CZ100696A3 - Method of submersible feeding cultivation of cryptococcus sp. ccy 17-22-1 years with a high content of intracellular v-penicillin amidase - Google Patents
Method of submersible feeding cultivation of cryptococcus sp. ccy 17-22-1 years with a high content of intracellular v-penicillin amidase Download PDFInfo
- Publication number
- CZ100696A3 CZ100696A3 CZ961006A CZ100696A CZ100696A3 CZ 100696 A3 CZ100696 A3 CZ 100696A3 CZ 961006 A CZ961006 A CZ 961006A CZ 100696 A CZ100696 A CZ 100696A CZ 100696 A3 CZ100696 A3 CZ 100696A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- weight
- concentration
- phenylpropionic acid
- cultivation
- culture
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Vynález se týká způsobu submersní příkrmové -kutfeivaee—— kvasinky Cryptococcus sp. CCY 17-22-1 s vysokým obsahem vnitrobuněčné V-penicilin amidasy.The present invention relates to a process for the submersible yeast Cryptococcus sp. CCY 17-22-1 with a high content of intracellular V-penicillin amidase.
Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
Kyselina 6-aminopenicilánová (6-APK), která je důležitým meziproduktem pro přípravu semisyntetických derivátů přírodních penicilinů, může být připravena enzymovou hydrolysou benzylpenicilinu (G-penicilin) nebo fenoxymethylpenicilinu (V-penicilin). Enzymy, které katalyzují selektivní hydrolysu CO-NH vazby mezi postranním řetězcem a hlavním skeletem obou přírodních penicilinů (penicilín amidasy EC 3.5.1.11) jsou substrátově specifické podle typu postranního řetězce výchozího penicilinu. Přesto, že se v současnosti vyrábí převážná většina 6-APK z G-penicilinu, mají alternativní technologie vycházející z V-penicilinu řadu výhod, spočívajících zejména ve vyšší stabilitě V-penicilinu ve vodných roztocích v závislosti na pH a teplotě, s čímž je spojena podstatně nižší přítomnost degradačních produktů (hlavně fenoxymethylpenicilánové kyseliny) a tím i lepší kvalita 6-APK a její vyšší výtěžek v izolaci. Firma NOVC nabízí pro výrobu 6-APK z V-penicilinu biokatalyzátor fungálního původu se specifickou aktivitou 130 U/g,, firma BIOCHEMIE KUNDEL vyrábí podobný biokatalyzátor se specifickou aktivitou 183 U/g, výchozím mikroorganismem je Pleurotus sp. Na našem pracovišti byla vypracována technologie pro přípravu 6-APK z V-penicilinu, která zahrnovala vysokoprodukční nepatogenní kmen Cryptococcus sp. CCY 17-1-22 (čs. autorské osvědčení č. 240 247, hygienicko-epidemiologická expertíza o nepatogenitě kmene), jeho submersní příkrmovou kultivaci (čs. autorské osvědčení č. 250 245) a jeho imobilizaci (čs. autorské osvědčení č. 259 996 a čs. autorské osvědčení č. 259 997). Specifická aktivita biokatalyzátorů připravených touto technologií se pohybovala mezi 60 - 100 U/g.6-Aminopenicillanic acid (6-APK), which is an important intermediate for the preparation of semisynthetic derivatives of natural penicillins, can be prepared by enzymatic hydrolysis of benzylpenicillin (G-penicillin) or phenoxymethylpenicillin (V-penicillin). Enzymes that catalyze the selective hydrolysis of the CO-NH bond between the side chain and the backbone of both natural penicillins (penicillin amidase EC 3.5.1.11) are substrate specific to the type of side chain of the parent penicillin. Although the vast majority of 6-APKs are currently produced from G-penicillin, alternative V-penicillin-based technologies have a number of advantages, notably due to the higher stability of V-penicillin in aqueous solutions depending on pH and temperature, with which it is associated considerably lower presence of degradation products (mainly phenoxymethylpenicillanic acid) and hence better 6-APK quality and higher isolation yield. NOVC offers a biocatalyst of fungal origin with a specific activity of 130 U / g for the production of 6-APK from V-penicillin. BIOCHEMIE KUNDEL produces a similar biocatalyst with a specific activity of 183 U / g, the starting microorganism being Pleurotus sp. We have developed technology for the preparation of 6-APK from V-penicillin, which included a high-production non-pathogenic strain of Cryptococcus sp. CCY 17-1-22 (Czech author's certificate no. 240 247, hygienic-epidemiological expertise on the non-pathogenicity of the strain), its submersive supplementary cultivation (Czech author's certificate no. 250 245) and its immobilization (Czech author's certificate no. 259) 996 and Czech author's certificate No. 259 997). The specific activity of biocatalysts prepared by this technology varied between 60 - 100 U / g.
V čs. autorském osvědčení č. 240 247 je popsán způsob selekce mikroorganismů, zejména kvasinek, a mutantní kmen Cryptococcus sp. CCY 17-22-1 s vysokou vnitrobuněčnou V-penicilin amidasovou aktivitou. V-penicilin amidasa obsažená v těchto kvasinkách má tu výhodu, že je schopna hydrolysovat nejen V-penicilin, ale i jeho p-hydroxyderivát, který bývá přítomen v některých komerčně vyráběných V-penicilinech. V čs. autorském osvědčení č. 250 495 je popsán způsob submersní příkrmové kultivace tohoto kmene ve fermentačních tancích. Kultivační metoda využívala pro příkrmy (a tím i pro dosažení vysoké specifické aktivity V-penicilinamidasy) jako hlavní zdroj uhlíku značná množství kyseliny fenylpropionové, která je metabolizovatelným induktorem tohoto enzymu. Popsanou metodou byla dosahována sušina biomasy 5,5 - 6,5 g/1, aktivita V-penicilin amidasy 1000 - 1300 U/l fermentačního media a specifická aktivita 150 - 210 U/g suché váhy buněk, přičemž bylo pro příkrmy spotřebováváno 1% kyseliny fenylpropionové na objem fermentační kapaliny (w/v). Vzhledem k vysoké ceně fenylpropionové kyseliny byla tato kultivační metoda a tím i celá technologie přípravy 6-APK z V-penicilinu značně nákladnou záležitostí.In MS. No. 240,247 describes a method for selecting microorganisms, especially yeast, and a mutant strain of Cryptococcus sp. CCY 17-22-1 with high intracellular V-penicillin amidase activity. The V-penicillin amidase contained in these yeasts has the advantage of being able to hydrolyze not only V-penicillin but also its p-hydroxy derivative, which is present in some commercially-produced V-penicillins. In MS. No. 250,495 discloses a method for submersive feed culture of this strain in fermentation tanks. The cultivation method used significant amounts of phenylpropionic acid, a metabolizable inducer of this enzyme, for the feed (and hence to achieve a high specific activity of V-penicillin amidase) as the main carbon source. Biomass dry weight of 5.5 - 6.5 g / l, V-penicillin amidase activity of 1000 - 1300 U / l fermentation medium and specific activity of 150 - 210 U / g dry cell weight were achieved by the described method, consuming 1% phenylpropionic acid per fermentation liquid volume (w / v). Due to the high cost of phenylpropionic acid, this cultivation method and hence the whole technology of preparing 6-APK from V-penicillin was a very expensive matter.
Tuto nevýhodu odstraňuje způsob submersní kultivace kmene Cryptococcus sp. CCY 17-22-1 podle vynálezu, který zároveň umožňuje dosažení podstatně vyšších specifických aktivit V-penicilinamidasy.This disadvantage is overcome by the method of submersive cultivation of the Cryptococcus sp. CCY 17-22-1 according to the invention, which at the same time allows to achieve substantially higher specific activities of V-penicillinamidase.
.<Jí :. <Her:
>>>>
o- o _í ;o ? >o? o? o? o? >
o ~ O !o ~ O!
σ oσ o
czxczx
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
LO ^4 kil.LO ^ 4 kil.
-T oc rs< s C. ř spočívá v tom, fenylpropionová-T r <s C. fenyl fenyl fenyl fenyl fenyl fenyl fenyl fenyl fenyl fenyl fenyl fenyl fenyl fenyl fenyl fenyl is phenylpropionic
Předmětem vynálezu je způsob submersní kultivace kvasinky Cryptococcus sp. CCY 17-22-1 s vysokým obsahem vnitrobuněčné V-penicilin amidasy za přítomnosti kyseliny fenylpropionové jako metabolizovatelného induktoru, který že ke kultivačnímu mediu se přidá kyselina v koncentraci 0,1 až 0,3% hmotf^ v kombinaci s kyselinou p-hydroxyfenoxyoctovou, s výhodou v koncentraciThe subject of the invention is a method of submersible cultivation of yeast Cryptococcus sp. CCY 17-22-1 with a high intracellular V-penicillin amidase content in the presence of phenylpropionic acid as a metabolizable inducer, which is added to the culture medium in a concentration of 0.1 to 0.3% by weight in combination with p-hydroxyphenoxyacetic acid, preferably in concentration
0,01% až 0,3% hmot.zý a že pro příkrmy se používá kyselina fenylpropionová v celkové koncentraci 0,1 až 0,3% hmotA, etanol v celkové koncentraci 0,8 až 1,5% hmot/' a síran amonný n/ ~ v celkové koncentraci 0,06 až 0,2% hmot', na objem kultivačního media, přičemž se jednotlivé dávky kyseliny fenylpropionové pohybují v rozmezí 0,005 až 0,1% hmotz^dávky etanolu v rozmezí 0,02 až 0,2% hmot/^na objem kultivačního media a koncentrace amonných iontů v kultivačním mediu se pohybuje v rozmezí 0,001 až 0,04% hmotXKoncentrace rozpuštěného kyslíku v kultivačním mediu se během příkrmové fáze udržuje v rozmezí 3 až 15% součinitele rozpustnosti plynů (saturace) a pH se udržuje mezi hodnotami 7,6 až 8. Dostatečné množství biomasy během kultivace je zajišťováno těmito hlavními zdroji uhlíku a dusíku: kukuřičný extrakt^, etanol, citronan sodný a síran amonný. Celkové množství kyseliny fenylpropionové, která je metabolizovatelným induktorem, je při tomto způsobu kultivace výrazně nižší než při způsobu kultivace podle čs. autorského osvědčení č. 250 245 a specifická aktivita V-penicilin amidasy na konci kultivace je vyšší. Etanol v kombinaci s induktory0.01% to 0.3% by weight, and that for the baby food, phenylpropionic acid is used in a total concentration of 0.1 to 0.3% by weight, ethanol in a total concentration of 0.8 to 1.5% by weight, and sulphate ammonium n in a total concentration of 0.06 to 0.2% by weight, per volume of culture medium, with single doses of phenylpropionic acid ranging from 0.005 to 0.1% by weight of the ethanol dose in the range of 0.02 to 0, 2% w / v of the culture medium and the concentration of ammonium ions in the culture medium is between 0.001 and 0.04% by weight. The dissolved oxygen concentration in the culture medium is maintained between 3 and 15% of the gas solubility coefficient (saturation). The pH is maintained between 7.6 and 8. Sufficient biomass during cultivation is provided by the following main sources of carbon and nitrogen: corn extract, ethanol, sodium citrate and ammonium sulfate. The total amount of phenylpropionic acid, which is a metabolizable inducer, is significantly lower in this cultivation method than in the cultivation method according to U.S. Pat. No. 250,245 and the specific activity of V-penicillin amidase at the end of the culture is higher. Ethanol in combination with inductors
7/4ν·Λ-ΐ Ατη v<7 / 4ν · Λ-ΐ Ατη in <
a amji yamckym dukci V-penicilin amidasy. Kyselina p-hydroxyfenoxyoctová je nemetabolizovatelným induktorem, proto je 0,02% hmotů koncentrace dostačující, a proto je možno po doplnění ostatních složek media pro další kultivace použít supernatant z předchozích kultivací, který kyselinu p-hydroxyfenoxyoctovou obsahuje v nezměněném množství.and amji yoke production of V-penicillin amidase. P-Hydroxyphenoxyacetic acid is a non-metabolizable inducer, so 0.02% by weight of the concentration is sufficient, and therefore, after the other media components have been added, the supernatant from previous cultures containing unchanged p-hydroxyphenoxyacetic acid can be used.
Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Následující příklady dokumentují podstatu vynálezu, aniž by se tím omezovaly patentové nároky.The following examples illustrate the nature of the invention without limiting the claims.
Jednotka V-penicilin amidasové aktivity (U) je v příkladech definována jako množství enzymu katalyzující tvorbu Ιμιη (mikromolu) 6-APK z draselné soli V-penicilinu při iniciální koncentraci substrátu 2% (w/v) za minutu při 37£°C a pH 8,0 v rozmezí nultého řádu reakční kinetiky.The unit of V-penicillin amidase activity (U) in the examples is defined as the amount of enzyme catalysing the formation of Ιμιη (micromole) of 6-APK from V-penicillin potassium salt at an initial substrate concentration of 2% (w / v) per minute at 37 ° C; pH 8.0 in the range of zero order reaction kinetics.
(U =1 μπιοί 6-APK/min. )(U = 1 μπιοί 6-APK / min.)
Specifická aktivita je pak vyjadřována jako U/gram sušiny buněk.Specific activity is then expressed as U / gram cell dry weight.
Příklad 1Example 1
Submersní kultivace probíhala v 10 1 fermentoru Chemap s pracovním objemem 10 1. Parametry kultivace byly následující: teplota 28~C, míchání 400 ot./min. (obv. r.Submerged cultivation was carried out in a 10 L Chemap fermenter with a working volume of 10 L. The cultivation parameters were as follows: temperature 28 ° C, stirring 400 rpm. (acc.
1,57 m/s), vzdušnění 2,5 1/min., přetlak 10 kPa. pH bylo během fed příkrmové fáze kultivace udržováno na hodnotě 7,7 , 20% roztokem kyseliny sírové, koncentrace rozpuštěného kyslíku (pO2) ve fermentačním mediu byla udržována v rozmezí1,57 m / s), aeration 2,5 l / min, overpressure 10 kPa. The pH was maintained at 7.7, 20% sulfuric acid during the feed phase of the culture, and the dissolved oxygen (pO2) concentration in the fermentation broth was kept within the range of
5-10% saturace (kyslíková elektroda).5-10% saturation (oxygen electrode).
Jako inokulum byla použita 48-hodinová kultura kvasinky Cryptococcus sp. CCY 17-22-1 vyrostlá v baňkách na reciproké třepačce při 28^C na tekutém mediu následujícího složení: 0,3% kyselina fenylpropionová (draselná sůl),A 48-hour culture of Cryptococcus sp. CCY 17-22-1 grown in flasks on a reciprocating shaker at 28 ° C on liquid medium of the following composition: 0,3% phenylpropionic acid (potassium salt),
0,02% kyselina p-hydroxyfenoxyoctová (draselná sůl), 1% kukuřičný extrakt, 0,25% citronan sodný, 0,25% kyselý fosforečnan draselný, 0,1% kvasničný autolyzát a 0,05% síran horečnatý, heptahydrát (w/v), pH 7,5. K zaočkování fermentoru byle použito 2% inokulum (v/vj. Složení media pro fermentor odpovídalo složení media pro inokulum, s tím rozdílem, že jako odpěňovací činidlo byly přidány 0,3 ml Struktolu SB0.02% p-hydroxyphenoxyacetic acid (potassium salt), 1% corn extract, 0.25% sodium citrate, 0.25% acid potassium phosphate, 0.1% yeast autolysate and 0.05% magnesium sulfate, heptahydrate (w pH 7.5. A 2% inoculum (v / vj) was used to inoculate the fermenter. The composition of the fermentor medium corresponded to the composition of the inoculum medium, except that 0.3 ml of SB Structure was added as antifoam.
2020 (Schill a Schleicher GmbH, Hamburg, SRN). Batch fáze kultivace trvala 35 hodin a na jejím konci byla dosažena sušina 2,5 g/1, aktivita V-penicilinamidasy 421 U/l a specifická aktivita 170 U/g sušiny buněk.2020 (Schill and Schleicher GmbH, Hamburg, Germany). The patch phase of the culture lasted 35 hours and at the end of the process a dry matter of 2.5 g / l, a V-penicillinamidase activity of 421 U / l and a specific activity of 170 U / g dry cell cells were achieved.
Potom bylo započato se současným dávkováním následujících příkrmů: síran amonný, etanol a kys. fenylpropionová podle výsledků analýz. Protože vysoké koncentrace amonných iontů potlačují syntézu enzymu, byl síran amonný, který sloužil jako zdroj dusíku, dávkován tak, aby se koncentrace amonných iontů ve fermentačním mediu pohybovala kolem 0,004%. Etanol a kys. fenylpropionová, které sloužily jako zdroje uhlíku, byly dávkovány tak, aby koncentrace etanolu v mediu nepřekročila 0,05 % a koncentrace kys. fenylpropionové nepřekročila 0,02% (w/v). Pro příkrmy bylo celkem spotřebováno 0,1% kys. fenylpropionové na objem fermentačního media, 0,8% etanolu na objem fermentačního media a 0,08% síranu amonného na objem fermentační kapaliny. Na konci příkrmové kultivace (v 69. hodině kultivace) byla při této spotřebě příkrmů dosažena sušina 4,1 g/1, aktivita V-penicilinamidasy 1510 U/l a specifická aktivita 368 U/g.Thereafter, simultaneous dosing of the following baby foods was started: ammonium sulfate, ethanol and phenylpropionic acid according to the analysis results. Because high concentrations of ammonium ions suppress enzyme synthesis, ammonium sulfate, which served as a nitrogen source, was dosed so that the concentration of ammonium ions in the fermentation medium was about 0.004%. Ethanol and phenylpropionic acid, which served as carbon sources, were dosed so that the ethanol concentration in the medium did not exceed 0.05% and the phenylpropionic acid concentration did not exceed 0.02% (w / v). A total of 0.1% phenylpropionic acid per volume of fermentation medium, 0.8% ethanol per volume of fermentation medium and 0.08% ammonium sulfate per volume of fermentation liquid was consumed for feed. At the end of the horticultural culture (at the 69th hour of cultivation), the dry food consumption reached 4.1 g / l, the V-penicillinamidase activity of 1510 U / l and the specific activity of 368 U / g.
Supernatant po kultivaci, který stále ještě obsahoval nemetabolizovatelnou kys. p-hydroxyfenoxyoctovou, byl po doplnění ostatních složek media použit pro opakovanou kultivaci, přičemž velikost indukce zůstala nezměněna.The culture supernatant, which still contained non-metabolizable p-hydroxyphenoxyacetic acid, was used for repeated culture after replenishment of the other media components, with the amount of induction remaining unchanged.
Příklad 2Example 2
Submersní příkrmová kultivace probíhala v 751 fermentoru Bioengeneering s pracovním objemem 301. Jako inokulum pro fermentor byla použita 48-hodinová kultura kvasinky Cryptococcus sp. CCY 17-22-1 vyrostlá na baňkách na reciproké třepačce při 28rC na tekutém mediu tohoto složení: 1% kukuřičný extrakt; 0,25% KH2PO4; 0,1% kvasničný autolyzát, 0,3% kys. feriylpropionové (Krsůl), 0,02% kys. p-hydroxyfenoxyoctová, 0,2% etanol, 0,002% CaCí^.eHgO, a 0,05% MgS04.7H20, pH před sterilizací 7,5, v množství 2% na fermentor.Submerged incremental cultivation was carried out in a 751 Bioengeneering fermentor with a working volume of 301. A 48-hour culture of Cryptococcus sp. CCY 17-22-1 grown on flasks on a reciprocating shaker at 28rC on liquid medium of the following composition: 1% corn extract; 0.25% KH 2 PO 4; 0.1% yeast autolysate, 0.3% feriylpropionic acid (Krsul), 0.02% p-hydroxyphenoxyacetic acid, 0.2% ethanol, 0.002% CaCl 2 · eHgO, and 0.05% MgSO 4 .7H 2 O pH before sterilization 7.5, at 2% per fermenter.
Medium pro fermentor se lišilo od media pro inokulum jen tím, že jako odpěňovací činidlo byl k němu přidán 1 ml Struktolu SB 2020 (Schill a Schleicher GmbH, Hamburg, SRN). Parametry kultivace: teplota 2f|°C, míchání 250 ot./min. (obv. r. 1,57 m/s), vzdušnění 8 1/min, přetlak 10 kPa, regulace pH 7,7 (20% H2SO4), regulace pO2 v rozmezí 10-15% saturace.The fermenter broth differed from the inoculum medium only by adding 1 ml of SB 2020 Structure (Schill and Schleicher GmbH, Hamburg, Germany) as antifoam. Culture parameters: temperature 2f | ° C, stirring 250 rpm. (approx. 1.57 m / s), aeration 8 l / min, overpressure 10 kPa, pH regulation 7.7 (20% H 2 SO 4 ), pO2 regulation in the range of 10-15% saturation.
f · - · ..f · - · ..
Na konci batch fáze (ve 36. h0tf. kultivace) byla dosažena sušina 3,2 g/1, aktivita V-penicilinamidasy bylaAt the end of the batch phase (at 36 th culture) a dry matter of 3.2 g / l was achieved, the activity of V-penicillinamidase was
453 U/l a specifická aktivita 141 U/g sušiny.453 U / l and specific activity 141 U / g dry matter.
Během fed batch fáze byly příkrmy dávkovány podle výsledků analýz tak, aby aktuální koncentrace jednotlivých příkrmů nepřekročily hodnoty uvedené v příkladu 1. V prvních 8 hodinách fed batch fáze kultivace byl dávkovkován pouze etanol a roztok síranu amonného, potom dalších 20 hodin byla dávkována směs roztoku K-soii kys. fenylpropionové a etanolu (v poměru 1+1) a roztok síranu amonného, potom dalších 10 hodin pouze etanol a roztok síranu amonného. V 74. hodině byla kultivace ukončena. Byla dosažena sušina 6,8 g/1, aktivita V-penicilinamidasy 2339 U/l a specifická aktivita 346 U/g sušiny. Během fed batch fáze kultivace bylo celkem spotřebováno: 0,167% síranu amonného, 0,989% etanolu a 0,253% kyseliny fenylpropionové na objem fermentačního media.During the fed batch phase, the feeds were dosed according to the analysis results so that the actual concentrations of the individual feeds did not exceed the values given in Example 1. In the first 8 hours of the fed batch phase only ethanol and ammonium sulfate solution were dosed. -salt of phenylpropionic acid and ethanol (1 + 1) and ammonium sulfate solution, then only ethanol and ammonium sulfate solution for a further 10 hours. At 74 hours, the culture was stopped. A dry weight of 6.8 g / l, a V-penicillinamidase activity of 2339 U / l and a specific activity of 346 U / g dry matter were achieved. A total of 0.167% ammonium sulfate, 0.989% ethanol and 0.253% phenylpropionic acid per volume of fermentation medium were consumed during the fed batch culture.
Příklad 3Example 3
Submersní kultivace probíhala v 751 fermentoru Bioengeneering s pracovním.objemem 301.Submerged cultivation was carried out in a 751 Bioengeneering fermenter with a working volume of 301.
Složení media pro inokulum, media pro fermentor, velikost inokula i parametry kultivace byly stejné, jak je uvedeno v příkladu 2.The composition of the inoculum medium, the fermenter medium, the inoculum size and the culture parameters were the same as in Example 2.
Na konci batch fáze kultivace (ve 32. kult. hodině) byla dosažena sušina 2,8 g/1, aktivita V-penicilin amidasy 450 U/l a specifická aktivita 162 U/g sušiny.At the end of the batch phase of culture (at 32 hr. Culture), a dry matter of 2.8 g / l, a V-penicillin amidase activity of 450 U / l and a specific activity of 162 U / g dry matter were achieved.
Během prvních 9 hodin fed batch kultivace bylo dodávány jako příkrmy etanol a síran amonný a byla dosažena sušina 3,8 g/1, aktivita V-penicilin amidasy 786 U/l a specifická aktivita 200 U/g sušiny. Dalších 37 hodin kultivace byla dávkována směs roztoku draselné soli kys. fenylpropionové a etanolu v poměru 1+10 spolu s roztokem síranu amonného. Na konci kultivace (78. hodina) byla dosažena sušina 6,1 g/1, aktivita V-penicilin amidasy činila 1931 U/l a specifická aktivita 309 U/g sušiny. Při tomto uspořádání kultivace činila spotřeba fenylpropionové kyseliny pro příkrmy nutná pro dosažení uvedené aktivity pouhé 0,1% na objem fermentační kapaliny. Etanolu bylo spotřebováno 1% a síranu amonného 0,65% na objem fermentačního media.During the first 9 hours of fed batch culture, ethanol and ammonium sulphate were fed as feed and 3.8 g / l dry matter, 786 U / l V-penicillin amidase activity and 200 U / g dry matter specific activity were achieved. An additional 37 hours of culture was dosed with a 1 + 10 mixture of a solution of phenylpropionic acid potassium salt and ethanol together with an ammonium sulfate solution. At the end of the culture (78 hours), a dry matter of 6.1 g / l was achieved, the activity of V-penicillin amidase was 1931 U / l and a specific activity of 309 U / g dry matter. With this culture arrangement, the consumption of phenylpropionic acid for baby foods required to achieve said activity was only 0.1% per volume of fermentation liquid. Ethanol was consumed 1% and ammonium sulfate 0.65% per volume of fermentation medium.
Příklad 4Example 4
Kultivace probíhala stejně jak bylo popsáno v příkladu 3, s tím rozdílem, že v 78. hodině nebyla kultivace ukončena, ale byl dále dávkován roztok síranu amonného spolu s roztokem zdroje uhlíku, který byl připraven tak, že obsahoval etanol a kyselinu fenylpropionovou v poměru 3+1. Během dalších 9 hodin příkrmové kultivace (do 87. h4$t kultivace) vzrostla aktivita V-penicilin amidasy na 2328 U/l a specifická aktivita na 380 U/g sušiny při téměř nezměněné sušině (6,2 g/1). Spotřeba fenylpropiové kyselina pro příkrmy od 78. hodiny činila v tomto případě 0,065%, spotřeba etanolu 0,195% a spotřeba síranu amonného 0,0135% na objem fermentačního media (w/v). Celková spotřeba příkrmů pro fed batch fázi kultivace tedy byla 0,165% kys.The cultivation was carried out as described in Example 3, except that at 78 hours the cultivation was not complete but the ammonium sulfate solution was added together with the carbon source solution, which was prepared containing ethanol and phenylpropionic acid in a ratio of 3. +1. During the next 9 hours of supplementary cultivation (up to 87 h4 $ t cultivation) V-penicillin amidase activity increased to 2328 U / l and specific activity to 380 U / g dry matter with almost unchanged dry matter (6.2 g / l). The consumption of phenylpropionic acid for baby foods from 78 hours was 0.065%, ethanol consumption 0.195% and ammonium sulfate consumption 0.0135% per volume of fermentation medium (w / v). Thus, the total feed consumption for the fed batch culture phase was 0.165% acid.
fenylpropionové, 1,195% etanolu a 0,6635% síranu amonného na objem fermentační kapaliny.phenylpropionic, 1.195% ethanol and 0.6635% ammonium sulfate per volume fermentation liquid.
Průmyslová využitelnostIndustrial applicability
Způsob submersní příkrmové kultivace podle vynálezu je možno použít k přípravě enzymově aktivní biomasy, z níž lze připravit biokatalyzátor schopný hydrolyzovat V-penicilin naThe submersible feed culture method of the invention can be used to prepare an enzyme-active biomass from which a biocatalyst capable of hydrolyzing V-penicillin to form a
6-APK, tedy jako součást technologie pro výrobu 6-aminopenicilánové kyseliny z V-penicilinu.6-APK, thus as part of the technology for producing 6-aminopenicillanic acid from V-penicillin.
Claims (2)
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ961006A CZ100696A3 (en) | 1996-04-04 | 1996-04-04 | Method of submersible feeding cultivation of cryptococcus sp. ccy 17-22-1 years with a high content of intracellular v-penicillin amidase |
SK882-96A SK280600B6 (en) | 1996-04-04 | 1996-07-04 | Submersion feeding cultivation method of yeast cryptococcus sp. ccy 17-22-1 with high content of intracellular v-penicillin amidase |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CZ961006A CZ100696A3 (en) | 1996-04-04 | 1996-04-04 | Method of submersible feeding cultivation of cryptococcus sp. ccy 17-22-1 years with a high content of intracellular v-penicillin amidase |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ282791B6 CZ282791B6 (en) | 1997-10-15 |
CZ100696A3 true CZ100696A3 (en) | 1997-10-15 |
Family
ID=5462602
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ961006A CZ100696A3 (en) | 1996-04-04 | 1996-04-04 | Method of submersible feeding cultivation of cryptococcus sp. ccy 17-22-1 years with a high content of intracellular v-penicillin amidase |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CZ (1) | CZ100696A3 (en) |
SK (1) | SK280600B6 (en) |
-
1996
- 1996-04-04 CZ CZ961006A patent/CZ100696A3/en not_active IP Right Cessation
- 1996-07-04 SK SK882-96A patent/SK280600B6/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CZ282791B6 (en) | 1997-10-15 |
SK88296A3 (en) | 1997-10-08 |
SK280600B6 (en) | 2000-04-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4217277B2 (en) | Fermentative production of useful compounds on an industrial scale using chemically defined media | |
CN109439701B (en) | Method for preparing ergothioneine by biosynthesis and fermentation medium | |
CA2049958A1 (en) | Enzymatic production of 7-amino cephalosporanic acid | |
Toraya et al. | Vitamin B12 production by a methanol-utilizing bacterium | |
Nakagawa et al. | High cell density cultivation and high recombinant protein production of Escherichia coli strain expressing uricase | |
US4584273A (en) | Method for the production of phenylalanine ammonia-lyase by fermentation | |
CA1186644A (en) | Ethanol production by high performance bacterial fermentation | |
Yoon et al. | Phosphate effects in the fermentation of α-amylase by Bacillus amyloliquefaciens | |
US4745059A (en) | Process for the preparation of L-phenylalanine | |
CN110669742A (en) | Method for improving laccase degrading activity of organophosphorus pesticide | |
CZ100696A3 (en) | Method of submersible feeding cultivation of cryptococcus sp. ccy 17-22-1 years with a high content of intracellular v-penicillin amidase | |
Burgess et al. | Alcohol production by yeast in concentrated ultrafiltration permeate from cheddar cheese whey | |
IL95692A (en) | Natural 5-decanolide and 5-dodecanolide and process for the production thereof | |
CN110468051B (en) | K252A fermentation medium and preparation method thereof | |
KR900007000B1 (en) | Novel candida utilis and process for production of protein | |
US4229543A (en) | Process for culturing methanol-utilizing yeasts | |
Houtaia et al. | Production of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase using genetically engineered Escherichia coli | |
Oura et al. | Biotin‐active compounds, their existence in nature and the biotin requirements of yeasts | |
JP2833037B2 (en) | Glutathione-rich yeast production method | |
Kikuchi et al. | Nitrate respiration of Klebsiella pneumoniae on amino acids, especially on serine | |
Kujan et al. | D-Amino-acid oxidase—an improved production of the enzyme by the yeast Trigonopsis variabilis in a laboratory fermentor | |
Dumenil et al. | Study of some factors influencing growth and vitamin B 12 production of a facultative methylotrophic Corynebacterium | |
CA1229809A (en) | Process for the biotechnical production of l-malic acid | |
KR910002861B1 (en) | Production of cephalosporin-c | |
RU2098485C1 (en) | Method of directed biosynthesis of citric acid |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20050404 |