DE102014109858A1 - Gentechnisch veränderte Hefe mit verbessertem Glycerol-Katabolismus - Google Patents

Gentechnisch veränderte Hefe mit verbessertem Glycerol-Katabolismus Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine gentechnisch veränderte Hefe mit verbessertem Glycerol-Katabolismus. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Fähigkeit von Hefe, Glycerol als Kohlenstoffquelle zu nutzen, zu verbessern. Gelöst wird die Aufgabe durch eine gentechnisch veränderte Hefezelle der Gattung Saccharomyces mit verbessertem Glycerol-Katabolismus, wobei die Hefezelle dahingehend gentechnisch verändert ist, dass a) der Abbau von Glycerol zu Dihydroxyacetonphosphat über den Glycerol-3-Phosphat-Weg blockiert ist, b) ein heterologes Glycerolaufnahme-Facilitator-Protein exprimiert wird, und c1) eine die Oxidation von Glycerol zu Dihydroxyaceton katalysierende heterologe Glyceroldehydrogenase exprimiert oder eine die Oxidation von Glycerol zu Dihydroxyaceton katalysierende heterologe Glyceroldehydrogenase überexprimiert wird, und oder c2) mindestens ein beim Abbau von Glycerol zu Glycerinaldehyd-3-Phosphat über den Glycerinaldehyd-Weg beteiligtes Enzym überexprimiert wird oder mindestens ein beim Abbau von Glycerol zu Glycerinaldehyd-3-Phosphat über den Glycerinaldehyd-Weg beteiligtes Enzym durch ein heterologes Enzym mit der gleichen Enzymaktivität ersetzt ist.

Description

  • Die Erfindung betrifft eine gentechnisch veränderte Hefe mit verbessertem Glycerol-Katabolismus.
  • Die Herstellung von Biokraftstoffen und Chemikalien aus erneuerbaren Ressourcen ist notwendig, um den Energiebedarf in einer Welt zu decken, in der mineralölbasierte Kraftstoffe immer knapper und teurer werden. Biodiesel ist ein alternativer Kraftstoff, der in Deutschland derzeit größtenteils aus Raps gewonnen wird und nach einer Umfrage des Verbands der Deutschen Biokraftstoffindustrie e.V. die Treibhausgasemission im Vergleich zu fossilem Diesel bis zu 60% reduzieren kann. Prinzipiell können auch Altspeisefette verwendet werden. Die potentielle Nutzung von Fetten bzw. Ölen, die durch Mikroalgen bzw. anderen Mikroorganismen produziert werden (Gong and Jiang, 2011; Shi et al., 2011), sind in der Diskussion, spielen aber kommerziell bisher keine Rolle. Biodiesel wird hauptsächlich hergestellt durch die Umesterung von Fetten und pflanzlichen Ölen in Gegenwart eines Alkohols (meist Methanol), was zur Bildung eines Fettsäuremethylesters (Biodiesel) und Glycerol (als Nebenprodukt) führt. Die Biodieselproduktion und damit auch die Menge an Rohglycerol, die parallel erzeugt wird, hat in den letzten Jahren stark zugenommen. Pro 100 Gewichtseinheiten hergestelltem Biodiesel fallen 10 Gewichtseinheiten Rohglycerol an (Yazdani & Gonzalez, 2007). In Deutschland wurden im Jahr 2011 200.000 t Rohglycerol im Zuge der Biodieselherstellung produziert (Marktanalyse Nachwachsende Rohstoffe, FNR, Schriftenreihe Nachwachsende Rohstoffe 34, 2014). Die Aufreinigung der Glycerolfraktion aus Rohglycerol in einer Weise, dass es die Standards der Lebensmittel-, Pharma- oder Kosmetikindustrie erfüllt, ist nicht wirtschaftlich, so dass andere Wege beschritten werden müssen, um Rohglycerol zu verwerten. Eine Möglichkeit ist die Verwendung als Ausgangsmaterial für mikrobielle Umwandlungsverfahren (Almeida et al., 2012).
  • Die Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) ist ein beliebtes Objekt des Metabolic Engineering sowie ein attraktiver Produktionsorganismus in der industriellen Biotechnologie. Es wurden zahlreiche Ansätze verfolgt, um diesen Organismus zur Herstellung von industriell relevanten Produkten wie Biokraftstoffen, Grund- und Feinchemikalien (einschließlich Arzneimitteln) sowie Proteinwirkstoffen nutzbar zu machen (Borodina & Nielsen, 2014; Hong & Nielsen, 2012; Nevoigt, 2008). S. cerevisiae wächst jedoch nur schlecht auf Glycerol als Kohlenstoffquelle. Zwei Studien haben gezeigt, dass die häufig in der Forschung und industriell verwendeten S.-cerevisiae-Stämme die Zugabe von Ergänzungsstoffen (wie Aminosäuren und Nukleobasen) erfordern, um auf Glycerol zu wachsen (Merico et al 2011; Swinnen et al., 2013). Lediglich einzelne Isolate sind in der Lage, Glycerol ohne solche Medienzusätze als Kohlenstoffquelle zu nutzen (Swinnen et al. 2013).
  • Zur Metabolisierung muss Glycerol zunächst in die Zelle aufgenommen werden. Bei Mikroorganismen sind grundsätzlich zwei Arten von Transportsystemen gefunden worden (s. Fakas et al. 2009 und Lin et al. 1976). Der erste Typ beruht auf erleichterter Diffusion, benötigt keine Energie und hängt von Glycerol-Facilitatoren ab. Im Gegensatz dazu ist der zweite Typ ein energieabhängiger aktiver Transport auf Basis eines Glycerol/H+-Symporters. Es war lange umstritten, wie Glycerol in den S. cerevisiae Zelle transportiert wird (Neves et al. 2004). Schließlich hat sich gezeigt, dass ein durch STL1 codiertes aktives Transportsystem von entscheidender Bedeutung ist (Ferreira et al. 2005). Ein von FPS1 codierter Glycerol-Facilitator ist natürlichweise auch in S. cerevisiae vorhanden, scheint bei dieser Art aber keine entscheidende Rolle für die Glycerol-Aufnahme zu spielen.
  • Generell erfolgt der initiale Abbau von Glycerol in Mikroorganismen auf drei Wegen (s. Fakas et al. 2009). Der Glycerol-3-Phosphat-Weg (auch G3P-Weg oder Phosphorylierungsweg) führt über die Phosphorylierung von Glycerol durch die Glycerolkinase zu L-Glycerol-3-phosphat (G3P), welches durch die Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase zu Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) oxidiert wird. Der DHA-Weg (auch Oxidationsweg) führt über die durch Glyceroldehydrogenase katalysierte Oxidation von Glycerol zu Dihydroxyaceton (DHA), welches von der Dihydroxacetonkinase zu Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) phosphoryliert wird. Der Glycerinaldehyd-Weg führt über Glycerinaldehyd zu Glycerinaldeyd-3-Phosphat, das enzymatisch zu DHAP umgewandelt werden kann.
  • Experimentelle Daten deuten darauf hin, dass S. cerevisiae Glycerol ausschließlich über den Phosphorylierungsweg, d.h. über L-Glycerin-3-phosphat, abbaut, d.h. lediglich die von GUT1 und GUT2 codierten Enzyme Glycerolkinase und Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase verwendet. Experimentelle Beweise für die Bedeutung von Gut1 und Gut2 für das Wachstum von S. cerevisiae auf Glycerol wurden erstmalig von Sprague und Cronan (1977) bereitgestellt.
  • Die Studien von Ferreira et al. (2005) zur Bedeutung des Stl1 Transporters bzw. von Sprague und Cronan (1977) zur Rolle von Gut1 und Gut2 für die Glycerolverwertung von S. cerevisiae wurden in Medien durchgeführt, die komplexe Zusätze wie mehrere Aminosäuren und Nukleobasen enthielt. Swinnen et al. 2013 konnten allerdings zeigen, dass die Gene STL1, GUT1 und GUT2 auch eine entscheidende und exklusive Rolle für das Wachstum von S. cerevisiae in Glycerol-haltigem Medium ohne Zusätze haben.
  • Der oxidative Glycerol-Abbauweg über DHA scheint bei Neurospora crassa parallel zum Phosphorylierungsweg vorhanden zu sein (Tom et al., 1978). Eine NAD+-abhängige Glyceroldehydrogenase wurde in einigen Arten der Gattungen und Candida, Torulopsis und Hansenula gefunden (Hofmann und Babel, 1979); später auch in Schizosaccharomyces pombe (May & Sloan, 1981). Babel und Hofmann (1982) konnten bei Candida valida eine besonders hohe Aktivität dieses Enzyms messen. Es ist allerdings unklar, ob der oxidative Weg in S. cerevisiae natürlicherweise funktional ist. In der Tat zeigten weder eine GUT1- noch eine GUT2-Deletionsmutante signifikantes Wachstum auf Glycerol (Swinnen et al. 2013), ein Ergebnis, das eine wichtige Rolle des DHA-Weges für diese Funktion ausschließt. Darüber hinaus konnten weder Norbeck und Blomberg (1997) noch Nguyen und Nevoigt (2009) eine native Glycerol-Dehydrogenase-Aktivität in S. cerevisiae messen. Im Gegensatz dazu schlagen andere Autoren vor, dass Glycerol durch eine NADP+-abhängige Glycerin-Dehydrogenase (GDH) zu Dihydroxyaceton umgewandelt wird, wobei die Gene ARA1, GCY1, GRE3 und YPR1 beteiligt sein sollen (Izawa et al., 2004). Zwar gibt es Zweifel an der Existenz einer natürlichen Glyceroldehydrogenase in S. cerevisiae, eine messbare Aktivität des zweiten Enzyms des DHA-Wegs, der durch die Gene und DAK1 und DAK2 codierten Dihydroxyacetonkinase, ist in S. cerevisiae jedoch natürlicherweise vorhanden (Molin et al., 2003). Eine Studie von Jung et al. 2011 hat kürzlich im Übrigen gezeigt, dass die Expression einer heterologen Glycerol-Dehydrogenase aus Ogataea angusta (Syn. Pichia angusta, Hansenula polymorpha) in S. cerevisiae die Glycerol-Nutzung im Vergleich zum Wildtyp-Stamm 1,22-fach verbesserte, d.h. der gentechnisch veränderte Stamm verbrauchte nach 96 h Kultivierung 5,18 g/l von 12,62 g/l Glycerol, während die Kontrolle im Vergleich dazu in der gleichen Zeit nur 4,24 g/l verbrauchte.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Fähigkeit von Hefe, Glycerol als Kohlenstoffquelle zu nutzen, zu verbessern.
  • Gelöst wird die Aufgabe durch eine gentechnisch veränderte Hefezelle der Gattung Saccharomyces mit verbessertem Glycerol-Katabolismus, wobei die Hefezelle dahingehend gentechnisch verändert ist, dass
    • a) der Abbau von Glycerol zu Dihydroxyacetonphosphat über den Glycerol-3-Phosphat-Weg blockiert ist,
    • b) ein heterologes Glycerolaufnahme-Facilitator-Protein exprimiert wird, und
    • c1) eine die Oxidation von Glycerol zu Dihydroxyaceton katalysierende heterologe Glyceroldehydrogenase exprimiert oder eine die Oxidation von Glycerol zu Dihydroxyaceton katalysierende heterologe Glyceroldehydrogenase überexprimiert wird, oder
    • c2) mindestens ein beim Abbau von Glycerol zu Glycerinaldehyd-3-Phosphat über den Glycerinaldehyd-Weg beteiligtes Enzym überexprimiert wird oder mindestens ein beim Abbau von Glycerol zu Glycerinaldehyd-3-Phosphat über den Glycerinaldehyd-Weg beteiligtes Enzym durch ein heterologes Enzym mit der gleichen Enzymaktivität ersetzt ist.
  • Die erfindungsgemäß vorgesehene Kombination von gentechnischen Veränderungen an Saccharomyces-Zellen bewirkt eine effiziente Aufnahme und Kanalisierung von Glycerol durch den nunmehr etablierten oder zumindest verstärkten DHA-Stoffwechselweg. Alternativ wird erfindungsgemäß der Glycerolkatabolismus über den Glycerinaldehyd-Weg optimiert, indem mindestens eines, vorzugsweise sämtliche der an diesem Weg bis hin zum Glycerinaldehyd-3-Phosphat beteiligten natürlichen (nativen) Enzyme überexprimiert oder durch ein heterologes Enzym mit der gleichen Enzymaktivität ersetzt wird. Bei dieser Alternative ist es nicht erforderlich und auch nicht bevorzugt, den DHA-Weg zu manipulieren. Die Integration eines heterologen Glycerol-Facilitators fördert die Aufnahme von Glycerol, ohne dass hierfür Energie benötigt wird. Die Blockade des Glycerol-3-phosphat-Wegs führt dazu, dass in die Zelle aufgenommenes Glycerol entweder über den DHA-Weg abgebaut wird, wobei durch die Einführung einer heterologen Glyceroldehydrogenase oder die Überexpression eines nativen Enzyms mit Glyceroldehydrogenaseaktivität, der etwaige Mangel an einer natürlichen Glyceroldehydrogenaseaktivität kompensiert ist, oder alternativ über den dann durch Überexpression der beteiligten Enzyme oder Einführung heterologer Enzymvarianten optimierten Glycerinaldehyd-Weg. Die am Glycerol-3-Phosphat-Weg beteiligte FAD-abhängige Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase ist auf der Außenseite der der inneren Mitochondrienmembran lokalisiert (Gancedo et al. 1968; Klingenberg 1970) und leitet Elektronen aus der Oxidation von Glycerol-3-phosphat direkt in die mitochondriale Atmungskette, was nachteilig ist, wenn Reduktionsäquivalente beispielsweise für eine nachfolgende Herstellung reduzierter Verbindungen, beispielsweise 1,2-Propandiol, benötigt werden. Demgegenüber liefert der DHA-Weg wertvolle Reduktionsäquivalente in Form von NADH, der Glycerinaldehyd-Weg in Form von NADPH.
  • Unter dem Begriff „Glycerol-3-Phosphat-Weg“, „Glycerol-3-Phosphat-Stoffwechselweg“, „G3P-Weg“ oder auch „Phosphorylierungsweg“ wird die Umsetzung von Glycerol über L-Glycerol-3-phosphat (G3P) zu Dihydroxacetonphosphat (DHAP) verstanden.
    Figure DE102014109858A1_0002
  • Die Reaktionen werden von der Glycerolkinase und der mitochondrialen (FAD-abhängigen) Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase (GPD-M, mGPD, EC 1.1.5.3) katalysiert. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae wird die Glycerolkinase durch das Gen GUT1, die Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase durch GUT2 kodiert.
  • Unter dem „DHA-Weg“, „DHA-Stoffwechselweg“ oder „Oxidationsweg“ wird die Umsetzung von Glycerol über Dihydroxyaceton (DHA) zu Dihydroxacetonphosphat (DHAP) verstanden.
    Figure DE102014109858A1_0003
  • Die Reaktionen werden von der Glyceroldehydrogenase und der Dihydroxyacetonphosphatkinase katalysiert.
  • Unter dem Begriff „Glycerinaldehyd-Weg“ wird die Umsetzung von Glycerol über D-Glycerinaldehyd zu D-Glycerinaldehyd-3-Phosphat (GAP) verstanden.
    Figure DE102014109858A1_0004
  • Die Reaktionen werden von einer NADP-abhängigen Glyceroldehydrogenase (NADP-Glyceroldehydrogenase, NADP-GDH) und einer Glycerinaldehyd-Kinase (Triokinase, Triosekinase, EC 2.7.1.28) katalysiert.
  • Wenn hier von einem „Syntheseweg zur Rückbildung von Glycerol aus Dihydroxyacetonphosphat“ gesprochen wird, ist damit die Umsetzung von Dihydroxyacetonphosphat über Glycerol-3-phosphat zu Glycerol gemeint.
    Figure DE102014109858A1_0005
  • Die Reduktion von DHAP zu Glycerol-3-phosphat wird durch die in zwei Isoformen vorkommende cytosolische NAD-abhängige Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase (GPD-C, cGPD, EC 1.1.1.8) katalysiert. Die Isoformen werden von den Genen GPD1 bzw. GPD2 kodiert. Die Dephosphorylierung von Glycerol-3-phosphat zu Glycerol wird von der Glycerol-3-phosphatase (GPP, EC 3.1.3.21) katalysiert, die ebenfalls in zwei Isoformen vorkommt, die von GPP1 und GPP2 kodiert werden.
  • Der Begriff „heterolog“ wird hier in seiner dem Fachmann bekannten Bedeutung verwendet, und bezieht sich auf die fremde Herkunft eines Elements, beispielsweise eines Enzyms oder anderen Proteins. „Fremd“ bedeutet, dass das Element so in der Zielzelle nicht vorkommt, und beispielsweise aus einer Zelle oder einem Organismus mit abweichender genetischer Ausstattung, beispielsweise einem Organismus einer anderen Art, stammt.
  • Unter einem „Glycerolaufnahme-Facilitator-Protein“ oder kurz „Glycerol-Facilitator“ wird ein Transmembranprotein verstanden, das den Transport von Glycerol in eine Zelle, beispielsweie eine Saccharomyces-Zelle, mittels erleichterter Diffusion ermöglicht.
  • Unter „Glyceroldehydrogenase“ (kurz GDH) wird hier eine cytosolische Glycerol:NAD+-Oxidoreduktase (EC 1.1.1.6) verstanden, welche die Oxidation von Glycerol zu Dihydroxyaceton mittels NAD+ als Kofaktor katalysiert. Unter einer „heterologen Glyceroldehydrogenase“ wird eine cytosolische Fremd-Glyceroldehydrogenase verstanden, d.h. eine aus einem anderen Organismus, z.B. einer anderen Art, Gattung etc., stammende Glyceroldehydrogenase, die jedoch dieselbe Reaktion katalysiert, gegebenenfalls unter Nutzung eines anderen Kofaktors. Unter dem Begriff „NADP-Glyceroldehydrogenase“ (abgekürzt auch „NADP-GDH“) wird hier eine Glycerol:NADP+-Oxidoreductase (EC 1.1.1.72) verstanden, die Glycerol zu D-Glycerinaldehyd oxidiert, wobei NADP+ als Kofaktor fungiert.
  • Unter dem Begriff „Dihydroxyacetonkinase“ oder „DHA-Kinase“ wird hier eine ATP:Dihydroxyaceton-Phosphotransferase (EC 2.7.1.29) verstanden, die die Phosphorylierung von Dihydroxaceton mittels ATP katalysiert.
  • Unter „Expression“ wird hier die Umsetzung einer genetischen Information in ein Produkt verstanden, beispielsweise die Bildung eines Proteins oder einer Nukleinsäure anhand der genetischen Information. Der Begriff umfasst insbesondere die Biosynthese von Proteinen anhand der genetischen Information einschließlich vorangehender Prozesse wie der Transkription, d.h. der Bildung von mRNA auf Basis einer DNA-Vorlage.
  • Der Ausdruck, dass ein heterologes Protein/Enzym exprimiert wird, schließt ein, dass das Protein/Enzym im Vergleich zum durchschnittlichen Expressionsniveau des Proteins/Enzyms in der Herkunftszelle in der Zielzelle unter ansonsten gleichen Bedingungen überexprimiert wird. Der Ausdruck schließt auch ein, dass das Protein/Enzym unter Kontrolle eines beliebigen Promotors exprimiert wird, also auch eines Promotors, der von dem Promotor verschieden sein kann, der in der Herkunftszelle mit dem Protein/Enzym verknüpft ist oder der in der Zielzelle mit einem etwaigen orthologen Protein/Enzym verknüft ist. Dem Fachmann ist bekannt, wie er eine Überexpression eines Proteins/Enzyms bewirken kann. Eine Möglichkeit ist beispielsweise die Einführung zusätzlicher Kopien des für das Protein/Enzym kodierenden Gens in eine Zelle und/oder die Ersetzung des natürlichen Promotors, unter dessen Kontrolle die Expressin des Gens erfolgt, durch einen stärkeren Promotor.
  • Unter dem Begriff der „Blockade“ oder des „Blockierens“ eines Stoffwechselweges, d.h. einer Kette von Reaktionen mit einer Ausgangsverbindung, mindestens einem Zwischenprodukt und einem Endprodukt (das selbst auch wieder die Ausgangsverbindung für einen anderen Stoffwechselweg sein kann) wird hier verstanden, dass die Bildung zumindest des ersten Zwischenproduktes des Weges unterbunden oder wesentlich vermindert ist. „Blockade“ oder „Blockieren“ bedeutet hier insbesondere, dass im Vergleich zu einer Hefezelle, bei der der Stoffwechselweg nicht blockiert ist, die Bildung des ersten Zwischenprodukts um mindestens 75 %, vorzugsweise mindestens 80 %, mindestens 85 %, mindestens 90 %, mindestens 95 % oder mindestens 98 % vermindert ist. In Bezug auf den Glycerol-3-Phosphat-Stoffwechselweg wird unter einer Blockade daher verstanden, dass zumindest der Abbau von Glycerol zu Glycerol-3-Phosphat durch die Glycerolkinase blockiert ist. In Bezug auf den Syntheseweg zur Rückbildung von Glycerol aus Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) wird unter einer Blockade verstanden, dass zumindest die Reduktion von DHAP zu Glycerol-3-Phosphat durch Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase blockiert ist. Der Begriff schließt auch ein, dass sämtliche Zwischenschritte auf dem Weg zum Endprodukt blockiert sind, beispielweise durch Deletieren oder Mutieren der Gene sämtlicher an dem Weg beteiligter Enzyme, so dass kein funktionsfähiges Genprodukt oder nur ein in seiner Funktion wesentlich eingeschränktes Genprodukt, d.h. Enzym, resultiert. Der Begriff kann auch bedeuten, dass die Bildung von funktionsfähigem Enzym um die oben genannten Prozentzahlen vermindert ist, indem beispielsweise die natürlichen Promotoren durch entsprechend schwächere ausgetauscht werden, oder dass nur eine solche Menge eines in seiner Funktionalität eingeschränkten Enzyms gebildet wird, dass die Bildung des Zwischenproduktes wie oben definiert vermindert ist. Mittel zur Modifizierung eines Stoffwechselweges im Wege des „Metabolic Engineering“ sind dem Fachmann gut bekannt (s. z.B. Nevoigt 2008; Mapelli 2014). Beispielsweise kann ein Stoffwechselweg durch Deletieren oder Deaktivieren eines Gens oder eines für die Regulation eines Gens relevanten DNA-Abschnitts, beispielsweise mittels zielgerichteter Mutation, blockiert werden. Eine Modifikation dahingehend, dass ein heterologes Enzym exprimiert wird, kann durch dem Fachmann bekannte gentechnische Verfahren erreicht werden, beispielsweise indem ein geeigneter Expressionsvektor mit einem das Enzym kodierenden Gen (zusammen mit einem geeigneten Promoter und Terminator) in die Zelle eingebracht wird.
  • Wenn hier von einem Enzym mit einer bestimmten Enzymaktivität gesprochen wird, z.B. von einer Dihydroxyaceton-Kinase (DHA-Kinase), wird von dem Begriff auch ein Enzym erfasst, das neben mindestense einer anderen Enzymaktivität zumindest auch die entsprechende Enzymaktivität hat. Unter einer „DHA-Kinase“ beispielsweise wird daher auch ein Enzym mit DHA-Kinase-Aktivität verstanden, dass daneben noch mindestens eine andere Enzymaktivität, beispielsweise eine Trioseisomeraseaktivität, besitzt. Ein konkretes Beispiel hierfür ist die 2,3-Butandioldehydrogenase (BDH1) aus Saccharomyces cerevisiae, von der gezeigt wurde, dass sie auch Glyceroldehydrogenaseaktivität aufweist (Gonzalez et al., 2000). Wenn hier von der Überexpression einer nativen Glyceroldehydrogenase gesprochen wird, umfasst dies daher auch beispielsweise die Überexpression der BDH1 oder eines anderen nativen Enzyms mit entsprechender Aktivität.
  • Bei der gentechnisch veränderten Hefezelle gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich vorzugsweise um eine Hefezelle der Art Saccharomyces cerevisiae.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße gentechnisch veränderte Hefezelle weiterhin dahingehend gentechnisch verändert, dass
    • c1a) der Abbau von Glycerol zu Glycerinaldehyd-3-Phosphat über den Glycerinaldehyd-Weg blockiert ist, und/oder
    • d) die Expression des durch STL1 kodierten natürlichen aktiven Glycerol-Transporters blockiert ist, und/oder
    • e) der Syntheseweg zur Rückbildung von Glycerol aus Dihydroxyacetonphosphat ist blockiert ist, und/oder
    • f) eine heterologe Dihydroxyacetonkinase exprimiert oder die native Dihydroxyacetonkinase überexprimiert wird.
  • Vorzugsweise sind bei der erfindungsgemäßen gentechnisch veränderten Hefezelle in einer Ausgestaltung alle Merkmale c1a) bis f) zusammen mit den Merkmalen a) bis c1) verwirklicht. Im Falle der alternativen Ausgestaltung der Erfindung mit den Merkmalen a) bis c2) ist es bevorzugt, wenn die Merkmale d) bis f) ebenfalls verwirklicht sind.
  • Die zusätzliche Blockade des Glycerinaldehyd-Wegs ist beispielsweise für die Herstellung von Fermentationsprodukten vorteilhaft, für die Reduktionsäquivalente nur in Form von NADH benötigt werden, z.B. Succinat.
  • Durch die Blockade der Expression des natürlichen aktiven durch STL1 kodierten Transporters wird ein unnötiger Verbrauch von ATP vermieden, insbesondere unter Bedingungen, bei denen die Zellen möglicherweise nicht genügend ATP liefern können, beispielsweise unter Sauerstofflimitierung. Die Expression des heterologen Glycerol-Facilitators ermöglicht dennoch die Aufnahme von Glycerol in die Hefezelle. Die Herstellung einer STL1-Deletionsmutante ist beispielsweise in Liu et al. 2013 und Swinnen et al. 2013 beschrieben.
  • Die Blockade des Synthesewegs zur Rückbildung von Glycerol aus Dihydroxyacetonphosphat verhindert zusätzlich, dass über den DHA-Weg gebildetes Dihydroxyacetonphosphat wieder zu Glycerol-3-Phosphat oder gar Glycerol umgesetzt wird, wodurch insbesondere ein unnötiger Abfluss von Reduktionsäquivalenten vermieden werden kann. Die Blockade kann beispielsweise durch Deletion der Gene (GPD1/2 und/oder GPP1/2) erreicht werden, welche für die die Rückbildung katalysierenden Enzyme kodieren. Deletionen von GPD1 bzw. GPD2 sind in Hubmann et al. (2011) beschrieben. Die Deletion von GPP1 bzw. GPP2 ist in Påhlmann et al. (2001) beschrieben. Alternativ können die natürlichen Promotoren durch sehr viel schwächere ausgetauscht werden, wie es für GPD1 bzw. GPD2 bereits beschrieben wurde (Hubmann et al., 2011).
  • Die Expression einer heterologen DHA-Kinase kann anstatt oder zusätzlich zur nativen, d.h. natürlicherweise in der Zelle vorhandenen, DHA-Kinase erfolgen. Vorzugsweise wird eine heterologe DHA-Kinase mit einer im Vergleich zur nativen DHA-Kinase höheren Aktivität (höheren Umsatzrate) verwendet, oder die DHA-Kinase wird überexprimiert. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Hefezelle dahingehend gentechnisch verändert, dass der Abbau von Glycerol zu Dihydroxyacetonphosphat über den Glycerol-3-Phosphat-Weg dadurch blockiert ist, dass die Expression der Glycerolkinase und/oder der mitochondrialen Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase (mGDP) blockiert ist. Bevorzugt ist, dass sowohl die Expression der Glycerolkinase als auch der mitochondrialen Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase blockiert ist. Dies kann mit verschiedenen Methoden erreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise durch Deletion der für die Enzyme kodierenden Gene (s. z.B. Swinnen et al. 2013).
  • Bevorzugt handelt es sich bei dem heterologen Glycerolaufnahme-Facilitator-Protein um Fps1 oder Fps2, vorzugsweise Fps2 aus Pachysolen tannophilus (s. Liu et al. 2013; PtFPS1: GenBank: JQ481631.1 GI:394996125, AFN43530.1 GI:394996126; PtFPS2: JQ481632.1 GI:394996127, AFN43531.1 GI:394996128). Andere Proteine kommen jedoch ebenfalls in Frage, z.B. Fps1 aus Pichia pastoris, Pichia jadinii oder Yarrowia lipolytica. Bei der heterologen Glyceroldehydrogenase handelt es sich bevorzugt um eine Glyceroldehydrogenase aus Ogataea angusta (s. Jung et al. 2011, GenBank: AB185335.1 GI:50582511, BAD32688.1 GI:50582512). Anstelle der Einführung einer heterologen Glyceroldehydrogenase kann auch die in Saccharomyces cerevisiae natürlicherweise vorkommende und Glyceroldehydrogenaseaktivität aufweisende BDH1 überexprimiert werden. Heterologe DHA-Kinasen stammen vorzugsweise aus Organismen, die nachweislich natürlicherweise den DHA-Weg benutzen, z.B. Dak1 aus Schizosaccharomyces pombe (s. Itoh et al., 1999, UniProtKB/Swiss-Prot O13902, Ver 98, 1106.2014.). Als heterologer Ersatz für die NADP+-abhängige Glyceroldehydrogenase des Glycerinaldehyd-Wegs kommt beispielsweise das Produkt des Gens gldB aus Aspergillus (Emericella) nidulans in Frage (de Vries et al. 2003, UniProtKB/Swiss-Prot Q7Z8L1, Ver 64, 11.06.2014). Als Ersatz für die Triosekinase kommt auch eine heterologe DHA-Kinase in Betracht. Alternativ oder zusätzlich können die für die Triosekinasen Dak1 oder Dak2 in S. cerevisiae kodierenden Gene DAK1 und/oder DAK2 überexprimiert werden.
  • Die erfindungsgemäße Hefezelle ist derart modifiziert, dass sie für die Herstellung reduzierter Fermentationsprodukte besonders geeignet ist. In der alternativen Ausgestaltung, in der der DHA-Weg aktiviert und/oder verstärkt ist, ist beispielsweise die Herstellung von Succinat besonders vorteilhaft realisierbar, weil hier die in der Redoxbilanz benötigten zwei NADH erzeugt werden. Je nach gewünschtem Fermentaitonsprodukt kann die Hefezelle entsprechend so manipuliert werden, dass die nötige Anzahl und Art von Reduktionsäquivalenten erzeugt wird. Hierzu kann es vorteilhaft sein, noch weitere Veränderungen an der Hefezelle vorzunehmen.
  • So ist die Hefezelle in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dahingehend gentechnisch verändert, dass eine heterologe Formiatdehydrogenase (FDH) in der Hefezelle exprimiert oder die native Formiatdehydrogenase überexprimiert wird. Als heterologe Formiatdehydrogenasen kommen beispielsweise bakterielle Formiatdehydrogenasen, beispielsweise aus E. coli, in Frage. Bevorzugt sind jedoch Formiatdehydrogenasen eukaryotischen Ursprungs, beispielsweise aus Candida (z.B. FDH1 aus Candida boidinii, UniProtKB/Swiss-Prot O13437 (FDH_CANBO), Ver 72, 16.04.14). Bei der überexprimierten Formiatdehydrogenase kann es sich auch um die vom FDH1-Gen kodierte Formiatdehydrogenase aus Saccharomyces cerevisiae handeln. Bei Kultivierung einer derart veränderten Hefezelle mit Formiat als Kosubstrat können zusätzliche Reduktionsäquivalente gewonnen werden, die beispielsweise bei Verwendung der Hefe zur Herstellung von insbesondere 1,2-Propandiol oder anderen stark reduzierten Produkten vorteilhaft sein können. Formiat (als Ko-Substrat verwendet) kann in diesem Zusammenhang als zusätzlicher Elektronendonator fungieren. Für den Fall, dass der Glycerinaldehyd-Weg durch Überexpression der relevanten Enzyme oder Einführung heterologer Varianten optimiert ist und daher NADPH als Reaktionsäquivalent anfällt, kann die 1,2-PDO Bildung auch mit NADPH betrieben werden, und alternativ zur Formatdehydrogenase könnte eine native Glucose-Dehydrogenase überexprimiert oder heterologe Glucose-Dehydrogenase eingeführt und Glucose als Co-Substrat eingesetzt werden.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsproduktes aus Glycerol, wobei eine erfindungsgemäß gentechnisch veränderte Hefezelle nach dem oben beschriebenen Aspekt in einem glycerolhaltigen Kulturmedium unter geeigneten Fermentationsbedingungen kultiviert und das Fermentationsprodukt von dem Kulturmedium abgetrennt wird. Beispiele für Fermentationsprodukte sind Succinat und 1,2-Propandiol. Im Fall von 1,2-Propandiol (1,2-PDO) ist es besonders bevorzugt, wenn die eingesetzte Hefezelle eine heterologe Formiatdehydrogenase und/oder eine native Formiatdehydrogenase enthält, die überexprimiert wird. Je nach gewünschtem Fermentationsprodukt kann eine Hefezelle eingesetzt werden, die für den jeweiligen Zweck insbesondere hinsichtlich der Redoxbilanz optimiert ist.
  • Die Erfindung wird im Folgenden anhand der beigefügten Figur beispielhaft näher erläutert.
  • 1 Schematische Darstellung des Abbaus von Glycerol in einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen gentechnisch veränderten Hefezelle.
  • 1 zeigt schematisch den Abbau von Glycerol in einer bevorzugten Ausführungsform einer erfindungsgemäßen gentechnisch veränderten Hefezelle. Dargestellt sind der Glycerol-3-Phosphat-Weg (links), der DHA-Weg (Mitte) und der Glycerinaldehyd-Weg (rechts), also jene drei Stoffwechselwege, die zu einem Glycerolabbau führen. Bei der Hefezelle wurde die Expression des natürlichen Transportproteins Stl1 durch Deletion des entsprechenden Gens blockiert. Darüber hinaus wurde die Zelle dahingehend gentechnisch verändert, dass ein heterologer Glycerol-Facilitator, hier Fps2 aus Pachysolen tannophilus, exprimiert wird. Der Glycerol-3-Phosphat-Weg ist durch Deletion der Gene für Glycerolkinase (GUT1) und die mitochondriale Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase (GUT2) blockiert. Darüber hinaus ist auch die Rückreaktion über die NAD-abhängige Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase und die Glycerol-3-Phosphatase durch Deletion der hierfür kodierenden Gene (GPD1, GPD2, GPP1, GPP2) blockiert. In die Zelle über den Glycerol-Facilitator transportiertes Glycerol wird damit über den in der Mitte dargestellten DHA-Weg über Dihydroxyaceton zu Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) umgesetzt. In der Hefezelle wird eine heterologe Glyceroldehydrogenase, hier eine Glyceroldehydrogenase aus Ogataea angusta, exprimiert. Des Weiteren ist auch der Glycerinaldehyd-Weg bei dieser Ausführungsform vollständig durch Deletion der kodierenden Enzyme blockiert. Diese Ausführungsform ist besonders vorteilhaft für den Fall, dass Reduktionsäquivalente nur in Form von NADH benötigt werden, wie beispielsweise bei der Herstellung von Succinat. Die Bildung bzw. der Verbrauch von Reduktionsäquivalenten oder ATP ist nur für den DHA-Weg und den Glycerinaldehyd-Weg dargestellt.
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Claims (9)

  1. Gentechnisch veränderte Hefezelle der Gattung Saccharomyces mit verbessertem Glycerol-Katabolismus, wobei die Hefezelle dahingehend gentechnisch verändert ist, dass a) der Abbau von Glycerol zu Dihydroxyacetonphosphat über den Glycerol-3-Phosphat-Weg blockiert ist, und b) ein heterologes Glycerolaufnahme-Facilitator-Protein exprimiert wird, und c1) eine die Oxidation von Glycerol zu Dihydroxyaceton katalysierende heterologe Glyceroldehydrogenase exprimiert oder eine die Oxidation von Glycerol zu Dihydroxyaceton katalysierende heterologe Glyceroldehydrogenase überexprimiert wird, oder c2) mindestens ein beim Abbau von Glycerol zu Glycerinaldehyd-3-Phosphat über den Glycerinaldehyd-Weg beteiligtes Enzym überexprimiert wird oder mindestens ein beim Abbau von Glycerol zu Glycerinaldehyd-3-Phosphat über den Glycerinaldehyd-Weg beteiligtes Enzym durch ein heterologes Enzym mit der gleichen Enzymaktivität ersetzt ist.
  2. Gentechnisch veränderte Hefezelle nach Anspruch 1, wobei die Hefezelle eine Hefezelle der Art Saccharomyces cerevisiae ist.
  3. Gentechnisch veränderte Hefezelle nach Anspruch 1 oder 2, wobei zusätzlich c1a) der Abbau von Glycerol zu Glycerinaldehyd-3-Phosphat über den Glycerinaldehyd-Weg blockiert ist, und/oder d) die Expression des durch STL1 kodierten natürlichen aktiven Glycerol-Transporters blockiert ist, und/oder e) der Syntheseweg zur Rückbildung von Glycerol aus Dihydroxyacetonphosphat blockiert ist und/oder f) eine heterologe Dihydroxyacetonkinase exprimiert oder die native Dihydroxyacetonkinase überexprimiert wird.
  4. Gentechnisch veränderte Hefezelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Abbau von Glycerol zu Dihydroxyacetonphosphat über den Glycerol-3-Phosphat-Weg dadurch blockiert ist, dass die Expression der Glycerolkinase und/oder der mitochondrialen Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase blockiert ist.
  5. Gentechnisch veränderte Hefezelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das heterologe Glycerolaufnahme-Facilitator-Protein Fps1 oder Fps2 aus Pachysolen tannophilus, oder Fps1 aus Pichia pastoris, Pichia jadinii oder Yarrowia lipolytica ist, und die heterologe Glyceroldehydrogenase eine Glyceroldehydrogenase aus Ogataea angusta ist.
  6. Gentechnisch veränderte Hefezelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Hefezelle dahingehend gentechnisch verändert ist, dass eine heterologe Formiatdehydrogenase in der Hefezelle exprimiert oder die native Formiatdehydrogenase überexprimiert wird.
  7. Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsproduktes aus Glycerol, wobei eine gentechnisch veränderte Hefezelle nach einem der vorhergehenden Ansprüche in einem glycerolhaltigen Kulturmedium unter geeigneten Fermentationsbedingungen kultiviert und das Fermentationsprodukt von dem Kulturmedium abgetrennt wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Hefezelle eine gentechnisch veränderte Hefezelle nach Anspruch 6 ist und die Hefezelle mit Formiat als Kosubstrat kultiviert wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Fermentationsprodukt Succinat oder 1,2-Propandiol ist.
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