BRPI0609040B1 - Fungo recombinante do gênero yarrowia, método de produção de um carotenóide e método de preparo de um aditivo alimentício ou ração contendo um carotenóide - Google Patents

Fungo recombinante do gênero yarrowia, método de produção de um carotenóide e método de preparo de um aditivo alimentício ou ração contendo um carotenóide Download PDF

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Abstract

produção de carotenóides em levedo e fungos oleaginosos. a presente invenção refere-se sistemas para produção de levedos ou fungos oleaginosos manipulados que expressam carotenõides.

Description

(54) Título: FUNGO RECOMBINANTE DO GÊNERO YARROWIA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM CAROTENÓIDE E MÉTODO DE PREPARO DE UM ADITIVO ALIMENTÍCIO OU RAÇÃO CONTENDO UM CAROTENÓIDE (51) Int.CI.: C12N 15/80; A23L 31/00; C12P 23/00 (30) Prioridade Unionista: 18/03/2005 US 60/663,621 (73) Titular(es): MICROBIA, INC.
(72) Inventor(es): RICHARD BAILEY; KEVIN T. MADDEN; JOSHUA TRUEHEART (85) Data do Início da Fase Nacional: 18/09/2007
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FUNGO RECOMBINANTE DO GÊNERO YARROWIA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM CAROTENÓIDE E MÉTODO DE PREPARO DE UM ADITIVO ALIMENTÍCIO OU RAÇÃO CONTENDO UM CAROTENÓIDE
Pedidos Relacionados
O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório
U.S. No. 60/663,621, depositado em 18 de Março de 2005, os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Antecedentes da Invenção
Carotenóides são pigmentos orgânicos oscilando, quanto à cor, 10 de amarelo a vermelho, que são naturalmente produzidos por determinados organismos, incluindo organismos fotossintéticos (por exemplo, plantas, algas, cianobactérias) e alguns fungos. Carotenóides são responsáveis pela cor laranja de cenouras, bem como rosa em flamingos e salmões e o vermelho em lagostas e camarão. Os animais, contudo, não podem produzir caro15 tenóides e devem receber os mesmos através de sua dieta.
Pigmentos de carotenóide (por exemplo, β-caroteno e astaxantina) são usados industrialmente como ingredientes para alimentos e estoques de ração, servindo a uma função nutricional e intensificação da aceitabilidade do consumidor. Por exemplo, astaxantina é amplamente usada em aqüicultura de salmão para proporcionar uma coloração laranja característica de suas contra-partes. Alguns carotenóides são também precursores de vitamina A. Também, carotenóides têm propriedades antioxidantes e podem ter vários benefícios para a saúde (veja, por exemplo, Jyonouchi e colaboradores, Nutr. Cancer 16: 93, 1991; Giovannucci e colaboradores, J. Natl.
Cancer Inst. 87: 1767, 1995; Miki, Pure Appl. Chem 63: 141, 1991; Chew e colaboradores, Anticancer Res. 19: 1849, 1999; Wang e colaboradores, Antimicrob. Agents Chemother. 44: 2452, 2000). Alguns carotenóides, tais como β-caroteno, licopeno e luteína, são atualmente vendidos como suplementos nutricionais.
Em geral, os sistemas biológicos que produzem carotenóides são industrialmente intratáveis e/ou produzem os compostos em níveis tais que isolamento em escala comercial não é praticável. Assim, a maioria dos carotenóides usados na indústria são produzidos através de síntese química.
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Existe uma necessidade por sistemas biológicos aperfeiçoados que produzem carotenóides. Alguns esforços foram feitos anteriormente para manipular geneticamente determinadas bactérias ou fungos para produzir níveis maiores de carotenóides (veja, por exemplo, Misawa e colaboradores, J. Bio5 technol. 59: 169, 1998; Visser e colaboradores, FEMS Yeast Research 4:
221, 2003). Contudo, sistemas aperfeiçoados que permitem níveis maiores de produção e maior facilidade de isolamento são necessários.
Sumário da Invenção
A presente invenção proporciona sistemas aperfeiçoados para a 10 produção biológica de carotenóides. Em um aspecto, a invenção abrange a descoberta de que é desejável produzir carotenóides em organismos oleaginosos. Sem desejar estar preso a qualquer teoria em particular, os presentes inventores propõem que sistemas biológicos sejam capazes de acumular níveis maiores de carotenóides se os compostos são capturados em corpos lipídicos. A despeito de se os níveis absolutos são maiores, contudo, carotenóides que são acumulados dentro de corpos lipídicos em organismos oleaginosos são prontamente isoláveis através de isolamento dos corpos lipídicos.
A presente invenção, portanto, proporciona fungos oleaginosos (incluindo, por exemplo, levedo e outros fungos unicelulares) que produzem um ou mais carotenóides. A presente invenção também proporciona métodos de construção de tais levedos e fungos, métodos de uso de tais levedos e fungos para produzir carotenóides e métodos de preparo de composições contendo carotenóide, tais como aditivos para alimentos ou rações ou su25 plementos nutricionais, usando os carotenóides produzidos em tais levedos ou fungos oleaginosos. Em particular, a presente invenção proporciona sistemas e métodos para geração de levedos e fungos contendo uma ou mais modificações oleagínicas e/ou carotenogênicas que aumentam a oleaginicidade e/ou alteram suas capacidades de produção de carotenóide quando comparado com outros organismos idênticos que carecem da(s) modificação(ões).
A presente invenção ainda abrange o reconhecimento geral de
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3/89 que sistemas que acumulam lipídios são úteis para a produção e/ou isolamento de agentes lipofílicos (tais como, mas não limitado a, isoprenóides ou compostos derivados de isoprenóide). Assim, de acordo com a presente invenção, é desejável manipular organismos para produzir tais agentes lipofíli5 cos e/ou acumular lipídios.
Vários outros aspectos da presente invenção serão evidentes para aqueles habilitados na técnica a partir da presente descrição, incluindo as reivindicações em anexo.
Breve Descrição dos Desenhos
As Figuras 1A-1D representam determinados carotenóides comuns.
A Figura 2 representa como níveis suficientes de acetil-CoA e NADPH podem ser acumulados no citosol de organismos oleaginosos para permitir a produção de níveis significativos de lipídios citosólicos. Enzimas:
1, decarboxilase de piruvato; 2, dehidrogenase de malato; 3, enzima málica;
4, dehidrogenase de piruvato; 5, sintase de citrato; 6, liase de ATP-citrato; 7, translocase de citrato/malato.
As Figuras 3A e 3B representam a via de biossíntese de isoprenóide de mevalonato a qual opera, tipicamente, em eucariotas, incluindo fungos.
A Figura 4 representa a via de biossíntese de isoprenóide mevalonato-independente, também conhecida como via de DXP a qual, tipicamente, opera em bactérias e nos plastídeos de plantas.
A Figura 5 representa intermediários na via de biossíntese de 25 isoprenóide e como eles alimentam as vias biossintéticas de outras biomoléculas, incluindo carotenóides, bem como compostos de não-carotenóides, tais como esteróis, esteróides e vitaminas, tais como vitamina E ou vitamina
K.
As Figuras 6A-6D ilustram várias vias biossintéticas de carote30 nóide. A Figura 6A destaca ramificações que levam a várias xantofilas cíclicas e acíclicas; a Figura 6B mostra determinadas vias de X. dendrorhous que geram carotenóides dicíclicos e monocíclicos, incluindo astaxantina; a
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Figura 6C mostra vias interconectadas para conversão de β-caroteno em qualquer um de uma variedade de outros carotenóides, incluindo astaxantina; a Figura 6D representa possíveis vias de síntese de carotenóides cíclicos e xantofilas comuns de plantas e algas a partir de neurosporeno.
As Figuras 7A-7C mostram um alinhamento de determinados polipeptídeos de reductase de HMG-CoA fúngica representativos. Conforme pode ser observado, esses polipeptídeos mostram identidade muito alta através da região catalítica e também têm domínios que abrangem a membrana complexa. Em algumas modalidades da invenção, esses domínios que abrangem membrana são rompidos ou são removidos de modo que, por exemplo, uma versão hiperativa do polipeptídeo pode ser produzida.
As Figuras 8A-8D representam representações esquemáticas de plasmídeos gerados e descritos em detalhes na exemplificação.
Definições
Modificação carotenogênica: O termo modificação carotenogênica, conforme usado aqui, se refere a uma modificação de um organismo hospedeiro que se ajusta à produção de um ou mais carotenóides, conforme descrito aqui. Por exemplo, uma modificação carotenogênica pode aumentar o nível de produção de um ou mais carotenóides e/ou pode alterar níveis de produção relativos de diferentes carotenóides. Em princípio, uma modificação carotenogênica da invenção pode ser qualquer modificação química, fisiológica, genética ou outra que altera, apropriadamente, a produção de um ou mais carotenóides em um organismo hospedeiro produzido por esse organismo quando comparado com o nível produzido em um organismo de outro modo idêntico não submetido à mesma modificação. Na maioria das modalidades, contudo, a modificação carotenogênica compreenderá uma modificação genética, tipicamente, resultando na produção aumentada de um ou mais carotenóides selecionados. Em algumas modalidades, o carotenóide selecionado é um ou mais de astaxantina, β-caroteno, cantaxantina, luteína, licopeno, fitoeno, zeaxantina e/ou modificações de zeaxantina ou astaxantina (por exemplo, glicosídeo, zeaxantina esterificada ou astaxantina). Em algumas modalidades, o carotenóide selecionado é uma ou mais
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5/89 xantofilas e/ou uma modificação das mesmas (por exemplo, glicosídeo, xantofilas esterificadas). Em determinadas modalidades, a xantofila é selecionada do grupo consistindo de astaxantina, luteína, zeaxantina, licopeno e modificações dos mesmos. Em algumas modalidades, o carotenóide selecionado é um ou mais de astaxantina, β-caroteno, cantaxantina, luteína, licopeno e zeaxantina e/ou modificações de zeaxantina ou astaxantina. Em algumas modalidades, o carotenóide é β-caroteno. Em algumas modalidades, o carotenóide selecionado é astaxantina. Em algumas modalidades, o carotenóide selecionado é outro que não β-caroteno.
Polipeptídeo carotenogênico: O termo polipeptídeo carotenogênico, conforme usado aqui, se refere a qualquer polipeptídeo que está envolvido no processo de produção de carotenóides em uma célula e pode incluir polipeptídeos que estão envolvidos em outros processos que não produção de carotenóide, mas cujas atividades afetam a extensão ou nível de produção de um ou mais carotenóides, por exemplo, através de remoção de um substrato ou reagente utilizado por um polipeptídeo de carotenóide que está diretamente envolvido na produção de carotenóide. Polipeptídeos carotenogênicos incluem polipeptídeos da biossíntese de isoprenóide, polipeptídeos da biossíntese de carotenóide e polipeptídeos competidores da bios20 síntese de isoprenóide, conforme esses termos são definidos aqui. O termo também abrange polipeptídeos que podem afetar a extensão até a qual carotenóides são acumulados em corpos lipídicos.
Carotenóide: O termo carotenóide é compreendido na técnica como se referindo a uma classe estruturalmente diversa de pigmentos deri25 vados de intermediários da via de isoprenóide. A etapa obrigatória na biossíntese de carotenóide é a formação de fitoeno a partir de pirofosfato de geranilgeranila. Carotenóides podem ser acíclicos ou cíclicos e podem ou não conter oxigênio, de modo que o termo carotenóides inclui carotenos e xantofilas. Em geral, carotenóides são compostos de hidrocarboneto tendo um esqueleto de carbono polieno-conjugado formalmente derivado do composto com cinco carbonos IPP, incluindo triterpenos (C30 diapocarotenóides) e tetraterpenos (C40 carotenóides), bem como seus derivados oxigenados e ouPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 8/121
6/89 tros compostos que têm, por exemplo, C35, C50, C60, C70, C80 de comprimento ou outros comprimentos. Muitos carotenóides têm fortes propriedades de absorção de luz e podem oscilar, quanto ao comprimento, em mais de C200. C30 diapocarotenóides consistem, tipicamente, de seis unidades de isopre5 nóide unidas de uma maneira tal que a disposição das unidades de isoprenóide é revertida no centro da molécula, de modo que os dois grupos metila centrais estão em uma relação posicional 1,6 e os grupos metila nãoterminais restantes estão em uma relação posicional 1,5. Tais C30 carotenóides podem ser formalmente derivados da estrutura acíclica C30H42, tendo uma cadeia central longa de ligações duplas conjugadas através de: (i) hidrogenação, (ii) desidrogenação, (iii) ciclização, (iv) oxidação, (v) esterificação/glicosilação ou qualquer combinação desses processos. C40 carotenóides consistem, tipicamente, de oito unidades de isoprenóide unidas de uma maneira tal que a disposição de unidades de isoprenóide é revertida no cen15 tro da molécula, de modo que os dois grupos metila centrais estão em uma relação posicional 1,6 e os grupos metila não-terminais restantes estão em uma relação posicional 1,5. Tais C40 carotenóides podem ser formalmente derivados da estrutura acíclica C40H56, tendo uma cadeia central longa de ligações duplas conjugadas através de (i) hidrogenação, (ii) desidrogenação, (iii) ciclização, (iv) oxidação, (v) esterificação/glicosilação ou qualquer combinação desses processos. A classe de C40 carotenóides também inclui determinados compostos que surgem de redisposições do esqueleto de carbono ou através da remoção (formal) de parte dessa estrutura. Mais de 600 carotenóides diferentes foram identificados na natureza; determinados caro25 tenóides comuns são representados na Figura 1. Carotenóides incluem, mas não estão limitados a: anteraxantina, adonirubina, adonixantina, astaxantina, cantaxantina, capsorubrina, β-criptoxantina, a-caroteno, β-caroteno, β,ψcaroteno, δ-caroteno, ε-caroteno, echinenona, 3-hidróxiechinenona, 3'hidróxiechinenona, γ-caroteno, ψ-caroteno, 4-ceto-y-caroteno, ζ-caroteno, a30 criptoxantina, deoxiflexixantina, diatoxantina, 7,8-didehidroastaxantina, didehidrolicopeno, fucoxantina, fucoxantinol, isorenierateno, β-isorenierateno, lactucaxantina, luteína, licopeno, mixobactona, neoxantina, neurosporeno,
Petição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 9/121
7/89 hidróxineurosporeno, peridinina, fitoeno, rodopina, glicosídeo de rodopina, 4ceto-rubixantina, sifonaxantina, esferoideno, esferoidenona, espiriloxantina, toruleno, 4-ceto-toruleno, 3-hidróxi-4-ceto-toruleno, uriolida, acetato de uriolida, violaxantina, zeaxantina-p-diglicosídeo, zeaxantina e C30 carotenóides.
Adicionalmente, compostos de carotenóide incluem derivados dessas moléculas os quais podem incluir grupos funcionais hidróxi-, metóxi-, oxo-, epóxi-, carbóxi- ou aldeídicos. Ainda, compostos de carotenóide incluídos incluem éster (por exemplo, éster de glicosídeo, éster de ácido graxo) e derivados de sulfato (por exemplo, xantofilas esterificadas).
Polipeptídeo de biossíntese de carotenóide: O termo polipeptídeo da biossíntese de carotenóide se refere a qualquer polipeptídeo que está envolvido na síntese de um ou mais carotenóides. Para mencionar uns poucos, esses polipeptídeos da biossíntese de carotenóide incluem, por exemplo, polipeptídeos de sintase de fitoeno, dehidrogenase de fitoeno (ou desaturase), ciclase de licopeno, cetolase de carotenóide, hidroxilase de carotenóide, sintase de astaxantina, epsilon hidroxilase de carotenóide, ciclase de licopeno (subunidades beta e epsilon), glicosiltransferase de carotenóide e aciltransferase de acil CoA:diacilglicerol. Exemplos representativos de seqüências de polipeptídeo da biossíntese de carotenóide são apresentados nas Tabelas 17-25.
Gene: O termo gene, conforme usado aqui, geralmente se refere a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, opcionalmente incluindo determinados elementos regulatórios que podem afetar a expressão de um ou mais produtos genéticos (isto é, RNA ou proteína).
Heterólogo: O termo heterólogo, conforme usado aqui, se refere a genes ou polipeptídeos que não ocorrem naturalmente no organismo no qual ele está sendo expresso. Deve ser compreendido que, em geral, quando um gene ou polipeptídeo heterólogo é selecionado para introdução em e/ou expressão por uma célula hospedeira, o organismo fonte particular do qual o gene ou polipeptídeo heterólogo pode ser selecionado não é essencial para a prática da presente invenção. considerações relevantes podem incluir, por exemplo, quão intimamente relacionados a fonte potencial e orPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 10/121
8/89 ganismos hospedeiros estão em evolução ou quão relacionado o organismo fonte está com outros organismos fonte dos quais seqüências de outros polipeptídeos relevantes foram selecionados.
Célula hospedeira: Conforme usado aqui, a célula hospedeira 5 é uma célula de levedo ou fúngica que é manipulada de acordo com a presente invenção para acumular lipídio e/ou expressar um ou mais carotenóides conforme descrito aqui. Uma célula hospedeira modificada, conforme esse termo é usado aqui, é uma célula hospedeira que contém pelo menos uma modificação oleagínica e/ou pelo menos uma modificação carotenogê10 nica de acordo com a presente invenção.
Isolado: O termo isolado, conforme usado aqui, significa que a entidade isolada foi separada de pelo menos um componente com o qual ela estava previamente associada. Quando a maioria dos outros componentes foi removida, a entidade isolada é purificada. isolamento e/ou purificação pode ser realizada usando quaisquer métodos conhecidos na técnica incluindo, por exemplo, fracionamento, extração, precipitação ou outra separação.
Polipeptídeo competidor da biossíntese de isoprenóide: O termo polipeptídeo competidor da biossíntese de isoprenóide, conforme usado aqui, se refere a um polipeptídeo cuja expressão em uma célula reduz o nível de difosfato de geranilgeranila (GGPP) disponível para entrar na via da biossíntese de carotenóide. Por exemplo, polipeptídeos competidores da biossíntese de isoprenóide incluem enzimas que atuam sobre intermediários de isoprenóide antes de GGPP, de modo que menos GGPP é gerado (veja, por exemplo, Figura 5). Sintase de esqualeno é mais um polipeptídeo competidor da biossíntese de isoprenóide de acordo com a presente invenção; seqüências da sintase de esqualeno representativos são apresentadas na Tabela 16. Enzimas sintase de prenildifosfato e poliprenil transferase de para-hidróxibenzoato (PHB) são ainda polipeptídeos competidores da biossín30 tese de isoprenóide adicionais de acordo com a presente invenção; enzimas sintase de prenildifosfato e polipeptídeos de poliprenil transferase de PHB representativos são apresentados nas Tabelas 29 e 30, respectivamente.
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Polipeptídeo da biossíntese de isoprenóide: O termo polipeptídeo da biossíntese de isoprenóide se refere a qualquer polipeptídeo que está envolvido na síntese de isoprenóides. Por exemplo, conforme discutido aqui, tiolase de acetoacetil-CoA, sintase de HMG-CoA, reductase de HMG5 CoA, quínase de mevalonato, quínase de fosfomevalonato, decarboxilase de pirofosfato de mevalonato, isomerase de IPP, sintase de FPP e sintase de GGPP estão todos envolvidos na via de mevalonato para biossíntese de isoprenóide. Cada uma dessas proteínas também é um polipeptídeo da biossíntese de isoprenóide para fins da presente invenção e seqüências de exem10 plos representativos dessas enzimas são proporcionados nas Tabelas 7-15.
Via de isoprenóide: A via de isoprenóide é compreendida na técnica como se referindo a uma via metabólica que produz ou utiliza o metabólito com cinco carbonos pirofosfato de isopentila (IPP). Conforme discutido aqui, duas vias diferentes podem produzir o precursor de isoprenóide comum IPP - a via de mevalonato e a via de não-mevalonato. O termo via de isoprenóide é suficientemente geral para abranger ambos esses tipos de via. A biossíntese de isoprenóides a partir de IPP ocorre através de polimerização de várias subunidades de isopreno de cinco carbonos. Metabólitos de isoprenóide derivados de IPP são de tamanho e estrutura química variados, incluindo moléculas cíclicas e acíclicas. Metabólitos de isoprenóide incluem, mas não estão limitados a, monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, esteróis e poliprenóis, tais como carotenóides.
Modificação oleagínica: O termo modificação oleagínica, conforme usado aqui, se refere a uma modificação de um organismo hospedeiro que se ajusta à oleaginidade desejada desse organismo hospedeiro, conforme descrito aqui. Em alguns casos, o organismo hospedeiro já será oleaginoso pelo fato de ter a capacidade de acumular lipídio em pelo menos cerca de 20% de seu peso celular seco. Todavia, pode ser desejável aplicar uma modificação oleagínica em tal organismo, de acordo com a presente invenção, por exemplo, para aumentar (ou, em alguns casos, possivelmente diminuir) seu acúmulo total de lipídio ou ajustar os tipos ou quantidades de um ou mais lipídios em particular que se acumulam (por exemplo, aumentar
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10/89 o acúmulo relativo de triacilglicerol). Em outros casos, o organismo hospedeiro pode ser não-oleaginoso (embora possa conter alguns componentes enzimáticos e regulatórios usados em outros organismos para acumular lipídio) e pode requerer modificação oleagínica de forma a se tornar oleaginoso de acordo com a presente invenção. A presente invenção também considera aplicação de modificação oleagínica de gêneros hospedeiros nãooleaginosos, de modo que sua oleaginicidade seja aumentada adicionalmente, ainda que mesmo após serem modificadas, elas possam não ser oleaginosas, conforme definido aqui. Em princípio, a modificação oleagínica pode ser qualquer modificação química, fisiológica, genética ou outra que altera, apropriadamente, a oleaginidade de um organismo hospedeiro quando comparado com um organismo de outro modo idêntico não submetido à modificação oleagínica. Na maioria das modalidades, contudo, a modificação oleagínica compreenderá uma modificação genética que resulta, tipicamente, em produção e/ou atividade aumentada de um ou mais polipeptídeos oleagínicos. Em algumas modalidades, a modificação oleagínica compreende pelo menos uma modificação química, fisiológica, genética ou outra; em outras modalidades, a modificação oleagínica compreende mais de uma modificação química, fisiológica, genética ou outra. Em determinados aspectos onde mais de uma modificação é utilizada, tais modificações podem compreender qualquer combinação de modificação química, fisiológica, genética ou outra (por exemplo, uma ou mais modificações genéticas e modificações químicas ou fisiológicas).
Polipeptídeos oleagínicos: O termo polipeptídeo oleagínico, conforme usado aqui, se refere a qualquer polipeptídeo que está envolvido no processo de acúmulo de lipídio em uma célula e pode incluir polipeptídeos que estão envolvidos em outros processos que não a biossíntese de lipídio, mas cujas atividades afetam a extensão ou nível de acúmulo de um ou mais lipídios, por exemplo, através de remoção de um substrato ou rea30 gente utilizado por um polipeptídeo oleagínico que está diretamente envolvido no acúmulo de lipídio. Por exemplo, conforme discutido aqui, carboxilase de acetil-CoA, decarboxilase de piruvato, dehidrogenase de isocitrato, liase
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11/89 de ATP-citrato, enzima málica e deaminase de AMP, dentre outras proteínas, estão todos envolvidos no acúmulo de lipídios em células. Em geral, espera-se que redução da atividade de decarboxilase de piruvato ou dehidrogenase de isocitrato e/ou aumento da atividade de carboxilase de acetil
CoA, liase de ATP-citrato, enzima málica e/ou deaminase de AMP promovam a oleaginidade. Cada uma dessas proteínas é um polipeptídeo oleagínico para fins da presente invenção e seqüências de exemplos representativos dessas enzimas são proporcionadas nas Tabelas 1-6.
Oleaginoso: O termo oleaginoso se refere à capacidade de um 10 organismo de acumular lipídio em pelo menos cerca de 20% de seu peso celular seco. Em determinadas modalidades da invenção, levedos ou fungos oleaginosos acumulam lipídios em pelo menos cerca de 25% de seu peso celular seco. Em outras modalidades, levedos ou fungos oleaginosos da invenção acumulam lipídio dentro da faixa de cerca de 20-45% de seu peso celular seco. Em algumas modalidades, organismos oleaginosos podem acumular lipídio em tanto quanto cerca de 70% de seu peso celular seco. Em algumas modalidades da invenção, organismos oleaginosos podem acumular uma grande fração do acúmulo total de lipídio na forma de triacilglicerol. Em determinadas modalidades, a maioria do lipídio acumulado está na forma de triacilglicerol. Alternativa ou adicionalmente, o lipídio pode se acumular na forma de corpos lipídicos intracelulares ou corpos oleosos. Em determinadas modalidades, a presente invenção utiliza levedos ou fungos que são naturalmente oleaginosos. Em alguns aspectos, organismos naturalmente oleaginosos são manipulados (por exemplo, genética, quimicamen25 te ou de outro modo) de modo a aumentar adicionalmente o nível de lipídio acumulado no organismo. Em outras modalidades, levedos ou fungos que não são naturalmente oleaginosos são manipulados (por exemplo, genética, quimicamente ou de outro modo) para acumular lipídio, conforme descrito aqui. Para fins da presente invenção, Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) e Candida utilis são fungos não naturalmente oleaginosos.
Polipeptídeo: O termo polipeptídeo, conforme usado aqui, gePetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 14/121
12/89 ralmente tem seu significado reconhecido na técnica de um polímero de pelo menos três aminoácidos. Contudo, o termo também é usado para se referir à classes funcionais específicas de polipeptídeos tais como, por exemplo, polipeptídeos oleagínicos, polipeptídeos carotenogênicos, polipeptídeos da bi5 ossíntese de isoprenóide, polipeptídeos da biossíntese de carotenóide e polipeptídeos competidores da biossíntese de isoprenóide. Para cada uma de tais classes, a presente especificação proporciona vários exemplos de seqüências conhecidas de tais polipeptídeos. Aqueles habilitados na técnica apreciarão, contudo, que o termo polipeptídeo se destina a ser suficiente10 mente geral para abranger não apenas polipeptídeos tendo a seqüência completa mencionada aqui (ou em uma referência ou banco de dados especificamente mencionado aqui), mas também abranger outros polipeptídeos que representam fragmentos funcionais (isto é, fragmentos retendo pelo menos uma atividade) de tais polipeptídeos completos. Além disso, aqueles habilitados na técnica compreenderão que seqüências de proteína geralmente toleram alguma substituição sem destruir a atividade. Assim, qualquer polipeptídeo que retém atividade e compartilha pelo menos cerca de 30-40% de identidade de seqüência global, freqüentemente maior do que cerca de 50%, 60%, 70% ou 80% e ainda usualmente incluindo pelo menos uma regi20 ão de identidade muito maior, freqüentemente maior do que 90% ou mesmo 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em uma ou mais regiões altamente conservadas (por exemplo, polipeptídeos de dehidrogenase de isocitrato freqüentemente compartilham um motivo de AMP-ligação conservado; polipeptídeos de reductase de HMG-CoA incluem, tipicamente, um domínio catalítico alta25 mente conservado (veja, por exemplo, Figura 7); carboxilase de acetil CoA tem, tipicamente, um domínio de transferase de carboxila; veja, por exemplo, Downing e colaboradores, Chem. Abs. 93: 484, 1980; Gil e colaboradores, Cell 41: 249, 1985; Jitrapakdee e colaboradores, Curr Protein Pept Sci. 4: 217, 2003; Patente U.S. Número 5.349.126, cada um dos quais é incorpora30 do aqui por referência em sua totalidade), usualmente abrangendo pelo menos 3-4 e freqüentemente até 20 ou mais aminoácidos, com outro polipeptídeo da mesma classe, é abrangido dentro do termo relevante polipeptídeo
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13/89 conforme usado aqui.
Organismo Fonte: O termo organismo fonte, conforme usado aqui, se refere ao organismo no qual uma seqüência de polipeptídeo particular pode ser encontrada na natureza. Assim, por exemplo, se um ou mais polipeptídeos heterólogos estão sendo expressos em um organismo hospedeiro, o organismo no qual os polipeptídeos são expressos na natureza (e/ou do a partir dos genes dos quais eles foram originalmente clonados) é referido como organismo fonte. Onde mais de um polipeptídeo heterólogo está sendo expresso no organismo hospedeiro, um ou mais organismos fonte podem ser utilizados para seleção independente de cada um dos polipeptídeo(s) heterólogo(s). será apreciado que qualquer e todos os organismos que contêm seqüências de polipeptídeo naturalmente relevantes podem ser usados como organismos fonte de acordo com a presente invenção. Organismos fonte representativos incluem, por exemplo, organismos fontes de animal, mamífe15 ro, inseto, planta, fungo, levedo, alga, bactéria, cianobactéria, archaebactéria e protozoário.
Descrição Detalhada de Determinadas Modalidades Preferidas da Invenção
Conforme mencionado acima, a presente invenção abrange a descoberta de que carotenóides podem, desejavelmente, ser produzidos em levedos e fungos oleaginosos. De acordo com a presente invenção, gêneros que (i) acumulam lipídio, freqüentemente na forma de corpos oleosos citoplásmicos em, tipicamente, pelo menos cerca de 20% de seu peso celular seco; e (ii) produzem carotenóide(s) em um nível de pelo menos cerca de 1% e, em algumas modalidades, pelo menos cerca de 3-20% de seu peso celular seco, são gerados através de manipulação de células hospedeiras (isto é, gêneros incluindo, por exemplo, gêneros que ocorrem naturalmente, gêneros os quais foram previamente modificados, etc.). Essas células hospedeiras manipuladas são, então, usadas para produzir carotenóides, de modo que carotenóides que participam dos corpos lipídicos possam ser prontamente isolados.
Em geral, será desejável equilibrar a oleaginidade e produção de carotenóide em células da invenção, de modo que, tão logo um nível desejáPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 16/121
14/89 vel mínimo de oleaginidade seja obtido, substancialmente todo carbono adicional o qual é capaz de ser utilizado e dirigido para a biossíntese de produtos seja dirigido a uma via de produção de carotenóide. Em algumas modalidades da invenção, essa estratégia envolve manipulação de células para serem oleaginosas; em outras modalidades, ela envolve manipulação de células para acumular um nível maior de lipídio, particularmente lipídio citoplásmico, do que elas acumulariam na ausência de tal manipulação, mesmo embora as células manipuladas possam não se tornar oleaginosas, conforme definido aqui. Em outras modalidades, a extensão até a qual uma cé10 lula hospedeira oleaginosa acumula lipídio é realmente reduzida, de modo que o carbono restante possa ser utilizado na produção de carotenóide. Células Hospedeiras
Aqueles habilitados na técnica apreciarão prontamente que existe uma variedade de gêneros de levedo e fungo que são naturalmente olea15 ginosos ou que produzem naturalmente carotenóides. Qualquer um de tais gêneros pode ser utilizado como gêneros hospedeiros de acordo com a presente invenção e pode ser projetadas ou de outro modo manipuladas para gerar os gêneros oleaginosos que produzem carotenóide da invenção. Alternativamente, gêneros que não são naturalmente oleaginosos nem produzem carotenóides podem ser empregados. Além disso, mesmo quando um gênero em particular tem uma capacidade natural para oleaginidade ou para produção de carotenóide, suas capacidades naturais podem ser ajustadas conforme descrito aqui, de modo a alterar o nível de produção de lipídio e/ou carotenóide. Em determinadas modalidades, projeção ou manipulação de um gênero resulta em modificação de um tipo de lipídio e/ou carotenóide o qual é produzido. Por exemplo, um gênero pode ser naturalmente oleaginoso e/ou carotenogênico, contudo, manipulação ou modificação do gênero pode ser empregada de modo a alterar o tipo de lipídio o qual é acumulado e/ou alterar o tipo de carotenóide o qual é produzido.
Quando de seleção de um gênero de levedo ou fúngico em particular para uso de acordo com a presente invenção, geralmente será desejável selecionar um cujas características de cultura sejam passíveis de proPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 17/121
15/89 dução em escala comercial. Por exemplo, geralmente (embora nem sempre necessariamente) será desejável evitar organismos filamentosos ou organismos com requisitos particularmente incomuns ou estringentes para condições de crescimento. Contudo, onde condições para escala produção em escala comercial podem ser aplicadas as quais permitem utilização de organismos filamentosos, esses podem ser selecionados como células hospedeiras. Em algumas modalidades da invenção, seria desejável utilizar organismos comestíveis como células hospedeiras, uma vez que eles podem, opcionalmente, ser formulados diretamente em aditivos para alimentos ou rações ou em suplementos nutricionais, conforme desejado. Para facilidade de produção, algumas modalidades da invenção utilizam células hospedeiras que são geneticamente tratáveis, passíveis de genética molecular (por exemplo, podem ser eficazmente transformadas, especialmente com vetores estabelecidos ou disponíveis; opcionalmente podem incorporar e/ou integrar genes múltiplos, por exemplo, seqüencialmente; e/ou têm seqüência genética conhecida; etc.), desprovidos de requisitos complexos de crescimento (por exemplo, uma necessidade pela luz), mesofílicos (por exemplo, preferem temperaturas de crescimento na faixa de cerca de 25-32 °C), capazes de assimilar uma variedade de fontes de carbono e nitrogênio e/ou capazes de crescimento em alta densidade celular. Alternativa ou adicionalmente, várias modalidades da invenção utilizam células hospedeiras que crescem como células únicas ao invés de organismos multicelulares (por exemplo, como micélios).
Em geral, quando é desejável utilizar um organismo naturalmen25 te oleaginoso de acordo com a presente invenção, qualquer organismo oleaginoso modificável e cultivável pode ser empregado. Em determinadas modalidades da invenção, levedos ou fungos de gêneros incluindo, mas não limitado a, Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidium, Rhodotorula,
Trichosporon e Yarrowia são empregados. Em determinadas modalidades particulares, organismos de espécies que incluem, mas não estão limitados a, Blakeslea frispora, Candida pulcherrima, C. revkaufi, C. tropicalis, CryptoPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 18/121
16/89 coccus curvatus, Cunninghamella echinulata, C. elegans, C. japonica, Lipomyces starkeyi, L. lipoferus, Mortierella alpina, M. isabellina, M. ramanniana, M. vinacea, Mucor circinelloides, Phycomyces blakesleanus, Pythium irregulare, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, R. gracilis, R.
graminis, R. mucilaginosa, R. pinicola, Trichosporon pullans, T. cutaneum e Yarrowia lipolytica, são usados.
Desses gêneros naturalmente oleaginosos, alguns também produzem naturalmente carotenóides e alguns não. Na maioria dos casos, apenas baixos níveis (menos de cerca de 0,05% em peso celular seco) de caro10 tenóides são produzidos por levedos ou fungos oleaginosos que ocorrem naturalmente. Níveis maiores de β-caroteno são, algumas vezes, produzidos, mas altos níveis de outros carotenóides geralmente não são observados.
Em geral, qualquer organismo que é naturalmente oleaginoso e não produz carotenóide (por exemplo, produz menos de cerca de 0,05% de peso celular seco, não produz o carotenóide de interesse) pode ser utilizado como uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção. Em algumas modalidades, o organismo é um levedo ou fungo de um gênero tal como, mas não limitado a, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Li20 pomyces, Mortierella, Pythium, Trichosporon e Yarrowia; em algumas modalidades, o organismo é de uma espécie incluindo, mas não limitado a, Mortierella alpina e Yarrowia lipolytica.
Comparavelmente, a presente invenção pode utilizar qualquer organismo naturalmente oleaginoso que produz carotenóide como uma célu25 la hospedeira. Em geral, a presente invenção pode ser utilizada para aumentar o fluxo de carbono na via de isoprenóide em organismos que produzem naturalmente carotenóides (particularmente para outros organismos que não Blakeslea e Phycomyces) e/ou para desviar a produção de um carotenóide (por exemplo, β-caroteno) para outro (por exemplo, astaxantina). Introdução de uma ou mais modificações carotenogênicas (por exemplo, expressão aumentada de um ou mais polipeptídeos carotenogênicos endógenos ou heterólogos) de acordo com a presente invenção, pode obter esses objetiPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 19/121
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Em determinadas modalidades da invenção, o organismo oleaginoso que produz carotenóide utilizado é um levedo ou fungo, por exemplo, um gênero tal como, mas não limitado a, Blakeslea, Mucor, Phycomyces,
Khodosporidium e Rhodotorula; em algumas modalidades, o organismo é de uma espécie tal como Mucor circinelloides e Phodotorula glutinis.
Quando é desejável utilizar gêneros que são naturalmente nãooleaginosos como células hospedeiras de acordo com a presente invenção, gêneros de levedos ou fungos não-oleaginosos incluem, mas não estão limi10 tados a, Aspergillus, Botrytis, Cercospora, Fusarium (Gibberella), Kluyveromyces, Neurospora, Penicillium, Pichia (Hansenula), Puccinia, Saccharomyces, Sclerotium, Trichoderma e Xanthophyllomyces (Phaffia); em algumas modalidades, o organismo é de uma espécie incluindo, mas não limitado a, Aspergillus nidulans, A. niger, A. terreus, Botrytis cinerea, Cercospora nicotianae, Fusarium fujikuroi (Gibberella zeae), Kluyveromyces lactis, K. lactis, Neurospora crassa, Pichia pastoris, Puccinia distincta, Saccharomyces cerevisiae, Sclerotium rolfsii, Trichoderma reesei e Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma).
Será apreciado que o termo não-oleaginoso, conforme usado aqui, abrange gêneros que têm naturalmente alguma capacidade de acumular lipídio, especialmente citoplasmicamente, mas não o fazem em um nível suficiente para qualificá-los como oleaginosos conforme definido aqui, bem como gêneros que não têm naturalmente qualquer capacidade de acumular lipídio extra, por exemplo, lipídio extra-membranoso. Será ainda apreciado que, em algumas modalidades da invenção, será suficiente aumentar o nível natural de oleaginidade de uma célula hospedeira em particular, mesmo se a célula modificada não é qualificada como oleaginosa, conforme definido aqui.
Conforme com organismos naturalmente oleaginosos, alguns dos fungos naturalmente não-oleaginosos produzem naturalmente carotenóides, enquanto que outros não. Gêneros de fungos naturalmente nãooleaginosos que não produzem naturalmente carotenóides (por exemplo,
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18/89 produzem menos de cerca de 0,05% em peso celular seco, não produzem carotenóide de interesse) podem, desejavelmente, ser usados como células hospedeiras de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, Aspergillus, Kluyveromyces, Penicillium, Saccharomyces e Pi5 chia; espécies incluem, mas não estão limitadas a, Aspergillus niger e Saccharomyces cerevisiae. Gêneros de fungos naturalmente não-oleaginosos que não produzem naturalmente carotenóides e que podem, desejavelmente, ser usados como células hospedeiras de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, Botrytis, Cercospora, Fusarium (Gibberella), Neurospora, Puccinia, Sclerotium, Trichoderma e Xanthophyllomyces (Phaffia); espécies incluem, mas não estão limitadas a, Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma).
Conforme discutido acima, qualquer um de uma variedade de organismos pode ser empregado como células hospedeiras de acordo com a presente invenção. Em determinadas modalidades da invenção, células hospedeiras serão células de Yarrowia lipolytica. Vantagens de Y. lipolytica incluem, por exemplo, genética e biologia molecular tratável, disponibilidade de seqüência genômica (veja, por exemplo, Sherman e colaboradores, Nucleic Acids Res. 32 (edição de Banco de Dados): D315-8, 2004), adequabili20 dade a várias condições de crescimento com custo eficaz e capacidade de crescer em alta densidade celular. Além disso, Y. lipolytica é naturalmente oleaginoso, de modo que menos manipulações podem ser requeridas para gerar um gênero de Y. lipolytica oleaginoso que produz carotenóide do que poderia ser requerido para outros organismos. Além disso, já existe uma ex25 periência comercial extensiva com Y. lipolytica.
Saccharomyces cerevisiae é também uma célula hospedeira útil de acordo com a presente invenção, particularmente em virtude de sua tratabilidade experimental e a experiência extensiva que os pesquisadores acumularam com o organismo. Embora cultura de Saccharomyces sob de30 terminadas condições ricas em carbono possa resultar em produção aumentada de etanol, isso geralmente pode ser gerenciado através de alterações no processo e/ou genéticas.
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Hospedeiros úteis adicionais incluem Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma), o qual é experimentalmente tratável e naturalmente carotenogênico. Gêneros de Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma) podem produzir vários carotenóides, incluindo astaxan5 tina.
Aspergillus niger e Mortierella alpina acumulam grandes quantidades de ácido cítrico e ácido graxo, respectivamente; Mortierella alpina também é oleaginoso.
Neurospora ou Gibberella também são úteis. Eles são não natu10 ralmente oleaginosos e tendem a produzir níveis muito baixos de carotenóides, assim, modificação extensiva pode ser requerida de acordo com a presente invenção. Neurospora e Gibberella são considerados relativamente tratáveis de um ponto de vista experimental. Ambos são fungos filamentosos, de modo que a produção em escalas comerciais pode ser um desafio que precisa ser superado na utilização de tais gêneros.
Mucor circinelloides é outra espécie útil disponível. Embora sua genética molecular seja geralmente menos acessível do que aquela de alguns outros organismos, ele produz β-caroteno naturalmente, assim, pode requerer menos modificação do que outras espécies disponíveis.
Genética molecular pode ser realizada em Blakeslea, embora esforço significativo possa ser requerido. Além disso, condições de fermentação com custo eficaz podem ser desafiadoras conforme, por exemplo, pode ser requerido que os dois tipos combinados sejam misturados. Fungos do gênero Phycomyces são também possíveis fontes as quais têm o potencial de impor desafios ao processo de fermentação e esses fungos também podem ser menos passíveis de manipulação do que vários outros organismos hospedeiros potenciais.
Aqueles habilitados na técnica apreciarão que a seleção de uma célula hospedeira particular para uso de acordo com a presente invenção também afetará, por exemplo, a seleção de seqüências de expressão utilizadas com qualquer polipeptídeo heterólogo a ser introduzido na célula e também influenciará vários aspectos de condições de cultura, etc. Muito se
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20/89 sabe sobre os diferentes requisitos regulatórios de gene, requisitos de seqüência de objetivação de proteína e requisitos de cultura de diferentes células hospedeiras a serem utilizadas com a presente invenção (veja, por exemplo, com relação a Yarrowia, Barth e colaboradores, FEMS Microbiol
Rev. 19: 219, 1997; Madzak e colaboradores, J Biotechnol. 109: 63, 2004;
veja, por exemplo, com relação a Xanthophyllomyces, Verdoes e colaboradores, Appl Environ Microbiol 69: 3728-38, 2003; Visser e colaboradores, FEMS Yeast Res 4: 221-31, 2003; Martinez e colaboradores, Antonie Van Leeuwenhoek. 73(2): 147-53, 1998; Kim e colaboradores, Appl Environ Mi10 crobiol. 64(5): 1947-9, 1998; Wery e colaboradores, Gene 184(1): 89-97,
1997; veja, por exemplo, com relação a Saccharomyces, Guthrie e Fink, Methods in Enzymology 194: 1-933, 1991). Em determinados aspectos, por exemplo, seqüências de objetivação da célula hospedeira (ou análogos intimamente relacionados) podem ser úteis para incluir proteínas heterólogas de direcionamento à localização subcelular. Assim, tais seqüências de objetivação úteis podem ser adicionadas à seqüência heteróloga para localização intracelular apropriada de atividade. Em outros aspectos (por exemplo, adição de seqüências de objetivação mitocondrial), seqüências de objetivação heterólogas podem ser eliminadas ou alteradas na seqüência heteróloga selecionada (por exemplo, alteração ou remoção de seqüências de objetivação de cloroplasta de planta do organismo fonte).
Manipulação de Oleaginidade
Todos os organismos vivos sintetizam lipídios para uso em suas membranas e várias outras estruturas. Contudo, a maioria dos organismos não acumula mais de cerca de 10% de seu peso celular seco como lipídio total e a maior parte desse lipídio geralmente reside dentro das membranas celulares.
Trabalho bioquímico significativo foi feito para definir as enzimas metabólicas necessárias para conferir oleaginidade a microorganismos (pri30 mariamente em virtude de manipulação de óleos de células simples, tais como fontes comerciais de ácido araquidônico e ácido docosahexaenóico; veja, por exemplo, Ratledge Biochimie 86: 807, 2004, os conteúdos dos
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21/89 quais são aqui incorporados por referência). Embora esse trabalho bioquímico seja convincente, antes da presente invenção não havia relatos de oleaginidade de novo sendo estabelecida através de engenharia genética com os genes que codificam as enzimas metabólicas chave.
Deve ser observado que organismos oleaginosos tipicamente não acumulam lipídio quando crescidos sob condições de excesso de carbono e limitação de nitrogênio ou outro nutriente. Sob essas condições, o organismo elimina prontamente o nutriente limitante, mas continua a assimilar a fonte de carbono. O carbono em excesso é canalizado para a biossín10 tese de lipídio, de modo que lipídios (usualmente triacilgliceróis) se acumulam no citosol, tipicamente na forma de corpos.
Em geral, acredita-se que, de forma a ser oleaginoso, um organismo deve produzir acetil-CoA e NADPH no citosol os quais podem, então, ser utilizados pela maquinaria de sintase de ácido graxo para gerar lipídios.
Em pelo menos alguns organismos oleaginosos, acetil-CoA é gerada no citosol através da ação da liase de ATP-citrato, a qual catalisa a reação:
(1) citrato + CoA + ATP - acetil-CoA + oxaloacetato + ADP + P,·.
Naturalmente, de forma que a liase de ATP-citrato gere níveis apropriados de acetil-CoA no citosol, ela deve primeiro ter um reservatório disponível de seu substrato, ácido cítrico. Ácido cítrico é gerado nas mitocôndrias de todas as células eucariotas através do ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) e pode ser movido para o citosol (na troca por malato) pela translocase de citrato/malato.
Na maioria dos organismos oleaginosos e em alguns organis25 mos não-oleaginosos, a enzima dehidrogenase de isocitrato, a qual opera como parte do ciclo de TCA nas mitocôndrias, é fortemente AMPdependente. Assim, quando AMP é eliminado das mitocôndrias, essa enzima é inativada. Quando dehidrogenase de isocitrato é inativa, isocitrato se acumula nas mitocôndrias. Esse isocitrato acumulado é, então, equilibrado com ácido cítrico, presumivelmente através da ação de aconitase. Portanto, sob condições de baixo AMP, citrato se acumula nas mitocôndrias. Conforme mencionado acima, citrato nas mitocôndrias é prontamente transportado
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22/89 para o citosol.
Eliminação de AMP o qual, em organismos oleaginosos, acredita-se que inicie a cascata que leve ao acúmulo de citrato (e, portanto, acetilCoA) no citoplasma, ocorre como um resultado da eliminação de nutriente mencionada acima. Quando células oleaginosas são crescidas na presença de fonte de carbono em excesso, mas sob condições limitativas para nitrogênio ou algum outro nutriente, a atividade de deaminase de AMP, a qual catalisa a reação:
(2) AMP 5'-monofosfato de inosina + NH3 10 É fortemente induzida. A atividade aumentada dessa enzima elimina o AMP celular no citosol e nas mitocôndrias. Acredita-se que eliminação de AMP das mitocôndrias inativa a dehidrogenase de isocitrato AMPdependente, resultando em acúmulo de citrato nas mitocôndrias e, portanto, no citosol. Essa série de eventos é representada diagramaticamente na Fi15 gura 2.
Conforme mencionado acima, oleaginidade requer acetil-CoA citosólica e NADPH citosólico. Acredita-se que, em muitos organismos oleaginosos, níveis apropriados de NADPH citosólico são proporcionados através da ação da enzima málica (Enzima 3 na Figura 2). Alguns organismos oleaginosos (por exemplo, Lipomyces e algumas Candida) não parecem ter enzimas málicas, contudo, de modo que evidentemente outras enzimas podem proporcionar atividade comparável, embora espera-se que uma fonte dedicada de NADPH seja, provavelmente, requerida para síntese de ácido graxo (veja, por exemplo, Wynn e colaboradores, Microbiol 145: 1911, 1999;
Ratledge, Adv. Appl. Microbiol. 51: 1, 2002, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade).
Assim, de acordo com a presente invenção, a oleaginidade de um organismo hospedeiro pode ser intensificada através de modificação da expressão ou atividade de um ou mais polipeptídeos envolvidos na geração de acetil-CoA citosólico e/ou NADPH. Por exemplo, modificação da expressão ou atividade de um ou mais de carboxilase de acetil-CoA, decarboxilase de piruvato, dehidrogenase de isocitrato, liase de ATP-citrato, enzima málica
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23/89 e AMP-deaminase pode intensificar a oleaginidade de acordo com a presente invenção. Polipeptídeos exemplificativos os quais podem ser utilizados ou derivados de modo a intensificar a oleaginidade de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, os polipeptídeos de carboxila5 se de acetil-CoA, decarboxilase de piruvato, dehidrogenase de isocitrato, liase de ATP-citrato, enzima málica e AMP-deaminase proporcionados na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Tabela 4, Tabela 5 e Tabela 6, respectivamente.
Em algumas modalidades da invenção, onde uma célula hospe10 deira oleaginosa é empregada, enzimas e componentes regulatórios relevantes para a oleaginidade já estão no lugar, mas poderiam ser modificados, se desejado, por exemplo, através de alteração da expressão ou atividade de um ou mais polipeptídeos oleagínicos e/ou através de introdução de um ou mais polipeptídeos oleagínicos heterólogos. Naquelas modalidades da invenção onde uma célula hospedeira não-oleaginosa é empregada, geralmente espera-se que pelo menos um ou mais polipeptídeos oleagínicos heterólogos sejam introduzidos.
A presente invenção considera não apenas introdução de polipeptídeos oleaginosos heterólogos, mas também ajuste dos níveis de ex20 pressão ou atividade de polipeptídeos oleagínicos endógenos ou heterólogos incluindo, por exemplo, alteração de padrões de expressão constitutiva ou induzível. Em algumas modalidades da invenção, padrões de expressão são ajustados de modo que o crescimento em condições com limitação de nutrientes não seja requerido para induzir à oleaginidade. Por exemplo, mo25 dificações genéticas compreendendo alteração e/ou adição de seqüências regulatórias (por exemplo, elementos promotores, elementos terminadores) podem ser utilizadas para conferir regulação particular de padrões de expressão. Tais modificações genéticas podem ser utilizadas em conjunto com genes endógenos (por exemplo, para regulação de polipeptídeo(s) oleagíni30 co(s) endógeno(s)); alternativamente, tais modificações genéticas podem ser incluídas de modo a conferir regulação de expressão de pelo menos um polipeptídeo heterólogo (por exemplo, polipeptídeo(s) oleagínico(s)). Por
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24/89 exemplo, promotores incluindo, mas não limitado a, promotores Tef1, Gpd1, podem ser usados em conjunto com genes endógenos e/ou genes heterólogos para modificação de expressão de padrões de polipeptídeos oleagínicos endógenos e/ou polipeptídeos oleagínicos heterólogos. Similarmente, se5 qüências terminadoras exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, uso de seqüências terminadoras XPR2 de Y. lipolytica.
Em algumas modalidades, pelo menos um polipeptídeo oleagínico é introduzido em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades da invenção, uma pluralidade (por exemplo, dois ou mais) de diferentes polipep10 tídeos oleagínicos é introduzida na mesma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a pluralidade de polipeptídeos oleagínicos contém polipeptídeos do mesmo organismo fonte; em outras modalidades, a pluralidade inclui polipeptídeos independentemente selecionados de diferentes organismos fonte.
Exemplos representativos de uma variedade de polipeptídeos oleagínicos que podem ser introduzidos em ou modificados dentro de células hospedeiras de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, aqueles proporcionados nas Tabelas 1-6. Conforme mencionado acima, espera-se que pelo menos alguns desses polipeptídeos (por exem20 plo, enzima málica e liase de ATP-citrato) mostrem atuar desejavelmente em conjunto e possivelmente junto com um ou mais componentes da sintase de ácido graxo de modo que, em algumas modalidades da invenção, será desejável utilizar dois ou mais polipeptídeos oleagínicos do mesmo organismo fonte.
Em geral, organismos fonte para polipeptídeos oleagínicos a serem usados de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon, Yarrowia, Aspergillus, Botrytis, Cercospora, Fusarium (Gibbe30 rella), Kluyveromyces, Neurospora, Penicillium, Pichia (Hansenula), Puccinia, Saccharomyces, Sclerotium, Trichoderma e Xanthophyllomyces (Phaffia). Em algumas modalidades, as espécies fonte para polipeptídeos de carPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 27/121
25/89 boxilase de acetil CoA, liase de ATP-citrato, enzima málica e/ou deaminase de AMP incluem, mas não estão limitadas a, Aspergillus nidulans, Cryptococcus neoformans, Fusarium fujikuroi, Kluyveromyces lactis, Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Ustilago maydis e Yarrowia lipolytica. Em algumas modalidades, espécies fonte para polipeptídeos de decarboxilase de piruvato ou dehidrogenase de isocitrato incluem, mas não estão limitadas a, Neurospora crassa, Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma), Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Mucor circinelloides, Rhodotorula glutinis, Candida utilis, Mortierella alpina e Yarrowia lipolytica.
Produção de Carotenóide por Manipulação
Carotenóides são sintetizados a partir de precursores de isoprenóide, alguns dos quais também estão envolvidos na produção de esteróides e esteróis. A via de biossíntese de isoprenóide mais comum, algumas vezes referida como a via de mevalonato, é representada de modo geral na Figura 3. Conforme mostrado, acetil-CoA é convertida, via hidróximetiglutaril-CoA (HMG-CoA), em mevalonato. O mevalonato é, então, fosforilado e convertido no composto com cinco carbonos pirofosfato de isopentenila (IPP). Após isomerização de IPP em pirofosfato de dimetilalila (DMAPP), três reações de condensação seqüenciais com moléculas adicionais de IPP geram a molécula com dez carbonos pirofosfato de geranila (GPP), seguido pela molécula com quinze carbonos pirofosfato de farnesila (FPP) e finalmente o composto de vinte carbonos pirofosfato de geranilgeranila (GGPP).
Uma via de biossíntese de isoprenóide alternativa que é utilizada por alguns organismos (particularmente bactérias) e é algumas vezes denominada a via mevalonato-independente é representada na Figura 4. Essa via é iniciada pela síntese de 1-deoxi-D-xiloglicose-5-fosfato (DOXP) a partir de piruvato e gliceraldeído-3-fosfato. DOXP é, então, convertida, via uma série de reações mostradas na Figura 4, em IPP, o qual isomeriza em
DMAPP e é, então, convertido, via GPP e FPP, em GGPP conforme mostrado na Figura 3 e discutido acima.
Várias proteínas envolvidas na biossíntese de isoprenóide foram
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26/89 identificadas e caracterizadas em uma série de organismos. Além disso, vários aspectos da via de biossíntese de isoprenóide são conservados através dos reinos fúngico, bacteriano, vegetal e animal. Por exemplo, polipeptídeos correspondendo à tiolase de acetoacetil-CoA, sintase de HMG-CoA, reduc5 tase de HMG-CoA, quínase de mevalonato, quínase de fosfomevalonato, decarboxilase de pirofosfato de mevalonato, isomerase de IPP, sintase de FPP e sintase de GGPP mostrados na Figura 3 foram identificados em e isolados de uma ampla variedade de organismos e células. Exemplos representativos de uma ampla variedade de tais polipeptídeos são proporciona10 dos nas Tabelas 7-15. Um ou mais dos polipeptídeos selecionados daqueles proporcionados em qualquer uma das Tabelas 7-15 podem ser utilizados ou derivados para uso nos métodos e composições de acordo com a presente invenção.
De acordo com a presente invenção, a produção de carotenóide em um organismo hospedeiro pode ser ajustada através de modificação da expressão ou atividade de uma ou mais proteínas envolvidas na biossíntese de isoprenóides. Em algumas modalidades, tal modificação envolve introdução de um ou mais polipeptídeos heterólogos da biossíntese de isoprenóide na célula hospedeira; alternativa ou adicionalmente, modificações podem ser feitas na expressão ou atividade de um ou mais polipeptídeos endógenos ou heterólogos da biossíntese de isoprenóide. Dada a conservação considerável de componentes dos polipeptídeos da biossíntese de isoprenóide, espera-se que polipeptídeos heterólogos da biossíntese de isoprenóide freqüentemente funcionem mesmo em organismos significativamente divergentes.
Além disso, seria desejável introduzir mais de um polipeptídeo heterólogo da biossíntese de isoprenóide, em muitos casos polipeptídeos de diferentes organismos fonte funcionarão juntos. Em algumas modalidades da invenção, uma pluralidade de diferentes polipeptídeos heterólogos da biossíntese de isoprenóide é introduzida na mesma célula hospedeira. Em algumas modali30 dades, essa pluralidade contém apenas polipeptídeos do mesmo organismo fonte (por exemplo, duas ou mais seqüências de, ou seqüências derivadas de, o mesmo organismo fonte); em outras modalidades, a pluralidade inclui
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27/89 polipeptídeos independentemente selecionados de diferentes organismos fonte (por exemplo, duas ou mais seqüências de, ou seqüências derivadas de, pelo menos dois organismos fonte independentes).
Em algumas modalidades da presente invenção que utilizam 5 polipeptídeos heterólogos da biossíntese de isoprenóide, os organismos fonte incluem, mas não estão limitados a, fungos dos gêneros Blakeslea, Candida, Cryptococcus, Cunninghamella, Lipomyces, Mortierella, Mucor, Phycomyces, Pythium, Rhodosporidium, Rhodotorula, Trichosporon, Yarrowia, Aspergillus, Botrytis, Cercospora, Fusarium (Gibberella), Kluyve10 romyces, Neurospora, Penicillium, Pichia (Hansenula), Puccinia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Sclerotium, Trichoderma, Ustilago e Xanthophyllomyces (Phaffia). Em determinadas modalidades, os organismos fonte são de uma espécie incluindo, mas não limitado a, Cryptococcus neoformans, Fusarium fujikuroi, Kluyveromyces lactis, Neurospora crassa, Sac15 charomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Ustilago maydis e Yarrowia lipolytica.
Conforme mencionado acima, a via de biossíntese de isoprenóide também está envolvida na produção de compostos de não-carotenóide, tais como esteróis, esteróides e vitaminas, tais como vitamina E ou vitamina
K. Proteínas que atuam sobre intermediários da via de biossíntese de isoprenóide e divergem os mesmos para a biossíntese de compostos de nãocarotenóide são, portanto, inibidores indiretos da biossíntese de carotenóide (veja, por exemplo, Figura 5, a qual ilustra pontos nos quais intermediários de isoprenóide são canalizados para outras vias de biossíntese). Tais prote25 ínas são, portanto, consideradas polipeptídeos competidores da biossíntese de isoprenóide. Espera-se que reduções do nível ou atividade de tais polipeptídeos competidores da biossíntese de isoprenóide aumentem a produção de carotenóide em células hospedeiras de acordo com a presente invenção.
Em algumas modalidades da presente invenção, produção ou atividade de polipeptídeos competidores da biossíntese de carotenóide endógenos pode ser reduzida ou eliminada em células hospedeiras. Em alguPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 30/121
28/89 mas modalidades, essa redução ou eliminação da atividade de um polipeptídeo competidor da biossíntese de isoprenóide pode ser obtida através de tratamento do organismo hospedeiro com inibidores de pequena molécula de enzimas da via de biossíntese de ergosterol. Enzimas da via de biossín5 tese de ergosterol incluem, por exemplo, sintase de esqualeno, epoxidase de esqualeno, ciclase de 2,3-oxidoesqualeno-lanosterol, 14a-demetilase de lanosterol do citocroma P450, reductase de C-14 esterol, metil oxidase de C4 esterol, metiltransferase de SAM:C-24 esterol, isomerase de C-8 esterol, desaturase de C-5 esterol, desaturase de C-22 esterol e reductase de C-24 esterol. Cada uma dessas enzimas é considerada um polipeptídeo competidor da biossíntese de isoprenóide. Reguladores dessas enzimas também podem ser considerados polipeptídeos competidores da biossíntese de isoprenóide (por exemplo, as proteínas de levedo Sut1 (Acesso ao Genbank JC4374 GI:2133159) e Mot3 (Acesso ao Genbank NP_013786 GL6323715), os quais podem ou não ter homólogos em outros organismos.
Em outras modalidades, redução ou eliminação da atividade de um polipeptídeo competidor da biossíntese de isoprenóide pode ser obtida através de diminuição de atividade da via de biossíntese de ubiquinona. A etapa obrigatória na biossíntese de ubiquinona é a formação de para20 hidróxibenzoato (PHB) a partir de tirosina ou fenilalanina em mamíferos ou corismato em bactérias, seguido por condensação de PHB e do precursor isopreno, resultando na adição de um grupo prenila. Essa reação é catalisada pela PHB-polipreniltransferase. A cadeia lateral de isoprenóide de ubiquinona é determinada pela enzima sintase de prenil-difosfato. O ácido 325 decaprenil-4-hidróxibenzóico resultante da reação de condensação de PHB e decaprenil-difosfato sofre outras modificações, as quais incluem hidroxilação, metilação e decarboxilação, de modo a formar ubiquinona (CoQ10). Assim, inibição da sintase de prenil-difosfato que leva ao farnesil-difosfato para carotenóides estendidos ou inibição de PHB-polipreniltransferase pode ser útil no aumento da quantidade de isoprenóide disponível para biossíntese de carotenóide. (Exemplos das enzimas sintase de prenil-difosfato e PHB-polipreniltransferase são representados nas Tabelas 29 e 30, respectiPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 31/121
29/89 vamente).
Inibidores de pequena molécula conhecidos de enzimas competidoras da biossíntese de isoprenóide incluem, mas não estão limitados a, ácido zaragósico (incluindo análogos do mesmo, tais como TAN1607A (Bio5 chem Biophys Res Commun, 15 de Fevereiro de 1996; 219(2): 515-520)), RPR 107393 (dihidrocloreto de 3-hidróxi-3-[4-(quinolin-6-il)fenil]-1azabiciclo[2-2-2]octano; J Pharmacol Exp Ther. Maio de 1997; 281(2): 74652), ER-28448 (sal trissódico de ácido 5-{N-[2-butenil-3-(2- metóxifenil)]-Nmetilamino}-1,1-pentilidenobis(fosfônico); Journal of Lipid Research, Vol. 41,
1136-1144, Julho de 2000), BMS-188494 (The Journal of Clinical Pharmacology, 1998; 38: 1116-1121), TAK-475 (ácido l-[2-[(3R,5S)-1-(3-acetóxi-2,2dimetilpropil)-7-cloro-1,2,3,5 -tetrahidro-2-oxo-5-(2,3-dimetóxifenil)-4,1benzoxazepina-3-il]acetil]piperidin-4-acético; Eur J Pharmacol. 11 de Abril de 2003; 466(1-2): 155-61), YM-53601 (monohidrocloreto de (E)-2-[2-fluoro-215 (quinuclidin-3-ilideno) etóxi]-9H-carbazola; Br J Pharmacol. Setembro de 2000; 131(1): 63-70) ou esqualestatina I, que inibe a sintase de esqualeno; terbinafina, que inibe a epoxidase de esqualeno; várias azolas que inibem a 14a-demetilase de lanosterol de citocroma P450; e fenpropimorph, que inibe a reductase de C-14 esterol e a isomerase de C-8 esterol. Em outras moda20 lidades, polipeptídeos competidores da biossíntese de isoprenóide heterólogos podem ser utilizados (quer funcionais ou não funcionais; em algumas modalidades, mutantes dominantes-negativos são empregados).
Um polipeptídeo competidor da biossíntese de isoprenóide particular útil de acordo com a presente invenção é sintase de esqualeno, a qual foi identificada e caracterizada a partir de uma variedade de organismos; exemplos representativos de seqüências de polipeptídeo de sintase de esqualeno são incluídos na Tabela 16. Em algumas modalidades da invenção que utilizam de sintase de esqualeno (ou modificações de sintase de esqualeno) organismos fonte incluem, mas não estão limitados a, Neurospora crassa, Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma), Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, Mucor circinelloides, Rhotorula glutinis, Candida utilis, Mortierella alpina e Yarrowia lipolytica.
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A via da biossíntese de isoprenóide se ramifica da via de biossíntese de isoprenóide no ponto onde GGPP é formado. A etapa obrigatória na biossíntese de carotenóide é a formação de fitoeno através de condensação cabeça-a-cabeça de duas moléculas de GGPP, catalisada pela sintase de fitoeno (freqüentemente denominada crtB; veja Figura 6). Uma série de reações de desidrogenação, cada uma das quais aumenta o número de ligações duplas conjugadas por dois, converte fitoeno em licopeno via neurosporeno. A via se ramifica em vários pontos, antes e após produção de licopeno, de modo que uma faixa de carotenóides pode ser gerada. Por exemplo, ação de uma enzima ciclase sobre o licopeno gera γ-licopeno; ação de uma desaturase, ao contrário, produz 3,4-didehidrolicopeno. γ-caroteno é convertido em β-caroteno através da ação de uma ciclase, β-caroteno pode ser processado em qualquer um de uma série de produtos (veja, por exemplo, Figura 6C), incluindo astaxantina (via echinona, hidróxiechinona e foenico15 xantina).
De acordo com a presente invenção, a produção de carotenóide em um organismo hospedeiro pode ser ajustada através de modificação da expressão ou atividade de uma ou mais proteínas envolvidas na biossíntese de carotenóide. Conforme indicado, em algumas modalidades, será desejá20 vel utilizar, como células hospedeiras, organismos que produzem naturalmente um ou mais carotenóides. Em alguns de tais casos, o foco estará sobre aumento da produção de um carotenóide naturalmente produzido, por exemplo, através de aumento do nível e/ou atividade de uma ou mais proteínas envolvidas na síntese desse carotenóide e/ou através de diminuição do nível ou atividade de uma ou mais proteínas envolvidas em uma via de biossíntese competitiva. Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, será desejável gerar a produção de um ou mais carotenóides não naturalmente produzidos pela célula hospedeira.
De acordo com algumas modalidades da invenção, será desejá30 vel introduzir um ou mais polipeptídeos carotenogênicos heterólogos em uma célula hospedeira. Conforme será evidente para aqueles habilitados na técnica, qualquer um de uma variedade de polipeptídeos heterólogos pode
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31/89 ser empregado; seleção considerará, por exemplo, o carotenóide em particular cuja produção tem de ser intensificada. A presente invenção considera não apenas introdução de polipeptídeos carotenogênicos heterólogos, mas também ajuste dos níveis de expressão ou atividade de polipeptídeos caro5 tenogênicos heterólogos ou endógenos incluindo, por exemplo, alteração de padrões de expressão constitutiva ou induzível. Em algumas modalidades da invenção, padrões de expressão são ajustados de modo que crescimento em condições com limitação de nutriente não é requerido para induzir à oleaginidade. Por exemplo, modificações genéticas compreendendo alteração e/ou adição de seqüências regulatórias (por exemplo, elementos promotores, elementos terminadores) podem ser utilizadas para conferir regulação particular de padrões de expressão. Tais modificações genéticas podem ser utilizadas em conjunto com genes endógenos (por exemplo, para regulação de carotenogênico endógeno); alternativamente, tais modificações genéticas podem ser incluídas de modo a conferir regulação de expressão de pelo menos um polipeptídeo heterólogo (por exemplo, polipeptídeo carotenogênico)). Por exemplo, promotores incluindo, mas não limitado a, promotores Tef1, Gpd1, podem ser usados em conjunto com os genes endógenos e/ou genes heterólogos para modificação de padrões de expressão de polipeptí20 deo(s) carotenogênico(s) endógeno(s) e/ou polipeptídeo(s) carotenogênico(s) heterólogo(s). Similarmente, seqüências terminadoras exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, uso de seqüências terminadoras XPR2 de Y. lipolytica.
Conforme indicado na Figura 6 e na literatura, proteínas envolvi25 das na biossíntese de carotenóide incluem, mas não estão limitadas a, sintase de fitoeno, dehidrogenase de fitoeno, ciclase de licopeno, cetolase de carotenóide, hidroxilase de carotenóide, sintase de astaxantina (uma enzima multifuncional única encontrada em alguns organismos fonte que, tipicamente, tem atividades de cetolase e hidroxilase), epsilon hidroxilase de carote30 nóide, ciclase de licopeno (subunidades beta e epsilon), glicosiltransferase de carotenóide e aciltransferase de acil CoA:diacilglicerol. Seqüências exemplificativas representativas para esses polipeptídeos da biossíntese de
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32/89 carotenóide são proporcionadas nas Tabelas 17-25.
Xantofilas podem ser distinguidas de outros carotenóides pela presença de grupos funcionais contendo oxigênio em seus grupos terminais cíclicos. Por exemplo, luteína e zeaxantina contêm um único grupo hidroxila sobre cada uma de suas estruturas de anel terminais, enquanto que astaxantina contém um grupo ceto e um hidroxila sobre cada anel terminal. Essa propriedade torna xantofilas mais polares do que carotenos, tais como betacaroteno e licopeno e, assim, reduz dramaticamente sua solubilidade em gorduras e lipídios. Xantofilas que ocorrem naturalmente são, freqüentemen10 te, encontradas como ésteres dos grupos hidroxila terminais, mono- e diésteres de ácidos graxos. Elas também ocorrem como glicosídeos em determinadas espécies de bactérias. A solubilidade e dispersibilidade de xantofilas podem ser grandemente modificadas através da adição de porções éster e se sabe que esterificação também pode afetar a absorção e/ou biodisponibi15 lidade de um determinado carotenóide. É um objetivo da presente invenção maximizar a quantidade de uma xantofila em particular que se acumula dentro da fração intracelular de triacilglicerídeo de levedos oleaginosos e um mecanismo para obtenção desse objetivo é aumentar a natureza hidrofóbica do produto de xantofila que se acumula. Uma forma de obter isso é manipu20 lar a produção de mono- e/ou diésteres de acila graxa do composto de xantofila alvo.
Uma variedade de enzimas pode funcionar para esterificar carotenóides. Por exemplo, glicosiltransferases de carotenóide foram identificadas em várias espécies bacterianas (veja, por exemplo, Tabela 24). Além disso, aciltransferase de acil CoA:diacilglicerol (DGAT) e aciltransferases de acil CoA:monoacilglicerol (MGAT), as quais funcionam nas etapas finais da biossíntese de triacilglicerol, provavelmente servem a um papel adicional na esterificação de xantofilas. Polipeptídeos de DGAT exemplificativos são mostrados na Tabela 25. Além disso, outras enzimas podem modificar espe30 cificamente carotenóides e moléculas de estrutura similar (por exemplo, esteróis) e estar disponíveis para modificação e produção de éster.
Em algumas modalidades da invenção, organismos fonte potenPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 35/121
33/89 ciais para polipeptídeos da biossíntese de carotenóide incluem, mas não estão limitados a, gêneros de fungos oleaginosos ou não-oleaginosos que produzem naturalmente carotenóides. Esses incluem, mas não estão limitados a, Botrytis, Cercospora, Fusapum (Gibberella), Mucor, Neurospora,
Phycomyces, Puccina, Rhodotorula, Sclerotium, Trichoderma e Xanthophyllomyces. Espécies exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, Neurospora crassa, Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma), Mucor circinelloides e Rhodotorula glutinis. Naturalmente, carotenóides são produzidos por uma ampla variedade de diversos organismos, tais como plantas, algas, levedos, fungos, bactérias, cianobactérias, etc. qualquer um de tais organismos podem ser organismos fonte para polipeptídeos da biossíntese de carotenóide de acordo com a presente invenção.
Será apreciado que a modificação carotenogênica em particular a ser aplicada a uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção será influenciada por qual(is) carotenóide(s) se deseja produzir. Por exemplo, polipeptídeos da biossíntese de isoprenóide são relevantes para a produção da maioria dos carotenóides. Polipeptídeos da biossíntese de carotenóide também são amplamente relevantes. Cetolase é particularmente relevante para a produção de cantaxantina, assim como hidroxilase é para a produção de luteína e zeaxantina, dentre outros. Hidroxilase e cetolase (ou sintase de astaxantina) são particularmente úteis para a produção de astaxantina.
Produção de Isolamento de Carotenóides
Conforme discutido acima, acúmulo de corpos lipídicos em or25 ganismos oleaginosos é geralmente induzido através de crescimento do organismo relevante na presença de uma fonte de carbono em excesso e nitrogênio limitativo. Condições específicas para indução de tal acúmulo foram previamente estabelecidas para uma série de diferentes organismos oleaginosos (veja, por exemplo, Wolf (ed.) Nonconventional yeasts in biotechno30 logy Vol. 1, Springer- Verlag, Berlin, Alemanha, páginas 313- 338; Lipids 18(9): 623, 1983; Indian J. Exp. Biol. 35(3): 313, 1997; J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30(1): 75, 2003; Bioresour Technol. 95(3): 287, 2004, cada um dos
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34/89 quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade).
Em geral, será desejável cultivar células hospedeiras modificadas da invenção sob condições que permitem acúmulo de pelo menos cerca de 20% de seu peso celular seco como lipídio. Em outras modalidades, as células hospedeiras modificadas da invenção são crescidas sob condições que permitem o acúmulo de pelo menos cerca de 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou mesmo 80% ou mais de seu peso celular seco como lipídio. Em determinadas modalidades, as células hospedeiras utilizadas são células as quais são naturalmente oleaginosas e induzidas a produzir lipídio em níveis desejados. Em outras modalidades, as células hospedeiras são células as quais produzem lipídio naturalmente, mas têm de ser manipuladas para aumentar a produção de lipídio, de modo que níveis desejados de produção e acúmulo de lipídio sejam obtidos.
Em determinadas modalidades, as células hospedeiras da invenção não são naturalmente oleaginosas, mas foram manipuladas para produzir lipídio, de modo que níveis desejados de produção de lipídio são obtidos. Aqueles habilitados na técnica apreciarão que, em geral, condições de crescimento que são eficazes para indução do acúmulo de lipídio em um organismo fonte também podem ser úteis para indução do acúmulo de lipídio em uma célula hospedeira na qual os polipeptídeos oleagínicos do organismo fonte tenham sido introduzidos. Naturalmente, modificações podem ser requeridas à luz das características da célula hospedeira, modificações as quais estão dentro da capacidade daqueles habilitados na técnica.
Também será apreciado por aqueles habilitados na técnica que geralmente será desejável assegurar que a produção do carotenóide desejado pela célula hospedeira modificada da invenção ocorre em um tempo apropriado com relação à indução de oleaginidade, de modo que o(s) carotenóide(s) se acumula(m) nos corpos lipídicos. Em algumas modalidades, será desejável induzir à produção do(s) carotenóide(s) em uma célula hospedeira a qual não produz naturalmente o(s) carotenóide(s), de modo que níveis detectáveis do(s) carotenóide(s) sejam produzidos. Em determinados
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35/89 aspectos, as células hospedeiras as quais não produzem naturalmente determinado^) carotenóide(s) são capazes de produção de outro(s) carotenóide(s) (por exemplo, determinadas células hospedeiras podem, por exemplo, produzir naturalmente β-caroteno, mas podem não produzir astaxantina); em outros aspectos, as células hospedeiras não produzem naturalmente qualquer carotenóide. Em outras modalidades, será desejável aumentar os níveis de produção de carotenóide(s) em uma célula hospedeira a qual não produz naturalmente baixos níveis do(s) carotenóide(s), de modo que níveis detectáveis aumentados do(s) carotenóide(s) são produzidos. Em determi10 nados aspectos, as células hospedeiras as quais não produzem naturalmente o(s) carotenóide(s) (por exemplo, β-caroteno) também produzem carotenóide(s) adicional (is) (por exemplo, astaxantina, etc.); em ainda outros aspectos, as células as quais produzem naturalmente o(s) carotenóide(s) (por exemplo, β-caroteno), não produzem carotenóide(s) adicional (is).
Em determinadas modalidades da invenção, será desejável acumular carotenóides em níveis (isto é, considerando-se a quantidade total de carotenóides produzidos juntos) que são maiores do que pelo menos cerca de 1% do peso seco das células. Em algumas modalidades, o acúmulo total de carotenóide nos corpos lipídicos estará em um nível de pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%, pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 6%, pelo menos cerca de 7%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 9%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 13%, pelo menos cerca de 14%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cer25 ca de 16%, pelo menos cerca de 17%, pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 19%, pelo menos cerca de 20% ou mais do peso seco total das células. Em determinadas modalidades da invenção, será desejável obter níveis totais de acúmulo de carotenóide nos corpos lipídicos (isto é, considerando-se a quantidade total de todos os carotenóides produzidos juntos) que são maiores do que pelo menos cerca de 1% do peso seco das células. Em algumas modalidades, o acúmulo total de carotenóide nos corpos lipídicos estará em um nível de pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 3%,
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36/89 pelo menos cerca de 4%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 6%, pelo menos cerca de 7%, pelo menos cerca de 8%, pelo menos cerca de 9%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 11%, pelo menos cerca de 12%, pelo menos cerca de 13%, pelo menos cerca de 14%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 16%, pelo menos cerca de 17%, pelo menos cerca de 18%, pelo menos cerca de 19%, pelo menos cerca de 20% ou mais do peso seco total das células.
Já foi demonstrado que genes carotenogênicos bacterianos podem ser transferidos para outros organismos e são, portanto, particularmen10 te úteis de acordo com a presente invenção (veja, por exemplo, Miura e colaboradores, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1226, 1998). Em outras modalidades, pode ser desejável utilizar genes de outros organismos fonte, tais como planta, alga ou microalgas; esses organismos proporcionam uma variedade de fontes potenciais para polipeptídeos de cetolase e hidroxilase. Outros organismos fonte adicionais incluem fontes fúngicas, de levedo, inseto, protozoário e mamífero de polipeptídeos.
Em determinadas modalidades, os genes de sintase de fitoeno/ciclase de licopeno multi-funcional de Mucor circinelloides e dehidrogenase de fitoeno de Neurospora crassa podem ser expressos em Yarrowia lipolytica. Subseqüente superexpressão do domínio catalítico de reductase de hidróximetilglutaril-CoA de N. crassa e/ou tratamento dos gêneros de Y. lipolytica modificados com o inibidor da sintase de esqualeno ácido zaragósico aumenta adicionalmente a produção; finalmente, genes de Paracoccus marcusii que codificam as enzimas hidroxilase de carotenóide e cetolase de carotenóide são expressos em gêneros de Y. lipolytica que produzem βcaroteno e essa modificação resulta no acúmulo de astaxantina. Abordagens similares para intensificar a produção de carotenóide poderiam ser empregadas em outros organismos hospedeiros oleaginosos e não-oleaginosos que podem ser conduzidas usando os mesmos ou polipeptídeos caroteno30 gênicos homólogos ou com funcionalidade similar.
Deverá ser observado que, para organismos da invenção que produzem mais de um carotenóide, algumas vezes será possível ajustar as
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37/89 quantidades relativas de carotenóides individuais produzidos através de ajuste das condições de crescimento. Por exemplo, foi reportado que controle da concentração de oxigênio dissolvido em uma cultura durante cultivo pode regular os níveis relativos de produção de determinados carotenóides, tais como β-caroteno, echinenona, β-criptoxantina, 3-hidróxiechinenona, asteroidenona, cantaxantina, zeaxantina, adonirubina, adonixantina e astaxantina (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Número 6.825.002 para Tsubokura e colaboradores, os conteúdos todos da qual são aqui incorporados por referência).
Particularmente para modalidades da presente invenção dirigidas à produção de astaxantina, freqüentemente será desejável utilizar um ou mais genes de um organismo que produz naturalmente astaxantina. Onde múltiplos polipeptídeos heterólogos têm de ser expressos, pode ser desejável utilizar o mesmo organismo fonte para todos ou utilizar organismos fonte intimamente relacionados.
Uma vantagem proporcionada pela presente invenção é que, alem de permitir a produção de altos níveis de carotenóides, a presente invenção permite que aqueles compostos produzidos sejam prontamente isolados porque eles se acumulam nos corpos lipídicos dentro de organismos oleaginosos. Métodos e sistemas para isolamento de corpos lipídicos foram estabelecidos para uma variedade de organismos oleaginosos (veja, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos 5.164.308; 5.374.657; 5.422.247; 5.550.156; 5.583.019; 6.166.231; 6.541.049; 6.727.373; 6.750.048; e 6.812.001, cada uma das quais é incorporada aqui por referência em sua totalidade). Em resumo, células são, tipicamente, recuperadas da cultura, freqüentemente através de secagem por pulverização, filtração ou centrifugação. Em alguns casos, as células são homogeneizadas e, então, submetidas à extração com líquido supercrítico ou extração com solvente (por exemplo, com solventes tais como clorofórmio, hexano, cloreto de metileno, metanol, isopropanol, acetato de etila, etc.), proporcionando uma suspensão oleosa bruta. Essa suspensão oleosa pode, opcionalmente, ser refinada, conforme conhecido na técnica. Óleos refinados podem ser usados diretaPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 40/121
38/89 mente como aditivos para alimentos ou rações. Alternativa ou adicionalmente, carotenóides pode ser isolados do óleo usando técnicas convencionais.
Dada a sensibilidade dos carotenóides em geral à oxidação, muitas modalidades da invenção empregam estabilizantes oxidativos (por exemplo, tocoferóis, vitamina C; etóxiquina; vitamina E, BHT, BHA, TBHQ, etc. ou combinações dos mesmos) durante e/ou após isolamento de carotenóide. Alternativa ou adicionalmente, microencapsulação, por exemplo, com proteínas, pode ser empregada para adicionar uma barreira física à oxidação e/ou melhorar a manipulação (veja, por exemplo, Pedido de Patente U.S.
2004/0191365).
Usos
Os carotenóides produzidos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados em qualquer uma de uma variedade de aplicações, por exemplo, explorando suas propriedades biológicas ou nutricionais (por exemplo, anti-oxidativa, anti-proliferativa, etc.) e/ou suas propriedades de pigmento. Por exemplo, de acordo com a presente invenção, carotenóides podem ser usados em produtos farmacêuticos (veja, por exemplo, Bertram, Nutr. Rev. 57: 182, 1999; Singh e colaboradores, Oncology 12: 1643, 1998; Rock, Pharmacol. Titer. 75: 185, 1997; Edge e colaboradores, J. Photochem
Photobiol 41: 189, 1997; Pedido de Patente U.S. 2004/0116514; Pedido de Patente U.S. 2004/0259959), suplementos alimentícios (veja, por exemplo, Koyama e colaboradores, J. Photochem Photobiol 9: 265, 1991 ; Bauernfeind, Carotenoids as colorants and vitamin A precursors, Academic Press, NY, 1981 ; Pedido de Patente U.S. 2004/0115309; Pedido de Patente U.S.
2004/0234579), aplicações eletro-ópticas, aditivos para rações para animais (veja, por exemplo, Krinski, Pure Appl. Chem. 66: 1003, 1994; Polazza e colaboradores, Meth. Enzymol. 213: 403, 1992), cosméticos (como antioxidantes e/ou como cosméticos, incluindo fragrâncias; veja, por exemplo, Pedido de Patente U.S. 2004/0127554), etc. Os carotenóides produzidos de acordo com a presente invenção podem também ser usados como intermediários na produção de outros compostos (por exemplo, esteróides, etc.).
Por exemplo, astaxantina e/ou ésteres da mesma podem ser
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39/89 úteis em uma variedade de aplicações farmacêuticas e alimentos saudáveis, incluindo tratamento de doenças inflamatórias, asma, dermatite atópica, alergias, mieloma múltiplo, arteriosclerose, doença cardiovascular, doença hepática, doença cérebrovascular, trombose, doenças relacionadas à neo5 angiogênese, incluindo câncer, reumatismo, retinopatia diabética; degeneração macular e distúrbio cerebral, hiperlipidemia, isquemia renal, diabetes, hipertensão, proliferação e metástase de tumor; e distúrbios metabólicos. Adicionalmente, carotenóides e astaxantina podem ser úteis na prevenção e tratamento de fadiga, para melhora da função renal em nefropatia por doen10 ças inflamatórias, bem como prevenção e tratamento de outras doenças relacionadas ao estilo de vida. Ainda, descobriu-se que a astaxantina exerce um papel como inibidores de vários processos biológicos, incluindo inibidores de interleucina, inibidores de fosfodiesterase, inibidores de fosfolipase A2, inibidores de ciclooxigenase 2, inibidores de metaloproteinase da matriz, inibidores de proliferação de células do endotélio capilar, inibidores de lipoxigenase. Veja, por exemplo, Publicação Japonesa No. 2006022121, publicada em 26/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301156 depositado em 17/10/ 2005); Publicação Japonesa No. 2006016408, publicada em 19/01/2006(Pedido JP No. 2005-301155 depositado em 17/10/2005); Publicação Japonesa No.
2006016409, publicada em 19/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301157 depositado em 17/10/2005); Publicação Japonesa No. 2006016407, publicada em 10/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301153 depositado em 17/10/2005); Publicação Japonesa No. 2006008717, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301151 depositado em 17/10/2005); Publicação Japonesa No.
2006008716, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301150 depositado em 17/10/2005); Publicação Japonesa No. 2006008720, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005- 301158 depositada em 17/10/2005); Publicação Japonesa No. 2006008719, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301154 depositado em 17/10/2005); Publicação Japonesa No.
2006008718, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301152 depositado em 17/10/2005); Publicação Japonesa No. 2006008713, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301147 depositado em 17/10/2005); PubliPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 42/121
40/89 cação Japonesa No. 2006008715, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301149 depositado em 17/10/2005); Publicação Japonesa No. 2006008714, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301148 depositado em 17/10/2005); e Publicação Japonesa No. 2006008712, publicada em 12/01/2006 (Pedido JP No. 2005-301146 depositado em 17/10/2005).
Será apreciado que, em algumas modalidades da invenção, os carotenóides produzidos pelas células hospedeiras manipuladas conforme descrito aqui são incorporados em um produto final (por exemplo, suplemento para alimento ou ração, produto farmacêutico, cosmético, artigo contendo corante, etc.) no contexto da célula hospedeira. Por exemplo, células hospedeiras podem ser liofilizadas, congeladas a seco, congeladas ou de outro modo inativadas e, então, células inteiras podem ser incorporadas em ou usadas como o produto final. A célula hospedeira também pode ser processada antes de incorporação no produto para aumentar a biodisponibilidade (por exemplo, via lise). Alternativa ou adicionalmente, um produto final pode incorporar apenas uma parte da célula hospedeira (por exemplo, fracionada pelo tamanho, solubilidade), separada do todo. Por exemplo, em algumas modalidades da invenção, gotículas de lipídio são isoladas das células hospedeiras e são incorporadas em ou usadas como o produto final. Em outras modalidades, os carotenóides em si ou compostos de carotenóide individuais são isolados e reformulados no produto final.
Conforme estabelecido acima, ácido graxo e ésteres de glicosídeo são os ésteres de carotenóide predominantes encontrados na natureza, enquanto que ésteres adicionais (por exemplo, com ácidos orgânicos ou fos25 fato inorgânico) podem ser sintetizados para gerar formas de produto úteis. Para distribuição, ésteres de carotenóide também podem ser formulados como sais da forma de éster (veja, por exemplo, Publicação de Patente US No. 20050096477).
A quantidade de carotenóide incorporado em um determinado produto pode variar dramaticamente dependendo do produto do(s) carotenóide(s) envolvido(s) em particular. Quantidades podem oscilar, por exemplo, de menos de 0,01% em peso do produto.
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Em algumas modalidades da invenção, um ou mais carotenóides produzidos são incorporados em um componente de alimento ou ração (por exemplo, um suplemento alimentício). Tipos de produtos alimentícios nos quais carotenóides podem ser incorporados de acordo com a presente in5 venção não são particularmente limitados e incluem bebidas, tais como chás, sucos e licores; produtos de confeitaria, tais como geléias e biscoitos; alimentos e bebidas contendo gordura, tais como produtos lácteos; produtos alimentícios processados, tais como arroz e arroz macio (ou mingau); fórmulas infantis; ou semelhante. Em algumas modalidades desse aspecto da in10 venção, pode ser útil incorporar os carotenóides dentro de corpos de lipídios comestíveis, uma vez que isso pode facilitar incorporação em determinados produtos alimentícios contendo gordura.
Exemplos de matérias corantes nas quais carotenóides produzidos de acordo com a presente invenção podem ser incorporados incluem, por exemplo, rações para animais de estimação, tais como rações para gato, rações para cães e semelhantes, rações para peixes de aquário, peixe cultivado ou crustáceos, etc., ração para animais criados em fazenda (incluindo animais de criação e outros incluindo peixe ou crustáceos criados em aqüicultura). Material para alimento ou ração no qual o(s) carotenóide(s) produ20 zido(s) de acordo com a presente invenção é(são) incorporado(s) é, de preferência, ingerível para o organismo o qual é o recipiente pretendido. Esse material para alimento ou ração pode ter quaisquer propriedades físicas atualmente conhecidas para um material alimentício (por exemplo, sólido, líquido, macio).
Em algumas modalidades da invenção, um ou mais carotenóides produzidos são incorporados em um produto cosmético. Exemplos de tais cosméticos incluem, por exemplo, cosméticos para a pele (por exemplo, loções, emulsões, cremes e semelhantes), batom, cosméticos antiqueimadura solar, cosméticos para maquiagem, fragrâncias, produtos para uso diário (por exemplo, pasta de dente, lavagens bucais, agentes preventivos de mal hálito, sabões sólidos, xampus, condicionadores).
Em algumas modalidades, um ou mais carotenóides produzidos
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42/89 são incorporados em um produto farmacêutico. Exemplos de tais produtos farmacêuticos incluem, por exemplo, vários tipos de tabletes, cápsulas, agentes para bebida, pastilhas, gargarejos, etc. Em algumas modalidades, o produto farmacêutico é adequado para aplicação tópica. Formas de dosa5 gem não estão particularmente limitadas e incluem cápsulas, óleos, grânulos, subunidades de grânulos, pós, tabletes, pílulas, pastilhas ou semelhante. Óleos e cápsulas cheias de óleo podem proporcionar vantagens adicionais em virtude de sua falta de decomposição de ingrediente durante fabricação e porque as gotículas de lipídio contendo carotenóide da invenção podem ser prontamente incorporadas em formulações baseadas em óleo.
Produtos farmacêuticos de acordo com a presente invenção podem ser preparados de acordo com métodos estabelecidos na técnica incluindo, por exemplo, o procedimento comum conforme descrito na United States Pharmacopoeia, por exemplo.
Os carotenóides produzidos de acordo com a presente invenção podem ser incorporados em qualquer produto contendo pigmento incluindo, por exemplo, tecido, tinta, etc. Eles também podem ser incorporados em um produto o qual é um indicador ambiental ou um instrumento, tal como um bio-sensor para uso como um agente de detecção.
EXEMPLIFICAÇÃO:
A Tabela 26 abaixo descreve determinados gêneros de Yarrowia lipolytica usados na exemplificação a seguir: TABELA 26: Generos de Yarrowia lipolytica.
NRRL Y1095 Diplóide do tipo silvestre
ATCC6861 MATB ura2-21 lyc1-5 LUS1-5B
ATCC6982 MATB ade1 leu2-35 lyc1-5 xpr2
ARCC201249 MATA ura3-302 leu2-270 lys8-11 PEX17-HA
MF346 MATA ura2-21 ATCC76861 x ATCC201249
MF350 MATB ura2-21 leu2-35 ade1 ATCC76982 x MF346
(Os genotipos em LYC1, LYS1, XPR2 e PEX17 não foram dePetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 45/121
43/89 terminados em cruzamentos, nem verificados com relação a gêneros na ATCC)
Todos os procedimentos de manipulação de DNA e biológica molecular básica descritos aqui são geralmente realizados de acordo com
Sambrook e colaboradores ou Ausubel e colaboradores. (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (eds). 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York; Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K (eds). 1998. Current Protocols in Molecular Biology. Wiley: New York).
Exemplo 1: Produção de plasmídeos para construção de gêneros que produzem carotenóide
Plasmídeos foram gerados para construção de gêneros que produzem carotenóide. As seguintes subpartes descrevem a produção de plasmídeos que codificam polipeptídeos carotenogênicos. Plasmídeos usados nesse estudo e detalhes de sua construção são descritos na Tabela 27.
Detalhes adicionais de construção de plasmídeo e descrições de seu uso são encontrados no texto da sub-seção relevante. Todas as amplificações por PCR usaram DNA genômico de NRRL Y-1095 como template, a menos que de outro modo especificado. O gene URA5 descrito abaixo é alé20 lico, com a auxotrofia ura2-21 acima. Os promotores GPD1 e TEF1 são de Y. lipolitica, assim como o terminador XPR2.
GGS1 é o gene que codifica o gene de codificação de sintase de pirofosfato de geranilgeranila de Y. lipolitica. A seqüência de codificação de ácido nucleico e a proteína Ggs1 codificada de pMB4591 e pMB4683 são como segue:
atggattataacagcgcggatttcaaggagatatggggcaaggccgccgacaccgcgctgctgggaccgtacaactacctcgccaacaaccggggccacaacatcagagaacacttgatcgcagcgttcggagcggttatcaaggtggacaagagcgatctcgagaccatttcgcacatcaccaagattttgcataactcgtcgctgcttgttgatgacgtggaagacaactcgatgctccga30 cgaggcctgccggcagcccattgtctgtttggagtcccccaaaccatcaactccgccaactacatgtactttgtggctctgcaggaggtgctcaagctcaagtcttatgatgccgtctccattttcaccgaggaaatgatcaacttgcatagaggtcagggtatggatctctactggagagaaacactPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 46/121
44/89 cacttgcccctcggaagacgagtatctggagatggtggtgcacaagaccggtggactgtttcggctggctctgagacttatgctgtcggtggcatcgaaacaggaggaccatgaaaagatcaactttgatctcacacaccttaccgacacactgggagtcatttaccagattctggatgattacctcaacctgcagtccacggaattgaccgagaacaagggattctgcgaagatatcag5 cgaaggaaagttttcgtttccgctgattcacagcatacgcaccaacccggataaccacgagattctcaacattctcaaacagcgaacaagcgacgcttcactcaaaaagtacgccgtggactacatgagaacagaaaccaagagtttcgactactgcctcaagaggatacaggccatgtcactcaaggcaagttcgtacattgatgatctagcagcagctggccacgatgtctccaagctacgagccattttgcattattttgtgtccacctctgactgtgaggagagaaagtact ttgaggatgcgcagtga (SEQ
ID NO:1) mdynsadfkeiwgkaadtallgpynylanmghnirehliaafgavikvdksdletishitkilhnssllvddvednsmlrrglpaahclfgvpqtinsanymyfvalqevlklksydavsifteeminlhrgqgmdlywretltcpsedeylemvvhktgglfrlalrlmlsvaskqedhekinfdlthltdtlgviyqilddylnlqsteltenkgfcedisegkfsfplihsirtnpdnhei15 lnilkqrtsdaslkkyavdymrtetksfdyclkriqamslkassyiddlaaaghdvsklrailhyfvstsdceerkyfedaq (SEQ ID NO:2)
TABELA 27: Plasmídeos
Plasmídeo Parte principal Inserto Oligos ou fonte
pMB4529 PCR2.1 Produto de PCR ADE1 de 3,4 kb MO4475 & MO4476
pMB4534 PCR2.1 Produto de PCR LEU2 de 2,1 kb MO4477 & MO4478
pMB4535 PCR2.1 Produto de PCR URA5 de 1,2 kb MO4471 & MO4472
pMB4589 pMB4535 (KpnI + Spe I) Promotor GPD1 de 1,2 kb (KpnI + NotI); terminador XPR2 de 0,14 kb (NotI + Spe I) MO4568 & MO4591; MO4566 & MO4593
pMB4590 pMB4535 (KpnI + SpeI) Promotor TEF1 de 0,4 kb (KpnI + NotI); terminador XPR2 de 0,14 kb (NotI + Spe I) MO4571 & MO4592; MO4566 & MO4593
pMB4591 pMB4590 (NheI + MluI) ORF de GGS1 de 0,1 kb (XbaI + MluI) MO4534 & MO4544
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Plasmídeo Parte principal Inserto Oligos ou fonte
pMB4597 pMB4534 (Acc65I + Spe I) Promotor GPD1 & terminador XPR2 (Acc65I + SpeI) do pMB4589
pMB4603 pMB4597 (RsrII + M/uI) Parte principal residual & promotor TEF1 (RsrII + M/uI) do pMB4590
pMB4616 pMB4529 (RsrII + Spe I) Parte principal residual & promotor GPD1 & terminador XPR2 (RsrII + SpeI) do pMB4589
pMB4629 pMB4616 (RsrII + M/uI) Parte principal residual & promotor TEF1 (RsrII + M/uI) do pBM4590
pMB4631 pMB4603 (KpnI + Nhe I) Promotor GPD1 de 1,2 kb (KpnI + NheI) MO4568 & MO4659
pMB4628 pMB4603 Carp Veja 1A
pMB4637 pMB4629 (NheI + M/uI) ORF hmg1trunc de 1,5 kb (XbaI + M/uI) Veja 1D
pMB4638 pMB4629 carB(i*) Veja 1B
pMB4660 pMB4638 (+URA3) carB(i*) Veja 1C
pMB4662 pMB4631 (SpeI + XhoI) Fragmento URA3 de 1,8 kb (SpeI + BsaI) MO4684 & MO4685, veja 1C
pMB4683 pMB4662 (Acc65I + M/uI) Fragmento tef1p-GGS1 de 1,4 kb (Acc65I + M/uI) do pMB4591
pMB4692 pMB4662 (Acc65I + M/uI) Promotor TEF1 de 0,4 kb (Acc65I + NheI); ORF de crtZ de 0,5 kkb (XbaI + M/uI) Veja 1E
pMB4698 pMB4629 (NheI + M/uI) ORF de crtW de 0,9 kb (XbaI + M/uI) Veja 1F
pMB4599 pBluescriptSKII- (EcoRV) Gene carRP de 1,9 kb MO4525 & MO4541
pMB4606 pBluescriptSKII- (EcoRV) Gene carB de 1,9 kb MO4530 & MO4542
pMB4613 pMB4599 (Acc65I + PpuMI) carRP(i*) Veja texto
pMB4619 pBluescriptSKII(BarnHI + Acc65I) carRP(i*) Veja texto
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Determinados oligonucleotídeos mencionados na Tabela 27 acima são como segue:
MO4471 5'-CTGGGTGACCTGGAAGCCTT (SEQ ID NO:3)
MO4472 5'-AAGATCAATCCGTAGAAGTTCAG (SEQ ID NO:4)
MO4475 5'-AAGCGATTACAATCTTCCTTTGG (SEQ ID NO:5)
MO4476 5'-CCAGTCCATCAACTCAGTCTCA (SEQ ID NO:6)
MO4477 5'-GCATTGCTTATTACGAAGACTAC (SEQ ID NO:7)
MO4478 5'-CCACTGTCCTCCACTACAAACAC (SEQ ID NO:8)
MO4534 5'-CACAAACGCGTTCACTGCGCATCCTCAAAGT (SEQ ID
NO:9)
MO4544 5'-CACAATCTAGACACAAATGGATTATAACAGCGCGGAT (SEQ ID NO:10)
MO4566 5'-CACAAACTAGTTTGCCACCTACAAGCCAGAT (SEQ ID
NO:11)
MO4568 5'- CACAAGGTACCAATGTGAAAGTGCGCGTGAT (SEQ ID
NO:12)
MO4571 5'-CACAAGGTACCAGAGACCGGGTTGGCGG (SEQ ID
NO:13)
MO4591 5'- CACAAGCGGCCGCGCTAGCATGGGGATCGATCTCTTATAT (SEQ ID NO:14)
MO4592 5'CACAAGCGGCCGCGCTAGCGAATGATTCTTATACTCAGAAG (SEQ ID NO:15)
MO4593 5'CACAAGCGGCCGCACGCGTGCAATTAACAGATAGTTTGCC (SEQ ID NO:16)
MO4659 5'- CACAAGCTAGCTGGGGATGCGATCTCTTATATC (SEQ ID
NO:17)
1A: Produção de pMB4628 (tef1p-carRP LEU2) que codifica sintase de fitoeno/ciclase de licopeno: carRP contendo íntron foi amplificado de DNA genômico de M. circinelloides (ATCC 90680) usando MO4525 e MO4541:
MO4525 5'-CACAAACGCGTTTAAATGGTATTTAGATTTCTCATT (SEQ
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ID NO:18)
MO4541 5'-CACAATCTAGACACAAATGCTGCTCACCTACATGGA (SEQ
ID NO:19) e o fragmento de 1,9 kb resultante foi fosforilado com quínase de polinucleo5 tídeo T4. O fragmento resultante teve a extremidade cega ligada no pBluescriptSKII clivado com EcoRV, proporcionando pMB4599. O fragmento XbaIMluI de 1,9 kb do pMB4599 foi inserido no pMB4603 clivado com NheI e MluI, proporcionando pMB4628. A seqüência de codificação de ácido nucleico contendo íntron e a proteína CarRP codificada do pMB4628 são como segue:
atgctgctcacctacatggaagtccacctctactacacgctgcctgtgctgggcgtcctgtcctggctgtcgcggccgtactacacagccaccgatgcgctcaaattcaaatttctgacactggttgccttcacgaccgcctccgcctgggacaactacattgtctaccacaaggcgtggtcctactgccccacctgcgtcaccgctgtcattggctacgtgcccttggaggagtacatgttctt15 catcatcatgactctgttgaccgtggcattcaccaatctggtgatgcgctggcacctgcacagcttctttatcaggcctgaaacgcccgtcatgcagtccgtcctggtccgtcttgtccccataacagccttattaatcactgcatacaaggcttgggtaagcaaacaaacaaatgatgtgccgcatcgcattttaatattaaccattgcatacacagcatttggcggtccctggaaagccactgttctacggatcatgcattttgtggtacgcctgtccggttttggccttattgtggtttggtg20 ctggcgagtacatgatgcgtcgtccgctggcggtgctcgtctccattgcgctgcccacgctgtttctctgctgggtcgatgtcgtcgctattggcgccggcacatgggacatttcgctggccacaagcaccggcaagttcgtcgtgccccacctgcccgtggaggaattcatgttctttgcgctaattaataccgttttggtatttggtacgtgtgcgatcgatcgcacgatggcgatcctccacctgttcaaaaacaagagtccttatcagcgcccataccagcacagcaagtcgttcctccacca25 gatcctcgagatgacctgggccttctgtttacccgaccaagtgctgcattcagacacattccacgacctgtccgtcagctgggacatcctgcgcaaggcctccaagtccttttacacggcctctgctgtctttcccggcgacgtgcgccaagagctcggtgtgctatacgccttttgcagagccacggacgatctctgcgacaacgagcaggtccctgtgcagacgcgaaaggagcagctgatactgacacatcagttcgtcagcgatctgtttggccaaaagacaagcgcgccgactg30 ccattgactgggacttttacaacgaccaactgcctgcctcgtgcatctctgccttcaagtcgttcacccgtttgcgccatgtgctggaagctggagccatcaaggaactgctcgacgggtacaagtgggatttggagcgtcgctccatcagggatcaggaggatctcagatattactcagPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 50/121
48/89 cttgtgtcgccagcagtgttggtgaaatgtgcactcgcatcatactggcccacgccgacaagcccgcctcccgccagcaaacacagtggatcattcagcgtgcgcgtgaaatgggtctggtactccaatatacaaacattgcaagagacattgtcaccgacagcgaggaactgggcagatgctacctgcctcaggattggcttaccgagaaggaggtggcgctgattcaaggcggccttgcccgagaa5 attggcgaggagcgattgctctcactgtcgcatcgcctcatctaccaggcagacgagctcatggtggttgccaacaagggcatcgacaagctgcccagccattgtcaaggcggcgtgcgtgcggcctgcaacgtctatgcttccattggcaccaagctcaagtcttacaagcaccactatcccagcagagcacatgtcggcaattcgaaacgagtggaaattgctcttcttagcgtatacaacctttacaccgcgccaattgcgactagtagtaccacacattgcagacagggaaaaa10 tgagaaatctaaataccatttaa (SEQ ID NO:20) mlliymevhlyytlpvlgvlswlsrpyytatdalkfkfltlvafttasawdnyivyhkawsycptcvtavigyvpleeymffiimtiltvaftalvmrwhlhsffirpetpvmqsvlvrlvpitallitaykawhlavpgkplfygscilwyacpvlallwfgageymmixplavlvsialptlflcwvdvvaigagtwdislatstgkfvvphlpveefmffalintvlvfgtcaidrtmai15 lhlfknkspyqrpyqhsksflhqilemtwafclpdqvlhsdtfhdlsvswdilrkasksfytasavfpgdvrqelgvlyafcratddlcdneqvpvqtrkeqlilthqfvsdlfgqktsaptaidwdfyndqlpascisafksftrlrhvleagaikelldgykwdlerrsirdqedlryysacvassvgemctriilahadkpasrqqtqwiiqraremglvlqytniardivtdseelgrcylpqdwltekevaliqgglareigeerllslshrliyqadelmvvankgidkl20 pshcqggvraacnvyasigtklksykhhypsrahvgnskrveiallsvynlytapiatsstthcrqgkmrnlnti (SEQ ID NO:21)
Alternativamente, pMB4599 também foi usado como um template para amplificação por PCR usando MO4318, MO4643, MO4644 e MO4639:
MO4318 5'-GTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID NO:22)
MO4643 5 '-CACACGGTCTCATGCCAAGCCTTGTATGCAGTGATTAA (SEQ ID NO:23)
MO4639 5'-CCACTGTGTTTGCTGGCGG (SEQ ID NO:24)
MO4644 5'- CACACGGTCTCTGGCATTTGGCGGTCCCTGGAAA (SEQ
ID NO:25) e produziu fragmentos de 0,5 e 0,95 kb, que foram subseqüentemente clivados com Acc65I e SsaI e SsaI e PpuMI, respectivamente. Esses fragmentos
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49/89 foram ligados ao pMB4599 que tinha sido digerido com ^cc65I e PpuMI, proporcionando pMB4613, abrigando carRP sem íntron. O fragmento XbaIMluI de 1,85 kb de pMB4613 pode ser inserido no pMB4603 clivado com NheI e MluI para proporcionar pCarRPdelI.
1B: Produção de pMB4638 (tef1p-carB ADE1) que codifica dehidrogenase de fitoeno: carB contendo íntron foi amplificado de DNA genômico de M. circinelloides (ATCC 90680) usando MO4530 e MO4542:
MO4530 5'-CACAAACGCGTTTAAATGACATTAGAGTTATGAAC (SEQ
ID NO:26)
MO4542 5'-CACAATCTAGACACAAATGTCCAAGAAACACATTGTC (SEQ ID NO:27) e o fragmento resultante de 1,9 kb foi fosforilado com quínase de polinucleotídeo T4 e a extremidade cega ligada ao pBS-SKII clivado com EcoRV, proporcionando pMB4606. pMB4606 foi, então, usado como um template para amplificação por PCR usando MO4318 e MO4648 e MO4646 e MO4647 e MO4343 e MO4645:
MO4318 5 '-GTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID NO:28)
MO4648 5'-CACAAGGTCTCAAGCACGCATCCCGGAACTG (SEQ ID
NO:29)
MO4646 5 '-CACACGGTCTCAGGCATGTCGCCCTACGATGC (SEQ ID
NO:30)
MO4647 5'-CACACGGTCTCATGCTTGCACCCACAAAGAATAGG (SEQ
ID NO:31)
MO4343 5'-CAGGAAACAGCTATGAC (SEQ ID NO:32)
MO4645 5 ' -CACACGGTCTCTTGCCCATATACATGGTCTGAAACG (SEQ ID NO:33) produzindo fragmentos de 0,4 e 0,85 e 0,7 kb, que foram subseqüentemente clivados com ^cc65I e BsaI e BsaI e BsaI e BamHI, respectivamente. Esses fragmentos foram ligados ao pBS-SKII que tinha sido cortado com ^cc65I e
BamRI, proporcionando pMB4619, abrigando carB sem íntron. O fragmento XbaI-MluI de 1,75 kb do pMB4619 foi inserido no pMB4629 clivado com NheI e MluI, proporcionando pMB4638. A seqüência de codificação de ácido nuPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 52/121
50/89 cleico resultante e a proteína CarB codificada do pMB4638 são como segue: atgtccaagaaacacattgtcattatcggtgctggcgtgggtggcacggctacagctgctcgtttggcccgcgaaggcttcaaggtcactgtggtggagaaaaacgactttggtggcggccgctgctccttgatccatcaccagggccatcgctttgatcagggcccgtcgctctacctgatg5 cccaagtactttgaggacgcctttgccgatctggacgagcgcattcaagaccacctggagctgctgcgatgcgacaacaactacaaggtgcactttgacgacggtgagtcgatccagctgtcgtctgacttgacacgcatgaaggctgaattggaccgcgtggagggcccccttggttttggccgattcctggatttcatgaaagagacacacatccactacgaaagcggcaccctgattgcgctcaagaagaatttcgaatccatctgggacctgattcgcatcaagtacgctccagagatcttt10 cgcttgcacctgtttggcaagatctacgaccgcgcttccaagtacttcaagaccaagaagatgcgcatggcattcacgtttcagaccatgtatatgggcatgtcgccctacgatgcgcctgctgtctacagcctgttgcagtacaccgagttcgctgaaggcatctggtatccccgtggcggcttcaacatggtggttcagaagctagaggcgattgcaaagcaaaagtacgatgccgagtttatctacaatgcgcctgttgccaagattaacaccgatgatgccaccaaacaagtgacaggtg15 taaccttggaaaatggccacatcatcgatgccgatgcggttgtgtgtaacgcagatctggtctatgcttatcacaatctgttgcctccctgccgatggacgcaaaacacactggcttccaagaaattgacgtcttcttccatttccttctactggtccatgtccaccaaggtgcctcaattggacgtgcacaacatctttttggccgaggcttatcaggagagctttgacgaaatcttcaaggactttggcctgccttctgaagcctccttctacgtcaatgtgccctctcgcatcgatccttctg20 ctgctcccgacggcaaggactctgtcattgtcttggtgcctattggtcatatgaagagcaagacgggcgatgcttccaccgagaactacccggccatggtggacaaggcacgcaagatggtgctggctgtgattgagcgtcgtctgggcatgtcgaatttcgccgacttgattgagcatgagcaagtcaatgatcccgctgtatggcagagcaagttcaatctgtggagaggctcaattctgggtttgtctcatgatgtgcttcaggtgctgtggttccgtcccagcacaaaggattctaccgg25 tcgttatgataacctattctttgtgggtgcaagcacgcatcccggaactggtgttcccattgtccttgcaggaagcaagctcacctctgaccaagttgtcaagagctttggaaagacgcccaagccaagaaagatcgagatggagaacacgcaagcacctttggaggagcctgatgctgaatcgacattccctgtgtggttctggttgcgcgctgccttttgggtcatgtttatgttcttttacttcttccctcaatccaatggccaaacgcccgcatcttttatcaataatttgttacctgaagta30 ttccgcgttcataactctaatgtcatttaa (SEQ ID NO:34) mskkhiviigagvggtataarlaregfkvtvvekndfgggrcslihhqghrfdqgpslylmpkyfedafadlderiqdhlellrcdnnykvhfddgesiqlssdltrmkaeldrvegplPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 53/121
51/89 gfgrfidfmkethihyesgtlialkknfesiwdlirikyapeifrlhlfgkiydrasJcyflctkkrniTiiaftfqtmymgmspydapavysIlqytefaegiwyprggfnmvvqkleaiakqkydaefynapvakintddatkqvtgvtlenghiidadawcnadlvyayhnllppcrwtqntlaskkltsssisfywsmstkvpqldvhniflaeayqesfdeifkdfglpseasfyvnv5 psridpsaapdgkdsvivlvpighmksktgdastenypamvdkarkmvlavierrlgmsnfadlieheqvndpavwqskfnlwrgsilglshdvlqvlwfrpstkdstgrydnlffvgasthpgtgvpivlagskltsdqvvksfglctpkprkiementqapleepdaestpvwfwlraafwvmfmffyffpqsngqtpasfinnllpevfrvhnsnvi (SEQ ID NO:35)
1C. Produção de pMB4660 (tef1p-carB URA3) que codifica dehidrogenase de fitoeno: O fragmento XhoI-NotI de 4,3 kb e o fragmento NotI-SpeI de 1,8 kb do pMB4638 foram ligados ao gene URA3 clivado com SsaI e SpeI de 1,9 kb gerado através de amplificação por PCR de DNA genômico de Y. lipolytica usando MO4684 e MO4685 para criar pMB4660:
MO4684 5'-CATTCACTAGTGGTGTGTTCTGTGGAGCATTC (SEQ ID
NO:36)
MO4685 5'-CACACGGTCTCATCGAGGTGTAGTGGTAGTGCAGTG (SEQ ID NO:37)
A seqüência de codificação de ácido nucleico resultante e a proteína CarB(i) codificada de pMB4660 são como segue:
atgtccaagaaacacattgtcattatcggtgctggcgtgggtggcacggctacagctgctcgtttggcccgcgaaggcttcaaggtcactgtggtggagaaaaacgactttggtggcggccgctgctccttgatccatcaccagggccatcgctttgatcagggcccgtcgctctacctgatgcccaagtactttgaggacgcctttgccgatctggacgagcgcattcaagaccacctggagctgctgcgatgcgacaacaactacaaggtgcactttgacgacggtgagtcgatccagctg25 tcgtctgacttgacacgcatgaaggctgaattggaccgcgtggagggcccccttggttttggccgattcctggatttcatgaaagagacacacatccactacgaaagcggcaccctgattgcgctcaagaagaatttcgaatccatctgggacctgattcgcatcaagtacgctccagagatctttcgcttgcacctgtttggcaagatctacgaccgcgcttccaagtacttcaagaccaagaagatgcgcatggcattcacgtttcagaccatgtatatgggcatgtcgccctacgatgcgcctg30 ctgtctacagcctgttgcagtacaccgagttcgctgaaggcatctggtatccccgtggcggcttcaacatggtggttcagaagctagaggcgattgcaaagcaaaagtacgatgccgagtttatctacaatgcgcctgttgccaagattaacaccgatgatgccaccaaacaagtgacaggtgPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 54/121
52/89 taaccttggaaaatggccacatcatcgatgccgatgcggttgtgtgtaacgcagatctggtctatgcttatcacaatctgttgcctccctgccgatggacgcaaaacacactggcttccaagaaattgacgtcttcttccatttccttctactggtccatgtccaccaaggtgcctcaattggacgtgcacaacatctttttggccgaggcttatcaggagagctttgacgaaatcttcaaggac5 tttggcctgccttctgaagcctccttctacgtcaatgtgccctctcgcatcgatccttctgctgctcccgacggcaaggactctgtcattgtcttggtgcctattggtcatatgaagagcaagacgggcgatgcttccaccgagaactacccggccatggtggacaaggcacgcaagatggtgctggctgtgattgagcgtcgtctgggcatgtcgaatttcgccgacttgattgagcatgagcaagtcaatgatcccgctgtatggcagagcaagttcaatctgtggagaggctcaattctggg10 tttgtctcatgatgtgcttcaggtgctgtggttccgtcccagcacaaaggattctaccggtcgttatgataacctattctttgtgggtgcaagcacgcatcccggaactggtgttcccattgtccttgcaggaagcaagctcacctctgaccaagttgtcaagagctttggaaagacgcccaagccaagaaagatcgagatggagaacacgcaagcacctttggaggagcctgatgctgaatcgacattccctgtgtggttctggttgcgcgctgcctfttgggtcatgtttatgttcttttactt15 cttccctcaatccaatggccaaacgcccgcatcttttatcaataatttgttacctgaagtattccgcgttcataactctaatgtcatttaa (SEQ ID NO:38) mskkhiviigagvggtataarlaregfkvtvvekndfgggrcslihhqghrfdqgpslylmpkyfedafadlderiqdhlellrcdnnykvhfddgesiqlssdltrmkaeldrvegplgfgrfldfmkethihyesgtlialkknfesiwdlirikyapeifrlhlfgkiydraskyf20 ktJdrniirnaftfqtaymgmspydapavysllqytefaegiwyprggfnmvvqkleaiakqkydaefiynapvakintddatkqvtgvtlenghiidadavvcnadlvyayhnllppcrwtqntlaskkltsssisfywsmstkvpqldvhniflaeayqesfdeifkdfglpseasfyvnvpsridpsaapdgkdsvivlvpighmksktgdastenypamvdkarkmvlavierrlgmsnfadlieheqvndpavwqskfnlwrgsilglshdvlqvlwfipstkdstgrydn25 lffvgasthpgtgvpivlagskltsdqvvksfgktpkprkiementqapleepdaestfpvwfwlraafwvmfrnffyffpqsngqtpasfinnllpevfrvhnsnvi (SEQ ID NO:39)
1D. Produção de pMB4637 e pTef-HMG que codifica uma HMG1 truncada.
Para produção de uma variante truncada do gene da reductase de HMGCoA, o qual também codifica a seqüência líder de 77 aminoácidos derivada de S. cerevisiae, os seguintes oligonucleotídeos são sintetizados:
PRIMER O 5'-TTCTAGACACAAAAATGGCTGCAGACCAATTGGTGA (SEQ ID NO:40)
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PRIMER P 5'-CATTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATC (SEQ ID NO:41)
PRIMER Q 5'-GTTCTCTGGACGACCTAGAGG (SEQ ID NO:42)
MO4658 5'-CACACACGCGTACACCTATGACCGTATGCAAAT (SEQ ID
NO:43)
Primers O e P são usados para amplificar um fragmento de 0,23 kb que codifica Met-Ala, seguido pelos resíduos 530 a 604 da proteína Hmg1 de S. cerevisiae, usando DNA genômico como template. Primers Q e MO4658 são usados para amplificar um fragmento de 1,4 kb que codifica os
448 resíduos C-terminais da proteína Hmg1 de Y. lipolytica, usando DNA genômico como template. Esses fragmentos são ligados ao vetor de clonagem apropriado e os plasmídeos resultantes, designados pOP e pQMO4658, são verificados através de seqüenciamento. O fragmento OP é liberado com XbaI e AseI e o fragmento QMO4658 é liberado com MaeI e MIuI. Esses fra15 gmentos são, então, ligados ao vetor de expressão de ADE1 TEF1p pMB4629 cortado com XbaI e MluI para produzir pTefHMG.
Alternativamente, o gene HMG1 nativo de Y. lipolytica pode ser modificado sem seqüências de S. cerevisiae conforme descrito na tabela acima usando os primers MO4658 (descrito acima) e MO4657, para criar pMB4637:
MO4657 5 '-CACACTCTAGACACAAAAATGACCCAGTCTGTGAAGGTGG (SEQ ID NO:44)
A seqüência de codificação de ácido nucleico resultante e a proteína Hmg1trunc codificada do pMB4637 são como segue:
atgacccagtctgtgaaggtggttgagaagcacgttcctatcgtcattgagaagcccagcgagaaggaggaggacacctcttctgaagactccattgagctgactgtcggaaagcagcccaagcccgtgaccgagacccgttctctggacgacctagaggctatcatgaaggcaggtaagaccaagcttctggaggaccacgaggttgtcaagctctctctcgagggcaagcttcctttgtatgctcttgagaagcagcttggtgacaacacccgagctgttggcatccgacgatctat30 catctcccagcagtctaataccaagactttagagacctcaaagcttccttacctgcactacgactacgaccgtgtttttggagcctgttgcgagaacgttattggttacatgcctctccccgttggtgttgctggccccatgaacattgatggcaagaactaccacattcctaPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 56/121
54/89 tggccaccactgagggttgtcttgttgcctcaaccatgcgaggttgcaaggccatcaacgccggtggcggtgttaccactgtgcttactcaggacggtatgacacgaggtccttgtgtttccttcccctctctcaagcgggctggagccgctaagatctggcttgattccgaggagggtctcaagtccatgcgaaaggccttcaactccacctctcgatttgctcgtctccagtctcttcactc5 tacccttgctggtaacctgctgtttattcgattccgaaccaccactggtgatgccatgggcatgaacatgatctccaagggcgtcgaacactctctggccgtcatggtcaaggagtacggcttccctgatatggacattgtgtctgtctcgggtaactactgcactgacaagaagcccgcagcgatcaactggatcgaaggccgaggcaagagtgttgttgccgaagccaccatccctgctcacattgtcaagtctgttctcaaaagtgaggttgacgctcttgttgagctcaacatcagcaaga10 atctgatcggtagtgccatggctggctctgtgggaggtttcaatgcacacgccgcaaacctggtgaccgccatctaccttgccactggccaggatcctgctcagaatgtcgagtcttccaactgcatcacgctgatgagcaacgtcgacggtaacctgctcatctccgtttccatgccttctatcgaggtcggtaccattggtggaggtactattttggagccccagggggctatgctggagatgcttggcgtgcgaggtcctcacatcgagacccccggtgccaacgcccaacagcttg15 ctcgcatcattgcttctggagttcttgcagcggagctttcgctgtgttctgctcttgctgccggccatcttgtgcaaagtcatatgacccacaaccggtcccaggctcctactccggccaagcagtctcaggccgatctgcagcgtctacaaaacggttcgaatatttgcatacggtcatag (SEQ ID NO:45) mtqsvkvvekhvpiviekpsekeedtssedsieltvgkqpkpvtetrslddleaimka20 glctklledhevvkslegklplyalekqlgdntravgirrsiisqqsntktletsklpylhydydrvfgaccenvigymplpvgvagpmnidgknyhipmattegclvastmrgckainagggvttvltqdgmtrgpcvsfpslkragaakiwldseeglksmrkafiistsrfarlqslhstlagnllfirfrtttgdamgmnmiskgvehslavmvkeygfpdmdivsvsgnyctdkkpaainwiegrgksvvaeatipahivksvlksevdalvelnisknligsamagsvggmahaan25 lvtaiylatgqdpaqnvessncitlmsnvdgnllisvsmpsievgtigggtilepqgamlemlgvrgphietpganaqqlariiasgvlaaelslcsalaaghlvqshmthnrsqaptpakqsqadlqrlqngsnicirs (SEQ ID NO:46)
1E. Produção de pMB4692 (URA3 tef1p-crtZ) que codifica hidroxilase de caroteno. A seguinte seqüência de ORP de hidroxilase de caroteno (CrtZ) foi sintetizada, baseado na seqüência de proteína de Novosphingobium aromaticivorans, usando tendência de códon de Y. lipolytica:
5'- ttcagacacaaaaatqqqtqqaqccatqcaqaccctcqctqctatcctqatcqtcctcqqtaPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 57/121
55/89 cagtgctegctatggagtttgtcgcttggtcttctcataagtatatcatgcatggcttcggatggggatggcatagagaccatcacgagccccatgagggatttcttgagaagaatgacttatacgccatcgttggcgctgccctctcgatactcatgtttgccctcggctctcccatgatcatgggcgctgacgcctggtggcccggaacctggatcggactcggtgtcctcttctatggtgt5 catctataccctcgtgcacgacggtctggtgcaccaacgatggtttagatgggtgcctaaacgaggttacgccaaacgactcgtgcaggcccataagctgcaccacgccaccattggcaaggaaggaggcgtctcattcggtttcgtgttcgcccgagatcccgccgttctgaagcaggagcttcgagctcaacgagaagcaggtatcgccgtgctgcgagaggctgtggaeggctagacgcgt (SEQ ID NO:47)
Essa seqüência foi clivada usando Xbal e Mlul e ligada, junto com o fragmento Acc65I-NheI do promotor TEF1 do pMB4629, ao pMB4662 cortado com Acc65I e MluI para produzir pMB4692. A seqüência de codificação do ácido nucleico é representada em negrito sublinhado acima. A proteína crtZ codificada resultante do pMB4692 é como segue:
Mggamqtlaailivlgtvlamefvawsshkyimhgfgwgwhrdhhephegflekndlyaivgaalsilmfalgspmimgadawwpgtwiglgvlfygviytlvhdglvhqrwfrwvpkrgyakrlvqahklhhatigkeggvsfgfvfardpavlkqelraqreagiavlreavdg (SEQ ID NO:82)
1F. Produção de pMB4698 (ADE1 teflp-crtW), que codifica cetolase de caro20 teno. A seguinte seqüência de ORP de cetolase de caroteno (CrtW) foi sintetizada, baseado na seqüência de proteína de uma seqüência ambiental isolada de Sargasso Sea (acesso ao Genbank AACY01034193.1):
5'- ttctagacacaaaaatgactcgatctatttcctggccttccacctactggcacctccagccctcctgttcttcttgggtcgcaaacgaattctctcctcaagcccgaaaaggtctcg25 tcctcgctggtctcattggttccgcttggctgcttactctcggacttggcttttcccttc ccctccatcaaacgagctggcttctcatcggttgtctcgttctccttagatctttcctgcacaccggactttttatcgttgcccatgacgctatgcacgcttctcttgttcctgaccaccctggccttaaccgttggattggacgtgtctgtcttctcatgtatgctggactctcctacaaaagatgctgccgaaatcaccgtcgacaccaccaagcccctgaaacagttgaagaccctgactac30 caacgatgcactaacaacaatatcctcgactggtacgttcactttatgggaaattacctcggatggcaacaattgcttaatctctcttgcgtttggctcgctctcaccttccgtgtttctgactactctgctcaattcttccacctgctccttttctctgtccttcctctcatcgtctcctcctgtPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 58/121
56/89 caactcttcctcqtqqqaacctqqctqccacaccqacqaqqcqctactactcqacccqqcqttaccactcqatccctqaacttccaccctqctctttccttcqctqcttqctaccacttcqqttaccaccqtqaacaccatqaatctccctctactccttqqttccaacttcctaaactc cqaqaaqqttctctcatctaaacgcgt (SEQ ID NO:48)
Essa seqüência foi clivada usando Xbal e Mlul e ligado ao pMB4629 cortado com NheI e MluI para produzir pMB4698. A seqüência de codificação de ácido nucleico é representada em negrito sublinhado acima. A proteína crtW codificada resultante de pMB4698 é como segue: mtrsiswpstywhlqpscsswvanefspqarkglvlagligsawlltlglgfsl10 plhqtswlligclvllrsflhtglfivahdamhaslvpdhpglrmvigrvcllmyaglsykrccmhn'hhqapetvedpdyqrctnnnildwyvhfmgnylgwqqllnlscvwlaltfrvsdysaqffhlllfsvlplivsscqlflvgtwlphrrgattrpgvttrslnfhpalsfaacyhfgyhrehhespst pwfqlpklregsli (SEQ ID NO:83)
Exemplo 2: Manipulação de Yarrowia lipolytica para produção aumentada de carotenóide
2A. Produção de Y. lipolytica expressando sintase de pirofosfato de geranilgeranila e dehidrogenase de fitoeno: MF350 (MATB ura2-21 leu2-35 ade1) foi transformado com pMB4591 (teflp-GGS1) que tinha sido clivado a montante do URA5 com SspI; um transformante Ura+ trazendo o plasmídeo no locus ura2 foi identificado e denominado MF364. Ele foi, subseqüentemente, transformado com pMB4638 (tef1p-carB) que tinha sido clivado em ADE1 com SspI e um transformante prototrófico foi escolhido, o qual abrigava ou plasmídeo no locus ade1. Esse gênero foi denominado MF502.
2B. Produção de Y. lipolytica expressando sintase de pirofosfato de geranil25 geranila, dehidrogenase de fitoeno e sintase de fitoeno/ciclase de licopeno:
MF502 foi transformado com pMB4628 (tef1p-carRP) que tinha sido tratado com SspI. Nove colônias prototróficas foram escolhidas, as quais eram incolores, laranja ou muito laranja sobre a lâmina de transformação (agar YNB com 1% de glicose e 0,1% de glutamato [YNBglut]) após dois a três dias de crescimento. Duas, MF597 e MF600 (aquelas muito laranjas), produziram mais de 4 mg de caroteno por g de peso celular seco (DCW) após quatro dias de crescimento em YPD a 300C. Análise de Southern revela uma única
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57/89 banda KpnI-HindIII diferente no DNA genômico de MF597 e MF600, nenhuma das quais sugeria que integração homóloga ocorreu em leu2-270.
2C. Produção de Y. lipolytica expressando sintase de fitoeno/ciclase de licopeno e dehidrogenase de fitoeno: ATCC201249 (MATA ura3-302 leu2-270 5 lys8-11) foi transformado com pMB4628 clivado com SspI. Centenas de colônias Leu+ foram empoçadas, crescidas novamente e transformadas com pMB4660 (tef1p-carB) que tinha sido clivado do URA3 com SalI. Uma colônia que era perceptivelmente amarela após 5 dias a 300C sobre YNBglut mais 0,6 mM de lisina foi selecionada, denominada MF447 e verificou-se que produzia 0,2 mg de caroteno por grama de peso celular seco após 4 dias de crescida em YPD.
MF447 foi estimulado com 1 g/L de ácido 5-fluoroorótico e segregantes Ura selecionados. Surpreendentemente, descobriu-se que todos eles retinham a aparência amarela idêntica de seu precursor, implicando que a perda de um gene URA3 funcional não coincide com a perda de uma enzima CarB funcional. Análise de Southern demonstra que dois fragmentos de uma digestão com KpnI-HindIII de DNA de MF447 contém seqüências de URA3phibridização, apenas uma das quais também se hibridiza ao carB. A outra está ausente em MF578, o segregante Ura3- escolhido para outra manipula20 ção. Resgate de plasmídeo e análise da seqüência de DNA abrangendo o íntron carRP em gêneros MF447, MF597 (Exemplo 2c) e MF600 (Exemplo 2c) revelou que os éxons 1 e 2 eram contíguos e eram, cada um, separados por uma seqüência de íntron que carecia do sítio SspI interno original (presente no pMB4628).
2D. Produção de Y. lipolytica expressando sintase de fitoeno/ciclase de licopeno, dehidrogenase de fitoeno e sintase de pirofosfato de geranilgeranila: MF578 foi transformado com pMB4683 (tef1p-GGS1) que tinha sido clivado com SalI (a montante do URA3) ou com StuI (dentro da ORF do GGS1). Colônias Ura+ Leu+ em ambos os casos apareciam laranja brilhante sobre YN30 Bglut+Lys e sobre YPD e várias produziam mais de 4 mg de caroteno por grama de peso celular seco quando crescidas conforme acima. Uma, MF633, continha uma única cópia do plasmídeo no locus GGS1, conforme
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58/89 inferido a partir de análise de Southern. As outras surgiram através de integrações não homólogas ou mais complexas.
2E. Produção de Y. lipolytica expressando sintase de fitoeno/ciclase de licopeno, dehidrogenase de fitoeno e sintase de pirofosfato de geranilgeranila:
MF364 é cruzado com MF578 e esporos do diplóide resultante são colocados em lâminas sobre YPD durante dois a três dias a 30 0C. Colônias laranja Leu+ Ade- Ura- são selecionadas com relação à presença de tefp-carB, tefpcarRP e tefp-GGS1 através de PCR e com relação à alta produção de carotenóide (>4 mg/g de peso celular seco) após crescimento em meio líquido
YPD. Colônias reunindo esses critérios, bem como mostrando resistência ao ácido 5-fluoroótico, uma indicação de que elas abrigam o alelo ura3-302, são escolhidas para outros estudos e aqui depois referidas como gêneros GBRPua. Tal gênero é selecionado para outra análise e modificação.
Exemplo 3: Extração de carotenóides de células de Yarrowia lipolytica
Testagem em frasco de agitação de gêneros gerados foi conduzida usando meio YPD (1% de extrato de levedo, 2% de peptona, 2% de glicose). Culturas de 20 ml em frascos de 125 ml foram crescidas a 300C. Células de Y. lipolytica foram coletadas de culturas de 72-96 horas e extrações foram realizadas para determinar a forma e quantidade de carotenóide.
1,8 ml de cultura foram colocados em um tubo de Eppendorf. As células foram empelotadas e lavadas duas vezes com 1 ml de H2O. Após a segunda lavagem, as células resuspensas foram transferidas para um tubo com tampa de pressão pré-pesado com um furo perfurado em cima e as células foram liofilizadas durante a noite. Após secagem para término, o tubo foi pe25 sado de forma a calcular o peso das células secas. 0,25 ml da cultura no mesmo frasco de agitação foram colocados em um tubo com tampa de rosca de 2 ml para extração de carotenóide. As células foram empelotadas e o sobrenadante foi aspirado. Células empelotadas podem ser congeladas a -80 °C e armazenadas. Um volume igual de glóbulos de zircônia cúbica foram adicionados às pelotas de células, junto com 1 ml de solvente de extração gelado (uma mistura a 50/50 v/v de hexano e acetato de etila contendo butilhidróxitolueno a 0,01% (BHT)). A mistura foi, então, agitada (MiniPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 61/121
59/89
BeadBeater-8, BioSpec Products, Inc.) em uma velocidade máxima durante 5 minutos a 4 °C. A mistura foi, então, centrifugada em velocidade máxima durante 1 minuto e o sobrenadante foi coletado e depositado em um frasco de vidro de 16 ml. O resíduos de células restantes foram re-extraídos pelo menos três vezes, sem a adição de glóbulos de zircônia; todos os sobrenadantes foram empoçados no frasco de vidro de 16 ml. Após extração, o frasco de vidro foi centrifugado durante 5 minutos a 2000 rpm a 4 °C em uma centrífuga para bancada Sorvall e sobrenadante foi transferido para um novo frasco de vidro de 16 ml. Um Speed Vac foi usado para concentrar o sobre10 nadante (temperatura ambiente no escuro) e as amostras foram armazenadas a -20 °C ou -80 °C até imediatamente antes de análise por HPLC. Antes de análise por HPLC, as amostras foram resuspensas em 1 ml de solvente gelado e, então, transferidas para um frasco âmbar gelado. No decorrer do protocolo, cuidado foi tomado para evitar contato com oxigênio, luz, calor e ácidos.
Exemplo 4: Quantificação de produção de carotenóide através de HPLC
Para análise de carotenóide, amostras foram resuspensas em solvente de extração gelado (uma mistura a 50/50 v/v de hexano e acetato de etila contendo butilhidróxitolueno a 0,01% (BHT). Um Alliance 2795 HPLC (Waters) equipado com uma coluna Waters XBridge C18 (3,5 pm, 2,1 x 50 mm) e uma coluna de proteção Thermo Basic 8 (2,1 x 10 mm) foi usada para decompor o carotenóide a 25 °C; amostras autênticas de carotenóide foram usadas como padrões. As fases móveis e taxas de fluxo são mostradas abaixo (Solvente A = acetato de etila; Solvente B = água; Solvente C = me25 tanol; Solvente D = acetonitrilo). O volume de injeção era de 10 pL. O detector é um detector com fileira de fotodiodo Waters 996. Os tempos de retenção para moléculas lipofílicas incluem astaxantina (1,159 min), zeaxantina (1,335), p-apo-8'-carotenal (2,86 min), ergosterol (3,11 min), licopeno (3,69 min), β-Caroteno (4,02 min) e fitoeno (4,13 min). Astaxantina, zeaxantina, β30 apo-8'-carotenal, licopeno e β-Caroteno são detectados a 475 nm, enquanto que ergosterol e fitoeno foram detectados a 286 nm.
TABELA 28. Tempos de Retenção para Moléculas Lipofílicas
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Tempo (min) Fluxo (mL/min) % A % B % C %D Curva
0,50 0,0 20,0 0,0 80,0
3,00 1,00 20,0 0,0 0,0 80,0 6
4,50 1,00 80,0 0,0 20,0 0,0 6
5,50 1,00 0,0 0,0 60,0 40,0 6
6,50 1,00 0,0 0,0 80,0 20,0 6
7,50 1,00 0,0 0,0 100,0 0,0 6
8,50 1,00 0,0 0,0 100,0 0,0 6
9,50 1,00 0,0 20,0 0,0 80,0 6
10,50 0,50 0,0 20,0 0,0 80,0 6
Exemplo 5: Expressão de uma forma truncada de reductase de HMG-CoA resulta em produção aumentada de carotenóide
De forma a aumentar a produção de carotenóide, o fluxo de carbono através da via de isoprenóide é intensificada através de introdução de uma variante truncada do gene de reductase de HMG-CoA.
Em uma abordagem, uma variante truncada do gene de reductase de HMG-CoA, o qual também codifica uma seqüência líder de 77 aminoácidos derivada de Hmg1 de S. cerevisiae é introduzida em um gênero GRPBua (descrito no Exemplo 2E acima). O plasmídeo pTefHMG pode ser clivado com SnaBI, BbvCI ou Bsu36\ para dirigir a integração no locus ade1 ou com BamHI para dirigir a integração ao locus HMG1 ou com EcoRV para promover integração aleatória, nos gêneros GRPBua, restaurando os mesmos para prototrofia de adenina. Transformantes Ade+ resultantes são selecionados para produção aumentada de carotenóide.
Alternativamente, o gene HMG1 nativo de Y. lipolytica pode ser modificado sem seqüências de S. cerevisiae conforme descrito no Exemplo 1D acima, para criar o pMB4637. Esse plasmídeo pode ser digerido conforme descrito para o pTefHMG e transformado em gêneros GRPBua e os transform antes resultantes selecionados conforme descrito para produção aumentada de carotenóide.
Em ainda outra abordagem, uma variante truncada do gene de reductase de HMG-CoA de N. crassa pode ser utilizada e introduzida em
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61/89 gêneros de Y. lipolytica. De forma a gerar um plasmídeo adequado para expressão da reductase de HMG-CoA heteróloga, p641P (Yeast 2001 ; 18 (2001): 97-113) é modificado através de substituição do promotor ICL1 pelo promotor GPD e através de adição de seqüências que conferem resistência à fleomicina. DNA genômico de Y. lipolytica é amplificado com dois primers. GPDdist: 5' CACACGGTacctgtaggttgggttgggtg (SEQ ID NO:49)
GPDprox: 5' CACACGGATCCtgtttaattcaagaatgaatatagagaagagaag (SEQ ID NO:50) e o fragmento resultante (0,7 kb) é clivado com BamHI e KpnI e o p641P 10 clivado com BamBI e KpnI, criando o plasmídeo p641Pgpd. O gene ble sob o controle do promotor GPD de A. nidulans é, então, excisado do pBCphleo (Silar, Fungal Genetics Newsletter 42:73) como um fragmento BclI-BamHI de 3,2 kb e inserido no sítio BamHI único do p641Pgpd, na orientação que preserva o sítio BamHI proximal ao promotor GPD, para criar o p641Pgpdble.
DNA genômico de N. crasa é amplificado com dois primers: Neuhmg diant: 5' CACACGGATCCACATCAACAatggcatctgccacccttcccc (SEQ ID NO:51)
Neuhmg rev: 5' CAC ACGG ATCcaagtgctgacgcggaacttg (SEQ ID NO:52) e o fragmento resultante é clivado com BamHI e inserido no p641Pgpdble digerido com BamHI na orientação correta. O plasmídeo resultante pZg, contém seqüências que codificam um domínio catalítico citosólico truncado de reductase de hidróximetilglutaril-CoA de N. crassa (acesso ao Genbank: XP_324892) sob o controle do promotor constitutivo GPD. Esse plasmídeo pode ser introduzido no gênero Y. lipolytica criado no Exemplo 2E acima e transformantes são selecionados por sua resistência à fleomicina (100 pg/ml). Transformantes resultantes são testados com relação à produção de β-caroteno, conforme descrito acima.
Exemplo 6: Introdução de genes heterólogos de hidroxilase de caroteno e cetolase de caroteno em gêneros de Y. lipolytica que produzem carotenóide para produção de astaxantina
Para introdução de hidroxilase de caroteno e cetolase de carotePetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 64/121
62/89 no em Y. lipolytica que produz carotenóide, pMB4692 e pMB4698, descritos conforme nos Exemplos 1E e 1F acima, podem ser seqüencialmente introduzidos no gênero GRPBua (descrito no Exemplo 2E). Para a introdução de pMB4692, o plasmídeo pode ser clivado com SalI ou BsrGI para dirigir a in5 tegração ao locus ura3 ou com XbaI para promover integração aleatória, selecionado prototrofia de uracila. Transformantes GRPBua Ura+ abrigando pMB4692 são selecionados para produção de zeaxantina em YPD. Células produzidas zeaxantina são transformadas com pMB4698 (o qual pode ser clivado com PpuMI, SspI ou BbvCI para dirigir a integração ao locus adel ou com EcoRI para promover integração aleatória) e colônias prototróficas são selecionadas para produção de astaxantina.
Alternativamente, de modo que a transformação de plasmídeo possa ser revertida, em que pMB4698 é transformado primeiro e transformantes são selecionados para prototrofia de adenina. Transformantes
GRPBua Ade+ abrigando pMB4698 são selecionados para produção de cantaxantina. Células GRPBua[pMB4698] que produzem cantaxantina são transformadas com pMB4692 e colônias prototróficas são selecionadas para produção de astaxantina.
Em outra abordagem, os genes de cetolase de carotenóide e hidroxilase de carotenóide de P. marcusii podem ser introduzidos nos gêneros descritos no Exemplo 2 acima de forma a converter β-caroteno em astaxantina. DNA genômico de P. marcusii é amplificado com dois primers. CrtZdiant: 5' CACACCGTCTCAAatgaccaatttcctgatcgtcgtc (SEQ ID NO:53) CrtZrev: 5' CACACAGATCtcacgtgcgctcctgcgcc, (SEQ ID NO:54) e o fragmento resultante é clivado com BsmBI, modificado com o fragmento Klenow de DNA polimerase e clivado com BglII. Esse fragmento é inserido no pINA1269 clivado com PmlI e BamHI (J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2000): 207-216), contendo o promotor hp4d, o terminador XPR2, o gene selecionável LEU2 e seqüências necessárias para seleção e propagação em
E. coli. O plasmídeo resultante pA contém seqüências que codificam a hidroxilase de caroteno de P. marcusii (gene crtZ) (acesso ao Genbank: CAB56060.1) sob o controle do promotor hp4d.
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63/89 pYEGITEF é modificado através de substituição do terminador LIP2 pelo terminador XPR2 como segue. pINA 1291 é digerido com AvrII, modificado com o fragmento Klenow de DNA polimerase e clivado com EcoRI e o pequeno fragmento contendo LIP2t é ligado ao pYEG1TEF que ti5 nha sido digerido com SacII, modificado com DNA polimerase T4 na presença de dNTP e clivado com EcoRI. O plasmídeo resultante é denominado pYEGlTEF-LIP2t .
De forma a amplificar o gene de cetolase de carotenóide, DNA genômico de P. marcusii é amplificado com dois primers.
CrtWdiant: 5' CACACCCTAGGCCatgagcgcacatgccctgc (SEQ ID NO:55) CrtWrev: 5' CACACAAGCTTtcatgcggtgtcccccttg (SEQ ID NO:56) e o fragmento resultante é clivado com AvrII e HindIII e inserido no pYEGlTEF-LIP2tclivado com AvrII e HindIII. O plasmídeo resultante, pBt, contém seqüências que codificam a cetolase de caroteno (gene crtW) (acesso ao
Genbank: CAB56059.1) sob o controle do promotor constitutivo TEF1.
De forma a combinar os dois cassetes de expressão em um único plasmídeo, pBt é clivado com ClaI, modificado com o fragmento Klenow de DNA polimerase e clivado com EcoRI e o fragmento contendo crt é isolado, misturado com o par adaptador de oligonucleotídeo fosforilado:
5 ' AATTCGCGGCCGCT (SEQ ID NO:57) e
5' AGCGGCCGCG (SEQ ID NO:58), clivado com NotI e ligado ao pA digerido com NotI. O plasmídeo resultante, pABt, contém o cassete TEF1p/crtWILIP2t e o cassete hp4dlcrtZ/XPR2t, bem como o gene selecionável LEU2.
pABt pode ser introduzido no gênero de Y. lipolytica descrito acima no Exemplo 4 (TEF1p/al-1/XPR2t; hp4d/carRP/LIP2t;
GPDp/HMGRtrunc) e transformantes selecionados para prototrofia de leucina. Exemplo 7: Inativação parcial de gene ERG9 de Y. lipolytica que codifica sintase de esqualeno resulta em produção aumentada de carotenóide
7A. De forma a inativar parcialmente o gene ER9 que codifica sintase de esqualeno, o gene FOL3 vizinho é rompido, resultando em um requisito de ácido folínico. Esse gênero é, então, transformado com um fraPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 66/121
64/89 gmento de DNA com mutação abrangendo parcialmente os dois genes e transformantes Fol+ são selecionados com relação à atividade diminuída de sintase de esqualeno.
Os seguintes oligonucleotídeos são sintetizados:
PRIMER K 5'-CCTTCTAGTCGTACGTAGTCAGC (SEQ ID NO:59)
PRIMER L 5'-CCACTGATCTAGAATCTCTTTCTGG (SEQ ID NO:60) e usados para amplificar um fragmento de 2,3 kb a partir de DNA genômico de Y. lipolytica abrangendo a maioria do gene FOL3, usando Pfu polimerase. O fragmento resultante é clivado com XbaI e fosforilado, então, ligado no pBluescriptSK-, que tinha sido clivado com KpnI, tratado com DNA polimerase T4 (T4pol) na presença de dNTPs e subseqüentemente clivado com XbaI. O plasmídeo resultante, designado pBS-fo13, foi, então, clivado com Acc65I e EcoRI, tratado com T4pol conforme acima e ligado ao fragmento de ADE1 EcoRV-SpeI de 3,4 (tratado com T4pol) do pMB4529.
O plasmídeo resultante, pBSfol3Áade, pode ser clivado com
BsiWI e XbaI para liberar um fragmento de 5,5 kb que é usado para transformar os gêneros GRBPua descritos acima para prototrofia à adenina. Os transformantes Ade+ resultantes são selecionados com relação a um requisito de ácido folínico e com relação à integração homóloga através de análise por PCR.
Gêneros que abrigam o alelo fol3AADE1 resultante podem ser transformados com um fragmento de DNA de 3,5 kb gerado através de amplificação por PCR mutagênica usando os primers:
PRIMERM 5'-GGCTCATTGCGCATGCTAACATCG (SEQ ID NO:61)
PRIMERN 5'-CGACGATGCTATGAGCTTCTAGACG (SEQ ID NO:
62) e DNA genômico de Y. lipolytica como template. O fragmento resultante contendo os três quartos N-terminais da ORG de FOL3 e os nove décimos Cterminais da ORF de ERG9 é usado para transformar gêneros. Os transfor30 mantes Fol+ Ade- são selecionados com relação à atividade diminuída de sintase de esqualeno através da sensibilidade a agentes tais como ácido zaragósico, itraconazola ou fluconazola. Adicionalmente, os transformantes
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65/89 resultante são selecionados com relação à produção aumentada de carotenóide.
7B. Alternativamente, o fragmento de PCR produzido em 7A poderia ser clonado e alterado de uma forma tal a remover a região 3'-não tra5 duzida do gene ERG9. Substituição da ruptura fol3AADE1 por esse fragmento resulta em expressão diminuída de sintase de esqualeno [Schuldiner e colaboradores (2005), Cell 123: 507-519] [Muhlrad e Parker (1999), RNA 5: 1299-1307], o qual pode ser confirmado conforme em 7A. Essa abordagem pode também ser usada em um gênero Fol+Ade-, usando o marcador ADE1 para romper a 3'-UTR de ERG9.
7C. Em ainda outra abordagem, alelos ERG9 parcialmente defectivos podem ser identificados em S. cerevisiae usando técnicas de embaralhamento de plasmídeo [Boeke e colaboradores, (1987), Methods Enzymol. 154: 164-175] e usando sensibilidades ao fármaco como um fenó15 tipo. Genes defectivos podem ser transferidos para Y. lipolytica usando técnicas padrões de biologia molecular.
Exemplo 8: Tratamento de gêneros de Y. lipolytica que produzem carotenóide com inibidor de um polipeptídeo competidor da biossíntese de isoprenóide resulta em produção aumentada de carotenóide
Culturas produzidas no Exemplo 2 são tratadas com o inibidor de sintase de esqualeno, ácido zaragósico (ácido zaragósico a 0,5 pM) e monitoradas com relação à produção de β-caroteno, conforme descrito acima.
Exemplo 9: Construção de um gênero oleaginoso de Saccharomyces cerevi25 siae
Os genes que codificam as duas subunidades de liase de ATPcitrato de N. crassa, a deaminase de AMP de Saccharomyces cerevisiae e a enzima málica citosólica de M. circinelloides são superexpressos em gêneros de S. cerevisiae de forma a aumentar o teor de lipídio total. Abordagens similares para intensificar a produção de lipídio poderiam ser empregadas em outros organismos hospedeiros, tais como Xanthophyllomyces dendrorhous (Phaffia rhodozyma), usando os mesmos ou polipeptídeos oleagíPetição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 68/121
66/89 nicos homólogos, funcionalmente similares.
Kits Qiagen RNAEasy (Qiagen, Valencia, CA.) são usados para preparar RNA mensageiro a partir da biomassa liofilizada preparada de culturas de N. crassa. Subseqüentemente, RT-PCR é realizada em duas rea5 ções contendo o template de mRNA e qualquer um dos seguintes pares de primer: acl1:
1diant: 5' CACACGGATCCTATAatgccttccgcaacgaccg (SEQ ID NO:63)
1rev: 5' CACACACTAGttaaatttggacctcaacacgaccc (SEQ ID NO:64) acl2:
2diant: 5' CACACGGATCCAATATAAatgtctgcgaagagcatcctcg (SEQ ID NO:65)
2rev: 5' CACACGCATGCttaagcttggaactccaccgcac (SEQ ID NO:66)
O fragmento resultante da reação com acl1 é clivado com SpeI e
SamHI e aquele da reação com acl2 é clivado com SamHI e SphI e ambos são ligados juntos no YEp24 que tinha sido digerido com NheI e SphI, criando o plasmídeo p12. O promotor bi-direcional GALI-10 é amplificado de DNA genômico de S. cerevisiae usando os primers:
Gal10: 5' CACACGGATCCaatmcaaaaattcttactttttttttggatggac (SEQ ID
NO:67)
Ga11: 5' CACACGGATCCttttttctccttgacgttaaagtatagagg (SEQ ID NO:68) e fragmento resultante de 0,67 kb é clivado com SamHI e ligado em qualquer orientação ao p12 digerido com SamHI para criar p1ga12 e p2gal, contendo GALI-acl1/GAL10-ac12 e GAL10-acl1/GALI-ac12, respectivamente (acesso ao Genbank: acl1: CAB91740.2; acl2: CAB91741.2).
De forma a amplificar o gene de S. cerevisiae que codifica deaminase de AMP e um promotor adequado para expressão desse gene, DNA genômico de S. cerevisiae é amplificado usando dois pares de primer em reações distintas:
AMD1 ORF:
AMD1DIANT: 5' CACACGAGCTCAAAAatggacaatcaggctacacagag (SEQ ID NO:69)
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AMDIrev: 5' CACACCCTAGGtcacttttcttcaatggttctcttgaaattg (SEQ ID NO:70) GAL7p:
gal7prox: 5' CACACGAGCTCggaatattcaactgtttttttttatcatgttgatg (SEQ ID NO:71) gal7dist: 5' CACACGGAtccttcttgaaaatatgcactctatatcttttag (SEQ ID NO:72) e o fragmento resultante da reação com AMD1 (2,4 kb) é clivado com SacI e AvrII e aquele da reação com GAL7 (0,7 kb) é clivado com SamHI e SphI e ambos são ligados juntos no YEp13 que tinha sido digerido com NheI e SamHI, criando o plasmídeo pAMPD. Esse plasmídeo traz o gene de S.
cerevisiae, AMD1, que codifica deaminase de AMP, sob o controle do promotor galactose-induzível GAL7.
RNA mensageiro é preparado a partir da biomassa liofilizada de M. circinelloides, conforme descrito acima, e o template de mRNA é usado em uma reação de RT-PCR com dois primers:
MAEdiant: 5' CACACGCTAGCTACAAAatgttgtcactcaaacgcatagcaac (SEQ ID NO:73)
MAErev: 5' CACACGTCGACttaatgatctcggtatacgagaggaac (SEQ ID NO:74) e o fragmento resultante é clivado com NheI e SalI e ligado a pRS413TEF digerido com XbaI e XhoI (Mumberg, D. e colaboradores (1995) Gene, 156:
119-122), criando o plasmídeo pTEFMAE, o qual contém seqüências que codificam a enzima málica citosólica NADP+-dependente de M. circinelloides (E.C. 1.1.1.40; gene mce; acesso ao Genbank: AY209191) sob o controle do promotor constitutivo TEF1.
Os plasmídeos plga12, pAMPD e pTEFMAE são seqüenci25 almente transformados em um gênero de S. cerevisiae para restaurar a prototrofia para uracila (plga12), leucina (pAMPD) e histidina (pTEFMAE) (Guthrie e Fink, Methods in Enzymology 194: 1-933, 1991). Os transformantes resultantes são testados com relação ao teor de lipídio total após testagem em um frasco de agitação em meio sintético completo (SC) carecendo de uracila, leucina e histidina, conforme descrito no Exemplo 3 ou em um processo de fermentação em 2 etapas. No processo em 2 etapas, 1,5 ml de células de uma cultura noturna em tubo giratório de 2 ml contendo meio SC
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68/89 carecendo de uracila, leucina e histidina são centrifugados, lavados em água destilada e resuspensos em 20 ml de um meio com limitação de nitrogênio adequado para acúmulo de lipídio (30 g/L de glicose, 1,5 g/L de extrato de levedo, 0,5 g/L de NH4Cl, 7 g/L de KH2PO4, 5 g/L de Na2HPO4-12H2O, 1,5 g/L de MgSO4-7H2O, 0,08 g/L de FeCla-6H2O, 0,01 g/L de ZnSO4-7H2O, 0,1 g/L de CaCl2-2H2O, 0,1 mg/L de MnSO4-5H2O, 0,1 mg/L de CuSO4-5H2O, 0,1 mg/L de Co(NOa)2-6H2O; pH de 5,5 (J Am Oil Chem Soc 70: 891-894 (1993)) .
O teor de lipídio intracelular dos gêneros de S. cerevisiae de 10 controle e modificados é analisado usando a sonda fluorescente, Nile Red (J Microbiol Meth (2004) 56: 331-338). Em resumo, células diluídas em tampão são coradas com Nile Red, excitadas a 488 nm e os espectros de emissão fluorescentes na região de comprimento de onda de 400-700 nm são adquiridos e comparado com espectros correspondentes de células não coradas com Nile Red. Para confirmar os resultados a partir do método de estimativa rápida, o teor de lipídio total é determinado através de análise cromatográfica gasosa dos ácidos graxos totais diretamente transmetilesterificados de células secas, conforme descrito (Appl Microbiol Biotechnol. Novembro de 2002; 60(3): 275-80). Gêneros de S. cerevisiae não transformados produzem
6% e 10% de lipídio total (base peso em célula seca) após crescimento em
YPD e meio de acúmulo de lipídio, respectivamente. Gêneros de levedo expressando os múltiplos polipeptídeos oleagínicos produzem 17% e 25% de lipídio total após crescimento em YPD e meio de acúmulo de lipídio, respectivamente.
Exemplo 10: Introdução de hidroxilase de caroteno heteróloga em gêneros de Y. lipolytica que produzem carotenóide para produção de zeaxantina
MF578 (tef-carRP tef-carB) foi transformado com pMB4692 que tinha sido clivado com SalI. Várias colônias Ura+ inferidas como contendo tef-crtZ através de análise por PCR foram capazes de produzir zeaxantina em frascos de agitação YPD e, em um caso, todo caroteno foi eliminado.
As tabelas a seguir são mencionadas no decorrer da especificação:
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Tabela 1. Exemplos de polipeptídeos de carboxilase de acetil-CoA • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 2. Exemplos de polipeptídeos de decarboxilase de piruvato • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 3. Exemplos de polipeptídeos de dehidrogenase de isocitrato 10 • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 4. Exemplos de polipeptídeos de liase de ATP-citrato • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 5. Exemplos de polipeptídeos de enzima málica • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 6. Exemplos de polipeptídeos de deaminase de AMP • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 7. Exemplos de polipeptídeos de tiolase de acetoacetil-CoA • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 8. Exemplos de polipeptídeos de sintase de HMG-CoA 30 • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
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Tabela 9. Exemplos de polipeptídeos de reductase de HMG-CoA • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 10. Exemplos de polipeptídeos de quínase de mevalonato • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 11. Exemplos de polipeptídeo de quínase de fosfomevalonato 10 · Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 12. Exemplos de polipeptídeos de decarboxilase de pirofosfato de mevalonato • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 13. Exemplos de polipeptídeos de isomerase de IPP • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 14. Exemplos de polipeptídeos de sintase de FPP • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 15. Exemplos de polipeptídeos de sintase de GGPP • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 16. Exemplos de polipeptídeos de sintase de esqualeno • Fileira • Acesso ao Genbank
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Tabela 17. Exemplos de polipeptídeos de dehidrogenase de fitoeno • Fileira • Acesso ao Genbank · GI Genbank
Tabela 18. Exemplos de polipeptídeos de sintase de fitoeno e ciclase de licopeno • Fileira • Acesso ao Genbank · GI Genbank
Tabela 19. Exemplos de polipeptídeos de cetolase de carotenóide • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 20. Exemplos de polipeptídeos de hidroxilase de carotenóide • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 21. Exemplos de polipeptídeos de sintase de astaxantina e polipeptí20 deos putativos de sintase de astaxantina • Fileira • Acesso ao Genbank • GI Genbank
Tabela 22. Exemplos de polipeptídeos de epsilon hidroxilase de carotenóide.
ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
ABB52076 79155148 Hidroxilase de caroteno com epsilon-anel putativa [Daucus carota subsp. Sativus]
BAD941436 62319017 Proteína semelhante ao citocroma P450 [Arabidopsis thaliana]
ABD28565 87162770 P450 da classe E, grupo I [Medicago truncatula]
AAT28222 47498772 Citocroma P450 semelhante ao 972B putativa [Ginkgo biloba]
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ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
ABC68396 85001685 Monooxigenase CYP97A de citocroma P450 [Glycine max]
ABC59110 84514203 Monooxigenase CYP97B de citocroma P450 [Medicago truncatula]
NP_190881 42565881 LUT1 (DEFICIENTE EM LUTEÍNA 1); ligação a oxigênio [Arabidopsis thaliana]
ABB47954 78708979 Monooxigenase de citocroma P450 putativa [Oryza sativa (grupo cultivar japonica)]
NP_922604 37336604 Monooxigenase de citocroma P450 putativa [Oryza sativa (grupo cultivar japonica)]
Tabela 23. Exemplos de polipeptídeos de ciclase de licopeno, subunidades beta e epsilon.
ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
AAK07431 12746307 Epsilon-ciclase de licopeno [Adonis palestina]
ABB52073 79154988 Epsilon ciclase de licopeno putativa [Daucus carota subsp. Sativus]
Q38932 27735211 Epsilon ciclase de licopeno, precursor de cloroplasto
AAB53336 1399181 Epsilon ciclase de licopeno
AAG10428 9971816 Epsilon ciclase [Tagetes erecta]
AAK07434 12746313 Epsilon-ciclase de licopeno [Lactuca sativa]
AAM45382 21360359 Epsilon ciclase [Tagetes erecta]
O65837 11132841 Epsilon ciclase de licopeno, precursor de cloroplasto
AAL69394 18419661 Epsilon ciclase de licopeno [Spinacia oleracea]
BAE79549 87299433 Epsilon-ciclase de licopeno [Chrysanthemum x morifolium]
XP_463351 50901836 Epsilon-ciclase de licopeno putativa [Oryza sativa (grupo cultivar japonica)]
AAS48096 44887640 Epsilon ciclase de licopeno [Citrus sinensis]
AAX92679 62638188 Epsilon ciclase de licopeno [Citrus maxima]
AAL92114 195669601 Epsilon-ciclase de licopeno [Citrus x paradisi]
AAK07433 12746311 Epsilon-ciclase de licopeno [Solanum tuberosum]
AAL47019 17864021 Epsilon-ciclase de licopeno [Citrus sinensis]
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ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
AAT46065 48686703 Epsilon-ciclase de licopeno precursor de cloroplasto [Chlamydomonas reinhardtii]
BAD07293 40809769 Epsilon-ciclase de licopeno [Citrus limon]
BAD07285 40809753 Epsilon-ciclase de licopeno [Citrus sinensis]
BAD07277 40909737 Epsilon-ciclase de licopeno [Citrus unshiu]
EAJ62839 44489138 desconhecido [seqüência ambiental]
BAE43547 73993068 Beta ciclase de licopeno putativa [Taxodium distichum var.distichum]
BAR43550 73993074 Beta ciclase de licopeno putativa [Taxodium distichum var.distichum]
BAE43557 73993088 Beta ciclase de licopeno putativa [Taxodium distichum var.imbricarium]
BAR43558 73993090 Beta ciclase de licopeno putativa [Taxodium distichum var.imbricarium]
BAE43553 73993080 Beta ciclase de licopeno putativa [Taxodium distichum var.imbricarium]
BAE43545 73993064 Beta ciclase de licopeno putativa [Taxodium distichum var.imbricarium]
BAE43556 73993086 Beta ciclase de licopeno putativa [Taxodium distichum var.imbricarium]
BAE43552 73993078 Beta ciclase de licopeno putativa [Taxodium distichum var.imbricarium]
BAE43560 73993094 Beta ciclase de licopeno putativa [Taxodium distichum var.imbricarium]
BAE43554 73993082 Beta ciclase de licopeno putativa [Taxodium distichum var.imbricarium]
BAE43551 73993076 Beta ciclase de licopeno putativa [Taxodium distichum var.imbricarium]
BAE43519 73993012 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAE43535 73993044 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAE43541 73993056 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAE43542 73993058 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAE43517 73993008 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
Petição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 76/121
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ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
BAE43534 73993042 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAE43537 73993048 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAE43533 73993040 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAD02774 38603277 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAD02766 38603261 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAE43540 73993054 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAE43514 73993002 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAE43544 73993062 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAE43538 73993050 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAE43528 73993030 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAE43546 73993066 Beta ciclase de licopeno putativa [Taxodium distichum var.distichum]
BAE43526 73993026 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAE43543 73993060 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAD02742 38603213 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAD02770 38603269 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAE43522 73993018 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAE43559 73993092 Beta ciclase de licopeno putativa [Taxodium distichum var.imbricarium]
BAE43527 73993028 Beta ciclase de licopeno putativa [Cryotomeria japonica]
BAE43548 73993070 Beta ciclase de licopeno putativa [Taxodium distichum var.distichum]
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ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
AAF44700 14550425 Beta-ciclase de licopeno [Citrus sinensis]
BAE43555 73993084 Beta ciclase de licopeno putativa [Taxodium distichum var.imbricarium]
VAE43549 73993072 Beta ciclase de licopeno putativa [Taxodium distichum var.distichum]
AAU14144 51922063 Beta-ciclase de licopeno [Citrus sinensis]
AAN86060 27261727 ciclase de licopeno [Citrus unshiu]
AAR89632 40756518 Beta-ciclase de licopeno [Citrus maxima]
AAM21152 20530862 Beta-ciclase de licopeno [Citrus sinensis]
AAD38049 13959731 Ciclase de licopeno [Citrus x paradisi]
AAU05146 51511939 Beta-ciclase de licopeno [Citrus sinensis]
AAU05145 51511937 Beta-ciclase de licopeno [Citrus sinensis]
AAK07430 12746305 Beta-ciclase de licopeno [Adonis palaestina]
ABB72443 82394885 Beta-ciclase de licopeno [Citrus sinensis]
BAE79544 87299423 Beta-ciclase de licopeno [Chrysanthemum x morifolium]
BAE78471 85717882 Beta-ciclase de licopeno [Taraxacum officinale]
Q43415 11133019 Beta ciclase de licopeno, precursor de cloroplasto
AAF23013 6665782 Epsilon-ciclase de licopeno [Daucus carota]
ABB52071 79154899 Beta ciclase de licopeno putativa [Daucaus carota subsp. Sativus]
AAW88382 59665024 Beta-ciclase de licopeno [Lycium barbarum]
AAG10429 9971818 Beta ciclase [Tagetes erecta]
AAM45381 21360357 Beta ciclase [Tagetes erecta]
AAM14335 20259239 Beta ciclase de licopeno putativa [Arabidopsis thaliana]
AAO18661 27728515 Beta-ciclase de licopeno [Zea mays]
AAA81880 735882 Ciclase de licopeno
Q43503 1133022 Beta ciclase de licopeno, precursor de cloroplasto
S66350 2129931 Beta-ciclase de licopeno (EC 5.5.1.-) - tomate
XP_464409 50905841 Beta-ciclase de licopeno putativo [Oryza sativa (grupo cultivar japonica)]
CAD70565 45237491 Ciclase de licopeno [Bixa orellana]
Q43578 11133025 Beta ciclase de licopeno, precursor de cloroplasto
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ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
AAL92175 19569782 Ciclase de beta-licopeno [Sandersonia aurantiaca]
AAX54906 61742130 Beta ciclase de licopeno, precursor de cloroplasto [Chlamydomonas reinhardtii]
S66349 2129954 Beta-ciclase de licopeno (EC 5.5.1.-) -
AAG21133 10644119 Beta ciclase de licopeno cromoplasto - específica [Lycopersicon esculentum]
CAB92977 8274354 Sintase de neoxantina [Solanum tuberosum]
CAB93342 8249885 Sintase de neoxantina [Lycopersicon esculentum]
Q9SEA0 1131528 Sintase de capsantina / capsorubina, precursor de cloroplasto
Q42435 12643508 Sintase de capsantina / capsorubina, precursor de cloroplasto
AAO64977 97730608 Beta ciclase de licopeno [Haematococcus pluvialis]
Q40424 1133011 Beta ciclase de licopeno, precursor de cloroplasto
ABB52072 79154940 Sintase de capsantina-capsorubina putativa [Daucus carota subs. Sativus]
AAQ02668 33304511 Ciclase de licopeno [Setaria italica]
CAA54961 840729 Oxidoreductase cromoplásica putativa [Capsicum annuum]
EAJ62838 44489136 Desconhecido [seqüência ambiental]
YP_401079 81300871 Ciclase de licopeno, beta e epsilon [Synechococcus elongatus PCC 7942]
YP_172741 56752040 Ciclase de licopeno [Synechococcus elongatus PCC 6301]
ZP_011... 88808972 Beta ciclase de licopeno [Synechococcus sp. WH 7805]
EAK50052 44615956 Desconhecido [seqüência ambiental]
NP_892751 33861190 Epsilon ciclase de licopeno putativa [Prochlorococcus marinus subsp. Pastoris gênero CCMP1986]
NP_875182 33240240 Epsilon ciclase de licopeno [Prochlorococcus marinus subsp. marinus gênero CCMP1375]
YP_382237 78213458 Ciclase de licopeno, beta e epsilon [Synechococcus sp. CC9605]
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ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
YP_397130 78779018 Ciclase de licopeno, beta e epsilon [Prochlorococcus marinus gênero MIT 9312]
NP_896821 33865262 Beta ciclase de licopeno [Synechococcus sp. WH 8102]
YP_397570 78779458 Ciclase de licopeno, beta e epsilon [Prochlorococcus marinus gênero MIT 9312]
ZP_010... 87302144 Ciclase de licopeno [Synechococcus sp. WH 5701]
EAK17149 44569190 Desconhecido [seqüência ambiental]
YP_291882 72382527 Ciclase de licopeno, beta e epsilon [Prochlorococcus marinus gênero NATL2A]
NP_875528 33240586 Dehidrogenase relacionada à beta-ciclase de licopeno [Prochlorococcus marinus subsp. marinus gênero CCMP1375]
NP_893181 33861620 Beta ciclase de licopeno putativa [Prochlorococcus marinus gênero CCMP1986]
NP_895600 33864040 Epsilon ciclase de licopeno putativa [Prochlorococcus marinus gênero MIT 9313]
EAI47456 44325573 Desconhecido [seqüência ambiental]
YP_291268 72381913 Ciclase de licopeno, beta e epsilon [Prochlorococcus marinus gênero NATL2A]
ZP_010... 84517806 Dehidrogenase relacionada a beta-ciclase de licopeno [Prochlorococcus marinus gênero MIT 9211]
AAF34191 6970079 Epsilon ciclase de licopeno [Daucus carota]
ZP_010... 84518202 Epsilon ciclase de licopeno [Prochlorococcus marinus gênero MIT 9211 ]
YP_376736 78184301 Ciclase de licopeno, beta e epsilon [Synechococcus sp. CC9902]
ZP_003... 66796756 Ciclase de licopeno, beta e epsilon [Deinococcus geothermalis DSM 11300]
NP_894954 33863394 Beta ciclase de licopeno putativa [Prochlorococcus marinus gênero MIT 9313]
AAT76051 50365502 Ciclase de licopeno [Citrus Clementina]
EAK22047 44576122 Desconhecido [seqüência ambiental]
NP_294525 15805827 Ciclase de licopeno [Deinococcus radiodurans R1]
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Tabela 24. Exemplos de polipeptídeos de glicosiltransferase de carotenóide
ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
AAA21261 148395 CRTx [Pantoea Agglomerans]
AAN85597 27228291 Glicosil transferase de zeaxantina [Pantoea stewartii]
BAB79601 18143446 CrtX [Pantoea agglomerans pv.milletiae]
AAZ73147 72536082 Glicosil transferase de zeaxantina [Enterobacteriaceae bacterium DC413]
AAZ73128 72536060 Glicosil transferase de zeaxantina [Enterobacteriaceae bacterium DC260]
AAZ73140 72536074 Glicosil transferase de zeaxantina [Enterobacteriaceae bacterium DC416]
Q01330 231911 Glicosil transferase de zeaxantina
ZP_006... 71674312 Glicosiltransferase-UDP, MGT [Trichodesmiume erythraeum IMS101]
NP_439972 16329244 Glicosil transferase de zeaxantina [Synechocystis sp. PCC 6803]
EAH29368 44130903 Desconhecido [seqüência ambiental]
ZP005... 67926135 Glicosil transferase de zeaxantina, proteína teórica [Crocosphaera watsonii WH 8501]
YP_378763 78188425 Proteína teórica Cag_04477 [Chlorobium chlorochromatii CaD3]
ZP_005... 68549418 Glicosil transferase, grupo 1 [Pelodictyon phaeoclathratiforme BU-1]
ZP_010... 85713606 Glicosil transferase, grupo 1 [Nitrobacter sp. Nb311A]
YP_317171 75674750 Glicosil transferase, grupo 1 [Nitrobacter winoigradskyi Nb-255]
ZP_006... 59929171 Glicosil transferase, grupo 1 [Nitrobacter hamburgensis X14]
ZP_009... 84500589 Proteína teórica OB2597_11541 [Oceanicola batsensis HTCC2597]
ZP_009... 83953176 Proteína teórica NAS141 12746 [Sulfitobacter sp. NAS-14.1]
ZP_009... 83942121 Proteína teórica EE36 07793 [Sulfitobacter sp. EE36]
YP 508020 89052569 Glicosil transferase, grupo 1 [Jannaschia sp.CCS1]
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ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
ZP_010... 85704103 Proteína teórica ROS217-13931 [Roseovarius sp. 217]
ZP_009... 83370850 Provável glicosiltransferase [Rhodobacter sphaeroides ATCC 17025]
ZP_006... 69934465 Glicosil transferase, grupo 1 [Paracoccus denitrificans PD1222]
ZP_009... 83949880 Provável glicosiltransferase [Rosevarius nubinhibens ISM]
YP_376237 78183803 Glicosiltransferase putativa [Synechococcus sp. CC9902]
YP_376129 78183695 Provável glicosiltransferase [Synechococcus sp. CC9902]
YP_374296 78186259 Proteína teórica Plut 0365 [Pelodictyon luteolum DSM 273]
ZP_010... 78431651 Glicosiltransferase putativa [Synechococcus sp. WH 5701]
ZP_011... 88809938 Glicosiltransferase putativa [Synechococcus sp. WH 7805]
BA347471 78483937 Glicosil transferase de carotenóide [Paracoccus sp. N81106]
ZP_010.. 87303273 Glicosil transferase [Synechococcus sp. WH 5701]
YP_376127 78183693 Provável glicosiltransferase [Synechococcus sp. CC9902]
YP_501334 88196509 Proteína teórica SAOUHSC_02880 [Staphylococcus aureus subsp. Aureus NCTC 8325]
YP_187370 57652300 Glicosil transferase, família de proteína do grupo 2 [Staphylococcus aureus subsp. Aureus COL]
CAA66627 1340131u Produto de proteína designado [Staphylococcus aureus]
YP_041987 49484763 Glicosil transferase putativa [Staphylococcus aureus subsp. Aureus MRSA252]
YP_417885 82752144 Proteína teórica SAB2436c [Staphylococcus aureus RF122]
YP_252404 70725490 Proteína teórica SH0489 [Staphylococcus haemolyticus JCSC1435]
NP_693379 23099913 Proteína teórica OB2458 [Oceanobacillus iheyensis HTE831]
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ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
ZP_008... 82501285 Proteína teórica conservada [Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903]
ZP_010... 87303565 Proteína teórica [Synechococcus sp. WH 5701]
Tabela 25. Exemplos de polipeptídeos de aciltransferase de acil CoA: diaciglicerol (DGAT)
ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
XP 957022 85082953 Proteína teórica [Neurospora crassa N150]
XP_386864 46124621 Proteína teórica FG06688.1 [Gibeberella zeae PH-1]
XP_755172 71000982 O-aciltransferase de DGAT de diaciglicerol [Aspergillus fumigatus Af293]
XP_663763 67539978 Proteína teórica AN6159.2 [Aspergillus nidulans FGSC A4]
BAE65302 83775179 Produto de proteína não designado [Aspergillus oryzae]
XP 502557 50550169 Proteína teórica [Yarrowia lipolytica]
AAS78662 56199782 Aciltransferase de diacilglicerol [Glycine max]
ABB84383 82582915 Aciltransferase de diacilglicerol [Jatropha curcas]
AAV31083 54145459 Aciltransferase 1,2-diacil-sn-glicerol:acil-CoA [Euonymus alatus]
AAG23696 10803053 Aciltransferase de diacilglicerol [Perilla frutescens]
AAF64065 7576941 Aciltransferase de diacilglicerol putativa [Brassica napus]
AAS01606 41387497 Aciltransferase 1 de acil-CoA:diacilglicerol [Olea europaea]
AAT73629 50299542 Aciltransferase de acil-CoA:diacilglicerol [Glycine Max]
AAM03340 67043496 Aciltransferase de diacilglicerol putativa [Tropaeolum majus]
XP_645633 66824557 Proteína teórica DDB0202877 [Dictiostelium discoideum]
AAF19345 6625653 Aciltransferase de diacilglicerol acilCoA [Nicotiana tabacum]
AAY40785 63376239 Aciltransferase DGAT2 de diacilglicerol [Brassica juncea]
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ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
AAW47581 57231736 Aciltransferase de diacilglicerol [Oryza sativa [grupo cultivar japonica]
AAR11479 338146080 Aciltransferase de diacilglicerol [Ricinus communis]
AAY40784 63376226 Aciltransferase DAGT1 diacilglicerol [Brassica juncea]
AAP68322 31711932 Aat2g19450 [Arabidopsis thaliana]
AAW51456 57545061 Aciltransferase de diacilglicerol [Lótus corniculatus var. japonicus]
AAD45536 5579408 Aciltransferase de diacilglicerol putativa [Brassica napus]
BAD53762 53791817 Aciltransferase de diacilglicerol: acil-CoA putativa [Oryza sativa (grupo cultivar japonica)]
NP 956024 41054343 Proteína teórica LOC325875 [Danio rerio]
AAL49962 18642598 Aciltransferase de diacilglicerol 1 [Bos taurus]
XP_930884 89028385 Similar a O-aciltransferase 1 de diacilglicerol (aciltransferase de diglicerídeo) (gene ACATrelacionado) [Homo sapiens]
NP 777118 27819636 O-aciltransferase 1 de diacilglicerol [Bos taurus]
Q9GMF1 18202926 O-aciltransferase 1 de diacilglicerol (aciltransferase de diglicerídeo)
NP_036211 6912332 O-aciltransferase 1 de diacilglicerol [Homo sapiens]
AAH06263 34782946 Proteína DGAT1 [Homo sapiens]
XP_780515 72006039 Similar a O-aciltransferase1 de diacilglicerol [Stronglulocentrotus purpuratus]
AAD40881 5225382 Aciltransferase de diacilglicerol putativa [Brassica napus]
XP_539214 73974769 Isoforma 1 similar a O-aciltransferase 1 de diacilglicerol (produto do gene ACAT-relacionado) [Canis familiares]
AAZ22403 71063860 O-aciltransferase1 de diacilglicerol [Bubalus bubalis]
NP_999216 47522918 Aciltransferase de diacilglicerol [Sus scrofa]
NP 001... 50539976 Proteína teórica LOC436721 [Danio rerio]
XP_849176 73974767 Isoforma 2 similar a O-aciltransferase 1 de diacilglicerol (produto de gene ACAT relacionado) [Canis familiares]
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ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
NP 505828 71997360 H19N07.4 [Caenorhabditis elegans]
AFF82410 9049538 Aciltransferase de diacilglicerol [Caenorhabditis elegans]
CAE75170 39591950 Proteína teórica CBG23107 [Caenorhabditis briggsae]
XP_626337 66358318 Aciltransferase 1 de diacilglicerol [Cryptosporidium parvum Iowa II]
XP_668402 67624239 Enzima relacionada à Aciltransferase 1 de diacilglicerol: acil-CoA [Cryptosporidium hominis TU502]
AAP94208 33113253 Enzima relacionada à Aciltransferase 1 de diacilglicerol: acil-CoA [Toxoplasma gondii]
AAP94209 33113255 Enzima relacionada à Aciltransferase 1 de diacilglicerol: acil-CoA [Toxoplasma gondii]
XP_579557 62652535 PREVISTO: O-aciltransferase 1 de diacilglicerol {Rattus norvegicus]
BAC66171 29170489 Aciltransferase de diacilglicerol [Mus musculus]
Q9ERM3 18202872 O-aciltransferase 1 de diacilglicerol (Diglicerídeo de aciltransferase)
AAL78366 18698659 Aciltransferase de diacilglicerol: acil coenzima A [Drosophila melanogaster]
NP_995724 45552403 CG31991-PD, isoforma D [Drosophila melanogaster]
NP_724017 18698659 CG31991-PC, isoforma C [Drosophila melanogaster]
XP_858062 45552403 Isoforma 3 similar a O-aciltransferase 1 de diacilglicerol (produto do gene ACAT-relacionado) [Canis familiares]
XP_728984 82915156 Proteína teórica PY01256 [Plasmodium yoelii yoelii gênero 17XNL]
CAG11944 47225461 Produto de proteína não designado [ Tetraodon nigroviridis]
BAD27526 50199438 Aciltransferase de diacilglicerol: acil-CoA [estrutura sintética eucariota]
XP_317656 31226099 ENSANGP00000002281 [Anopheles gambie gênero PEST]
AAV59457 55733950 Aciltransferase de diacilglicerol putativa [Oryza sativa (grupo cultivar japonica)]
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ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
EAL33593 54644853 GA16599-PA [Drosophila pseudoobscura]
XP_678753 68073677 O-aciltransferase de diacilglicerol [Plasmodium berghei gênero ANKA]
XP_520014 55631434 PREVISTO: similar à O-aciltransferase 1 de diacilglicerol (Aciltransferase de diacilglicerol ) [Pan troglodytes]
CAG10815 47219451 Produto de proteína não designado [Tetraodon nigroviridis]
XP_624754 66522700 PREVISTO: similar a ENSANGP00000002281 [Apis mellifera]
CAC69884 1560769 Aciltransferase 1 de diacilglicerol [Rattus norvegicus]
XP_686181 68363630 PREVISTO: similar a O-aciltransferase 1 de diacilglicerol (Aciltransferase de diacilglicerol) [Danio rerio]
XP_734008 70921323 O-aciltransferase [Plasmodium chabaudi chabaudi]
XP_673128 68062248 Proteína teórica PB300300.00.0 [Plasmodium berghei gênero ANKA]
AAS72376 45642963 Beta Aciltransferase de colesterol : acil-CoA [Toxoplasma gondii]
AAS72375 45642961 Alfa aciltransferase de colesterol: acil-CoA [Toxoplasma gondii]
NP_586145 19074639 O-ACILTRANSFERASE DE ESTEROL [Encephalitozoon cuniculi GB-M1]
XP_640280 66812202 Proteína teórica DDB0205259 [Dictyostelium discoideum]
AAY40783 63376221 Aciltransferase de diacilglicerol [Brassica juncea]
XP_765774 71032265 O-aciltransferase de diacilglicerol [Theileria parva gênero Muguga]
Q876L2 34582301 O-aciltransferase 2 (sintase de éster-esterol 2)
XP_571260 58268208 O-aciltransferase esterol [Cryptococcus neoformans var. norformans JEC21]
EAL20032 50257323 Proteína teórica CNBF3580 [Cryptococcus neoformans var. neoformans B-2501A]
XP 954478 84999514 Aciltransferase [Theileria annulata gênero Ankara]
XP 505086 50555355 Proteína teórica [Yarrowia lipolytica]
Petição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 86/121
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ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
NP_588558 19076058 Proteína teórica SPCP1E11.05c [Schizosaccharomyces pombe 972h-]
AAC49441 1389739 Aciltransferase esterol: acil-CoA
NP_014416 6324346 Aciltransferase esterol: acil-CoA, isozima Are1p; Are2p [Sccharomyces cerevisiae]
XP_750354 70991010 O-aciltransferase esterol APE2 [Aspergillus fumigatus Af293]
XP_382192 46110268 Proteína teórica FG02016.1 [Gibberella zeae PH1]
BAE54934 83764790 Produto de proteína não designado [Aspergillus oryzae]
XP_885914 76617939 Isoforma 2 similar a O-aciltransferase 2 esterol ( Aciltransferase 2 de colesterol) (ACAT-2) [Bos taurus]
XP_591251 76617937 Isoforma 1 similar a O-aciltransferase 2 esterol ( Aciltransferase 2 de colesterol) (ACAT-2) [Bos taurus]
BAC00846 21392392 Aciltransferase 2 de colesterol: acil-CoA [Rattus norvegicus]
NP_649816 285711583 CG8112-PA [Drosophila melanogaster]
NP 666176 22122547 O-aciltransferase 2 de esterol [Mus musculus]
O88908 18202245 O-aciltransferase 2 de esterol (O-aciltransferase 2 de colesterol) (ACAT-2)
XP_761502 71022545 Proteína teórica UM05355.1 [Ustilago maydis 521]
NP_714950 40254723 O-aciltransferase 2 de esterol [Rattus norvegicus]
EAQ86094 88178626 Proteína teórica CHGG_07347 [Chaetomium globosum CBS 148.51]
XP_461395 50425599 Proteína teórica DEHA0F25625g [Debaryomyces hansenii CBS767]
XP_661812 67527926 Proteína teórica AN42208.2 [Aspergillus nidulans FGSC A4]
AAH96091 64654094 O-aciltransferase 2 de esterol [Homo sapiens]
O75908 18202149 O-aciltransferase 2 de esterol (O-aciltransferase 2 de colesterol) (ACAT-2)
AAH96090 64652990 O-aciltransferase 2 de esterol [Homo sapiens]
AAK48829 13898623 O-aciltransferase 2 de colesterol: acil coenzima A [Homo sapiens]
Petição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 87/121
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ACESSO GI DESCRIÇÃO DE PROTEÍNA
XP_543637 73996435 PREVISTO: similar a O-aciltransferase 2 de esterol [Canis familiaris]
O77759 18202176 O-aciltransferase 2 de esterol (O-aciltransferase 2 de colesterol) (ACAT-2)
AAO32474 28564191 ARE2 [Saccharomyces castelli]
XP 323485 32405744 Proteína teórica [Neurospora crassa]
NP_982606 45184888 AAR065Cp [Eremothecium gossypii]
NP_593708 19114620 Proteína teórica SPAC13G7.06 [Schizosaccharomyces pombe 972h-]
AAO32554 28564940 ARE2 [Saccharomyces kluyveri]
EAL28962 54639560 GA20833-PA [Drosophila pseudoobscura]
XP_449806 50294790 Proteína teórica CAGL0M10571g [Candida glabrata CBS138]
NP_033256 84619697 O-aciltransferase 1 de esterol [Mus musculus]
Q61263 18202591 O-aciltransferase 1 de esterol (O-aciltransferase 1 de colesterol) (ACAT-1)
BAC34925 26342537 Produto de proteína não designado [Mus musculus]
XP_452607 50305295 Produto de proteína não designado [Kluyveromyces lactis]
NP 001... 77735363 Proteína teórica LOC504287 [Bos taurus]
Q60457 18202585 O-aciltransferase 1 de esterol (aciltransferase 1 colesterol) (ACAT-1)
XP_320321 58393811 ENSANGP00000016512 [Anopheles gambie gênero PEST]
XP_320320 58393809 ENSANGP00000016486 [Anopheles gambie gênero PEST]
O70536 18202126 O-aciltransferase 1 de esterol ( Aciltransferase 1 de colesterol) (ACAT-1)
XP_714776 68482533 Aciltransferase de colesterol acil-CoA [Canida albicans SC5314]
Petição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 88/121
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Tabela 29. Exemplos de sintase de polipeptídeos de prenildifosfato
29A: Proteínas de bactéria que requerem uma seqüência de objetivação mitocondrial
ACESSO GI DESCRIÇÃO
ZP_009... 83373595 Trans-hexapreniltranstransferase [Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029]
ZP_009... 83371280 Trans-hexapreniltranstransferase [Rhodobacter sphaeroides ATCC 17025]
CAD24417 20429105 Sintase de difosfato decaprenil [Paracoccus zeaxanthinifaciens]
ZP_010... 85705714 Sintase de pirofosfato de geranilgeranila / Sintetase de poliprenila [Roseovarius sp.217]
ZP_010... 84515724 Sintase de difosfato de decaprenila [Loktanella vestfoldensis SKA53]
YP_165582 56695234 Sintase de difosfato de decaprenila [Silicibacter pomeroyi DSS-3]
ZP_010... 86139019 Sintase de difosfato de decaprenila [Roseobacter sp. MED193]
ZP_009... 83941379 Sintase de difosfato de decaprenila [Sulfitobacter sp. EE-36]
ZP_009... 83854856 Sintase de difosfato de decaprenila [Sulfitobacter sp. NAS-14.1]
ZP_006... 69299873 Farnesiltranstransferase [ Sulfitobacter sp. TM1040]
ZP_010... 84683979 Sintase de pirofosfato de geranilgeranila / Sintetase de poliprenila [Rhodobacterales bacterium HTCC2654]
ZP_009... 84500217 Sintase de difosfato de decaprenila [Oceanicola batsensis HTCC2597]
ZP_009... 83952381 Sintase de difosfato de decaprenila [Roseovarius nubinhibens ISM]
ZP_006... 69937106 Trans-hexapreniltranstransferase [Paracoccus denitrificans PD1222]
ZP_005... 68180845 Trans-hexapreniltranstransferase [Jannaschia sp. CCS1]
ZP_008... 78495595 Sintetase de poliprenila [Rhodopseudomonas palustris BisB18]
AAY82368 67866738 Sintase de difosfato de decaprenila [Agrobacterium tumefaciens]
Petição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 89/121
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29A: Proteínas de bactéria que requerem uma seqüência de objetivação mitocondrial
ACESSO GI DESCRIÇÃO
NP_353656 1587975 Proteína AGR_C_1125 [Agrobacterium tumefaciens gênero C58]
ZP_008... 77688465 Farnesiltranstransferase [Rhodopseudomonas palustris BisB5]
NP_531334 17934544 Sintase de difosfato-octaprenila [Agrobacterium tumefaciens gênero C58]
YP_484709 86748213 Farnesiltranstransferase [Rhodopseudomonas palustris HaA2]
AAP56240 37903500 Sintase de difosfato de decaprenila [Agrobacterium tumefaciens]
YP_192388 58010124 Sintase de difosfato de decaprenila [Gluconobacter oxydans 621H]
29B: Subunidade 1 - Proteínas que contém seqüência de objetivação mitocondrial
ACESSO GI DESCRIÇÃO
T43193 11279237 Homólogo de trans-pentapreniltranstransferase levedo com fissão (Schizosaccharomyces pombe)
AAD28559 4732024 Trans-preniltransferase [Homo sapiens]
AAI07275 78070698 Trans-preniltransferase [Mus músculos]
BAE48216 81157931 Subunidade 1 de sintase de difosfato de decaprenil [Homo sapiens]
AAH49211 29165656 Proteína PDSS1 [Homo Sapiens]
Q33DR2 85700953 Subunidade 1 de sintase de difosfato de decaprenila (Subunidade 1 de sintase de solanesildifosfato)
XP_507706 55633583 PREVISTO: similar a proteína TPRT [Pan troglodytes]
XP_586717 76632198 PREVISTO: similar a transpreniltransferase [Bos taurus]
XP_849908 73948851 PREVISTO: similar a trans-preniltransferase [Canis familiares]
29C: Subunidade 2 - Proteínas que contém seqüência de objetivação mitocondrial
ACESSO GI DESCRIÇÃO
Petição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 90/121
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O13851 60389474 Subunidade 2 sintase de difosfato-decaprenila (Subunidade 2 de sintase de difosfato de decaprenila)
29C: Subunidade 2 - Proteínas que contém seqüência de objetivação mitocondrial
ACESSO GI DESCRIÇÃO
BAE48218 81157935 Subunidade 2 de sintase de difosfato de solanesila [Mus musculus]
BAE48217 81157933 Subunidade 2 de sintase de difosfato de decaprenil [Homo sapiens]
Tabela 30: Exemplos de polipeptídeos PHB-polipreniltransferase
GI DESCRIÇÃO DA PROTEÍNA
51013645 YNR041C [Saccharomyces cerevisiae]
50285815 Produto de proteína não designado [Candida glabrata]
50311051 Produto de proteína não designado [Kluyveromyces lactis]
45200866 AGL23Wp [Erepthecium gossypii]
505555263 Proteína teórica [Yarrowia lipolytica]
68473193 Transferase de poliprenila: para-hidroxibenzoto [Candida albicans SC5314]
50410039 Proteína teórica DEHA0A14212g [Debaryomyces hansenii CBS767]
83769349 Produto de proteína não designado [Aspergillus oryaze]
70994900 Precursor de para-hidroxibenzoato-polipreniltransferase [Aspergillus fumigatus Af293]
19114131 Proteína teórica SPAC56F8. 04c [Schizosaccharomyces pombe 972h-]
39976573 Proteína teórica MG01067.4 [Magnaporthe grisea 70-15]
85078920 Precursor de proteína relacionada à polipreniltransferase de para-hidroxibenzoato [Neurospora crassa N150]
76660839 PREVISTO: similar à polipreniltransferase de para- hidroxibenzoato, mitocondrial [Bos taurus]
52138578 polipreniltransferase de para-hidroxibenzoato, mitocondrial [Homo sapiens]
18088424 Proteína COQ2 [Homo sapiens]
47221448 Produto de proteína não designado [Tetraodon nigroviridis]
58385249 ENSANGP00000012220 [Anopheles gambiae gênero PEST]
50746583 PREVISTO: similar à proteína teórica CL640 [Gallus gallus]
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GI DESCRIÇÃO DA PROTEÍNA
54638587 GA21912-PA [Drosophila pseudoobscura]
21355567 GC9612-PA [Drosophila pseudoobscura]
71005862 Proteína teórica UM01450.1 [Ustilago maydis 521]
Conforme aqueles habilitados na técnica reconhecerão ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção descrita aqui. O escopo da presente invenção não se destina a estar limitado à descrição acima, mas antes, é conforme apresentado nas reivindicações a seguir.
Petição 870170026791, de 24/04/2017, pág. 92/121
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Claims (2)

REIVINDICAÇÕES
1. Fungo recombinante Yarrowia caracterizado por:
a. o fungo ser oleaginoso pelo fato de poder acumular lipídio até pelo menos 20% de seu peso celular seco; e
5 b. o fungo produzir pelo menos um carotenóide e poder acumular o carotenóide produzido em de 1% a 10% de seu peso celular seco;
em que o fungo compreende uma modificação carotenogênica, a modificação confere ao fungo a capacidade de produzir o pelo menos um carotenóide em um nível de pelo menos 1% de seu peso celular
10 seco, a modificação carotenogênica aumenta a expressão ou atividade dos seguintes polipeptídeos carotenogênicos: polipeptídeo de GGPP sintase, polipeptídeo de fitoeno sintase, polipeptídeo de fitoeno desidrogenase, polipeptídeo de licopeno ciclase e polipeptídeo de HMG-CoA redutase,
15 em que os polipeptídeos carotenogênicos são derivados a partir do grupo de microorganismos consistindo em: Y. lipolytica, M. circinelloides,
S. cerevisae, N. crassa, N. aromaticivorans, P. marcusii.
2. Fungo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a pelo menos uma modificação carotenogênica conferir ao fungo a
20 capacidade de produzir o pelo menos um carotenóide em um nível selecionado do grupo consistindo em: pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 5% e pelo menos 10% do peso celular seco do fungo.
3. Fungo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um carotenóide é selecionado do grupo con25 sistindo em astaxantina, β-caroteno, cantaxantina, zeaxantina, luteína, licopeno e combinações dos mesmos.
4. Fungo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de o fungo acumular lipídio na forma de corpos citoplásmicos.
30 5. Fungo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de o pelo menos um carotenóide se acumular nos corpos oleosos citoplásmicos.
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6. Método de produção de um carotenóide, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:
a. cultivo do fungo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 sob condições que permitem a produção de carotenóide; e
5 b. isolamento do carotenóide produzido.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento compreende fracionamento do meio de cultura para obter pelo menos uma fração enriquecida em carotenóide.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo
10 fato de que:
a etapa de cultura compreende cultura do fungo sob condições que permitem acúmulo do carotenóide nos corpos oleosos citoplásmicos; e a etapa de isolamento compreende isolamento do óleo derivado dos corpos oleosos citoplásmicos.
15 9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o carotenóide é selecionado do grupo consistindo em astaxantina, β-caroteno, cantaxantina, zeaxantina, luteína, licopeno e combinações dos mesmos.
10. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo
20 fato de que o carotenóide compreende astaxantina.
11. Método de preparo de um aditivo alimentício ou ração contendo um carotenóide, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
a. cultura do fungo como definido em qualquer uma das reivindi25 cações 1-5 sob condições que permitem produção do carotenóide;
b. isolamento do carotenóide; e
c. combinação do carotenóide isolado com um ou mais de outros componentes alimentícios ou para ração.
Petição 870180034205, de 26/04/2018, pág. 12/13
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