DE102013209950A1

DE102013209950A1 - Hefestamm und Verfahren zur Produktion von Lycopin

Info

Publication number: DE102013209950A1
Application number: DE102013209950.9A
Authority: DE
Inventors: Falk Matthäus; Markus Ketelhot; Michael Gatter; Gerold Barth; Thomas Schlösser
Original assignee: Technische Universitaet Dresden; Wacker Chemie AG
Current assignee: Technische Universitaet Dresden; Wacker Chemie AG
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2013-05-28
Publication date: 2014-12-04
Also published as: WO2014191205A1

Abstract

Hefestamm der Art Yarrowia lipolytica der dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine Phytoensynthase und eine Phytoendesaturase enthält, eine Verringerung der Aktivität der Proteine Pox1p, Pox2p, Pox3p, Pox4p, Pox5p Pox6p und Gut2p aufweist, und eine erhöhte Aktivität der Proteine Ggs1p und Hmg1p aufweist.

Description

Die Erfindung betrifft einen Hefestamm der Art Yarrowia lipolytica und ein Verfahren zur Produktion von Lycopin mit diesem Stamm.
Das Interesse an biotechnologisch hergestellten Carotinoiden als Lebensmittelzusatzstoff oder als Wirkstoff in der pharmazeutischen oder kosmetischen Industrie steigt stetig. Carotinoide besitzen komplexe chemische Strukturen, die sich auf synthetischem Weg nur schwer herstellen lassen. Die Isolation aus pflanzlichem Material ist kompliziert und zeitaufwendig.
Lycopin repräsentiert ein zentrales Carotinoid in der Carotinoid-Biosynthese. Ausgehend von Lycopin können verschiedenartige Carotinoide gebildet werden. Es wird in natürlicher Form in Pflanzen, Algen und anderen photosynthetisch aktiven Organismen gefunden. Lycopin besitzt eine hohe Quenchingrate für Singulett-Sauerstoff. Dadurch werden Lycopin vorbeugende Eigenschaften gegen Krebs nachgesagt. Des Weiteren besitzt Lycopin antifungale Eigenschaften gegen die humanpathogene Hefe Candida albicans. Aus diesem Grund ist die mikrobiologische Produktion von Lycopin besonders herausfordernd.
Die Carotinoid-Biosynthese zweigt sich vom Isoprenoid-Stoffwechsel ab durch die Kondensation von zwei GGPP-Molekülen zu Phytoen. Dies wird durch das Enzym Phytoensynthase (crtBp) durchgeführt. Phytoen wird danach durch die sukzessive Einführung von Doppelbindungen über Phytofluen, Zeta-Carotin, Neurosporen zu Lycopin umgewandelt. Hierfür ist das Enzym Phytoendesaturase (crtIp) verantwortlich (1).
In verschiedenen nicht-lycopinbildenden Hefen wurden bereits die Lycopin-Biosynthese-Gene eingebracht:

• Saccharomyces cerevisiae (Verwaal, R., J. Wang, et al. (2007), Appl Environ Microbiol 73(13): 4342–4350; Lange, N. and A. Steinbuchel (2011), Appl Microbiol Biotechnol 91(6): 1611–1622; Ukibe, K., K. Hashida, et al. (2009), Appl Environ Microbiol 75(22): 7205–7211; Yamano, S., T. Ishii, et al. (1994), Biosci Biotechnol Biochem 58(6): 1112–1114)
• Candida utilis (Misawa, N. and H. Shimada (1998), J Biotechnol 59(3): 169–181; Miura, Y., K. Kondo, et al. (1998), Appl Environ Microbiol 64(4): 1226–1229; Shimada, H., K. Kondo, et al. (1998), Appl Environ Microbiol 64(7): 2676–2680)
• Pichia pastoris (Bhataya, A., C. Schmidt-Dannert, et al. (2009), Process Biochemistry 44(10): 1095–1102;) und
• Mucor circinelloides (Papp, T., A. Velayos, et al. (2006), Appl Microbiol Biotechnol 69(5): 526–531;).

Des Weiteren wurde bereits beschrieben, wie Yarrowia lipolytica (Y. lipolytica) zur Lycopinbildung gebracht werden kann (Ye, R. W., P. L. Sharpe, et al. (2012), Methods Mol Biol 898: 153–159). In den Veröffentlichungen wurden maximal 7,8 mg Lycopin pro Gramm Biotrockenmasse beschrieben.
Y. lipolytica bildet natürlicherweise keine Carotinoide. Sie bildet aber Geranyl-Geranyl-Pyrophosphat, ein wichtiges Intermediat der Lycopinbiosynthese.
US201110021843A1 offenbart, dass ein Y. lipolytica Stamm mit den Genen für ATP-Citrat Lyase, AMP Deaminase und cytosolischer Malat-Dehydrogenase in die Lage versetzt wurde größere Mengen an Fetten zu akkumulieren. Durch Überexpression der Gene HMG1 (kodiert eine HMG-CoA Reduktase) und GGS1 (kodiert eine Geranyl-Geranyl Synthase) aus Y. lipolytica, sowie einer Überexpression der Gene crtB (kodiert eine Phytoensynthase) und crtI (codiert eine Phytoendesaturase) aus Erwinia uredovora konnte Lycopin produziert werden.
US7851199B2 offenbart die Verwendung von Y. lipolytica zur Produktion von Carotinoiden.
WO 2010/004141 offenbart, dass durch eine Deletion des Genes GUT2 in Kombination mit den Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 vergrößerte Fettkörperchen gebildet werden, die für die Produktion von Lipiden genutzt werden können. Darauf aufbauend offenbart WO 2012/001144A1 , dass eine zusätzliche Überexpression des Gens GPD1 in Y. lipolytica zu weiter vergrößerten Fettkörperchen führt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Hefestamms der Art Y. lipolytica der zur mikrobiellen Produktion von Lycopin, in größeren Mengen als bisher bekannt, geeignet ist.
Die Aufgabe wird gelöst durch einen Hefestamm der Art Y. lipolytica der dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine Phytoensynthase und eine Phytoendesaturase enthält, eine Verringerung der Aktivität der Proteine Pox1p, Pox2p, Pox3p, Pox4p, Pox5p Pox6p und Gut2p aufweist, und eine erhöhte Aktivität der Proteine Ggs1p und Hmg1p aufweist.
Bei der Phytoensynthase handelt es sich bevorzugt um eine Phytoensynthase aus Bakterien, besonders bevorzugt aus Pantoea ananatis (P. ananatis). Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der Phytoensynthase um das Protein crtBp (NCBI Reference Sequence: YP_003522457.1).
Bei der Phytoendesaturase handelt es sich bevorzugt um eine Phytoendesaturase aus Bakterien, besonders bevorzugt aus P. ananatis. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der Phytoendesaturase um das Protein crtIp (UniProtKB/Swiss-Prot: P21685.1).
Unter einer erhöhten Aktivität der Proteine Ggs1p und Hmg1p ist vorzugsweise zu verstehen, dass die Aktivität pro Zelle erhöht ist, was durch die Steigerung der Proteinmenge oder durch die Steigerung der proteineigenen Aktivität erzielt werden kann. Die Steigerung der Proteinmenge ist dadurch gekennzeichnet, dass mehr Protein gebildet wird, als bei einem unveränderten Stamm unter gleichen Bedingungen. Die Steigerung der proteineigenen Aktivität ist dadurch gekennzeichnet, dass die gleiche Menge an Protein in einem veränderten Stamm eine höhere Aktivität aufweist als der unveränderte Stamm.
Unter einer Verringerung der Aktivität eines Proteins ist vorzugsweise zu verstehen, dass die Aktivität des Proteins pro Zelle verringert wird. Besonders bevorzugt ist darunter das Fehlen der Aktivität des Proteins zu verstehen.
Eine erhöhte Aktivität der Proteine kann auf verschiedene Weise erzeugt werden:

(i) durch Einbringen des relevanten Gens in mehrfacher, vorzugsweise 8 bis 12facher, Kopie in das Genom des Organismus (Gen-Dosis-Effekt)
(ii) durch Austausch des natürlichen Promoters des relevanten Gens durch einen stärkeren als den natürlichen Promotor, vorzugsweise einen Promoter, der mindestens 50% der Aktivität des Promoters des TEF1-Gens (Translationselongationsfaktor 1 alpha Genolevures: YALI0C09141g) besitzt, höchstvorzugsweise die Aktivität des TEF1-Promoters besitzt. Dabei können Promotoren gewählt werden, die entweder während der gesamten Kultivierung aktiv sind oder nur in einer gewünschten Wachstumsphase aktiv sind (Gen-Regulations-Effekt)

Bei der Aktivitätserhöhung wird das zusätzliche Einbringen des relevanten Gens unter Kontrolle eines starken Promotors besonders bevorzugt, insbesondere bevorzugt unter Kontrolle des TEF1-Promoters aus Yarrowia lipolytica.
Die Verringerung der Aktivität von Proteinen kann durch verschiedene Verfahren erlangt werden:

(i) durch die Inhibierung oder Verminderung der Expression der Gene
(ii) durch partielle oder komplette Deletion der codierenden Gene
(iii) durch Expression von nicht-funktionalen Genen
(iv) durch Inhibierung oder Verminderung der Aktivität der exprimierten Gene.

Die Proteine Pox1p, Pox2p, Pox3p, Pox4p, Pox5p Pox6p und Gut2p werden vorzugsweise durch die Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 (Genolevures: YALI0E32835g, YALI0F10857g, YALI0D24750g, YALI0E27654g, YALI0C23859g, YALI0E06567g) und GUT2 (Genolevures: YALI0B13970g) kodiert.
Das Protein Ggs1p wird vorzugsweise kodiert durch das Gen GGS1 (Genolevures: YALI0D17050p).
Das Protein Hmg1p wird vorzugsweise kodiert durch das Gen HMG1 (Genolevures: YALI0D17050p).
Die Inhibierung oder Verminderung der Expression kann beispielsweise durch Inhibierung oder Verminderung der Transkription des codierenden Gens oder der Translation der gebildeten mRNA erfolgen. Die Deletion der codierenden Gene kann beispielsweise durch einen Ausbau der Gene mittels Deletionskassetten durchgeführt werden. Die Expression eines dysfunktionalen oder aktivitätsreduzierten Genproduktes kann beispielsweise durch Insertion, Substitution oder Punktmutation in dem codierenden Gen bewerkstelligt werden.
Bei der Aktivitätsverringerung wird die Deletion eines codierenden Gens bevorzugt.
Vorzugsweise trägt der erfindungsgemäße Stamm somit die Gene crtB, crtI, GGS1 und HMG1 dessen Genprodukte in ihrer Aktivität erhöht vorliegen und weist eine Deletion der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5, POX6 und GUT2 auf.
Die Deletion der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 unterbindet die Beta-Oxidation, verhindert somit den Abbau der intrazellulären Fettreserven und führt somit wiederum zu vergrößerten Fettkörperchen.
Die Deletion des Gens GUT2, dessen Genprodukt für die Umwandlung von G3P zu DHAP verantwortlich ist, lässt sich die TAG-Synthese Rate erhöhen was zu vergrößerten Fettkörperchen führt.
Das Einbringen der Gene crtB und crtI aus P. ananatis, bewirkt die Bildung von Lycopin.
Die Aktivitätssteigerung Geneprodukte von GGS1 und HMG1 führt zu einer vermehrten Bildung der Carotinoidvorstufen.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass große Fettkörperchen per se keine verstärkte Akkumulation von hydrophoben Substraten in den Hefezellen bewirkt. Unter geeigneten Bedingungen, wie Wachstum in Anwesenheit von Fettsäuren, bildet Y. lipolytica sehr große Fettkörperchen aus. Diese führen jedoch in Lycopin-bildenden Yarrowia lipolytica-Stämmen nicht zu einer verstärkten Akkumulation von Lycopin. Erst die erfindungsgemäßen gentechnischen Veränderungen, nämlich eine Verringerung der Aktivität der durch die Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5 und POX6 (Genolevures: YALI0E32835g, YALI0F10857g, YALI0D24750g, YALI0E27654g, YALI0C23859g, YALI0E06567g) und GUT2 (Genolevures: YALI0B13970g) kodierten Proteine in an sich bereits im Stand der Technik beschriebenen modifizierten Y. lipolytica-Stämmen, welche die Lycopin-bildenen Proteine crtBp (NCBI Reference Sequence: YP_003522457.1) und crtIp (UniProtkB/Swiss-Prot: P21685.1) enthalten und welche eine Erhöhung der Aktivität der Proteine Ggs1p und Hmg1p, vorzugsweise durch die Verknüpfung mit dem starken Promoter des TEF1-Gens, aufweisen und Desweiteren in geeigneten Limitationsbedingungen kultiviert werden, führen zu einer verstärkten Akkumulation von Lycopin in den Fettkörperchen der Hefe.
Als Ausgangsstamm für die Konstruktion eines erfindungsgemäßen Stammes kann ein Wildtypisolat der Hefe Y. lipolytica verwendet werden, vorzugsweise der Stamm H222. Der Stamm H222 wurde am 29.04.2013 bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7B, D-38142 Braunschweig) unter der Nummer DSM 27185 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt.
Zur Verwendung eines Stammes für die weitere gentechnische Bearbeitung, ist ein Selektionsmarker notwendig. Dieser Selektionsmarker kann z. B. in Form der Uracilauxotrophie in an sich bekannter Weise in den Stamm eingebracht werden. Alternativ kann auf bereits bekannte uracilauxotrophe Stämme zurückgegriffen, vorzugsweise auf den Stamm H222-S4 (Mauersberger, S., H. J. Wang, et al. (2001), J Bacteriol 183(17): 5102–5109).
Eingebracht werden die Gene vorzugsweise mittels üblicher Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind.
Um eine effiziente Translation der eingebrachten Gene zu gewährleisten, ist es bevorzugt, die Sequenz der Gene crtB und crtI an die Codon-Verwendung von Y. lipolytica anzupassen. Besonders bevorzugt werden crtB und crtI Gene eingesetzt, deren Codon-Verwendung mit dem Program GeneOptimizer^® (http://dede.invitrogen.com/site/de/de/home/Products-and-Services/Applications/Cloning/gene-synthesis/GeneArt-Gene-Synthesis/GeneOptimizer.html) angepasst wurde. Insbesondere bevorzugt hat das crtB Gen die Sequenz SEQ ID NO: 34. Insbesondere bevorzugt hat das crtI Gen die Sequenz SEQ ID NO: 35.
Weiterhin ist es bevorzugt für den Organismus funktionierende Promotoren mit dem offenen Leserahmen der Gene zu verknüpfen. Hierbei können sowohl konstitutive Promotoren als auch von den Kultivierungsbedingungen abhängige Promotoren der Hefe Y. lipolytica genutzt werden.
Vorzugsweise werden konstitutive Promotoren genutzt. Besonders bevorzugt wird der Promoter des Translationselongationsfaktors 1 alpha (pTEF1) verwendet.
Ebenso ist es bevorzugt, den offenen Leserahmen der Gene mit einem Terminator zu versehen. Vorzugsweise wird der Terminator des Gens der Isocitratlyase (ICL1t) verwendet.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Lycopin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus in an sich bekannter Art und Weise in einem Fermenter fermentiert wird.
Bei der Kulivierung eines erfindungsgemäßen Stammes führt ein verbessertes Wachstum in Medium mit Ölsäure zu einer Verringerung der spezifischen Lycopin-Bildung. Daher ist es bevorzugt neben den erfindungsgemäßen gentechnischen Veränderungen von Y. lipolytica zur Erhöhung der Kapazität der Fettkörperchen durch Erhöhung des Fettgehalts, das Wachstum zu limitieren.
Die vergrößerten Fettkörperchen bilden zwar eine erhöhte Kapazität für die Akkumulation von Lycopin, jedoch ist dies nur relevant, wenn auch zytotoxische Mengen an Lycopin gebildet werden. Aufgrund der konstitutiven Expression der an der Carotinoid-Biosynthese beteiligten Gene, führt eine Wachstumslimitation zu einer erhöhten spezifischen Lycopin-Bildung. Diese Limitation kann auf verschiedene Weise realisiert werden.
Die Deletion des GUT2-Gens führt nicht nur zur Vergrößerung der Fettkörperchen durch den verminderten Abfluss des G3P in die Glycolyse, sondern auch zu einer verringerten Verwertung von Glycerol. Für das Wachstum auf Glycerol als einzige Kohlenstoffquelle ist die Bildung von Glucose über die Gluconeogenese essentiell. Das Genprodukt des GUT2-Gens stellt hierbei ein wichtiges Enzym dar, weil es die Umsetzung von G3P zu DHAP katalysiert, welches dann in die Gluconeogenese einfließt. Die Deletion des GUT2-Gens führt bei Kultivierung in Glycerol-haltigem Medium zu limitiertem Wachstum und zu einer erhöhten spezifischen Lycopin-Bildung. Dementsprechend ist die Deletion des GUT2-Gens in zweierlei Hinsicht entscheidend für die Bildung und Akkumulation von Lycopin verantwortlich.
Eine weitere Form der Limitierung ist die Stickstofflimitierung. Diese Limitierung führt in der Hefe Y. lipolytica zu einem Wachstumsstopp nach Aufbrauchen der Stickstoffquelle und zur Bildung von Citronensäure und Iso-Citronensäure. Vorzugsweise erfolgt die Kultivierung im Fermenter unter kontrollierten Prozessparametern, wobei besonders bevorzugt der pH-Wert im Medium konstant gehalten wird. Insbesondere bevorzugt erfolgt die Fermentation unter Limitationsbedingungen.
Es konnte gezeigt werden, dass die spezifische Lycopinkonzentration in den Zellen durch Wachstum unter Limitationsbedingungen erhöht ist. Die Wachstumslimitation kann durch vielerlei Mittel erzeugt werden. Vorzugsweise sollte der Stickstoffgehalt im Medium während der Produktionsphase kleiner als 2 g l^–1, vorzugsweise kleiner als 1 g l^–1, hoch vorzugswiese kleiner 0,5 g l^–1, höchst vorzugsweise Null sein. Die Produktionsphase ist dadurch gekennzeichnet, dass sie sich einer Phase starken Wachstums (Wachstumsphase) anschließt und nur noch im Vergleich zur Wachstumsrate geringes Wachstum, jedoch erhöhte Produktbildung aufweist.
Im Falle der Stickstofflimitation sollte der pH-Wert im Medium kleiner sein als der physiologisch bevorzugte von 5,5, vorzugsweise sollte der pH-Wert zwischen 1 und 5,5 liegen, besonders bevorzugt zwischen 2 und 4, insbesondere bevorzugt bei 3,5.
Vorzugsweise werden im erfindungsgemäßen Verfahren die genannten Limitationsbedingungen miteinander kombiniert.
1 zeigt schematisch die Lycopin-Biosynthese in nichtcarotinoidbildenden Organismen.
2 zeigt schematisch die Erhöhung der Fettsynthese und -akkumulation. Proteinbezeichnungen an den Reaktionswegen entsprechen denen aus Saccharomyces cerevisiae, durchgestrichene Proteine kennzeichnen die Aktivität der Proteine, die verringert werden soll.
3 zeigt Integrative Vektoren für die Lycopin-Biosynthese
4 zeigt integrative Vektoren zur vermehrten Bildung der Isoprenoid-Vorstufen
5 zeigt wie in Bsp. 3 beschrieben, den spezifischen Lycopingehalt des Wildtypstammes H222, der Abkömmlinge transformiert mit den Codon-Usage-optimierten Genen crtB und crtI aus P. ananatis (BI) und der zusätzlichen Überexpression der Gene GGS1 (G) und HMG1 (H) nach 96 h in YPD-Medium. In allen Abkömmlingen sind die Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5, POX6 und GUT2 deletiert.
6 zeigt wie in Bsp. 4 beschrieben, spezifische Lycopin-Konzentrationen nach 168 h Kultivierung von H222 BI GH (Stamm ohne Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5, POX6 und GUT2) in Komplex-(YP) und Minimalmedium (M) mit je 3% Glucose (G) bzw. 3% Dextrose (D), 3% Glycerol (Y) oder 3% Ölsäure (O).
7 zeigt wie in Bsp. 4 beschreiben, die mikroskopische Überlagerung aus Hellfeld- und Fluoreszenzaufnahmen von Nilrotgefärbten Zellen nach 168 h Kultivierung von H222 BI GH.
8 zeigt, wie in Bsp. 5 beschreiben, den spezifischen Lycopingehalt und die Biotrockenmasse der Stämme H222 Δ BI GH (erfindungsgemäß) und H222 BI GH (Vergleichsbeispiel).
9 zeigt, wie in Bsp. 6 beschreiben, Kultivierungen des Stammes H222 Δ BI GH bei verschiedenen pH-Werten.
10 zeigt die Codon Usage Tabelle von Y. lipolytica.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
Beispiel 1: Blockierung der Beta-Oxidation und der Glycerol-basierten Gluconeogenese
Für die Konstruktion der Deletionskassetten der POX-Gene und des GUT2-Gens wurde eine Restriktionsschnittstelle (Tabelle 1: RS) zwischen Promoter und Terminator des jeweiligen Gens, welche per PCR aus genomischer DNA des Stammes H222 mit den in Tabelle 1 aufgeführten Primern gewonnen wurden, durch PCR eingebracht. Das PCR-Produkt wurde in pJET1.2 (Fermentas, Germany) ligiert und mit BamHI linearisiert. Das URA3-Fragment (2868 bp) wurde durch Restriktion mit BamHI und BglII aus dem Vektor pU-CLys2-DK2 (SEQ ID NO: 1) isoliert und in den mit BamHI linearisierten Vektor mit den entsprechenden Promoter-Terminator-Fragment ligiert. Die Deletionskassetten wurden letztendlich mittels natürlich vorkommenden oder an den Primern angehängten Schnittstellen gewonnen und in Y. lipolytica H222-S4, der aus Y. lipolytica H222 hergestellt werden kann (Mauersberger, S., H. J. Wang, et al. (2001), J Bacteriol 183(17): 5102–5109), nach Barth und Gaillardin (1996) transformiert. Vor einer erneuten Transformation, wurde der Marker per FOA-Selektion zurückgewonnen. Der Stamm, der sowohl Deletionen der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5, POX6 und GUT2 trägt wurde H222 Δ genannt. Tabelle 1: Primer zur Herstellung der Deletionskassetten
Beispiel 2: Herstellung der Vektoren
Als Ausgangsplasmid diente pUCBM21 (Boehringer Ingelheim)(SEQ ID NO: 2). Aus diesem Vektor wurde durch Restriktion mit EcoRV und EcoICRI und Religation die SphI-Schnittstelle entfernt. Das URA3-Fragment (2868 bp) wurde durch Restriktion mit BamHI und BglII aus dem Vektor pUCLys2-DK2 (SEQ ID NO: 1) isoliert und in den mit BamHI linearisierten pUCBM21 ohne SphI-Schnittstelle ligiert. Der pTEF1-Promoter und der tICL1-Terminator wurden aus dem Vektor p64-TEF-T (SEQ ID NO: 3) durch Restriktion mit BamHI und KpnI (1262 bp) isoliert und in den mit BamHI/KpnI geschnittenen pUCBM21 ligiert.
Es wurden Expressionskassetten konstruiert, die neben dem Selektionsmarker URA3 den Promoter des Translationselongationsfaktors 1 alpha (pTEF1) fusioniert mit den offenen Leserahmen (open reading frames) der Gene GGS1, HMG1, crtB und crtI tragen. Als Terminator für die Translation fungiert der Terminator des Isocitratlyasegens (tICL1). Der Selektionsmarker URA3 ist mit zwei homologen Fragmenten des Tetracyclinresistenzgens aus Escherichia coli versehen, um durch homologe Rekombination (Ausloopen) den Selektionsmarker für weiterführende Arbeiten zurückgewinnen zu können.
Des Weiteren ist in der Expressionskassette eine Sequenz eingebracht, die homolog ist zu einem nichtcodierenden Bereich im Genom des Expressionsorganismus, in der eine zentrale NotI-Restriktionsschnittstelle vorliegt. Mit dieser Schnittstelle kann die Expressionskassette für die homologe Integration in den Expressionsorganismus linearisiert werden. Der Vektor wird entsprechend der Integrationsstelle pIntB genannt.
Der homologe Bereich für die Integration in das Wirtsgenom wurde per PCR mit Primern, die eine KpnI-Schnittstelle im Überhang tragen (intb_KpnI_fw atataggtaccCCCACAGTTCTCACTCAG mit SEQ ID NO: 4; intb_KpnI_rv atataggtaccCATAAGACGCCTCGTTGC mit SEQ ID NO: 5), gewonnen. Diese wurden dann in den mit KpnI linearisierten Vektor ligiert.
Alle folgenden Gene wurden auf die gleiche Weise in den erhaltenen Vektor eingebracht. Als Schnittstellen für die Integration in den Expressionsvektor dienten hierbei SpeI und SphI.
Die an die Codon-Verwendung der Hefe Y. lipolytica angepassten Gene crtB und crtI aus P. ananatis wurden auf synthetischem Wege mit dem Promotor pTEF1 erzeugt und mit den Restriktionsschnittstellen für die Vektorintegration versehen (3)
Die Yarrowia-eigenen Gene GGS1 und HMG1 wurden durch PCR gewonnen und ebenfalls wie crtB und crtI per PCR mit dem Promoter pTEF1 fusioniert und in den Vektor eingebracht (4).
Die NotI-linearisierten Vektoren wurden mittels Lithiumacetat-Methode nach Barth und Gaillardin (1996, Berlin, Heidelberg, New York, Springer-Verlag) in die Y. lipolytica-Stämme H222 und H222 Δ transformiert. Homologe Rekombination wurde durch PCR nachgewiesen. Der Uracil-Selektionsmarker wurde durch die Selektion auf 5'-Fluororotsäure (FOA) zurückgewonnen, sodass eine erneute Transformation mit einem weiteren Vektor möglich wird.
Beispiel 3: Vergleichende Kultivierung der Carotinoid-Vorstufen-produzierenden Stämme
Die Gene für die Carotinoid-Biosynthese wurden sukzessive in den Stamm H222 Δ durch die Integration von pIntB crtI und pIntB crtB und nachfolgender FOA-Selektion eingebracht. In den so erhaltenen uracilauxotrophen Stamm wurde GGS1 unter Kontrolle des pTEF1-Promoters in das Genom integriert. Auch HMG1 wurde auf dieselbe Weise in den Rezipientenstamm und den bereits mit GGS1 transformierten Stamm integriert.
Alle Transformanden und der Rezipientenstamm wurden in YPD (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose) kultiviert. Lycopin wurde mit Hexan:Ethylacetat:Butylhydroxytoluol (50:50:1) während eines Glasperlenaufschlusses extrahiert und bei 472 nm photometrisch bestimmt.
In 5 ist zu sehen, dass die vermehrte Bildung von Ggs1p und Hmg1p zu vermehrter Bildung von Lycopin führt. Auch der additive bzw. synergistische Effekt beider Enzyme ist in der weiteren Erhöhung der spezifischen Lycopinausbeute zu sehen.
Beispiel 4: Kultivierung unter Limitationsbedingungen zur Erhöhung des spezifischen Lycopin-Gehalts
Es konnte gezeigt werden, dass Stämme und Kultivierungsbedingungen, die zu vergrößerten Fettkörperchen führen, nicht automatisch zu einer erhöhten biomassespezifischen Lycopin-Bildung führen (6 und 7).
Der Stamme H222 Δ BI GH wurde vergleichend im Schüttelkolben in Vollmedium YP (1% Hefeextrakt, 2% Pepton) mit je 3% Dextrose (YPD), Dextrose und Ölsäure (YPDO), Glycerol (YPY) oder Glycerol und Ölsäure (YPYO); oder in Minimalmedium (1 g l-1 KH₂PO₄, 0,16 g l^–1 K₂HPO₄ × 3H₂O, 3 g l^–1 (NH₄)₂SO₄, 0,7 g l^–1 MgSO₄ × 7H₂O, 0,5 g/l NaCl, 0,4 g l^–1 Ca(NO₃)₂ × 4H₂O, 0,5 mg l^–1 H₃BO₃, 0,04 mg l^–1 CuSO₄ × 5H₂O, 0,1 mg l^–1 KI, 0,4 mg l^–1 MnSO₄ × 4H₂O, 0,2 mg l^–1 Na₂MoO₄ × 2H₂O, 0,4 mg l^–1 ZnSO₄ × 7H₂O, 6 mg l^–1 FeCl₃ × 6H₂O, 0,3 mg l^–1 Thiamin-Hydrochlorid) mit je 3% Glucose (MG), Glucose und Ölsäure (MGO), Glycerol (MV) oder Glycerol und Ölsäure (MYO) kultiviert. Die Kultivierung wurde bei 28°C und pH 5,5 durchgeführt.
In 7 ist zu sehen, dass die Fettkörperchen in Medium mit Ölsäure vergrößert sind. Die Vergrößerung ist in Minimalmedium stärker ausgeprägt als in Komplexmedium und geht jedoch nicht mit einer erhöhten Akkumulation von Lycopin einher (6).
Beispiel 5: Stickstofflimitierende Kultivierung der Lycopinbildenden Stämme
Die Stämme H222 Δ crtB crtI GGS1 HMG1 (H222 Δ BI GH) und H222 crtB crtI GGS1 HMG1 (H222 BI GH) wurden vergleichend im Fermenter (Multifors, Infors, Stuttgart, Deutschland) in Minimalmedium (5% Glucose, 1 g l-1 KH₂PO₄, 0,16 g l^–1 K₂HPO₄ × 3H₂O, 3 g l^–1 (NH₄)₂SO₄, 0,7 g l^–1 MgSO₄ × 7H₂O, 0,5 g/l NaCl, 0,4 g l^–1 Ca(NO₃)₂ × 4H₂O, 0,5 mg l^–1 H₃BO₃, 0,04 mg l^–1 CuSO₄ × 5H₂O, 0,1 mg l^–1 KI, 0,4 mg l^–1 MnSO₄ × 4H₂O, 0,2 mg l^–1 Na₂MoO₄ × 2H₂O, 0,4 mg l^–1 ZnSO₄ × 7H₂O, 6 mg l^–1 FeCl₃ × 6H₂O, 0,3 mg l^–1 Thiamin-Hydrochlorid) kultiviert. Die Kultivierung wurde bei 28°C, pH 5,5, 1 VVM Druckluft und Rührerdrehzahl zwischen 400 und 1200 Upm durchgeführt.
Aus 8 ist die verstärkte spezifische Bildung des Lycopins im erfindungsgemäßen Stamm ersichtlich (3,8fach). Die gebildeten Mengen an Citronensäure (CA) und Isocitronensäure (ICA) sind in beiden Stämmen vergleichbar (H222 BI GH: CA = 46,6 g l-1; ICA = 6,8 g l-1; H222 Δ BI GH: CA = 43,3 g l-1; ICA = –6,0 g l-1 nach 7 Tagen [d]).
Beispiel 6: Erhöhte Lycopin-Akkumulation durch Kultivierung bei verringertem pH-Wert
H222 Δ BI GH wurde vergleichend bei pH 5,5 und 3,5 im Fermenter (Multifors, Infors, Stuttgart, Deutschland) in Minimalmedium (5 Glucose, 1 g l^–1 KH₂PO₄, 0,16 g l^–1 K₂HPO₄ × 3H₂O, 0,7 g l^–1 MgSO₄ × 7H₂O, 0,4 g l^–1 Ca(NO₃)₂ × 4H₂O, 0,5 mg l^–1 H₃BO₃, 0,04 mg l^–1 CuSO₄ × 5H₂O, 0,4 mg l^–1 MnSO₄ × 4H₂O, 0,4 mg l^–1 ZnSO₄ × 7H₂O, 0,2 mg l^–1 Na₂MoO₄ × 2H₂O, 0,1 mg l^–1 KI, 6 mg l^–1 FeCL₃ × 6H₂O, 0,3 mg l^–1 Thiamin-Hydrochlorid) kultiviert. Die Kultivierung wurde bei 28°C, 1 VVM Druckluft und Rührerdrehzahl zwischen 400 und 1200 Upm durchgeführt (9).
Die Verringerung des pH-Wertes führt zu einem Verfahren mit dem sehr hohe Mengen an Lycopin (16 mg Lycopin pro Gramm Biotrockenmasse) produziert werden können. Sequenzprotokoll SEQUENCE LISTING

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 201110021843 A1 [0008]
US 7851199 B2 [0009]
WO 2010/004141 [0010]
WO 2012/001144 A1 [0010]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Verwaal, R., J. Wang, et al. (2007), Appl Environ Microbiol 73(13): 4342–4350 [0005]
Lange, N. and A. Steinbuchel (2011), Appl Microbiol Biotechnol 91(6): 1611–1622 [0005]
Ukibe, K., K. Hashida, et al. (2009), Appl Environ Microbiol 75(22): 7205–7211 [0005]
Yamano, S., T. Ishii, et al. (1994), Biosci Biotechnol Biochem 58(6): 1112–1114 [0005]
Misawa, N. and H. Shimada (1998), J Biotechnol 59(3): 169–181 [0005]
Miura, Y., K. Kondo, et al. (1998), Appl Environ Microbiol 64(4): 1226–1229 [0005]
Shimada, H., K. Kondo, et al. (1998), Appl Environ Microbiol 64(7): 2676–2680 [0005]
Bhataya, A., C. Schmidt-Dannert, et al. (2009), Process Biochemistry 44(10): 1095–1102 [0005]
Papp, T., A. Velayos, et al. (2006), Appl Microbiol Biotechnol 69(5): 526–531 [0005]
Ye, R. W., P. L. Sharpe, et al. (2012), Methods Mol Biol 898: 153–159 [0006]
Mauersberger, S., H. J. Wang, et al. (2001), J Bacteriol 183(17): 5102–5109 [0032]
http://dede.invitrogen.com/site/de/de/home/Products-and-Services/Applications/Cloning/gene-synthesis/GeneArt-Gene-Synthesis/GeneOptimizer.html [0034]
Mauersberger, S., H. J. Wang, et al. (2001), J Bacteriol 183(17): 5102–5109 [0057]
Lithiumacetat-Methode nach Barth und Gaillardin (1996, Berlin, Heidelberg, New York, Springer-Verlag [0065]

Claims

Hefestamm der Art Yarrowia lipolytica der dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine Phytoensynthase und eine Phytoendesaturase enthält, eine Verringerung der Aktivität der Proteine Pox1p, Pox2p, Pox3p, Pox4p, Pox5p Pox6p und Gut2p aufweist, und eine erhöhte Aktivität der Proteine Ggs1p und Hmg1p aufweist.
Hefestamm gemäß Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Phytoensynthase um eine Phytoensynthase aus Bakterien handelt.
Hefestamm gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die Phytoensynthase aus Pantoea ananatis handelt.
Hefestamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Phytoendesaturase um eine Phytoendesaturase aus Bakterien handelt.
Hefestamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die Phytoendesaturase aus Pantoea ananatis handelt.
Hefestamm gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass er die Gene crtB und crtI exprimiert, die Gene GGS1 und HMG1 überexprimiert und eine Deletion der Gene POX1, POX2, POX3, POX4, POX5, POX6 und GUT2 aufweist.
Hefestamm gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz der Gene crtB und crtI an die Codon-Verwendung von Yarrowia lipolytica angepasst ist.
Verfahren zur Herstellung von Lycopin dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Hefestamm gemäß Anspruch 1 bis 7 in einem Fermenter unter limitierten Wachstumsbedingungen fermentiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Stickstoffgehalt im Medium während der Fermentation kleiner als 2 g l^–1 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert zwischen 1 und 5,5 liegt.