DE102018117233A1

DE102018117233A1 - Biotechnologische Herstellung von Cannabinoiden

Info

Publication number: DE102018117233A1
Application number: DE102018117233.8A
Authority: DE
Inventors: Oliver Kayser; Felix-Oliver Stehle
Original assignee: Technische Universitaet Dortmund
Current assignee: Technische Universitaet Dortmund
Priority date: 2018-07-17
Filing date: 2018-07-17
Publication date: 2020-01-23
Also published as: EP3824078A1; WO2020016287A1; US20210292799A1; US11674126B2; CA3106581A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Cannbigerolsäure in einem Wirtsorganismus mit Hilfe einer modifizierten Prenyltransferase. Ferner betrifft die Erfindung eine modifizierte Prenyltransferase, ein Nukleinsäuremolekül, welches für eine solche modifizierte Prenyltransferase kodiert und einen rekombinanten Organismus, der die modifizierte Prenyltransferase und/oder das Nukleinsäuremolekül umfasst.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Cannbigerolsäure in einem Wirtsorganismus mit Hilfe einer modifizierten Prenyltransferase. Ferner betrifft die Erfindung eine modifizierte Prenyltransferase, ein Nukleinsäuremolekül, welches für eine solche modifizierte Prenyltransferase kodiert und einen rekombinanten Organismus, der die modifizierte Prenyltransferase und/oder das Nukleinsäuremolekül umfasst.
Cannabinoide und ihre Derivate erfahren zurzeit ein verstärktes Interesse als Wirkstoffe und Arzneimittel, bzw. als Ausgangmaterialien für weitere Synthesen. Das vermehrte Interesse hängt z.B. mit der fortschreitenden Legalisierung von Cannabinoiden zur medizinischen Verwendung zusammen.
Cannabinoide treten z.B. im Menschen in Form von Endocannabinoiden (Cannabis-ähnliche Stoffe) auf. Hauptsächlich sind sie aber als Phytocannabinoide aus Pflanzen bekannt, insbesondere aus der Pflanze Cannabis sativa L., auch bekannt als Cannabis oder Marijuana.
Im menschlichen Körper wirken Cannabinoide an speziellen Cannabinoid-Rezeptoren, z.B. G-Proteingekoppelten Rezeptoren und anderen Zielmolekülen und rufen damit zum Beispiel die Freisetzung von Neurotransmittern oder eine Aktivierung postsynaptischer Calciumkanäle hervor. Dadurch können sie an einer Vielzahl von Körper- und Stoffwechselfunktionen beteiligt sein.
Besonders Tetrahydrocannabinol (THC) wird häufig als therapeutisches Mittel bei der Behandlung von Chemotherapie-assoziierter Übelkeit und Erbrechen, AIDS-bedingter Appetitlosigkeit sowie bei Schmerzen oder Muskelspasmen bei multipler Sklerose angewendet. Das Cannabinoid Cannabidiol (CBD) wird als Wirkstoffkandidat bei Epilepsie und Psoriasis in Betracht gezogen. Die schlaffördernde und antikonvulsive Wirkung von Cannabinol (CBN) sowie die entzündungshemmende oder auch antidepressive Wirkung von Cannabichromen (CBC) werden derzeit untersucht.
Bisher werden Cannabinoide meist durch Extraktion aus Pflanzen oder mittels chemischer Synthese zugänglich gemacht. Die Extraktionserfolge sind oft unzureichend, da Cannabinoide nur in geringen Konzentration in der Pflanze vorliegen. Sie treten vor allem in den Blättern oder der Blütenknospe auf. Nach der Extraktion liegt meist ein Gemisch unterschiedlicher Cannabinoide vor. Die Reinigung einer einzelnen Substanz ist aufwendig und teuer und resultiert oft in unzureichenden Ergebnissen.
Auch die chemische Synthese derartiger Verbindungen hat viele Nachteile, wie z.B. die aufwendige und kostenintensive Reinigung von Intermediaten nach einzelnen Syntheseschritten, die Verwendung gesundheitsschädlicher Lösungsmittel und Chemikalien und die fehlende oder nur unzureichende Regio- oder Stereospezifität.
Die schlechte Zugänglichkeit erschwert die medizinische Forschung mit Cannabinoiden.
Eine der gängigsten Darreichungsformen von Cannabinoiden ist nach wie vor das Rauchen. Es ist aber bekannt, dass besonders nichtrauchende Patienten eine alternative Darreichungsform bevorzugen.
Aus den oben genannten Gründen rückt die biotechnologischen Synthese von Cannabinoiden immer weiter in den Fokus.
In dem US Patent No. US 8,884,100 B2 wird die Cannabigerolsäure-Synthase aus der Pflanze Cannabis sativa L., eine aromatische Prenyltransferase, die für die Synthese von Cannabigerolsäure und anderen Produkten verantwortlich ist, näher beschrieben.
Das US-Patent US 2016/0010126 A1 ( WO 2016/010827 A1 ) offenbart z.B. die Synthese unterschiedlicher Cannabinoide in Hefezellen.
Die erfolgreiche biotechnologische Herstellung von Cannabinoiden scheiterte aber bisher an der unzureichenden Umsetzung einzelner Biosyntheseschritte. Deshalb besteht weiterhin Bedarf an alternativen Synthesewegen und Enzymen, um einzelne Cannabinoide sowie ihre Vorstufen in größeren Mengen möglichst rein herzustellen.
Überraschenderweise haben die Erfinder durch die Modifizierung einer aromatischen Prenyltransferase (NphB) aus Streptomyces sp. CL190 (Zirpel et al., J. Biotechnol., 2017, 259, 204-212) eine Möglichkeit gefunden, die Substratspezifität des Enzyms auf das Substrat Olivetolsäure zu erweitern und gleichzeitig die Produktspezifität des Enzyms für Cannabigerolsäure zu erhöhen. Im Gegensatz zu der modifizierten Variante produziert das Wildtypenzym NphB im Wesentlichen 2-O-Geranylolivetolsäure und nur in geringem Maße das gewünschte Produkt Cannabigerolsäure.
Um Cannabigerolsäure rekombinant herzustellen, wird erfindungsgemäß das Gen, welches für die modifizierte NphB-Variante kodiert, in einen Wirtsorganismus eingebracht und exprimiert. Zusätzlich können weitere Synthesewege und Enzyme des Wirtsorganismus optimiert werden, um eine verbesserte rekombinante Cannabigerolsäure-Synthese im Wirtsorganismus zu ermöglichen. Cannabigerolsäure ist eine wichtige Vorstufe vieler weiterer Cannabinoide, wie z.B. Δ⁹-Tetrahydrocannabinolsäure, und die verbesserte Synthese von Cannabigerolsäure bildet damit die Basis für die Biosynthese nachfolgender Cannabinoide.
Die Erfindung betrifft daher in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Cannabigerolsäure in einem Wirtsorganismus, wobei das Verfahren umfasst:

a) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das eine erste, heterologe Nukleotidsequenz umfasst, die für eine modifizierte Prenyltransferase kodiert, in den Wirtsorganismus, wobei die Prenyltransferase derart modifiziert ist, dass (1) die Substratspezifität auf Olivetolsäure erweitert ist und (2) bei Umsetzung von Olivetolsäure mit Geranyldiphosphat das Produktverhältnis Cannabigerolsäure:2-O-Geranylolivetolsäure mindestens 1:1, vorzugsweise mindestens 5:1 beträgt;
b) Kultivieren des Wirtsorganismus unter Bedingungen, die die Expression der Nukleotidsequenz, die für die Prenyltransferase kodiert, ermöglichen;
c) Kultivieren des Wirtsorganismus unter Bedingungen, die die Herstellung von Cannabigerolsäure ermöglichen.

In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine modifizierte Prenyltransferase, wobei die Prenyltransferase eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens 80% vorzugsweise mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96,0%, 96,5%, 97,0%. 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98,0%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4% oder 99,5% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist und deart modifiziert ist, dass sie mindestens eine Aminosäuresubstitution gegenüber der in SEQ ID NO:2 angegeben Aminosäuresequenz aufweist, vorzugsweise eine Substitution an mindestens einer der Positionen, die den Positionen 126, 161, 162, 175, 213 oder 295 in SEQ ID NO:2 entsprechen. In verschiedenen Ausführungsformen weist diese modifizierte Prenyltransferase Substratspezifität für Olivetolsäure auf und kann diese mit Geranyldiphosphat derart umsetzen, dass das Produktverhältnis Cannabigerolsäure:2-O-Geranylolivetolsäure mindestens 1:1, vorzugsweise mindestens 5:1 beträgt. Bevorzugt bezieht sich das angegebene Produktverhältnis auf das molare Produktverhältnis. Sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die hierin angegebenen Verhältnisse daher immer auf molare Verhältnisse.
Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt auch ein Nukleinsäuremolekül, welches eine Nukleotidsequenz umfasst, die für die erfindungsgemäße modifizierte Prenyltransferase kodiert.
Schließlich betrifft die Erfindung in einem weiteren Aspekt einen rekombinanten Organismus umfassend mindestens eine Prenyltransferase gemäß der Erfindung und/oder mindestens eine Nukleinsäure gemäß der Erfindung.
„Mindestens ein“, wie hierin verwendet, bezieht sich auf 1 oder mehr, beispielsweise 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder mehr. Im Zusammenhang mit der hierin beschriebenen Erfindung bezieht sich diese Angabe nicht auf die absolute Menge eines Merkmals oder Bestandteils, sondern auf die Art des Merkmals oder Bestandteils. „Mindestens eine weitere heterologe Nukleinsäure“ bedeutet daher beispielsweise eine oder mehrere weitere, verschiedene heterologe Nukleinsäuren. Zusammen mit Mengenangaben beziehen sich die Mengenangaben auf die Gesamtmenge der entsprechend bezeichneten Art von Bestandteil.
Zahlenwerte, die hierin ohne Dezimalstellen angegeben sind, beziehen sich jeweils auf den vollen angegebenen Wert mit einer Dezimalstelle. So steht beispielsweise „99 %“ für „99,0 %“.
Der Ausdrücke „ungefähr“ oder „etwa“, in Zusammenhang mit einem Zahlenwert, bezieht sich auf eine Varianz von ±10% bezogen auf den angegebenen Zahlenwert, vorzugsweise ±5%, besonders bevorzugt ±1 %.
Die Begriffe „heterolog“ oder „rekombinant“ werden hierin verwendet, um anzuzeigen, dass das entsprechende Molekül in dem Wirtsorganismus nicht natürlicherweise vorkommt. Die heterologe oder rekombinante Expression einer oder mehrerer Nukleotidsequenz(en) in einem Wirtsorganismus, bedeutet somit, dass dieser Wirtsorganismus diese Nukleotidsequenz(en) unter natürlichen Bedingungen nicht enthält oder exprimiert. Dadurch können im Wirtsorganismus heterologe bzw. rekombinante Proteine produziert werden, die unter natürlichen Bedingungen nicht im Wirtsorganismus produziert würden. Die in den Wirtsorganismus eingebrachten Nukleotidsequenzen können Wildtyp-Sequenzen und/oder modifizierte Sequenzen eines anderen Organismus sein. Zusätzlich kann die Wirtszelle derart verändert/mutiert sein, dass die Expression wirtseigener Gene oder Nukleotidsequenzen heruntergefahren oder ausgeschaltet wird. Die zugehörigen wirtseigenen Proteine oder zugehörigen Funktionen der herunterregulierten oder ausgeschalteten wirtseigenen Gene können durch das heterolog produzierte Protein ersetzt, verändert, abgeschwächt oder verstärkt werden. Auch Promotorsequenzen im Wirtsorganismus können modifiziert sein oder es können Aktivatoren oder Repressoren in die Nukleotidsequenz, das Wirtsgenom oder den Expressionsvektor eingebracht werden, um die Expression der heterologen bzw. rekombinanten Nukleotidsequenz zu regulieren.
„Modifiziert“ oder „Modifikation“, bezogen auf eine Nukleotid- oder Aminosäuresequenz bzw. eine Nukleinsäure oder Protein/Enzym, bedeutet, dass die entsprechende Sequenz ausgehend von der natürlich vorkommenden Sequenz (Wildtyp) abgewandelt ist, so dass sie von dieser unterscheidbar ist. Die Abwandlung liegt insbesondere darin, dass eine Sequenz mutiert sein kann, z.B. durch Substitution, Deletion oder Insertion.
Die Bestimmung der Identität von Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen erfolgt durch einen Sequenzvergleich. Dieser Sequenzvergleich basiert auf dem im Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus (vgl. beispielsweise Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) „Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410, und Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): „Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, S.3389-3402) und geschieht prinzipiell dadurch, dass ähnliche Abfolgen von Nukleotiden oder Aminosäuren in den Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Sequenzvergleiche (Alignments), insbesondere multiple Sequenzvergleiche, werden mit Computerprogrammen erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise die Clustal-Serie, T-Coffee oder Programme, die auf diesen Programmen beziehungsweise Algorithmen basieren. Ferner möglich sind Sequenzvergleiche (Alignments) mit dem Computer-Programm Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit den vorgegebenen Standardparametern, dessen AlignX-Modul für die Sequenzvergleiche auf ClustalW basiert. Soweit nicht anders angegeben, wird die hierin angegebene Sequenzidentität mit dem BLAST-Algorithmus bestimmt.
Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben oder in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden. Homologe oder identische Bereiche von verschiedenen Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen sind daher durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Solche Bereiche weisen oftmals identische Funktionen auf. Sie können klein sein und nur wenige Nukleotide oder Aminosäuren umfassen. Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität des Proteins essentielle Funktionen aus. Es kann daher sinnvoll sein, Sequenzübereinstimmungen nur auf einzelne, gegebenenfalls kleine Bereiche zu beziehen. Soweit nicht anders angegeben beziehen sich Sequenzidentitäts- oder Homologieangaben in der vorliegenden Anmeldung aber auf die Gesamtlänge der jeweils angegebenen Nukleotid- oder Aminosäuresäuresequenz.
Die vorstehend beschriebenen und weiteren Aspekte, Ausführungsformen, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden für den Fachmann aus dem Studium der nachfolgenden detaillierten Beschreibung und Ansprüche ersichtlich. Dabei kann jedes Merkmal aus einer Ausführungsform der Erfindung in jede andere Ausführungsform der Erfindung eingesetzt werden. Ferner ist es selbstverständlich, dass die hierin enthaltenen Beispiele die Erfindung beschreiben und veranschaulichen sollen, diese aber nicht einschränken und insbesondere die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.
Die nachfolgend dargestellten Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für das erfindungsgemäße Verfahren beschrieben sind, sind auch auf alle anderen Erfindungsgegenstände, wie die erfindungsgemäße Prenyltransferase, das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül und/oder den rekombinanten Organismus anwendbar.
Der erste Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Cannabigerolsäure in einem Wirtsorganismus, wobei das Verfahren umfasst:

a) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, welches eine erste, heterologe Nukleotidsequenz umfasst, die für eine modifizierte Prenyltransferase kodiert, in den Wirtsorganismus, wobei die Prenyltransferase derart modifiziert ist, dass (1) die Substratspezifität auf Olivetolsäure erweitert ist und (2) bei Umsetzung von Olivetolsäure mit Geranyldiphosphat das Produktverhältnis Cannabigerolsäure:2-O-Geranylolivetolsäure mindestens 1:1, vorzugsweise mindestens 5:1 beträgt;
b) Kultivieren des Wirtsorganismus unter Bedingungen, die die Expression der Nukleotidsequenz die für die modifizierte Prenyltransferase kodiert, ermöglichen;
c) Kultivieren des Wirtsorganismus unter Bedingungen, die die Herstellung von Cannabigerolsäure ermöglichen.

Bevorzugt bezieht sich das angegebene Produktverhältnis auf das molare Produktverhältnis.
Als Wirtsorganismus eignen sich prinzipiell alle Zellen, das heißt prokaryotische und eukaryotische Zellen. Dabei kann es sich um Säugetierzellen (wie etwa Zellen aus dem Menschen), andere tierische Zellen (z.B. Insektenzellen), um pflanzliche Zellen oder um Mikroorganismen wie Hefen, Pilze oder Bakterien handeln.
Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich gentechnisch vorteilhaft handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit der Nukleinsäure oder dem Vektor und dessen stabile Etablierung angeht. Ferner zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Ferner können die Proteine von den sie produzierenden Zellen nach deren Herstellung modifiziert werden, beispielsweise durch Anknüpfung von Zuckermolekülen, Formylierungen, Aminierungen, usw. Solche posttranslationale Modifikationen können die Enzyme funktionell beeinflussen.
Besonders bevorzugt sind hierin einzellige Pilze, Hefen oder Bakterien, am meisten bevorzugt Hefen. Diese zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Kultivierungsverfahren oder Herstellungsverfahren etabliert werden. Zudem verfügt der Fachmann bei einzelligen Pilzen, Hefen oder Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz.
Als Bakterien, Hefen oder einzellige Pilze sind insbesondere diejenigen Bakterien, Hefen oder einzelligen Pilze geeignet, die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Deutschland, als Bakterien-, Hefe- oder Pilz-Stämme hinterlegt sind. Erfindungsgemäß geeignete einzellige Pilze, Hefen und Bakterien gehören zu den Gattungen, die in den Katalogen des Leibniz-Institut DSMZ-Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter http://www.dsmz.de enthalten sind.
Erfindungsgemäß bevorzugte Zellen sind diejenigen der Gattungen Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Basfia, Wollinella, Fibrobacter, Ruminococcus, Mannheimia, Lactobacillus, Lactococcus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia (auch Komagataella genannt), Hansenula, Kluveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium oder Cupriavidus, wobei Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Alcaligenes latus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Basfia succiniciproducens, Wollinella succinogenes, Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Mannheimia succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Saccharomyces cerevisiae, Kluveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymonomas mobilis, Yarrowia lipolytica, Methylobacterium extorquens, Hansenula polymorpha, Ralstonia eutropha, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus versutus, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus, Pichia pastoris (auch Komagataella phaffii genannt), Thermoanaerobacter kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium notera, Clostridium aceticum, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium acetobutylicum, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium butyricum, Moorella thermoacetica, Eubacterium limosum, Peptostreptococcus productus, Clostridium ljungdahlii, Clostridium carboxidivorans, Clostridium scatalogenes, Rhodospirillum rubrum, Burkholderia thailandensis und Pseudomonas putida besonders bevorzugt sind.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Wirtsorganismus eine Hefe, bevorzugt Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica oder Pichia pastoris, weiter bevorzugt Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris, insbesondere Saccharomyces cerevisiae.
Erfindungsgemäße Wirtszellen können hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder noch andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere auch um solche Wirtszellen handeln, die mehrere Proteine oder Enzyme rekombinant exprimieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleotidsequenz, die für die modifizierte Prenyltransferase kodiert, für die Expression in dem Wirtsorganismus, bevorzugt Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica oder Pichia pastoris, weiter bevorzugt Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, codonharmonisiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleotidsequenz, die für die modifizierte Prenyltransferase kodiert,

(1) abgeleitet von dem NphB Gen aus dem Streptomyces sp. Stamm CL190; und/oder
(2) für die Expression in dem Wirtsorganismus codon-harmonisiert.

Das NphB-Gen aus Streptomyces sp. CL190 kodiert für eine aromatische Prenyltransferase und weist vorzugsweise die in SEQ ID NO:1 angegebene Nukleotidsequenz auf. Das Enzym ist ursprünglich an der Naphterpin Biosynthese in Streptomyces sp. beteiligt.
Die Wildtyp-Prenyltransferase kann die Substrate Olivetolsäure und Geranyldiphosphat mittels einer C-C-Friedel-Craft Alkylierung zu 2-O-Geranylolivetolsäure und Cannabigerolsäure umsetzen. Dabei wird aber im Wesentlichen 2-O-Geranylolivetolsäure und nur in geringer Menge Cannabigerolsäure synthetisiert.
Mit „Wildtyp“ wird im Rahmen dieser Anmeldung z.B. eine Zelle bezeichnet, deren Genom in einem Zustand vorliegt, wie es natürlicherweise durch die Evolution entstanden ist. Der Begriff wird sowohl für die gesamte Zelle als auch für einzelne Gene verwendet. Unter den Begriff „Wildtyp“ fallen daher insbesondere nicht solche Zellen bzw. solche Gene, deren Gensequenzen zumindest teilweise durch den Menschen mittels rekombinanter/gentechnischer Verfahren verändert worden sind.
Im Rahmen dieser Erfindung wird ein Nukleinsäuremolekül, das eine erste heterologe Nukleotidsequenz umfasst, die für eine modifizierte Prenyltransferase kodiert, in den Wirtsorganismus eingebracht und exprimiert, wodurch die Umsetzung von Olivetolsäure und Geranyldiphosphat zu Cannabigerolsäure (und ggf. auch 2-O-Geranylolivetolsäure) ermöglicht wird und Cannabigerolsäure und 2-O-Geranylolivetolsäure mindestens in einem Verhältnis von 1:1, vorzugsweise mindestens in einem Verhältnis von 5:1, weiter bevorzugt mindestens in einem Verhältnis von 10:1, insbesondere mindestens in einem Verhältnis von 15:1 produziert werden. Bevorzugt ist das Verhältnis ein molares Verhältnis.
Die Cannabigerolsäure-Synthese wird dadurch erreicht, dass der Wirtsorganismus die gemäß der Erfindung modifizierte Prenyltransferase, die von der ersten heterologen Nukleotidsequenz kodiert wird, produziert. Bevorzugt basiert die Nukleotidsequenz auf der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 ist aber derart modifiziert, dass sie die modifizierte Prenyltransferase kodiert.
Zusätzlich können weitere heterologe Nukleotidsequenzen in den Wirtsorganismus eingebracht werden und/oder ein oder mehrere Wirtsenzyme modifiziert bzw. optimiert vorliegen, um die Umsetzung einzelner Syntheseschritte zu verbessern oder Substrate bereitzustellen. Dabei kann die Modifikation oder Optimierung der Enzyme auf einer Genmutation der zugehörigen Nukleotidsequenz beruhen, bevorzugt auf Deletion(en), Insertion(en) und/oder Nukleotidaustausch(e) eines oder mehrerer Nukleotide, eines oder mehrerer Codons, oder von Genabschnitten. Die weiteren heterologen Sequenzen können zusammen mit der ersten heterologen Sequenz, die für die modifizierte Prenyltransferase kodiert, von einem einzigen Nukleinsäuremolekül, beispielsweise einem Plasmid, umfasst sein oder auf mehreren, separaten Nukleinsäuremolekülen enthalten sein.
Die heterologen Nukleotidsequenzen, die für wirtsfremde Proteine kodieren, insbesondere für die modifizierte Prenyltransferase, können codon-harmonisiert oder codon-optimiert sein, insbesondere codon-harmonisiert.
Da aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes eine bestimmte Aminosäuresequenz von mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuren kodiert werden kann, sind erfindungsgemäß sämtliche Nukleotidsequenzen eingeschlossen, die die hierin beschriebenen Proteine, insbesondere die modifizierten Prenyltransferasen, kodieren können. Der Fachmann ist in der Lage, diese Nukleotidsequenzen zweifelsfrei zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind. Daher kann der Fachmann ausgehend von einer Aminosäuresequenz für diese Aminosäuresequenz kodierende Nukleinsäuren problemlos ermitteln. Weiterhin können bei erfindungsgemäßen Nukleinsäuren gegenüber der Wildtyp- oder Ausgangssequenz ein oder mehrere Codons durch synonyme (d.h. für dieselbe Aminosäure kodierende) Codons ersetzt sein. Dieser Aspekt bezieht sich insbesondere auf die heterologe Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren. Da jeder Organismus, beispielsweise eine Wirtszelle eines Produktionsstammes, eine festgelegte Codon-Verwendung aufweist, kann in einem gegebenen Organismus ein Codon weniger effizient translatiert werden als ein synonymes Codon, das für dieselbe Aminosäure codiert.
„Codon-Optimierung“ einer Nukleotidsequenz geht daher bevorzugt mit einer vollständigen Anpassung der Ursprungs-Nukleotidsequenz an häufig verwendete Codons des Wirtsorganismus einher. „Codonharmonisiert“ beschreibt dagegen bevorzugt eine Anpassung der Nukleotidsequenz an den Wirtsorganismus unter Beibehaltung einiger seltener Codons der Ursprungssequenz. Da seltene Codons oft regulatorische Funktionen aufweisen oder an der mRNA-Stabilität beteiligt sein können, kann es bevorzugt sein, einige seltene Codons des Ursprungsorganismus beizubehalten, beispielsweise, um die Ausbeute an aktivem Enzym zu erhöhen. Ein Online-Tool zum Harmonisieren von Sequenzen ist z.B. unter „http://codonharmonizer.systemsbiology.nl/“ (Claassens et al., Improving heterologous membrane protein production in Escherichia coli by combining transcriptional tuning and codon usage algorithms, PLoS One, 2017), verfügbar. Der Begriff „Ursprungsorganismus“ bezieht sich hier auf den Organismus, aus dem die Nukleotidsequenz natürlicherweise stammt. „Wirtsorganismus“ beschreibt den Organismus in den die Nukleotidsequenz eingebracht wird und in dem sie rekombinant exprimiert wird.
Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3. Edition Cold Spring Laboratory Press, bekannt.
Ferner ist es möglich, die Aktivität eines Enzyms im Wirtsorganismus zu erhöhen. Dazu kann beispielsweise die Kopienzahl des entsprechenden Gens erhöht werden oder die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu steigern. Des Weiteren können dem Enzym-Gen als regulatorische Sequenzen aber auch Enhancer zugeordnet sein, die über eine verbesserte Wechselwirkung zwischen RNA-Polymerase und DNA ebenfalls eine erhöhte Genexpression bewirken. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können dabei entweder in Vektoren bzw. Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder können im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in EP-A-0 472 869 , in US 4,601,893 , bei Schwarzer und Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in WO-A- 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), in JP-A-10-229891 und bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)). Die vorstehend beschriebenen Maßnahmen führen ebenso wie die Mutationen zu gentechnisch veränderten Zellen des Wirtsorganismus.
Bevorzugt ist jedes geeignete, rekombinante Verfahren zur Weiterentwicklung und Modifizierung von Wirtsenzymen, heterologen Enzymen oder dem Wirtsorganismus im Allgemeinen, welches dem Fachmann bekannt ist, einsetzbar.
In einer Ausführungsform liegt die erste heterologe Nukleotidsequenz, die die Prenyltransferase kodiert, codon-harmonisiert vor. Bevorzugt wird die Nukleotidsequenz für die Expression in Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris codon-harmonisiert, insbesondere für die Expression in Saccharomyces cerevisiae.
In einer bevorzugten Ausführungsform basiert die modifizierte Prenyltransferase auf der Prenyltransferase aus dem Streptomyces sp. Stamm CL190 mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2, ist aber gegenüber dieser Sequenz derart modifiziert, dass mindestens eine Aminosäureposition gegenüber dem Ausgangsenzym verändert ist, entweder durch Substitution, Deletion oder Insertion, vorzugsweise durch Substitution.
Für die Beschreibung von Substitutionen, die genau eine Aminosäureposition betreffen (Aminosäureaustausch), wird hierin folgende Konvention angewendet: zunächst wird die natürlicherweise vorhandene Aminosäure in Form des international gebräuchlichen Einbuchstaben-Codes bezeichnet, dann folgt die zugehörige Sequenzposition und schließlich die eingefügte Aminosäure. Mehrere Austausche innerhalb derselben Polypeptidkette werden durch Schrägstriche voneinander getrennt. Bei Insertionen sind nach der Sequenzposition zusätzliche Aminosäuren benannt. Bei Deletionen ist die fehlende Aminosäure durch ein Symbol, beispielsweise einen Stern oder einen Strich, ersetzt oder vor der entsprechenden Position ein Δ angegeben. Beispielsweise beschreibt Q295F die Substitution von Glutamin an Position 295 durch Phenylalanin. Diese Nomenklatur ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie bekannt.
Bevorzugt weist die Aminosäuresequenz der modifizierten Prenyltransferase, bezogen auf die Nummerierung gemäß SEQ ID NO:2 und gegenüber der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:2, eine Substitution an mindestens einer der Positionen 126, 161, 162, 175, 213 oder 295 auf, besonders bevorzugt weist die Aminosäuresequenz eine Substitution an Position 295 auf. In verschiedenenen Ausführungsformen können 1, 2, 3, 4, 5 oder alle 6 der genannten Positionen substituiert sein.
An den genannten Positionen liegen in dem Wildtypmolekül gemäß SEQ ID NO: 2 der Prenyltransferase aus Streptomyces sp. Stamm CL190 folgende Aminosäurereste vor: T126, Q161, M162, Y175, F213, Q295.
Die Aminosäurepositionen werden hierbei durch ein Alignment der Aminosäuresequenz einer erfindungsgemäßen Prenyltransferase mit der Aminosäuresequenz der Prenyltransferase aus Streptomyces sp. Stamm CL190, wie sie in SEQ ID NO:2 angegeben ist, definiert. Diese Zuordnung ist insbesondere auch anzuwenden, wenn die Aminosäuresequenz einer erfindungsgemäßen Prenyltransferase eine höhere Zahl von Aminosäurenresten umfasst, als die Prenyltransferase aus Streptomyces sp. Stamm CL190 gemäß SEQ ID NO:2. Ausgehend von den genannten Positionen in der Aminosäuresequenz der Prenyltransferase aus Streptomyces sp. Stamm CL190, sind die Veränderungspositionen in einer erfindungsgemäßen Prenyltransferase diejenigen, die eben diesen Positionen in einem Alignment zugeordnet sind.
In verschiedenen Ausführungsformen ist die Aminosäuresequenz gegenüber SEQ ID NO:2 derart modifiziert, dass sie mindestens eine der Substitutionen 295D, 295F, 295L, 295H, 295N, 295V, 126V, 126G, 161A, 161N, 162A, 175N oder 213A aufweist. In einer Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz gegenüber SEQ ID NO:2 derart modifiziert, dass mindestens die Substitutionen 126V/161A vorliegen. Besonders bevorzugt ist die Aminosäuresequenz gegenüber SEQ ID NO:2 derart modifiziert, dass mindestens eine der Substitutionen 295F, 295L oder 295H vorliegt.
In verschiedenen Ausführungsformen ist die Aminosäuresequenz gegenüber SEQ ID NO:2 derart modifiziert, dass sie mindestens eine der Substitutionen Q295D, Q295F, Q295L, Q295H, Q295N, Q295V, T126V, T126G, Q161A, Q161N, M162A, Y175N oder F213A aufweist. In einer Ausführungsform ist die Aminosäuresequenz gegenüber SEQ ID NO:2 derart modifiziert, dass mindestens die Substitutionen T126V/Q161A vorliegen. Besonders bevorzugt ist die Aminosäuresequenz gegenüber SEQ ID NO:2 derart modifiziert, dass mindestens eine der Substitutionen Q295F, Q295L oder Q295H vorliegt.
Neben der oben genannten mindestens einen Substitution an einer der Positionen 126, 161, 162, 175, 213 und 295, kann die modifizierte Prenyltransferase weitere Aminosäuresubstitutionen gegenüber der Ausgangsaminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 aufweisen. In derartigen Ausführungsformen hat die modifizierte Prenyltransferase eine Aminosäuresequenz, die mindestens 80%, weiter vorzugsweise mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96,0%, 96,5%, 97,0%. 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98,0%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5% oder 99,6% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist. In einer Ausführungsform hat die modifizierte Prenyltransferase eine Aminosäuresequenz, die mindestens 99,5% und insbesondere mindestens 99,6% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist. In verschiedenen Ausführungsformen entspricht die Aminosäuresequenz der modifizierten Prenyltransferase der in SEQ ID NO:2 angegebenen Sequenz mit Ausnahme der mindestens einen Substitution an den oben angegebenen Positionen.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die modifizierte Prenyltransferase daher ein Enzym, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die eine Sequenzidentität von mindestens 80%, weiter bevorzugt von mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96,0%, 96,5%, 97,0%. 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98,0%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5% oder 99,6% mit der in SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist und mindestens eine Aminosäuresubstitution an mindestens einer der Positionen, die den Positionen 126, 161, 162, 175, 213 und 295 in SEQ ID NO:2 entsprechen aufweist, vorzugsweise ausgewählt aus Q295F, Q295L, Q295H, Q295N, Q295D, Q295V, T126V, T126G, Q161A, Q161N, M162A, Y175N und F213A, besonders bevorzugt Q295F, Q295L oder Q295H.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die modifizierte Prenyltransferase die in SEQ ID NO:17 angegebene Aminosäuresequenz auf. Die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:17 weist die Aminosäuresubstitution Q295H gegenüber der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 auf. Die Prenyltransferase gemäß SEQ ID NO:17 wird beispielsweise durch die für Saccharomyces cerevisiae codon-harmonisierte Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:16 kodiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die modifizierte Prenyltransferase die in SEQ ID NO:19 angegebene Aminosäuresequenz auf. Die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:19 weist die Aminosäuresubstitution Q295L gegenüber der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 auf. Die Prenyltransferase gemäß SEQ ID NO:19 wird beispielsweise durch die für Saccharomyces cerevisiae codon-harmonisierte Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:18 kodiert.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen weist die modifizierte Prenyltransferase die in SEQ ID NO:4 angegebene Aminosäuresequenz auf. Die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:4 weist die Aminosäuresubstitution Q295F gegenüber der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:2 auf. Die Prenyltransferase gemäß SEQ ID NO:4 wird beispielsweise durch die für Saccharomyces cerevisiae codon-harmonisierte Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:3 kodiert.
Die Erfindung betrifft nicht nur die Verwendung der vorstehend beschriebenen Prenyltransferasen in den erfindungsgemäßen Verfahren, sondern auch die Enzyme als solche.
In verschiedenen Ausführungsformen wird die Prenyltransferase durch eine Nukleotidsequenz kodiert, die codon-harmonisiert für die Verwendung in dem gewünschten Wirtsorganismus ist.
Bevorzugt wird das Nukleinsäuremolekül, das eine erste heterologe Nukleotidsequenz umfasst, die für eine modifizierte Prenyltransferase kodiert, in Form eines Vektors oder Plasmids in den Wirtsorganismus eingebracht, beispielsweise durch Transformation, Transduktion, Konjugation oder einer Kombination dieser Methoden, bevorzugt mittels Transformation. Verfahren zur Transformation von Zellen sind im Stand der Technik etabliert und dem Fachmann hinlänglich bekannt. Die heterologe Expression wird insbesondere durch Integration des Gens oder der Allele in das Chromosom des Wirtsorganismus oder mit einem extrachromosomal replizierenden Vektor erzielt.
Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten. Sie vermögen diese in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere in Bakterien oder Hefen verwendete spezielle Plasmide, also zirkulare genetische Elemente. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einen Vektor kloniert oder kann ein solcher sein. Zu den Vektoren zählen beispielsweise solche, deren Ursprung bakterielle Plasmide, Viren oder Bacteriophagen sind, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Sie können extrachromosomal als eigene Einheiten vorliegen oder in ein Chromosom oder chromosomale DNA integrieren.
Expressionsvektoren umfassen Nukleotidsequenzen, die sie dazu befähigen, sich in den sie enthaltenden Wirtszellen, vorzugsweise in Mikroorganismen, besonders bevorzugt in einzelligen Pilzen, Bakterien oder Hefen, zu replizieren und dort eine umfasste Nukleotidsequenz zur Expression zu bringen. Die Expression wird insbesondere von dem oder den Promotoren beeinflusst, welche die Transkription regulieren. Prinzipiell kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor der zu exprimierenden Nukleinsäure lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle oder auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle. Im vorliegenden Fall wird zumindest ein Promotor für die Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Verfügung gestellt und für deren Expression genutzt. Expressionsvektoren können ferner regulierbar sein, beispielsweise durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte der sie enthaltenen Wirtszellen oder durch Zugabe von bestimmten Substanzen, insbesondere Aktivatoren der Genexpression. Ein Beispiel für eine solche Substanz ist das Galactose-Derivat Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG), welches als Aktivator des bakteriellen Lactose-Operons (lac-Operons) verwendet wird. Ein weiteres Beispiel ist Methanol, welches in Pichia pastoris als Aktivator des AOX1-Gens, das für die Alkoholoxidase I kodiert, fungiert. Ferner kann Galaktose zur Regulierung des Gal1 und Gal10-Promotors in Saccharomyces cerevisiae verwendet werden. Im Gegensatz zu Expressionsvektoren wird die enthaltene kodierende Nukleotidsequenz in Klonierungsvektoren nicht exprimiert.
Als Plasmide bzw. Vektoren kommen im Prinzip alle dem Fachmann für diesen Zweck zur Verfügung stehenden Ausführungsformen in Frage. Derartige Plasmide und Vektoren können z. B. den Broschüren der Firmen Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech oder Gibco BRL entnommen werden. Weitere bevorzugte Plasmide und Vektoren können gefunden werden in: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol. I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D. T (eds) (1988), Vectors : a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sambrook, J.; Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Als Vektoren eignen sich vorzugsweise solche, die in Hefezellen repliziert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Vektoren pESC (Agilent Technologies), pGAPZ A und/oder pYES2 (Invitrogen, Darmstadt, Deutschland) oder eine modifizierte Form davon eingesetzt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst oder besteht die Nukleinsäure aus einer Nukleotidsequenz, die für eine wie oben beschriebene Aminosäuresequenz kodiert, und ausgehend von der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO:1 derart modifiziert ist, dass (1) die oben beschriebene modifizierte Prenyltransferase kodiert wird und (2) sie optional zusätzlich an den Wirtsorganismus angepasst ist, indem sie codon-harmonisiert oder codon-optimiert ist.
Es kann vorkommen, dass dem verwendeten Wirtsorganismus, insbesondere in den Hefen Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris, einige der Enzyme und Vorstufen, die für die Cannabinoid-Biosynthese oder die Synthese von Cannabigerolsäure benötigt werden, fehlen. Die fehlenden Enzyme oder Synthesewege können zusätzlich zu der modifizierten Prenyltransferase gemäß der Erfindung in den Wirtsorganismus eingebracht werden, um benötigte Vorstufen oder Substrate zu bilden oder nachfolgende Umsetzungen zu ermöglichen. Ferner können Enzyme im Wirtsorganismus ausgetauscht oder modifiziert werden, um ihre Aktivität oder Stabilität zu erhöhen. Möglichkeiten zur Erhöhung der Enzymaktivität wurden bereits weiter oben dargestellt. Der Wirtsorganismus produziert natürlicherweise z.B. nur geringe Mengen an Geranyldiphosphat. Deshalb ist eine Optimierung des Mevalonat-abhängigen Isoprenoidbiosyntheseweges erfindungsgemäß bevorzugt, bzw. ist die Verwendung von Wirtsorganismen, in denen dieser optimiert ist, bevorzugt.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Wirtsorganismus ferner mindestens ein weiteres heterologes Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die

(1) für eine Hexanoyl-CoA-Synthase kodiert; und/oder
(2) für eine Olivetol-Synthase kodiert und/oder
(3) für eine Olivetolsäure-Cyclase kodiert,

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Wirtsorganismus daher ferner mindestens eine weitere heterologe Nukleotidsequenz, die ebenfalls auf dem ersten Nukleinsäuremolekül oder einem separaten Nukleinsäuremolekül lokalisiert sein kann, die

Bevorzugt katalysiert die Hexanoyl-CoA-Synthase die Synthese von Hexansäure und Coenzym A zu Hexanoyl-Coenzym A. Dieses Produkt bildet die Vorstufe für die Cannabinoid-Biosynthese. Bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz, die für die Hexanoyl-CoA-Synthase kodiert aus Cannabis sativa L. Die Nukleinsäuresequenz kann aber auch aus anderen Organismen, die dem Fachmann bekannt sind, stammen. Bevorzugt umfasst oder besteht die zugehörige Aminosäuresequenz der Hexanoyl-CoA-Synthase aus der Sequenz gemäß SEQ ID NO:5. Wie bereits oben beschrieben, umfasst die Erfindung auch Varianten dieser Sequenz, die mindestens 80%, weiter bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96,0%, 96,5%, 97,0%. 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98,0%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6% oder 99,7% Sequenzidentät mit der in SEQ ID NO:5 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweisen, wobei die enzymatische Funktion aber vorzugsweise derart erhalten bleibt, dass die Variante in einem geeigneten Assay mindestens 80% der Enzymaktivität des Enzyms mit der SEQ ID NO:5 aufweist. Alternativ können auch Acyl-Coenzym A-Synthetasen, z.B. ACSM1 aus Bos taurus, mittelkettige Fettsäure-CoA-Ligasen, z.B. FadK aus Escherichia coli, und/oder andere Enzyme mit entsprechender Funktion, z.B. Faa2p aus Saccharomyces cerevisiae, Anwendung finden. In einer alternativen Ausführungsform können Enzyme mit Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO:24 und/oder SEQ ID NO:25 und/oder SEQ ID NO:26 oder Varianten davon, zusätzlich zur Hexanoyl-CoA-Synthase oder diese ersetzend, eingesetzt werden.
Die Olivetol-Synthase (OLS) katalysiert bevorzugt den ersten Schritt der Cannabinoid-Biosynthese von Hexanoyl-CoA und 3 Molekülen Malonyl-CoA zu 1,3,5,7-Tetroxydodecanoyl-CoA. Bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz, die für die Olivetol-Synthase kodiert aus Cannabis sativa L. Die Nukleinsäuresequenz kann aber auch aus anderen Spenderorganismen, die dem Fachmann bekannt sind, stammen. Bevorzugt umfasst oder besteht die zugehörige Aminosäuresequenz der Olivetol-Synthase aus der Sequenz gemäß SEQ ID NO:6. Die Erfindung umfasst auch Varianten dieser Sequenz, die mindestens 80%, weiter bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96,0%, 96,5%, 97,0%. 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98,0%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6% oder 99,7% Sequenzidentät mit der in SEQ ID NO:6 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweisen, wobei die enzymatische Funktion aber vorzugsweise derart erhalten bleibt, dass die Variante in einem geeigneten Assay mindestens 80% der Enzymaktivität des Enzyms mit der SEQ ID NO:6 aufweist.
Die Olivetolsäure-Cyclase (OAC) katalysiert bevorzugt den zweiten Schritt der Cannabinoid-Biosynthese von 1,3,5,7-Tetroxydodecanoyl-CoA zu Olivetolsäure. Bevorzugt stammt die Nukleinsäuresequenz, die für die Olivetolsäure-Cyclase kodiert aus Cannabis sativa L. Die Nukleinsäuresequenz kann aber auch aus anderen Spenderorganismen, die dem Fachmann bekannt sind, stammen. Bevorzugt umfasst oder besteht die zugehörige Aminosäuresequenz der Olivetolsäure-Cyclase aus der Sequenz gemäß SEQ ID NO:7. Die Erfindung umfasst auch Varianten dieser Sequenz, die mindestens 80%, weiter bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96,0%, 96,5%, 97,0%. 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98,0%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6% oder 99,7% Sequenzidentät mit der in SEQ ID NO:7 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweisen, wobei die enzymatische Funktion aber vorzugsweise derart erhalten bleibt, dass die Variante in einem geeigneten Assay mindestens 80% der Enzymaktivität des Enzyms mit der SEQ ID NO:7 aufweist.
Die oben genannten Ausgangsenzyme können daher modifiziert oder optimiert sein, vorzugsweise so, dass die Variante in einem geeigneten Assay mehr als 100% der Enzymaktivität des Ausgangsenzyms aufweist. Möglichkeiten der Modifizierung wurden weiter oben bereits beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist der rekombinante Wirtsorganismus einen optimierten Hexansäuresyntheseweg auf.
Zur Optimierung des Hexansäuresyntheseweges in S. cerevisiae können die Fettsäuresynthasen in S. cerevisiae modifiziert vorliegen: FAS1 (I3016A) und FAS2(G1250S). Diese Enzymvarianten sind in der Europäischen Patentanmeldung EP 3 112 458 A1 näher beschrieben.
Zusätzlich kann ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für die Fettsäure-Synthase aus Aspergillus parasiticus kodiert in den Wirtsorganismus eingebracht werden. Bevorzugt umfassen oder bestehen die zugehörigen Aminosäuresequenzen aus den Untereinheiten gemäß SEQ ID NO:8 und SEQ ID NO:9, sowie Varianten davon, die mindestens 80%, weiter bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96,0%, 96,5%, 97,0%. 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98,0%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6% oder 99,7% Sequenzidentät mit der in SEQ ID NO:8 oder 9 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweisen, wobei die enzymatische Funktion erhalten bleibt.
Ferner kann der Hexansäuresyntheseweg optimiert werden, indem eine Acetyl-CoA-Acetyltransferase (AtoB) aus Escherichia coli und/oder eine β-Ketothiolase (BktB) aus Ralstonia eutropha und/oder eine 3-Hydroxybutyryl-CoA-Dehydrogenase (Hbd) und/oder eine Crotonase (Crt) aus Clostridium acetobutylicum und/oder eine trans-Enoyl-CoA-Reductase (Ter) aus Treponema denticola und/oder eine MCT1 aus Saccharomyces cerevisiae und/oder eine TES1 aus K. marxianus in den Wirtsorganismus eingebracht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden alle in diesem Abschnitt beschriebenen Enzyme im Wirtsorganismus produziert. Der Biosyntheseweg zur Hexansäureproduktion in Kluyveromyces marxianus unter Verwendung der angegebenen Enzyme wird in der folgenden Publikation beschrieben: Cheon et al., A biosynthetic pathway for hexanoic acid production in Kluyveromyces marxianus, J. Biotechnol., 2014, 182-183, 30-36.
Ferner ist es bevorzugt, wenn die Gene AQR1, welches bevorzugt für ein Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:20 oder Varianten davon kodiert, (Legras et al., Activation of two different resistancemechanisms in S. cerevisiae upon exposure to octanoic and decanoic acids, Appl. Envi- ron. Microbiol., 2010, 76, 7526-7535) und/oder PDR12, welches bevorzugt für ein Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:21 oder Varianten davon kodiert, (Holyoak et al., The Saccharomyces cerevisiae weak-acid-inducible ABC transporter Pdr12 transports fluorescein and preservative anions from the cytosol by an energy- dependent mechanism, J. Bacteriol., 1999, 181, 4644-4652) im Genom des Wirtsorganismus, bevorzugt in S. cerevisiae oder in P. pastoris, herabreguliert oder ausgeschaltet werden. Entsprechende Techniken sind dem Fachmann bekannt.
In einer anderen, alternativen Ausführungsform wird der Wirtsorganismus unter Bedingungen kultiviert, in denen Hexansäure als Substrat zugegeben wird.
In einer anderen Ausführungsform kann der Hexansäuresyntheseweg oder Teile davon im Wirtsorganismus optimiert vorliegen und zusätzlich eine Kultivierung des Wirtsorganismus unter Zugabe von Hexansäure erfolgen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann in dem Wirtsorganismus Geranyldiphosphat über den Mevalonat-abhängigen-Isoprenoidsyntheseweg oder den Methylerythritolphosphatweg bereitgestellt werden. Bevorzugt wird Geranyldiphosphat im Wirtsorganismus über den Mevalonat-abhängigen Isoprenoidsyntheseweg bereitgestellt. Weiter bevorzugt liegt der Mevalonat-abhängige Isoprenoidsyntheseweg in einer optimierten Form vor.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden folgende Enzyme des Mevalonat-abhängigen Isoprenoidsyntheseweges im Wirtsorganismus produziert:

Aldehyd-Dehydrogenase (ALD6) und/oder Acetyl-CoA-Synthetase (ACS1/ACS2) und/oder Acetyl-CoA-C-Acetyltransferase (ERG10) und/oder 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoA-Synthase (ERG13) und/oder 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoA-Reduktase (tHMGR; modifiziert durch Entfernung der Transmembrandomäne der Aminosäuren 1-530) und/oder Mevalonatkinase (ERG12) und/oder Phosphomevalonatkinase (ERG8) und/oder Mevalonat-Diphosphat-Decarboxylase (ERG19) und/oder Isopentenyl-Diphosphat:Dimethylallyl-Diphosphat-Isomerase (IDI1). Die aufgezählten Enzyme stammen alle aus dem Wirtsorganismus S. cerevisiae. Bevorzugt werden die in diesem Abschnitt aufgezählten Enzyme gemeinsam im Wirtsorganismus produziert.

Bevorzugt kann die Famesyl-Diphosphat-Synthetase (ERG20) aus S. cerevisiae modifiziert vorliegen oder die Famesyl-Diphosphat-Synthese im Wirtsorganismus verändert sein. Die Modifizierung kann erfolgen, indem z.B. der native Promotor gegen einen schwachen konstitutiven Promotor ausgetauscht wird, um das ERG20-Gen herunterzuregulieren. Ferner kann eine zusätzliche Kopie einer ERG20-F96W-N127W-Variante in den Wirtsorganismus eingebracht werden, wodurch die Synthese von Geranyl-Diphosphat (GPP) verstärkt würde, und/oder es könnte eine weitere heterologe Geranyl-Diphosphat-Synthase (AgGPPS) z.B. aus Abies grandis, in den Wirtsorganismus eingebracht werden (Ignea et al., Engineering monoterpene production in yeast using a synthetic dominant negative geranyl diphosphate synthase, ACS Synth. Biol., 2014, 3, 298-306).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegen neben der Nukleotidsequenz, die für die modifizierte NphB aus Streptomyces sp. Stamm CL190 kodiert, der Mevalonat-abhängige Isoprenoidsyntheseweg und/oder die Hexansäurebiosynthese wie oben beschrieben optimiert im Wirtsorganismus vor. Zusätzlich können die eingesetzte(n) Nukleinsäure(n), die Nukleotidsequenzen, bevorzugt aus Cannabis sativa L., umfassen, die für die Enzyme Hexanoyl-CoA-Synthase und/oder Olivetol-Synthase, und/oder Olivetolsäure-Cyclase kodieren. Diese können ebenfalls in den Wirtsorganismus eingebracht werden und die Expression der zugehörigen Enzyme ermöglichen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Wirtsorganismus ferner mindestens eine weitere heterologe Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein heterologes Enzym kodiert, welches die Synthese oder einen Teilschritt der Synthese von Cannabinoiden, insbesondere Δ⁹-Tetrahydrocannabinolsäure (Δ⁹-THCA), Cannabidiolsäure (CBDA), Cannabichromensäure (CBCA), Tetrahydrocannabinol (THC), Cannabidiol (CBD), Cannabichromen (CBC) oder Cannabinolsäure (CBNA), aus Cannabigerolsäure katalysiert.
Weiter bevorzugt ist das heterologe Enzym, welches durch die mindestens eine weitere heterologe Nukleinsäure, die eine Nukleotidsequenz umfasst, kodiert wird, eine Tetrahydrocannabinolsäure-Synthase, eine Cannabidiolsäure-Synthase oder eine Cannabichromensäure-Synthase.
Bevorzugt umfasst oder besteht die Aminosäuresequenz der Tetrahydrocannabinolsäure-Synthase aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:10 oder Varianten davon, die mindestens 80%, weiter bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96,0%, 96,5%, 97,0%. 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98,0%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6% oder 99,7% Sequenzidentät mit der in SEQ ID NO:10 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweisen, wobei die enzymatische Funktion erhalten bleibt (mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 100% des Ausgangsenzyms in einem geeigneten Assay).
Weiter bevorzugt umfasst oder besteht die Aminosäuresequenz der Cannabidiolsäure-Synthase aus der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO:11 oder Varianten davon, die mindestens 80%, weiter bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96,0%, 96,5%, 97,0%. 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98,0%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6% oder 99,7% Sequenzidentät mit der in SEQ ID NO:11 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweisen, wobei die enzymatische Funktion erhalten bleibt (mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 100% des Ausgangsenzyms in einem geeigneten Assay).
Weiter bevorzugt umfasst oder besteht die Nukleotidsequenz der Cannabichromensäure-Synthase aus der in SEQ ID NO:12 angegebenen Nukleotidsequenz oder Homologen davon. Die zugehörige Aminosäuresequenz ist unter SEQ ID NO:13 angegeben. Ebenfalls erfasst sind Varianten davon, die mindestens 80%, weiter bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96,0%, 96,5%, 97,0%. 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98,0%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6% oder 99,7% Sequenzidentät mit der in SEQ ID NO:13 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweisen, wobei die enzymatische Funktion erhalten bleibt (mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 100% des Ausgangsenzyms in einem geeigneten Assay).
Der Wirtsorganismus kann kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch-Verfahren (Zulaufverfahren) oder repeated-fed-batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Herstellung von Cannabigerolsäure mit dem Nährmedium in Kontakt gebracht, kultiviert und fermentiert werden. Eine Zusammenfassung der bekannten Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel („Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik“ (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas („Bioreaktoren und periphere Einrichtungen“, Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) zu finden. Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen des jeweiligen Wirtszellstammes genügen. Beschreibungen von Kulturmedien für verschiedene Mikroorganismen sind im Handbuch „Manual of Methods for General Bacteriology“ der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten. Das Produkt, bevorzugt die gebildete Cannabigerolsäure oder eine modifizierte Form davon, kann entweder aus dem Medium entnommen werden oder durch Zellernte und anschließenden Zellaufschluss erhalten werden. Auch eine Kombination der beiden Methoden ist möglich. Bevorzugt wird das gebildete Produkt durch Zellernte und anschließenden Zellaufschluss erhalten.
In den verwendeten Nährmedien dient mindestens ein Zucker, bevorzugt Fruktose, Galaktose oder Glukose als C-Quellen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Wirtsorganismus unter Bedingungen kultiviert, in denen Glukose als C-Quelle, weiter bevorzugt als einzige C-Quelle, eingesetzt wird.
Als Stickstoffquellen können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium kann weiterhin Metallsalze enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum der Zellen notwendig sind.
Schließlich können dem Medium noch weitere Stoffe, wie z.B. Basen, Aminosäuren, Vitamine und/oder Spurenelemente zugesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen und Substrate zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur können basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Salzsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt werden. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Vektoren können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden.
Die Kulter erfolgt typischerweise bei einer Temperatur im Bereich von 15°C bis 45°C und vorzugsweise bei 19°C bis 37°C.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst ferner den Schritt der Isolierung von Cannabigerolsäure aus dem Wirtsorganismus.
In einer dieser Ausführungsformen werden die Zellen des Wirtsorganismus lysiert, um Cannabigerolsäure aus dem Wirtsorganismus zu isolieren. Die Lyse kann mechanisch, z.B. mittels French Press, Glaskugeln oder Homogenisator oder chemisch erfolgen. Bevorzugt werden die bei der Fermentation eingesetzten Zellen mit einem organischen Lösungsmittel chemisch behandelt. Anschließend können die Zelltrümmer von dem Extrakt getrennt werden. Dies kann bevorzugt mittels Filtration, Sedimentation, Zentrifugation oder einer Kombination der Verfahren erfolgen. Auch jedes andere, dem Fachmann bekannte Verfahren kann hier Anwendung finden. Bevorzugt können die Produkte anschließend gereinigt werden, vorzugsweise mittels präparativer, chromatographischer Verfahren.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Prenyltransferase, wie sie oben im Kontext des Verfahrens beschrieben ist sowie die dafür kodierenden Nukleinsäuremoleküle bzw. Nukleotidsequenzen. In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül, wie es erfindungsgemäß eingesetzt und hierin beansprucht wird,

(1) DNA; und/oder
(2) ein Expressionsvektor; und/oder
(3) für die Expression in einem Wirtsorganismus, bevorzugt in Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica oder Pichia pastoris, weiter bevorzugt Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, codon-harmonisiert.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein rekombinanter Organismus umfassend mindestens eine Prenyltransferase gemäß der Erfindung und/oder mindestens ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung, insbesondere gemäß einer hierin beschriebenen Ausführungsform.
In einer Ausführungsform ist der rekombinante Organismus ein mikrobieller Organismus, insbesondere eine Hefezelle. In einer speziellen Ausführungsform ist der rekombinante Organismus eine S. cerevisiae Zelle, eine K. marxianus Zelle, eine Y. lipolytica Zelle oder eine P. pastoris Zelle, weiter bevorzugt eine S. cerevisiae Zelle oder eine P. pastoris Zelle, insbesondere eine S. cerevisiae Zelle.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung sind in den Ansprüchen und den Beispielen enthalten. Die aufgeführten Nukleotidsequenzen bzw. deren korrespondierende Aminosäuresequenzen können, sofern nicht anders angegeben, der KEGG-, der NCBI-, der UniProt- oder EMBL-Datenbank entnommen werden.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung, wobei die Erfindung nicht auf diese speziellen Ausführungsformen beschränkt ist.
Folgende Abbildungen sind in dieser Anmeldung enthalten:

: Bildung von CBGA in S. cerevisae Zellen, die in einem Bioreaktor mit Glucose als Kohlenstoffquelle kultiviert wurden. Alle biosynthetischen Gene zur Bildung von CBGA wurden in das Genom des Hefestamms integriert.

Beispiele
Beispiel 1

Olivetolsäure und Geranyldiphosphat wurden unter Verwendung unterschiedlicher NphB-Varianten (SEQ ID NO:2 + angegebene Substitution) zu den Produkten Cannabigerolsäure und 2-O-Geranylolivetolsäure umgesetzt. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse unter Angabe des molaren Verhältnisses von Cannabigerolsäure und 2-O-Geranylolivetolsäure. Tabelle 1: Umsetzung von Olivetolsäure und Geranyldiphosphat zu den Produkten Cannabigerolsäure und 2-O-Geranylolivetolsäure mit unterschiedlichen NphB-Varianten (SEQ ID NO:2 + angegebene Substitution)

	CBGA	2OGOA	CBGA in %	2OGOA in %
WT (SEQ ID NO:2)	1	5	100	500
Q161A	2	20	200	2000
Q161N	2	10	190	1000
T126V	4	10	400	1000
T126V/Q161A	2	4	200	400
F213A	2	120	240	12000
Y175N	1	2	70	170
Q295L	15	1	1500	150
M162A	0	14	14	1400
T126G	2	5	170	500
Q295F	20	1	2000	100
Q295N	3	1	300	100
Q295V	1	0,5	100	50
Q295H	20	2	2000	200
Q295D	1	0,5	100	50

Für die Mutation Q295F konnte eine deutlich erhöhte Cannabigerolsäure-Bildung im Verhältnis zur 2-O-Geranylolivetolsäure-Bildung gemessen werden. Es wurde 20-mal mehr Cannabigerolsäure als 2-O-Geranylolivetolsäure gebildet. Für die Mutation Q295L konnte eine 15-mal höhere Cannabigerolsäure-Synthese im Vergleich zur 2-O-Geranylolivetolsäure-Synthese gemessen werden und für die Mutation Q295H konnte 10-mal mehr Cannabigerolsäure als 2-O-Geranylolivetolsäure gemessen werden. Die angegebenen Produktverhältnisse beziehen sich hier auf molare Produktverhältnisse.
Die Expression der Prenyltransferase-Varianten wurde in E. coli durchgeführt, da hier höhere Proteinausbeuten erzielt werden konnten. Die zugehörigen Nukleotidsequenzen wurden zuvor für E. coli codon-optimiert. Für die Hauptkultur wurden 330 ml LB-Medium und 200 µg/ml Ampicillin in einem 1-Liter-Schüttelkolben mit einer OD₆₀₀ von 0,2 angeimpft. Die Kultur wurde bei 30 °C und 160 U/min inkubiert bis sie eine OD₆₀₀ zwischen 0,6 und 0,65 erreichte. Anschließend wurde die Kultur auf Raumtemperatur abgekühlt bis sie eine OD₆₀₀ von 0,7 erreichte. Die Induktion wurde mit 0,1 g/L Lactose gestartet und für 16 Stunden bei 25 °C und 160 U/min inkubiert.
100 µl Aktivitätsassay enthielten 5 mM Magnesiumchlorid, 2 mM GPP, 5 mM Olivetolsäure und 80 µl gereinigte Enzymlösung (2 mg/ml) in Enzympuffer (50 mM TRIS-HCI (pH7,5), 5 mM DTT, 10 % (v/v) Glycerol, 100 mM NaCI). Die Aktivitätsassays wurden nach 10, 20 und 30 Minuten durch Zugabe von 290 µL eiskaltem Acetonitril und 10 µL Ameisensäure gestoppt. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand mittels HPLC-Diodenarray Detektor (DAD) auf die Produktbildung untersucht.
Beispiel 2
Das modifizierte Gen NphB wurde für die Expression in Saccharomyces cerevisiae codon-harmonisiert und als synthetisches Gen bestellt (GeneArt, Life Technologies, Regensburg, Deutschland). Das Gen wurde in den Vektor pDionysos (Stehle et al., Heterologous expression of a serine carboxypeptidase-like acyltransferase and characterization of the kinetic mechanism, FEBS J, 2001, 275, 775-87) kloniert und das resultierende Konstrukt mittels Transformation in den Wirtsorganismus eingebracht.
Die Produktion der Enzyme im Wirtsorganismus wurde mit zwei Vorkulturen gefolgt von einer Hauptkultur durchgeführt. Die erste Vorkultur wurde zur Beimpfung der zweiten Vorkultur verwendet, die bei 30 °C und 200 U/min für 12 h inkubiert wurde. 100 ml Komplexmedium (20 g/L Hefeextrakt, 40 g/L Pepton, 80 mg/L Adeninhemisulfat, 40 g/L, Fructose, 5 g/L Galaktose, 100 mM Kaliumcitratpuffer pH 5,5) wurden in 1 L-Schikanekolben auf eine OD₆₀₀ von 0,5 inokuliert und als Hauptkultur verwendet. Die Kulturen wurden über 168 h bei 20 °C und 200 U/min inkubiert.
Zellkulturvolumina, die einer OD₆₀₀ von 125 entsprachen, wurden durch Zentrifugation (2000 × g, 4 °C, 10 min) geerntet. Die Überstände wurden verworfen und die Zellen in 500 µl Puffer resuspendiert (50 mM Tris-HCI-Puffer, pH 7,5, 10% (v/v) Glycerin, 100 mM Natriumchlorid). Die Zellsuspension wurde in 0,5-ml-Röhrchen überführt und mit 0,4-0,6 mm-Glasperlen gefüllt. Die Zellen wurden durch Vortexen bei maximaler Geschwindigkeit bei 4 °C für 30 Minuten lysiert. Das Zelllysat wurde zentrifugiert und der Überstand für NphB-Aktivitätsassays (1 mM GPP, 1 mM OA, 5 mM Magnesiumchlorid, 37 °C, 1100 Upm, 4 h) verwendet. Die Reaktionsprodukte wurden mittels Reverse Phase (RP)-HPLC chromatographisch aufgetrennt. Die Reinigung wurde an einer Nucleodur C18 HTec 5 µm (250 × 10 mm)-Säule (Macherey Nagel, Düren, Deutschland) unter Verwendung eines isokratischen Gradienten (4,0 ml/min, 40 °C, 35 % (v/v) H₂O, 65% (v/v) ACN) vorgenommen.
Beispiel 3
Die Produktionsleistung von S. cerevisiae wurde anhand der Cannabigerolsäure (CBGA) ausgehend von Glukose als einziger C-Quelle gemessen. Der MVA-Weg und die Hexansäurebiosynthese lagen optimiert im Wirtsorganismus vor (siehe Beschreibung). Die Hexanoyl-CoA-Synthase aus Cannabis sativa, die Olivetol-Synthase aus Cannabis sativa, die Olivetolsäure-Cyclase aus Cannabis sativa und die optimierte NphB aus Streptomyces sp. CL190 wurden zusätzlich im Wirtsorganismus produziert.
Die Gene wurden alle in das Wirtsgenom integriert. Bekannte Methoden zur Integration der Gene in den Wirtsorganismus finden sich in folgenden Publikationen: Apel et al., A Cas9-based toolkit to program gene expression in Saccharomyces cerevisiae, Nucleic Acids Res., 2017, 45, 496-508, doi:10.1093/nar/gkw1023; Maury et al., EasyCloneMulti: A Set of Vectors for Simultaneous and Multiple Genomic Integrations in Saccharomyces cerevisiae, PLoS One 11, 2016, e0150394, doi:10.1371/journal.pone.0150394. Die Kultivierung erfolgte im Bioreaktor in Komplexmedium (20 g/L Hefeextrakt, 40 g/L Pepton, 80 mg/L Adeninhemisulfat, 40 g/L Glucose, 5 g/L Galaktose, 100 mM Kaliumcitratpuffer pH 5,5). Nach 24 h erfolgte ein Glucosefeed mit 2 g/h. Nach 48 h konnte eine Produktionsleistung von 23 nmol/(OD*L*h) CBGA bestimmt werden (siehe ).
Beispiel 4
Das Gen der modifizierten Prenyltransferase wurde in den Vektor pAX_EV (Vektor pGAPZ A (Invitrogen, Darmstadt, Deutschland) mit dem Promotor AOX1 aus pPINK_HC (Invitrogen, Darmstadt, Deutschland)) kloniert und das resultierende Konstrukt mittels Transformation in den Wirtsorganismus eingebracht. Hierfür wurden Elektrokompetente Zellen mit 2 bis 3 µg Pmel-linearisierter DNA von pAX_NphB bei 1800 V unter Verwendung eines Electroporators transformiert. Die Zellen wurden 2 Tage lang auf YPD-Agar mit 100 µg/mL Zeocin wachsen gelassen und die erfolgreiche Integration in das Genom wurde mittels Kolonie-PCR untersucht. P. pastoris-Zellen wurden in BMGY Medium bei 30 °C und 200 U/min für 24 Stunden inkubiert. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und in modifiziertem BMMY (1 % (v/v) Methanol, 10 g/L Hefeextrakt, 20 g/L Peptone, 5 g/L Casaminosäuren, 13,8 g/L Hefestickstoffbase, 100 mM Bis- Tris pH 5.8, 0.4 mg/L Biotin) bis zu einer OD₆₀₀ von 20 resuspendiert. Schließlich wurden Pichia-Zellen bei 15 °C und 200 U/min kultiviert. Alle 24 h wurden zur Induktion 0,5% (v/v) Methanol zugegeben.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 8884100 B2 [0011]
US 2016/0010126 A1 [0012]
WO 2016/010827 A1 [0012]
EP 0472869 A [0050]
US 4601893 [0050]
JP 10229891 A [0050]
EP 3112458 A1 [0080]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) „Basic local alignment search tool.“ J. Mol. Biol. 215:403-410 [0025]
Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): „Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs“; Nucleic Acids Res., 25, S.3389-3402 [0025]
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 2001 [0049]
Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)) [0050]
Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)) [0050]
Schwarzer und Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) [0050]
Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) [0050]
LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in WO-A- 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)) [0050]
Apel et al., A Cas9-based toolkit to program gene expression in Saccharomyces cerevisiae, Nucleic Acids Res., 2017, 45, 496-508, doi:10.1093/nar/gkw1023 [0119]
Maury et al., EasyCloneMulti: A Set of Vectors for Simultaneous and Multiple Genomic Integrations in Saccharomyces cerevisiae, PLoS One 11, 2016, e0150394, doi:10.1371/journal.pone.0150394 [0119]

Claims

Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Cannabigerolsäure in einem Wirtsorganismus, wobei das Verfahren umfasst: a) Einbringen eines Nukleinsäuremoleküls, das eine erste heterologe Nukleotidsequenz umfasst, die für eine modifizierte Prenyltransferase kodiert, in den Wirtsorganismus, wobei die Prenyltransferase derart modifiziert ist, dass (1) die Substratspezifität auf Olivetolsäure erweitert ist und (2) bei Umsetzung von Olivetolsäure mit Geranyldiphosphat das Produktverhältnis Cannabigerolsäure:2-O-Geranylolivetolsäure mindestens 1:1, vorzugsweise mindestens 5:1 beträgt; b) Kultivieren des Wirtsorganismus unter Bedingungen, die die Expression der Nukleotidsequenz, die für die modifizierte Prenyltransferase kodiert, ermöglichen; c) Kultivieren des Wirtsorganismus unter Bedingungen, die die Herstellung von Cannabigerolsäure ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die modifizierte Prenyltransferase eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens eine Aminosäuresubstitution gegenüber der in SEQ ID NO:2 angegeben Aminosäuresequenz aufweist, vorzugsweise eine Substitution an mindestens einer der Positionen, die den Positionen 295, 126, 161, 162, 175 oder 213 in SEQ ID NO:2 entsprechen und die mindestens 80% vorzugsweise mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96,0%, 96,5%, 97,0%. 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98,0%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4% oder 99,5% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Wirtsorganismus eine Hefe, bevorzugt Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica oder Pichia pastoris, weiter bevorzugt Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nukleotidsequenz, die für die modifizierte Prenyltransferase kodiert, für die Expression in dem Wirtsorganismus, bevorzugt in Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica oder Pichia pastoris, insbesondere in Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris, codon-harmonisiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Wirtsorganismus ferner mindestens ein weiteres heterologes Nukleinsäuremolekül enthält, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die (1) für eine Hexanoyl-CoA-Synthase kodiert; und/oder (2) für eine Olivetol-Synthase kodiert und/oder (3) für eine Olivetolsäure-Cyclase kodiert, wobei vorzugsweise mindestens 2, weiter bevorzugt alle 3 Sequenzen in dem Wirtsorganismus enthalten sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der rekombinante Wirtsorganismus einen optimierten Hexansäuresyntheseweg aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei in dem Wirtsorganismus Geranyldiphosphat über den Mevalonat-abhängigen-Isoprenoidsyntheseweg oder den Methylerythritolphosphatweg bereitgestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Wirtsorganismus ferner mindestens eine weitere heterologe Nukleotidsequenz umfasst, die für eine Tetrahydrocannabinolsäure-Synthase, eine Cannabidiolsäure-Synthase oder eine Cannabichromensäure-Synthase, kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, ferner umfassend den Schritt der Isolierung von Cannabigerolsäure aus dem Wirtsorganismus.
Prenyltransferase, wobei die Prenyltransferase eine Aminosäuresequenz aufweist, die mindestens eine Aminosäuresubstitution gegenüber der in SEQ ID NO:2 angegeben Aminosäuresequenz aufweist, vorzugsweise eine Substitution an mindestens einer der Positionen, die den Positionen 295, 126, 161, 162, 175 oder 213 in SEQ ID NO:2 entsprechen, und die mindestens 80% vorzugsweise mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95,5%, 96,0%, 96,5%, 97,0%. 97,2%, 97,4%, 97,6%, 97,8%, 98,0%, 98,2%, 98,4%, 98,6%, 98,8%, 99,0%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4% oder 99,5% Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO:2 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist.
Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz, die für eine Prenyltransferase gemäß Anspruch 10 kodiert.
Die Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 11, wobei das Nukleinsäuremolekül (1) DNA ist; und/oder (2) ein Expressionsvektor ist; und/oder (3) für die Expression in einem Wirtsorganismus, bevorzugt in Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica oder Pichia pastoris, insbesondere in Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris, codon-harmonisiert ist.
Rekombinanter Organismus umfassend mindestens eine Prenyltransferase gemäß Anspruch 10 und/oder mindestens ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 11-12.
Rekombinanter Organismus gemäß Anspruch 13, wobei der Organismus ein mikrobieller Organismus, vorzugsweise eine Hefezelle, weiter bevorzugt eine S. cerevisiae Zelle, eine K. marxianus Zelle, eine Y. lipolytica Zelle oder eine P. pastoris Zelle, insbesondere eine S. cerevisiae Zelle oder eine P. pastoris Zelle ist.