midiendo las tasas de conversión de glucosa en fructosa y expresada en GU/g. (1 GU es la cantidad de enzima requerida para la formación de 1 \mumole de fructosa/min.). Usando la actividad específica de 12 Unidades por mg de proteína, la cantidad de proteína por kg de caldo puede ser determinada.
En la Figura 2 la cantidad total de enzima producida es indicada.
Como es demostrado en este ejemplo 850 kg de la enzima pueden ser fabricados en un ciclo de producción por lote de alimentación.
Ejemplo 2
Producción de penicilina V
Las conidiosporas de un P. chrysogenum CBS 455.95 (u otra cepa apropiada derivada de Wisconsin 54.1255 por mutación y selección para mayor productividad, preferiblemente en la receta que aparece a continuación) son inoculadas a 10E5-10E6 conidia/ml en un medio de producción que contiene (g/l): glucosa.H_{2}O, 5; lactosa.H_{2}O, 80; (NH_{2})_{2}CO, 4.5; (NH_{4})_{2}SO_{4,} 1.1; Na_{2}SO_{4}, 2.9; KH_{2}PO_{4}, 5.2; K_{2}HPO_{4.}3H_{2}O_{,} 4.8;_{ }solución de oligoelementos (ácido cítrico.H_{2}O, 150; FeSO_{4.}7H_{2}O, 15; MgSO_{4}.7H_{2}O, 150; H_{3}BO_{3,} 0.0075_{;} CuSO_{4.}5H_{2}O, 0.24; CoSO_{4}.7H_{2}O, 0.375; ZnSO_{4}.7H_{2}O, 1.5; MnSO_{4}.H_{2}O, 2.28; CaCl_{2.}2H_{2}O, 0.99), 10 (ml/l); 10% solución de fenoxiacetato de potasio, pH 7, 75 (ml/l). (pH antes de la esterilización 6.5).
El cultivo es incubado a 25ºC en un agitador orbital a 280 rpm durante 144-168 horas. Al finalizar esta fermentación, el micelio es eliminado por centrifugación o filtración y se cuantifica la cantidad, y el medio es ensayado para la penicilina formada por métodos de HPLC bien conocidos en el arte.
Ejemplo 3
Fermentación de Penicillium a gran escala con medios definidos y complejos
El Penicillium chrysogenum Wisconsin 54.1255 fue optimizado para el cultivo y la producción de penicilina en un medio químicamente definido por mutación y selección en medio definido como se describió en el Ejemplo 2. Se realizaron fermentaciones por lote de alimentación a escala de 60 m^{3} con un medio complejo como lo describió Hersbach y otros (Biotechnology of Industrial Antibiotics pp 45-140, Marcel Dekker Inc. 1984, Tabla 4, Medio B, que incluye las sales como se menciona en el Medio A) que contiene 50 kg/m^{3} de Sólidos de Maíz Macerado. Paralelamente a esto, una fermentación fue llevada a cabo en un medio definido como es dado en el Ejemplo 2, donde las dosificaciones fueron dobladas debido al carácter elevado de la densidad celular de estas fermentaciones por lote de alimentación mientras la lactosa y la urea fueron omitidas. La glucosa fue alimentada al fermentador manteniendo la concentración de glucosa por debajo de 2g/L para evitar la represión de la glucosa. Amonio, sulfato de di-amonio y ácido fenilacético fueron alimentados al fermentador con el fin de controlar el pH y las concentraciones de amonio, sulfato y ácido fenilacético en los rangos deseados (Hersbach 1984).
Debido a que la transferencia de oxígeno es un parámetro importante que determina la factibilidad económica de un proceso de fermentación industrial, el resultado del proceso de fermentación anterior fue analizado determinando la magnitud de la transferencia de oxígeno en cada proceso.
Una buena medida de la transferencia de oxígeno obtenida en un proceso de fermentación es el valor relativo de k_{L}a determinado dentro de un sistema. k_{L}a es definido como el coeficiente de transferencia de oxígeno y se calcula de acuerdo a van't Riet y Tramper (Basic Bioreactor Design, Marcel Dekker Inc. (1991), pp. 236-273).
La capacidad de transferencia de oxígeno calculada como el valor de k_{L}a fue encontrado que está entre el 10 y 20% superior en el medio químicamente definido que en el medio complejo, durante la parte principal de la fermentación.
Ejemplo 4
Producción de 7-ADCA
El proceso descrito en el Ejemplo 2 es modificado mediante el uso de un P.chrysogenum CBS 455.95 (u otras cepas apropiadas derivadas del Wisconsin 54.1255 por mutación y selección para una mayor productividad, preferiblemente en la receta establecida a continuación) el cual es transformado con un casete de expresión de expandasa donde la región de codificación de la expandasa está provista del promotor IPNS, como se describe en EP 532341, y usando una solución de adipato de potasio al 10% en lugar de fenoxiacetato y usando una modificación del medio antes mencionado que contiene 400 ml de una solución de adipato de potasio al 10%, pH 5.5 en lugar de fenoxiacetato (pH del medio antes de la esterilización 5.5 en lugar de 6.5).
El adipoil-7-ADCA resultante subsiguientemente es convertido a 7-ADCA usando el proceso de deacilación enzimática esencialmente como es descrito en el Ejemplo 4 o 5 de WO95/04148.
Ejemplo 5
Producción de lovastatina
Las conidioesporas o la cepa de Aspergillus terreus CBS 456.95 (o cepas derivadas de las mismas por mutación o selección para mayor productividad, preferiblemente en cualquiera de las recetas establecidas a continuación) son inoculadas a 10E5-10E6 conidia/ml en un medio de producción que contiene (g/l): dextrosa, 40; CH_{3}COONH_{4}, 2.2; Na_{2}SO_{4}, 4; KH_{2}PO_{4}, 3.6; K_{2}HPO_{4}.3H_{2}O, 35.1; solución de los oligoelementos (ver anteriormente, Ej. 2), 10 (ml/l).
El cultivo es incubado a 28ºC en un agitador orbital a 220 rpm durante 144-168 horas. Al final de la fermentación, el micelio es eliminado por centrifugación o filtración y se cuantifica la cantidad, y el medio es ensayado para lovastatina formada por métodos de HPLC bien conocidos en el arte.
Ejemplo 6
Producción de ácido clavulánico
La cepa de Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 o un mutante de la misma es inoculada en un medio de precultivo que consiste de (g/l): (NH_{4})2SO_{4,} 2.75; KH_{2}PO_{4,} 0.5; MgSO_{4.}7H_{2}O, 0.5; CaCl_{2.}2H_{2}O, 0.01; 3-(N-morfolino), ácido propanosulfúrico, 21; glicerol, 19.9; succinato de sodio, 5.5; solución de oligoelementos; (ZnSO_{4}.7H_{2}O, 2.8; citrato de amoniaco férrico, 2.7; CuSO_{4}.5H_{2}O, 0.125; MnSO_{4}.H_{2}O, 1; CoCl_{2}.6H_{2}O, 0.1; Na_{2}B_{4}O7.10H_{2}O, 0.16; Na_{2}MoO_{4}.2H_{2}O, 0.054), 0.06 (ml/l).
El cultivo es incubado en un agitador orbital a 220 rpm a 28ºC durante 48-72 horas y usado para inocular 20 volúmenes de un medio de producción que contiene (g/l): (NH_{4})2SO_{4}, 2; asparagina, 4; KH_{2}PO_{4}, 1.5; MgSO_{4}.7H_{2}O, 0.5; CaCl_{2}.2H_{2}O, 0.01; 3-(N-morfolino), ácido propanosulfónico, 21; glicerol, 19.9; succinato de sodio, 5.5; solución de oligoelementos (ver anteriormente), 0.06 (ml/l); FeSO_{4}.7H_{2}O, 0.5; MnCl_{2}.4H_{2}O, 0.1; ZnSO_{4}.7H_{2}O, 0.1.
La incubación es continuada durante 144 horas, preferiblemente en un frasco Erlenmeyer de 500 ml con deflectores, que contiene 50 ml de volumen de cultivo. Al finalizar la fermentación, el micelio es eliminado por centrifugación o filtración y se cuantifica la cantidad, y el filtrado es ensayado por métodos de HPLC bien conocidos en el arte.
Ejemplo 7
Producción de amiloglucosidasa
La cepa de Aspergillus níger CBS 513.88 o un mutante de la misma es inoculada a 10^{5}-10^{6} condioesporas/ml en un medio de germinación que consiste de (g/l): K_{2}HPO_{4}.3H_{2}O, 0.75; KH_{2}PO_{4,} 6.6_{;} Na3citrato.3H_{2}O, 5.3; ácido cítrico.H_{2}O, 0.45; glucosa.H_{2}O, 25; (NH_{4})2SO_{4}, 8; NaCl, 0.5; MgSO_{4}.7H_{2}O, 0.5; FeSO_{4}.7H_{2}O, 0.1; ZnSO_{4}.7H_{2}O, 0.05; CaCl_{2}, 0.005; CuSO_{4.}5H_{2}O, 0.0025; MnSO_{4}.4H_{2}O, 0.0005; H_{3}BO_{3}, 0.0005; Na_{2}MoO_{4}.2H_{2}O, 0.0005; EDTA, 0.13; Tween80,3. Si es necesario, 50\mug/ml de arginina y/o prolina pueden ser adicionados para mejorar la germinación.
El cultivo se incuba en un agitador orbital durante 48-72 horas a 33ºC, 295 rpm y luego usado para inocular 10-20 volúmenes de un medio de producción que consiste de (g/l): KH_{2}PO_{4}, 1-5; NaH_{2}PO_{4}.H_{2}O, 0.5; Na3citrato.3H_{2}O, 53; ácido cítrico.H_{2}O, 4.05; polímeros de dextrosa 70; (NH_{4})2SO_{4}, 8; (NaCl, MgSO_{4}.7H_{2}O, FeSO_{4.}7H_{2}O, ZnSO_{4}.7H_{2}O, CaCl_{2}, CuSO_{4.}5H_{2}O, MnSO_{4}.4H_{2}O, H_{3}BO_{3}, Na_{2}MoO_{4}.2H_{2}O, EDTA): el mismo del medio de germinación.
La incubación es continuada durante 96 horas, preferiblemente en un frasco Erlenmeyer de 500 ml, que contiene 100 ml del medio. Al finalizar la fermentación, el micelio es eliminado por centrifugación o filtración y se cuantifica la cantidad y el filtrado es ensayado para una actividad amilolítica.
Ejemplo 8
Producción de astaxantina
La cepa de Phaffia rhodozyma CBS 6938 o un mutante de la misma es inoculada en 25 ml de un medio de precultivo que contiene (g/l) de extracto de levadura, 10; peptona, 20; glucosa, 20.
El cultivo es incubado durante 72 horas a 20ºC, en un frasco Erlenmeyer de 100 ml con deflector, en un agitador orbital a 275 rpm.
1 ml del precultivo es entonces usado para inocular 100 ml de un medio de producción que contiene (g/l): glucosa, 30; NH_{4}Cl, 4.83; MgSO_{4}.7H_{2}O, 0.88; NaCl, 0.06; CaCl_{2}.6H_{2}O, 0.15; solución de oligoelementos (ácido cítrico.H_{2}O, 50; (NH_{4})2Fe(SO_{4})2.6H_{2}O, 90; ZnSO_{4}.7H_{2}O, 16.7; CuSO4.5H_{2}O, 2.5; MnSO_{4.}4H_{2}O, 2; H_{3}BO_{3}, 2; Na_{2}MoO_{4}.2H_{2}O, 2; KI, 0.5; en 0.4N H_{2}SO_{4}), 0.3 (ml/l); solución de vitaminas (mio-inositol, 40; ácido nicotínico, 2;
Ca-D-pantotenato, 2; vitamina B1, 2: ácido p. aminobenzoico, 1.2; vitamina B6, 0.2; biotina 0.008; en 0.07N H_{2}SO_{4}) 1-5 (ml/l); plurónico, 0.04; KH_{2}PO_{4}, 1; ftalato de hidrógeno potasio, 20 (pH antes de la esterilización
5.4).
La incubación es continuada durante 96 horas preferiblemente en un frasco Erlenmeyer de 500 ml con deflector. Al finalizar la fermentación, el contenido de astaxantina de la biomasa (cantidad cuantificada) es determinado mediante la extracción del solvente y se mide la densidad óptica del extracto a 470-490 nm.
Ejemplo 9
Producción de ácido araquidónico
Un frasco de 1 ml de una suspensión de la cepa de Mortierella alpina ATCC 16266 almacenada a -80ºC es abierto asépticamente y el contenido es usado para inocular 500 ml de un medio de producción que contiene (g/l):
glucosa, 70; extracto de levadura 0.5; NH_{4}NO_{3} 3.0; KH_{2}PO_{4} 7.2; MgSO_{4}.7H_{2}O 1.5; solución de oligoelementos (ácido cítrico.H_{2}O 50; (NH_{4})_{2}Fe(SO_{4})2.6H_{2}O, 90; ZnSO_{4}.7H_{2}O, 16.7; CuSO_{4}.5H_{2}O, 2.5; MnSO_{4.}4H_{2}O, 2; H_{3}BO_{3}, 2; Na_{2}MoO_{4}.2H_{2}O, 2; KI, 0.5; en 0.4N H_{2}SO_{4}), 0.3 (ml/l); (pH antes de la esterilización 7.0).
El cultivo es incubado en un frasco de agitación de 2 litros con deflectores, a 25ºC durante 72 horas en un agitador orbital a 250 rpm. Al finalizar la fermentación, la cantidad de biomasa y el contenido de ácido araquidónico de la biomasa es determinado, después de la centrifugación, el secado por congelación y la extracción del solvente, utilizando métodos GC bien conocidos en el arte.
Ejemplo 10
Producción de eritromicina
La cepa de Saccharopolyspora erithraea NRRL2338 o un mutante de la misma (seleccionada para mayor productividad, preferiblemente en la receta establecida a continuación) es inoculada en 25 ml de un medio de precultivo que contiene (g/l):
Almidón soluble, 15; NaCl, 5; harina de soja, 15; CaCO_{3}, 10; Extracto de levadura, 5, Sólidos de maíz macerado, 5; CoCl_{2}.6H2O, 670 \mul de una solución de 1 g/l.
El cultivo es incubado en un frasco de agitación de 100 ml sin deflectores a 32-34ºC durante 3 días en un incubador agitador a 250 RPM.
0.4 ml del cultivo son inoculados en 25 ml de un medio de producción estéril que contiene (g/l):
Ácido cítrico.H_{2}O, 2; (NH_{4})_{2}SO_{4,} 2; MgSO_{4}.7H_{2}O, 2; CaCl_{2}.2H_{2}O, 0.085; KH_{2}PO_{4}, 0.25; HEPES (= N-(2-hidroxietilo)piperazina-N'-(2-ácido etanosulfónico)), 5; Glucosa, 1.5; Almidón soluble, 20; Aceite de soja, 0.4; solución de oligoelementos (gramo en 250 ml de agua destilada: Ácido cítrico.H_{2}O, 62.5, FeSO_{4}.7H_{2}O, 0.8215; CuSO_{4}.5H_{2}O, 0.0625; CoCl_{2}.H_{2}O, 0.375; H_{3}BO_{3}, 0.0625; ZnSO_{4.}7H_{2}O, 1.25; MnSO_{4.}H_{2}O, 1.25; Na_{2}MoO_{4}.2H_{2}O, 0.0625), 3.6 ml/l. pH=7.0. A cada frasco, 0.25 ml de n-propanol son adicionados.
El cultivo es incubado en un frasco de agitación de 100 ml con deflectores a 32-34ºC durante 5 días en un incubador agitador a 300 RPM. Al finalizar la fermentación, el caldo es centrifugado y se cuantifica la cantidad de biomasa. El contenido de la eritromicina del sobrenadante se mide por métodos de HPLC conocidos en el arte.
Ejemplo 11
Producción de \beta-caroteno
Una suspensión de espora de Blakeslea trispora CBS 130.59 es usada para inocular 114 ml del medio de precultivo (extracto de levadura 10 g/l; peptona 20 g/l; glucosa 20 g/l) en un frasco de agitación de 500 ml sin deflectores. El precultivo es incubado durante 42 h en un agitador rotatorio a 250 rpm a 26ºC. La biomasa es cosechada por filtración, y se lava 3 veces con 100 ml de agua desmineralizada estéril para eliminar los componentes del medio de precultivo. Subsiguientemente la biomasa es homogenizada por mezclado, hasta que sólo queden pequeños fragmentos, y es resuspendida en 40 ml de agua desmineralizada.
El medio de producción es preparado en porciones de 100 ml en frascos de agitación de 500 ml con deflectores. La composición del medio de producción es como sigue (en g/l): glucosa, 40; monohidrato de asparagina, 2; KH_{2}PO_{4,} 0.5; MgSO_{4}.7H_{2}O, 0.25. Además una solución de oligoelementos (0.3 ml/l) es adicionada con la siguiente composición (en g/l): ácido cítrico.H_{2}O, 50; (NH_{4})_{2}Fe(SO_{4})_{2}.6H_{2}O, 90; ZnSO_{4}.7H_{2}O, 16.7; CuSO_{4}.5H_{2}O, 2.5; MnSO_{4.}4H_{2}O, 2; H_{3}BO_{3}, 2; Na_{2}MoO_{4}.2H_{2}O, 2; KI, 0.5; en 0.4N H_{2}SO_{4}. Antes de la esterilización el pH del medio es ajustado a 6.2. Los frascos son esterilizados durante 20 minutos a 120ºC, y después de la esterilización 0.05 ml de una solución de 1 mg/ml de hidrocloruro de tiamina en agua desmineralizada (esterilizada por filtración) son adiciondados.
Los cultivos de producción son inoculados con 0.5 a 10 ml de la suspensión del micelio fragmentado preparado anteriormente. Los cultivos son incubados durante 139 h en un agitador rotatorio (250 rpm; 26ºC). La biomasa fúngica es cosechada por filtración, lavada con agua desmineralizada para eliminar los componentes del medio y se cuantifica.
La cantidad de \beta-caroteno producida es determinada mediante la extracción de acetona y la medición de la extinción a 450 nm de la fracción de acetona en un espectrofotómetro.

Claims (18)

1. Un proceso para la producción de un compuesto de \beta-lactama, que comprende los pasos de:
\bigstar
fermentación de una cepa microbiana filamentosa a una escala industrial en un medio de fermentación que es un medio químicamente definido esencialmente compuesto de constituyentes químicamente definidos, y
\bigstar
recuperación del compuesto de \beta-lactama del caldo de fermentación.
2. El proceso de la reivindicación 1, donde el medio químicamente definido contiene una cantidad de una fuente compleja de carbono y/o nitrógeno de a lo máximo alrededor de 10% del total de la cantidad de carbono y/o nitrógeno (Kjeldahl N) que está presente en el medio químicamente definido.
3. El proceso de la reivindicación 1 o 2, donde los constituyentes químicamente definidos del medio químicamente definido comprenden una fuente de carbono seleccionada del grupo que consiste de carbohidratos como glucosa, lactosa, fructosa, sacarosa, maltodextrina, almidón e inulina, glicerol, aceites vegetales, hidrocarburos, alcoholes tales como el metanol y el etanol, ácidos orgánicos tales como el acetato y los ácidos alcanoicos superiores, y una fuente de nitrógeno seleccionada del grupo que consiste de urea, amoníaco, nitrato, sales de amonio, tales como el sulfato de amonio, el fosfato de amonio y el nitrato de amonio, y aminoácidos tales como el glutamato y la lisina.
4. El proceso de la reivindicación 3, donde la fuente de carbono es glucosa y la fuente de nitrógeno es amoníaco y/o una sal de amonio.
5. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la fermentación ocurre mediante un proceso de fermentación por lote, por lote repetido, por lote de alimentación, por lote de alimentación repetido o conti-
nuo.
6. El proceso de la reivindicación 5, donde la fermentación ocurre mediante de un proceso por lote de alimenta-
ción.
7. El proceso de la reivindicación 6, donde una fuente de carbono y/o una de nitrógeno es alimentada al
proceso.
8. El proceso de la reivindicación 7, donde la fuente de carbono es glucosa y la fuente de nitrógeno es amoníaco y/o una sal de amonio.
9. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la cepa filamentosa es un hongo.
10. El proceso de la reivindicación 9, donde el hongo es una cepa de Penicillium.
11. El proceso de la reivindicación 10, donde el hongo es Penicillium chrysogenum.
12. El proceso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la cepa filamentosa es una bacteria.
13. El proceso de la reivindicación 12, donde la bacteria es un Actinomycete.
14. El proceso de la reivindicación 13, donde el Actinomycete es Streptomyces clavulliegerus y el compuesto de \beta-lactama es ácido clavulánico.
15. Un método para preparar y/o mejorar una cepa microbiana filamentosa que produce un compuesto de \beta-lactama de interés, la cual es capaz de ser fermentada a escala industrial en un medio químicamente definido, que comprende las etapas de:
\bigstar
someter una cepa madre apropiada a un tratamiento mutagénico seleccionado del grupo de medios físicos y mutágenos químicos, y/o a una transformación de ADN,
\bigstar
clasificar los transformantes y/o mutantes resultantes por su grado de crecimiento en un medio químicamente definido y su nivel de producción del compuesto de \beta-lactama de interés,
\bigstar
seleccionar los transformantes y/o mutantes que tengan un buen grado de crecimiento en un medio químicamente definido y/o un nivel de producción mejorado del dicho compuesto de \beta-lactama de interés en comparación con dicha cepa madre.
16. El método de la reivindicación 15, donde la cepa madre es seleccionada del grupo que consiste de cepas que tienen un buen grado de crecimiento en un medio químicamente definido, pero que necesitan ser mejoradas en cuanto al nivel de producción.
17. El método de la reivindicación 15, donde la cepa madre es seleccionada del grupo que consiste de cepas que tienen un nivel de producción alto de un compuesto de \beta-lactama deseado, pero un grado de crecimiento relativamente malo en un medio químicamente definido.
18. Uso de un medio de fermentación químicamente definido para la producción de un compuesto de \beta-lactama por fermentación de una cepa microbiana filamentosa a escala industrial.
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Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5340742A (en) 1988-09-07 1994-08-23 Omegatech Inc. Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids
KR100576576B1 (ko) * 1997-02-20 2006-05-04 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 화학적 합성 배지를 이용하는 가치있는 화합물들의 산업적 규모의 발효적 생산
US6004784A (en) * 1998-09-14 1999-12-21 General Electric Co. Fermentation medium and method for producing α, ω -alkanedicarboxylic acids
US6440708B1 (en) * 1998-09-29 2002-08-27 Dsm N.V. Fermentation of clavulanic acid at a controlled level of ammonia
KR20090064603A (ko) * 2000-01-28 2009-06-19 마텍 바이오싸이언스스 코포레이션 발효기 내에서 진핵 미생물의 고밀도 배양에 의한 고도불포화 지방산을 함유하는 지질의 증진된 생산 방법
DE10106493B4 (de) * 2001-02-13 2010-11-04 Plasmidfactory Gmbh & Co. Kg Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäuren
DK1520012T3 (da) 2002-07-01 2009-04-27 Novozymes As Monopropylenglycol tilsat til fermenteringsmedium
KR100454508B1 (ko) * 2002-07-05 2004-11-03 허명준 소취기능과 다제내성균에 대한 멸균력을 갖는 자연기능수및 그의 제조방법
US6955892B2 (en) * 2002-11-12 2005-10-18 Akzo Nobel N.V. Feeding processes for fermentation
DE10317877A1 (de) * 2003-04-17 2004-11-18 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Verfahren zur Herstellung von Sporidiobolus ruineniae Stämmen mit verbesserter Coenzym Q10-Produktion
JP2006528970A (ja) 2003-05-28 2006-12-28 デーエスエム アイピー アセッツ ベー． ヴェー． セフェム化合物
AU2005212237B2 (en) 2004-02-04 2009-06-11 Merck Sharp & Dohme Llc Process for large scale production of plasmid DNA by E. coli fermentation
NZ552133A (en) * 2004-06-16 2009-05-31 Dsm Ip Assets Bv Fermentation process using FABA beans as nitrogen source
BRPI0609040B1 (pt) 2005-03-18 2018-07-31 Microbia, Inc. Fungo recombinante do gênero yarrowia, método de produção de um carotenóide e método de preparo de um aditivo alimentício ou ração contendo um carotenóide
AU2006226304B2 (en) * 2005-03-24 2012-03-15 Dsm Ip Assets B.V. Process for microbial production of a valuable compound
US7990102B2 (en) * 2006-02-09 2011-08-02 Karl Frederick Scheucher Cordless power supply
KR100839874B1 (ko) * 2006-07-07 2008-06-19 자연과생명기술(주) 분말 발효제 제조 방법
US8691555B2 (en) 2006-09-28 2014-04-08 Dsm Ip Assests B.V. Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi
EP2592149A1 (en) 2007-03-21 2013-05-15 DSM IP Assets B.V. Improved method for homologous recombination
US20130189722A1 (en) * 2007-09-05 2013-07-25 Joshua Trueheart Isolation of pellet-forming microorganisms
WO2010015627A2 (en) 2008-08-05 2010-02-11 Dsm Ip Assets B.V. Adipoyl-7-adca producing strains
EP2213723A1 (en) 2009-01-30 2010-08-04 Novozymes A/S Isomaltose for fungus fermentation
WO2010097436A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Novozymes A/S Mutant cells having reduced expression of metallopeptidase, suitable for recombinant polypeptide production
EP2896686A1 (en) 2009-07-03 2015-07-22 DSM IP Assets B.V. Talaromyces strains and enzyme compositions
IN2012DN03186A (es) 2009-11-04 2015-09-25 Dsm Ip Assets Bv
DK2552934T3 (en) 2010-03-30 2015-09-28 Novozymes As Krystalmetabolit-extraction
KR101013456B1 (ko) * 2010-11-24 2011-02-14 주식회사 그린바이오텍 심플리실리움 라멜리콜라 ｂｃｐ 균주 배양용 배지 조성물 및 이의 배양방법
WO2012088276A2 (en) * 2010-12-21 2012-06-28 J3H, Inc Phospholipid production and composition manipulation through media manipulation
ES2656049T3 (es) 2011-01-31 2018-02-22 Novozymes A/S Uso de glucosa tostada para la producción fermentativa de taxtomina
US20140106398A1 (en) 2011-03-11 2014-04-17 Dsm Ip Assets B.V. Vector-host system
US10160989B2 (en) * 2011-05-02 2018-12-25 Renewuel Llc System and method of co-cultivating microalgae with fungus
JP2014521356A (ja) 2011-08-12 2014-08-28 ノボザイムス アクティーゼルスカブ マンガン添加による培養液粘度の低減
US20150197760A1 (en) 2012-06-19 2015-07-16 Dsm Ip Assets B.V. Promoters for expressing a gene in a cell
WO2014006040A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Novozymes A/S Inactivation of a production strain using a fatty acid
WO2014030774A1 (ja) 2012-08-24 2014-02-27 国立大学法人山口大学 酵母用培地
EP2914611B1 (en) 2012-11-01 2018-08-29 Novozymes A/S Method for removal of dna
EP2951296A2 (en) 2013-02-04 2015-12-09 DSM IP Assets B.V. Carbohydrate degrading polypeptide and uses thereof
US9943545B2 (en) 2013-03-15 2018-04-17 Fate Therapeutics, Inc. Stem cell culture media and methods of enhancing cell survival
WO2014202620A2 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Rasamsonia gene and use thereof
WO2014202624A2 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Rasamsonia gene and use thereof
WO2014202622A2 (en) 2013-06-19 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Rasamsonia gene and use thereof
WO2014202621A1 (en) 2013-06-20 2014-12-24 Dsm Ip Assets B.V. Carbohydrate degrading polypeptide and uses thereof
EP2826384A1 (de) 2013-07-16 2015-01-21 Evonik Industries AG Verfahren zur Trocknung von Biomasse
JP6393898B2 (ja) * 2014-08-03 2018-09-26 国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 酵母の培養方法
DK3200606T3 (da) 2014-10-02 2021-06-21 Evonik Operations Gmbh Fremgangsmåde til fremstilling af et fodermiddel, der indeholder pufa'er, ved ekstrusion af en biomasse, der indeholder pufa'er, af typen labyrinthulomycetes
US20170295824A1 (en) 2014-10-02 2017-10-19 Evonik Degussa Gmbh Process for producing a pufa-containing biomass which has high cell stability
US11324234B2 (en) 2014-10-02 2022-05-10 Evonik Operations Gmbh Method for raising animals
DK180016B1 (da) 2014-10-02 2020-01-22 Evonik Degussa Gmbh Feedstuff of high abrasion resistance and good stability in water, containing PUFAs
JP2018536418A (ja) 2015-12-09 2018-12-13 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 脱離条件下で発酵固体からタンパク質を精製する方法
CN105505829A (zh) * 2016-01-20 2016-04-20 黑龙江省中医药科学院 发酵类中药优势菌群选择性培养基及其制备方法和发酵类中药优势菌的筛选方法
EP3442340A1 (en) 2016-04-12 2019-02-20 Wim De Laat Consultancy B.V. Pseudomonas strains and consortia thereof for use in protection against plant diseases
MX2019000621A (es) 2016-07-14 2019-08-01 Basf Se Medio de fermentacion que comprende agente quelante.
JP2018023356A (ja) * 2016-08-04 2018-02-15 三洋化成工業株式会社 有用物質の生産方法
WO2018029353A1 (en) 2016-08-11 2018-02-15 Wim De Laat Consultancy B.V. Single cell protein from thermophilic fungi
CN111032856A (zh) 2017-08-07 2020-04-17 诺维信公司 基于pH的FCA控制的用途
CN110452945B (zh) * 2018-05-07 2023-06-23 华东理工大学 利用红色糖多孢菌发酵生产红霉素的方法
CN114127256A (zh) 2019-02-20 2022-03-01 巴斯夫欧洲公司 用确定成分培养基和微量元素补料的芽孢杆菌工业发酵工艺
US20220186177A1 (en) 2019-02-20 2022-06-16 Basf Se Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and magnesium feed
US20220275355A1 (en) 2019-06-13 2022-09-01 Basf Se Method of Recovering a Protein from Fermentation Broth Using a Divalent Cation
CN110283854B (zh) * 2019-08-08 2021-07-16 内蒙古金达威药业有限公司 一种发酵培养基及其应用和利用三孢布拉霉菌发酵制备番茄红素的方法
JP2023506284A (ja) 2019-12-19 2023-02-15 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア ファインケミカルを生成する際の空時収率、炭素変換効率、及び炭素基質適応性の増加
US20230041211A1 (en) 2019-12-20 2023-02-09 Basf Se Decreasing toxicity of terpenes and increasing the production potential in micro-organisms
KR102264895B1 (ko) * 2019-12-27 2021-06-15 명지대학교 산학협력단 메탄올을 소비하는 Aspergillus 균주를 이용한 유기산 생산 공정
WO2021144342A1 (en) 2020-01-14 2021-07-22 The Protein Brewery B.V. Expression of ovalbumin and its natural variants
AU2021210157A1 (en) 2020-01-23 2022-08-18 The Protein Brewery B.V. Use of a defoamer for maintaining dispersed morphology in submerged fungal fermentation
WO2021176032A1 (en) 2020-03-06 2021-09-10 The Protein Brewery B.V. Pasteurisation of microbial biomass suitable for food applications
WO2021176033A1 (en) 2020-03-06 2021-09-10 The Protein Brewery B.V. Improved single-cell protein production using antioxidants
CN111548944B (zh) * 2020-06-05 2022-06-14 福建省农业科学院植物保护研究所 一种促进莱氏绿僵菌产孢的固体发酵培养基及其制备方法和应用
AU2021295115A1 (en) 2020-06-23 2023-01-19 The Protein Brewery B.V. Novel food
EP4208561A1 (en) 2020-09-04 2023-07-12 Basf Se Method for removing antifoaming agents from a fermentation broth
BR112023005111A2 (pt) 2020-09-22 2023-04-18 Basf Se Método para recuperar uma proteína de interesse de um caldo de fermentação bacteriana, e, uso de pelo menos um floculante
WO2023118565A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Novozymes A/S Reduction of residual dna in microbial fermentation products
WO2023242273A1 (en) 2022-06-14 2023-12-21 Newmilkbuzz B.V. Expression of milk caseins in filamentous fungi
EP4349993A1 (en) 2022-10-06 2024-04-10 SecondCircle ApS Optimised fermentation of anaerobic bacteria
WO2024110509A1 (en) 2022-11-22 2024-05-30 Newmilkbuzz B.V Improved casein secretion by non-mammalian host cells

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3205150A (en) * 1961-11-27 1965-09-07 Ca Nat Research Council Hydroxy fatty acid production
US3700558A (en) * 1967-11-20 1972-10-24 Lepetit Spa Production of l-tryptophan by fermentation
NZ177159A (en) * 1974-04-20 1978-03-06 Beecham Group Ltd Clavulanic acid, salts, esters and preparation thereof from streptomyces clavuligerus: pharmaceutical compositions
IE41489B1 (en) * 1974-07-30 1980-01-16 Ici Ltd Production of glucose isomerase
US4164445A (en) * 1975-03-27 1979-08-14 E. R. Squibb & Sons, Inc. Ethanol as the major source of carbon and energy in penicillin production
US4077842A (en) * 1976-03-19 1978-03-07 Cory Robert Paul Stabilized glucose isomerase enzyme concentrate
US4231938A (en) * 1979-06-15 1980-11-04 Merck & Co., Inc. Hypocholesteremic fermentation products and process of preparation
IL60219A (en) * 1979-06-15 1985-05-31 Merck & Co Inc Hypocholesteremic fermentation products of the hmg-coa reductase inhibitor type,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US4348481A (en) * 1979-11-29 1982-09-07 Institute Po Microbiologia Method of obtaining glucose isomerase
US4374929A (en) * 1980-07-14 1983-02-22 Standard Oil Company (Indiana) Production of xanthan gum from a chemically defined medium introduction
JPS59205979A (ja) * 1983-05-11 1984-11-21 Agency Of Ind Science & Technol 微生物菌体の製造方法
AR245221A1 (es) * 1984-10-27 1993-12-30 Beecham Group Plc Un metodo para la produccion de acido clavulanico por fermentacion de s. clavuligerus
JP2746371B2 (ja) * 1987-12-21 1998-05-06 サントリー株式会社 ビスホモ−γ−リノレン酸及びこれを含有する脂質の製造方法
US5290690A (en) * 1988-07-15 1994-03-01 Plant Genetic Systems Methods and means for controlling the stability of proteins
EP0351029B1 (en) * 1988-07-15 2002-03-06 Genencor International, Inc. Novel glucose isomerase enzymes and their use
US5376536A (en) * 1988-07-15 1994-12-27 Gist-Brocades, N.V. Glucose isomerase enzymes and their use
CH680448A5 (es) * 1990-01-17 1992-08-31 Nestle Sa
US5658767A (en) * 1991-01-24 1997-08-19 Martek Corporation Arachidonic acid and methods for the production and use thereof
US5318896A (en) * 1991-09-11 1994-06-07 Merck & Co., Inc. Recombinant expandase bioprocess for preparing 7-aminodesacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA)
NZ245713A (en) * 1992-02-10 1994-12-22 Novopharm Ltd Production of the antibiotic lovastatin from genetically engineered aspergillus strains
GB9220670D0 (en) * 1992-09-30 1992-11-11 Unilever Plc Cosmetic composition
FR2700552B1 (fr) * 1993-01-19 1995-04-21 Pernod Ricard Mutants de Phaffia rhodozyma, procédé de production de beta-carotène et utilisation de biomasse riche en beta-carotène.
PL180799B1 (pl) * 1993-07-30 2001-04-30 Gist Brocades Bv Sposób wydajnego wytwarzania 7-ADCA poprzez 2-(karboksyetylotio)acetylo-7-ADCA i 3-(karboksymetylotio)-propionylo-7-ADCA
JP2677949B2 (ja) * 1993-08-26 1997-11-17 常盤薬品工業株式会社 アラキドン酸含有健康食品
US5494808A (en) * 1994-09-15 1996-02-27 Merck & Co., Inc. Defined medium OMPC fermentation process
US5583019A (en) * 1995-01-24 1996-12-10 Omegatech Inc. Method for production of arachidonic acid
WO1996038051A1 (fr) * 1995-05-30 1996-12-05 Suntory Limited ×ufs de volaille a teneur elevee en acides gras hautement insatures a longues chaines, leur procede de fabrication et leur utilisation
US5731165A (en) * 1995-06-02 1998-03-24 Gist-Brocades, B.V. Process for the production of 7-ADCA via expandase activity on penicillin G
SI9500238A (en) * 1995-07-27 1997-02-28 Krka Tovarna Zdravil Procedure for the production of lovastatin
US5989877A (en) * 1995-08-03 1999-11-23 Gist-Brocades B.V. Selective process for the deacylation of acylated compounds
US6255505B1 (en) * 1996-03-28 2001-07-03 Gist-Brocades, B.V. Microbial polyunsaturated fatty acid containing oil from pasteurised biomass
US20030143659A1 (en) * 1996-03-28 2003-07-31 Hendrik Louis Bijl Process for the preparation of a granular microbial biomass and isolation of a compound thereform
KR100576576B1 (ko) * 1997-02-20 2006-05-04 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. 화학적 합성 배지를 이용하는 가치있는 화합물들의 산업적 규모의 발효적 생산
ATE408701T1 (de) * 1997-03-04 2008-10-15 Suntory Ltd Verfahren zur herstellung von hochungesättigten fettsäuren und hochungesättigte fettsäuren enthaltendes lipid

Also Published As

Publication number Publication date
CZ295499A3 (cs) 2000-04-12
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DE69834630D1 (de) 2006-06-29
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WO1998037179A2 (en) 1998-08-27
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JP2001512970A (ja) 2001-08-28
EP0970236A2 (en) 2000-01-12
AU6400098A (en) 1998-09-09
ATE327340T1 (de) 2006-06-15
EP2345734A2 (en) 2011-07-20
EP2256211A3 (en) 2011-02-16
BR9807362A (pt) 2000-04-18
CN1127571C (zh) 2003-11-12
PT970236E (pt) 2006-08-31
KR20000075487A (ko) 2000-12-15
EP0970236B1 (en) 2006-05-24
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KR100576576B1 (ko) 2006-05-04
US20020039758A1 (en) 2002-04-04
WO1998037179A3 (en) 1999-01-14
US20140342396A1 (en) 2014-11-20
CN1248294A (zh) 2000-03-22
CZ299290B6 (cs) 2008-06-11
CN1495259A (zh) 2004-05-12
JP2014087365A (ja) 2014-05-15
DE69834630T2 (de) 2007-04-19
JP4217277B2 (ja) 2009-01-28
JP2009195254A (ja) 2009-09-03

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