CN101218352B - 产油酵母和真菌中类胡萝卜素的产生 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于生产表达类胡萝卜素的经工程设计的产油酵母或真菌的系统。

Description

产油酵母和真菌中类胡萝卜素的产生
相关申请案
本申请案主张2005年3月18日申请的美国临时申请案第60/663,621号的权益，所述申请案的内容是以全文引用的方式并入本文中。 
技术领域
无 
背景技术
类胡萝卜素是由某些有机体(包括光合作用有机体)(例如，植物、藻类、蓝藻)和一些真菌自然产生的有机色素，其颜色在黄色到红色的范围内。类胡萝卜素负责使胡萝卜呈橙色，同时也是导致火烈鸟和鲑鱼呈粉红色和龙虾与小虾呈红色的原因。然而，动物无法产生类胡萝卜素并且必须通过饮食来接收类胡萝卜素。 
工业上将类胡萝卜素色素(例如，β-胡萝卜素和虾青素(astaxanthin))用作食品和饲料原料的成分，从而提供营养功能并增强消费者的可接受性。举例来说，虾青素广泛用于鲑鱼水产养殖业中以使其具有其野生对应物的橙色特征。一些类胡萝卜素还是维生素A的前体。同时，类胡萝卜素具有抗氧化剂特性，并且可具有多种健康益处(例如，参看Jyonouchi等人，Nutr.Cancer 16：93，1991；Giovannucci等人，J.Natl.Cancer Inst.87：1767，1995；Miki，Pure Appl.Chem 63：141，1991；Chew等人，Anticancer Res.19：1849，1999；Wang等人，Antimicrob.Agents Chemother.44：2452，2000)。一些类胡萝卜素(诸如β-胡萝卜素、番茄红素和叶黄素)当前是作为营养补充剂销售。 
一般来说，产生类胡萝卜素的生物系统在工业上极难操作和/或因仅产生低水平的化合物而使工业规模分离无法实行。因此，工业上使用的大多数类胡萝卜素都是通过化学合成制备。故需要经改良的能产生类胡萝卜素的生物系统。先前已对基因工程设计某些细菌或真菌以产生较高水平的类胡萝卜素进行一些尝试(例如，参看Misawa等人，J.Biotechnol.59：169，1998；Visser等人，FEMS Yeast Research 4：221，2003)。然而，仍需要允许以较高产量生产并且更易于分离的经改良系统。 
发明内容
本发明提供用于生物学生产类胡萝卜素的经改良系统。一方面，本发明涵盖在产油 生物体中生产类胡萝卜素是合乎需要的这一发现。不希望受任何特定理论的束缚，本发明提出，如果将类胡萝卜素螯合于脂质体中，那么生物系统就能够积累较高水平的所述化合物。然而，不管绝对水平是否较高，积累于产油生物体脂质体内的类胡萝卜素都可通过脂质体的分离而轻易地分离。 
因此，本发明提供产生一种或一种以上类胡萝卜素的产油真菌(例如，包括酵母或其它单细胞真菌)。本发明还提供构造所述酵母和真菌的方法；使用所述酵母和真菌产生类胡萝卜素的方法；和使用在所述产油酵母或真菌中所产生的类胡萝卜素制备含有类胡萝卜素的组合物(诸如食品或饲料添加剂，或营养补充剂)的方法。具体来说，本发明提供用于产生含有一个或一个以上产油和/或产类胡萝卜素修饰的酵母和真菌的系统和方法，与缺乏所述修饰的其它相同生物体相比，所述修饰使所述生物体的产油能力提高和/或改变其产生类胡萝卜素的能力。 
本发明另外涵盖脂质积累系统可用于产生和/或分离亲脂剂(诸如(但不限于)类异戊二烯或类异戊二烯衍生的化合物)的通用识别。因此，根据本发明，需要工程设计生物体以产生所述亲脂剂和/或积累脂质。 
所属领域技术人员根据包括随附权利要求在内的本发明将对本发明的各个其它方面显而易见。 
定义 
产类胡萝卜素修饰：如本文所使用的术语“产类胡萝卜素修饰”是指如本文所述的对宿主生物体进行的调节一种或一种以上类胡萝卜素的产量的修饰。举例来说，产类胡萝卜素修饰可增加一种或一种以上类胡萝卜素的产量，和/或可改变不同类胡萝卜素的相对产量。大体上，本发明的产类胡萝卜素修饰可为任何化学、生理学、基因或其它修饰，与不经历相同修饰的其它相同生物体中所产生的一种或一种以上类胡萝卜素的水平相比，所述修饰适当地改变宿主生物体中由所述生物体所产生的所述类胡萝卜素的产量。然而，在大部分实施例中，产类胡萝卜素修饰将包含通常引起一种或一种以上所选类胡萝卜素产量增加的基因修饰。在一些实施例中，所选类胡萝卜素为虾青素、β-胡萝卜素、角黄素、叶黄素、番茄红素、八氢番茄红素、玉米黄素和/或玉米黄素或虾青素的变体(例如，糖苷化、酯化玉米黄素或虾青素)中的一种或一种以上。在一些实施例中，所选类胡萝卜素为一种或一种以上叶黄素和/或其变体(例如，糖苷化、酯化叶黄素)。在某些实施例中，所选叶黄素选自由虾青素、叶黄素、玉米黄素、番茄红素和其变体组成的群组。在一些实施例中，所选类胡萝卜素为虾青素、β-胡萝卜素、角黄素、叶黄素、番茄 红素和玉米黄素和/或玉米黄素或虾青素的变体中的一种或一种以上。在一些实施例中，类胡萝卜素为β-胡萝卜素。在一些实施例中，所选类胡萝卜素为虾青素。在一些实施例中，所选类胡萝卜素为除β-胡萝卜素以外的物质。 
产类胡萝卜素多肽：如本文所使用的术语“产类胡萝卜素多肽”是指在细胞中产生类胡萝卜素的过程中所涉及的任何多肽，且其可包括除产生类胡萝卜素的过程外的其它过程中所涉及的多肽，但所述多肽的活性会(例如)通过清除类胡萝卜素生产中直接涉及的类胡萝卜素多肽所利用的底物或反应物而影响一种或一种以上类胡萝卜素的生产程度或产量。产类胡萝卜素多肽包括类异戊二烯生物合成多肽、类胡萝卜素生物合成多肽和类异戊二烯生物合成竞争剂多肽，所述术语已于本文中定义。所述术语还涵盖可能影响脂质体中类胡萝卜素积累的程度的多肽。 
类胡萝卜素：在所属领域中应将术语“类胡萝卜素”理解为是指由类异戊二烯路径中的中间体得到的一类结构不同的色素。类胡萝卜素生物合成中的约定步骤为由香叶基香叶基焦磷酸形成八氢番茄红素。类胡萝卜素可无环或为环状，并且可含或可不含氧，因此术语类胡萝卜素包括胡萝卜素与叶黄素。总的来说，类胡萝卜素为具有在形式上衍生自五碳化合物IPP的共轭多烯碳骨架的碳氢化合物，包括三萜(C30二-阿朴类胡萝卜素(C30 diapocarotenoid))和四萜(C40类胡萝卜素)，以及其氧化衍生物和例如长度为C35、C50、C60、C70、C80或其它长度的其它化合物。许多类胡萝卜素都具有强吸光特性，并且其长度可在超过C200的范围内。C30二-阿朴类胡萝卜素通常是由6个类异戊二烯单元组成，所述类异戊二烯单元是以使类异戊二烯单元的排列在分子中心处倒转从而使两个中心甲基呈1，6位关系而剩余非末端甲基呈1，5位关系的方式连接。在形式上，所述C30类胡萝卜素可通过以下方法从具有具共轭双键的长中心链的无环C30H42结构获得：(i)氢化；(ii)脱氢；(iii)环化；(iv)氧化；(v)酯化/糖基化；或这些方法的任何组合。C40类胡萝卜素通常是由八个类异戊二烯单元组成，所述类异戊二烯单元是以使类异戊二烯单元的排列在分子中心处倒转从而使两个中心甲基呈1，6位关系而剩余非末端甲基呈1，5位关系的方式连接。在形式上，所述C40类胡萝卜素可通过以下方法从具有具共轭双键的长中心链的无环C40H56结构获得：(i)氢化；(ii)脱氢；(iii)环化；(iv)氧化；(v)酯化/糖基化；或这些方法的任何组合。这类C40类胡萝卜素中还包括由碳骨架重排或(形式上)移除部分所述结构而产生的某些化合物。自然界中已鉴别出超过600种不同的类胡萝卜素；某些常见类胡萝卜素已描绘于图1中。类胡萝卜素包括(但不限于)：花黄素、金盏花红素、金盏花黄素、虾青素、角黄素、辣椒红素、β-隐黄素、α-胡萝卜素、 β-胡萝卜素、β，Ψ-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、ε-胡萝卜素、海胆酮、3-羟基海胆酮、3′-羟基海胆酮、γ-胡萝卜素、Ψ-胡萝卜素、4-酮基-γ-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、α-隐黄素、脱氧屈曲黄素、硅藻黄素、7，8-二脱氢虾青素、二脱氢番茄红素、岩藻黄素、岩藻黄醇、异胡萝卜素(isorenieratene)、β-异胡萝卜素、莴苣黄素(lactucaxanthin)、叶黄素、番茄红素、myxobactone、新叶黄素、链孢红素、羟基链孢红素、多甲藻素、八氢番茄红素、玫红品、玫红品糖苷、4-酮基-玉红黄素、管藻黄素、球形烯、球形酮、螺菌黄素、圆酵母素、4-酮基-圆酵母素、3-羟基-4-酮基-圆酵母素、乌利奥利德(uriolide)、乙酸乌利奥利德、紫黄素、玉米黄素-β-二糖苷、玉米黄素和C30类胡萝卜素。此外，类胡萝卜素化合物包括这些分子的衍生物，其可包括羟基-、甲氧基-、氧基-、环氧基-、羧基-或醛式官能团。另外，所包括的类胡萝卜素化合物包括酯(例如，糖苷酯、脂肪酸酯)和硫酸酯衍生物(例如经酯化叶黄素)。 
类胡萝卜素生物合成多肽：术语“类胡萝卜素生物合成多肽”是指一种或一种以上类胡萝卜素的合成过程中所涉及的任何多肽。仅举几例，这些类胡萝卜素生物合成多肽例如包括八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶(或去饱和酶)、番茄红素环化酶、类胡萝卜素酮酶、类胡萝卜素羟化酶、虾青素合酶、类胡萝卜素ε羟化酶、番茄红素环化酶(β和ε亚单位)、类胡萝卜素葡糖基转移酶和酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶。类胡萝卜素生物合成多肽序列的代表性实例提供于表17-25中。 
基因：如本文所使用的术语“基因”一般是指编码多肽的核酸，其视情况包括可影响一种或一种以上基因产物(即，RNA或蛋白质)的表达的某些调控元件。 
异源：如本文所使用的术语“异源”是指基因或多肽，即指并非自然存在于表达基因或多肽的生物体中的所述基因或多肽。应了解，一般来说，当对异源基因或多肽进行选择以将其引入宿主细胞和/或通过宿主细胞表达时，可选择异源基因或多肽的特定原始生物体对于实践本发明并不重要。有关的需要考虑的事项可包括(例如)潜在来源与宿主生物体在进化过程中如何紧密相关；或原始生物体与已进行其它相关多肽序列选择的其它原始生物体的关系如何。 
宿主细胞：如本文所使用的“宿主细胞”为已根据本发明进行处理从而能积累脂质和/或表达一种或一种以上如本文所述的类胡萝卜素的酵母细胞或真菌细胞。如本文所使用的术语“经修饰宿主细胞”为含有根据本发明的至少一种产油修饰和/或至少一种产类胡萝卜素修饰的宿主细胞。 
经分离：如本文所使用的术语“经分离”意谓已将经分离的实体与至少一种先前与 其缔合的组分分开。当已将大部分其它组分移除时，所述经分离实体“经纯化”。分离和/或纯化可使用所属领域已知的任何技术进行，例如包括分馏、萃取、沉淀或其它分离方法。 
类异戊二烯生物合成竞争剂多肽：如本文所使用的术语“类异戊二烯生物合成竞争剂多肽”是指在细胞中的表达会降低进入类胡萝卜素生物合成路径的可用香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的水平的多肽。举例来说，类异戊二烯生物合成竞争剂多肽包括对GGPP之前的类异戊二烯中间体起作用从而产生较少GGPP的酶(例如参看图5)。角鲨烯合酶就为一种根据本发明的类异戊二烯生物合成竞争剂多肽；代表性角鲨烯合酶序列提供于表16中。异戊二烯基二磷酸合酶和对羟基苯甲酸(PHB)聚异戊二烯基转移酶也为根据本发明的其它类异戊二烯生物合成竞争剂多肽；代表性异戊二烯基二磷酸合酶和PHB聚异戊二烯基转移酶多肽分别提供于表29和表30中。 
类异戊二烯生物合成多肽：术语“类异戊二烯生物合成多肽”是指类异戊二烯的合成过程中所涉及的任何多肽。举例来说，如本文所论述，乙酰乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、IPP异构酶、FPP合酶和GGPP合酶为类异戊二烯生物合成的甲羟戊酸路径中所涉及的所有酶。出于本发明的目的，这些蛋白质中的每一种也是类异戊二烯生物合成多肽，并且这些酶的代表性实例的序列提供于表7-15中。 
类异戊二烯路径：在所属领域中应将“类异戊二烯路径”理解为是指产生或利用五碳代谢物焦磷酸异戊酯(IPP)的代谢路径。如本文所论述，有两种不同的路径可产生常见的类异戊二烯前体IPP一“甲羟戊酸路径”和“非甲羟戊酸路径”。术语“类异戊二烯路径”一般足以涵盖这两种类型的路径。由IPP生物合成类异戊二烯是通过若干个五碳异戊二烯亚单位聚合发生。源自IPP的类异戊二烯代谢物具有不同的尺寸和化学结构，包括环状与无环分子。类异戊二烯代谢物包括(但不限于)单萜、倍半萜、二萜、固醇和多萜醇(诸如类胡萝卜素)。 
产油修饰：如本文所使用的术语“产油修饰”是指如本文所述对宿主生物体进行的调节所述宿主生物体的所需产油能力的修饰。在一些情况下，宿主生物体将因具有积累占其细胞干重至少约20％的脂质的能力而为产油生物体。尽管如此，仍然需要根据本发明对此类生物体施行产油修饰，例如以增加(例如，在一些情况下可能降低)其总脂质积累，或调节其所积累的一种或一种以上特定脂质的类型或一种或一种以上特定脂质的量(例如，增加三酰基甘油的相对积累)。在其它情况下，宿主生物体可能为不产油生物 体(但可能含有其它生物体中用于积累脂质的一些酶和调控组分)，并且可能需要根据本发明进行产油修饰以便能够产油。本发明还预期对不产油宿主菌株施行产油修饰，从而使其产油能力增加，甚至即使在经修饰后，其可能也不是如本文所定义的产油生物体。大体上，产油修饰可为任何化学、生理学、基因或其它修饰，与未经历产油修饰的其它相同生物体相比，所述修饰使宿主生物体的产油能力适当地改变。然而，在大部分实施例中，产油修饰将包含通常引起一种或一种以上产油多肽的产量增加和/或活性增强的基因修饰。在一些实施例中，产油修饰包含至少一种化学、生理学、基因或其它修饰；在其它实施例中，所述产油修饰包含一种以上化学、生理学、基因或其它修饰。在利用一种以上修饰的某些方面，所述修饰可包含化学、生理学、基因或其它修饰的任何组合(例如，一种或一种以上基因修饰和化学或生理学修饰)。 
产油多肽：如本文所使用的术语“产油多肽”是指细胞脂质积累过程中所涉及的任何多肽，且其可包括除脂质生物合成外的其它过程中所涉及的多肽，但其活性将(例如)通过清除脂质积累直接涉及的产油多肽所利用的底物或反应物而影响一种或一种以上脂质积累的程度或水平。举例来说，如本文所论述，在其它蛋白质中乙酰辅酶A羧化酶、丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、ATP-柠檬酸裂解酶、苹果酸酶和AMP脱氨酶都涉及于细胞脂质积累中。一般来说，预期降低丙酮酸脱羧酶或异柠檬酸脱氢酶的活性和/或增强乙酰辅酶A羧化酶、ATP-柠檬酸裂解酶、苹果酸酶和/或AMP脱氨酶的活性将促进产油能力。出于本发明的目的，这些蛋白质中的每一种都为产油多肽，且这些酶的代表性实例的序列提供于表1-6中。 
产油：术语“产油”是指生物体积累占其细胞干重至少约20％的脂质的能力。在本发明的某些实施例中，产油酵母或真菌可积累占其细胞干重至少约25％的脂质。在其它实施例中，本发明的产油酵母或真菌可积累占其细胞干重在约20％-45％范围内的脂质。在其它实施例中，产油生物体可积累占其细胞干重多达约70％的脂质。在本发明的一些实施例中，产油生物体可积累占总脂质积累极大分率的三酰基甘油形式的脂质。在某些实施例中，所积累的大部分脂质都为三酰基甘油的形式。另外或其它，所述脂质可以胞内脂质体或油体的形式积累。在某些实施例中，本发明利用自然产油的酵母或真菌。在一些方面，自然产油的生物体可经处理(例如，以基因方式、化学方式或其它方式处理)从而进一步增加生物体中所积累的脂质的水平。在其它实施例中，如本文所述对自然不产油的酵母或真菌进行处理(例如，以基因方式、化学方式或其它方式处理)以积累脂质。出于本发明的目的，红酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)(红法夫酵母(Phaffia rhodozyma))和产朊假丝酵母(Candida utilis)为自然不产油的真菌。 
多肽：如本文所使用的术语“多肽”一般具有其在所属领域中公认的含义，即具有至少三个氨基酸的聚合物。然而，本术语还用于指特殊功能种类的多肽，诸如产油多肽、产类胡萝卜素多肽、类异戊二烯生物合成多肽、类胡萝卜素生物合成多肽和类异戊二烯生物合成竞争剂多肽。就每一所述种类而言，本说明书都提供所述多肽的已知序列的若干实例。然而，所属领域技术人员将理解，预期术语“多肽”一般不仅足以涵盖具有本文所述(或本文特别提及的参考文献或数据库中所述)的完整序列的多肽，而且还涵盖表示所述完整多肽的功能片段(即，保留至少一种活性的片段)的多肽。此外，所属领域技术人员应了解，蛋白质序列一般容许在不破坏活性的情况下存在某种取代。因此，如本文所使用的相关术语“多肽”涵盖任何多肽，其保留活性且与相同种类的另一多肽共有至少约30％-40％，通常大于约50％、60％、70％或80％的整体序列一致性，且另外通常包括至少一个具有更高一致性(通常大于90％)的区域，或甚至在一个或一个以上高度保守的区域中具有95％、96％、97％、98％或99％的一致性(例如，异柠檬酸脱氢酶多肽通常共有保守AMP结合基序；HMG-CoA还原酶多肽通常包括高度保守的催化结构域(例如参看图7)；乙酰辅酶A羧化酶通常具有羧基转移酶结构域；例如参看Downing等人，Chem.Abs.93：484，1980；Gil等人，Cell 41：249，1985；Jitrapakdee等人Curr ProteinPept Sci.4：217，2003；美国专利第5,349,126号，所述参考文献中每一者都是以全文引用的方式并入本文中)，通常涵盖至少3-4个且通常多达20个或更多个氨基酸。 
原始生物体(source organism)：如本文所使用的术语“原始生物体”是指特定多肽序列可发现于自然界的生物体。因此，举例来说，如果在宿主生物体中表达一种或一种以上异源多肽，那么将在自然界中表达所述多肽(和/或最初对其基因进行克隆)的生物体被称为“原始生物体”。如果在宿主生物体中表达一种以上异源多肽，那么可利用一种或一种以上原始生物体来独立选择各异源多肽。应理解，自然含有相关多肽序列的任何生物体和所有生物体都可用作本发明的原始生物体。代表性原始生物体包括(例如)动物、哺乳动物、昆虫、植物、真菌、酵母、藻类、细菌、蓝藻、古细菌和原生动物原始生物体。 
附图说明
图1A-1D描述某些常见类胡萝卜素。 
图2描述足量的乙酰辅酶A和NADPH如何在产油生物体的胞质中积累从而允许产生显著水平的胞质脂质。酶：1，丙酮酸脱氢酶；5，柠檬酸合酶；6，ATP-柠檬酸裂解酶；7，柠檬酸/苹果酸移位酶。 
图3A和3B描述通常在真核生物(包括真菌)中运作的甲羟戊酸类异戊二烯生物合成路径。 
图4描述通常在细菌和植物质体中运作的甲羟戊酸非依赖性类异戊二烯生物合成路径(也称为DXP路径)。 
图5描述类异戊二烯生物合成路径中的中间体和如何将其馈入其它生物分子(包括类胡萝卜素和非类胡萝卜素化合物，诸如固醇、类固醇和诸如维生素E或维生素K的维生素)的生物合成路径中。 
图6A-6D描述各种类胡萝卜素的生物合成路径。图6A突出描述产生各种环状和无环叶黄素的分支路径；图6B绘示产生二环和单环类胡萝卜素(包括虾青素)的某些红酵母(X.dendrorhous)路径；图6C绘示将β-胡萝卜素转化成多种其它类胡萝卜素(包括虾青素)中的任一种的互连路径；图6D描述由链孢红素合成环状类胡萝卜素和常见植物与藻类叶黄素的可能途径。 
图7A-7I绘示某些代表性真菌HMG-CoA还原酶多肽的比对。如所见，这些多肽在催化区内具有极高一致性，且还具有复杂的跨膜结构域。在本发明的一些实施例中，这些跨膜结构域被破坏或移除，使得(例如)极度活跃型式的多肽得以产生。 
图8A-8D描述例证中产生且详细描述的质粒的示意性代表图。 
具体实施方式
如上文所述，本发明涵盖类胡萝卜素可合乎需要地在产油酵母和真菌中产生这一发现。根据本发明，通过处理宿主细胞来产生具有以下特性的菌株(即，菌株包括例如自然存在的菌株、先前已经修饰的菌株等)：(i)积累经常为细胞质油体形式且通常占细胞干重至少约20％的脂质；且(ii)产生占细胞干重至少约1％且在一些实施例中为至少约3％-20％的水平的类胡萝卜素。随后，使用这些经处理的宿主细胞产生类胡萝卜素，从而能够轻易地分离分配到脂质体中的类胡萝卜素。 
一般说来，需要使本发明细胞中的产油能力与类胡萝卜素产量平衡，使得能达成尽可能最低的所需产油水平，从而将能够利用并且转入产物生物合成中的实质上所有的其它碳都转入类胡萝卜素生产路径中。在本发明的一些实施例中，这一战略涉及工程设计产油细胞；在其它实施例中，其涉及工程设计细胞以积累比细胞在缺乏此工程设计的情况下积累的脂质水平高的脂质，尤其细胞质脂质，即使经工程设计的细胞可能无法达到如本文所定义的“产油”时也是如此。在其它实施例中，产油宿主细胞积累脂质的程度实际上已降低，因此剩余的碳可用于类胡萝卜素的生产中。 
宿主细胞 
所属领域技术人员将易于理解，存在自然产油或自然产生类胡萝卜素的各种酵母和真菌菌株。所述菌株中的任一种都可用作本发明的宿主菌株，并且可经工程设计或另外经处理以产生本发明的产油、产类胡萝卜素菌株。或者，也可使用自然不产油也自然不产类胡萝卜素的菌株。此外，甚至当特定菌株具有自然的产油或产生类胡萝卜素的能力时，也可如本文所述对其自然能力进行调节，从而改变脂质和/或类胡萝卜素的产量。在某些实施例中，工程设计或处理菌株将导致对所产生的脂质和/或类胡萝卜素的类型的改变。举例来说，菌株可自然产油和/或产类胡萝卜素，然而，可对菌株进行工程设计或修饰，从而改变所积累的脂质的类型或改变所产生的类胡萝卜素的类型。 
当选择特定酵母或真菌菌株用于本发明中时，一般会需要选择培养特性适于工业规模生产的菌株。举例来说，一般(但通常非必需)需要避免丝状生物体，或对生长条件具有特别罕见或严苛要求的生物体。然而，当应用允许利用丝状生物体的工业规模生产条件时，可将这些丝状生物体选作宿主细胞。在本发明的一些实施例中，当可视情况将宿主细胞直接调配成食品或饲料添加剂，或视需要调配成营养补充剂时，需要利用可食用生物体作为宿主细胞。为便于生产，本发明的一些实施例利用易于以基因方法处理、适于分子遗传学(例如，尤其可经已确立或可用载体有效转化；视情况可例如连续并入和/或整合多个基因；和/或具有已知的基因序列等)、无复杂的生长要求(例如，对光的需求)、嗜温(例如，优选的生长温度在约25℃-32℃的范围内)、能够吸收多种碳源和氮源和/或能够生长到高细胞密度的宿主细胞。另外或其它，本发明的各个实施例将利用生长为单一细胞而非多细胞生物体(例如，菌丝体)的宿主细胞。 
一般来说，当根据本发明需要利用自然产油的生物体时，任何可修饰且可培养的产油生物体都可使用。在本发明的某些实施例中，所使用的酵母或真菌属包括(但不限于)布拉氏霉属(Blakeslea)、假丝酵母属(Candida)、隐球菌属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、毛霉菌属(Mucor)、须霉属(Phycomyces)、腐霉属(Pythium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、毛孢子菌属(Trichosporon)和耶氏酵母属(Yarrowia)。在某些特殊实施例中，所使用的生物体种类包括(但不限于)三孢布拉氏霉(Blakesleatrispora)、铁红假丝酵母(Candida pulcherrima)、C.revkaufi、热带假丝酵母(C.tropicalis)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、刺孢小克银汉霉菌(Cunninghamella echinulata)、 绮丽小克银汉霉(C elegans)、高大毛霉(C.japonica)、斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)、产油油脂酵母(L.lipoferus)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、深黄被孢霉(M.isabellina)、拉曼被孢霉(M.ramanniana)、葡酒色被孢霉(M.vinacea)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、布氏须霉(Phycomyces blakesleanus)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、圆红冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)、瘦弱红酵母(R.gracilis)、牧草红酵母(R.graminis)、粘质红酵母(R.mucilaginosa)、R.pinicola、出芽短梗丝孢酵母(Trichosporon pullans)、皮肤毛孢子菌(T.cutaneum)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。 
在这些自然产油的菌株中，一些菌株也可自然产生类胡萝卜素而一些菌株不能。在大多数情况下，自然存在的产类胡萝卜素、产油酵母或真菌仅产生低水平的类胡萝卜素(占细胞干重小于约0.05％)。有时会产生较高水平的β-胡萝卜素，但一般不会观察到高水平的其它类胡萝卜素。 
总的来说，可将自然产油但不产生类胡萝卜素(例如，产生小于约0.05％细胞干重的类胡萝卜素、不产生所关注的类胡萝卜素)的任何生物体用作本发明的宿主细胞。在一些实施例中，生物体为来自诸如(但不限于)假丝酵母属、隐球菌属、小克银汉霉属、油脂酵母属、被孢霉属、腐霉属、毛孢子属和耶氏酵母属等种属的酵母或真菌；在一些实施例中，所述生物体属于包括(但不限于)高山被孢霉和解脂耶氏酵母种类的生物体。 
相比之下，本发明可将任何自然产油、产类胡萝卜素的生物体用作宿主细胞。一般来说，本发明可用于增加流入自然产生类胡萝卜素的生物体(尤其是除布拉氏霉属和须霉属外的生物体)中的类异戊二烯路径中的碳，和/或将产生一种类胡萝卜素(例如β-胡萝卜素)转变成产生另一种类胡萝卜素(例如虾青素)。根据本发明，引入一种或一种以上产类胡萝卜素修饰(例如，增加一种或一种以上内源性或异源性产类胡萝卜素多肽的表达)可达成这些目标。 
在本发明的某些实施例中，所利用的产油、产类胡萝卜素生物体为例如属于诸如(但不限于)布拉氏霉属、毛霉菌属、须霉属、红冬孢酵母属和红酵母属等种属的酵母或真菌；在一些实施例中，所述生物体属于诸如卷枝毛霉和粘红酵母的种类。 
当需要将自然不产油的菌株用作本发明的宿主细胞时，不产油酵母或真菌属包括(但不限于)曲霉属(Aspergillus)、葡萄孢属(Botrytis)、尾孢属(Cercospora)、镰孢菌属(Fusarium)(赤霉属(Gibberella))、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、毕赤酵母属(Pichia)(汉森氏酵母属(Hansenula))、 柄锈菌属(Puccinia)、酵母菌属(Saccharomyces)、小核菌属(Sclerotium)、木霉属(Trichoderma)和红酵母属(Xanthophyllomyces)(法夫属(Phaffia))；在一些实施例中，所述生物体的种类包括(但不限于)钩巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(A.niger)、土曲霉(A.terreus)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、烟草尾孢(Cercospora nicotianae)、藤仓镰孢霉(Fusarium fujikuroi)(玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae))、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、巴斯得毕赤酵母(Pichia pastoris)、独特锈菌(Puccinia distincta)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和红酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)(红法夫酵母(Phaffia rhodozyma))。 
应理解，如本文所使用的术语“不产油”涵盖自然具有积累脂质、尤其细胞质脂质的某种能力但未积累达到足以成为如本文所定义的“产油”的程度的菌株；和不会自然具有积累额外脂质(例如膜外脂质)的任何能力的菌株。另外应理解，在本发明的一些实施例中，即使经修饰细胞无法成为如本文所述的产油细胞，但其足以增加特定宿主细胞的自然产油水平。 
与自然产油的生物体一样，一些自然不产油的真菌自然产生类胡萝卜素，而其它生物体则不能。可合意地用作本发明的宿主细胞的不会自然产生类胡萝卜素(例如，产生小于约0.05％细胞干重的类胡萝卜素、不产生所关注的类胡萝卜素)的自然不产油真菌属包括(但不限于)曲霉属、克鲁维酵母属、青霉菌属、酵母菌属和毕赤酵母属；种类包括(但不限于)黑曲霉和酿酒酵母。不会自然产生类胡萝卜素且可合意地用作本发明的宿主细胞的自然不产油真菌属包括(但不限于)葡萄孢属、尾孢属、镰孢菌属(赤霉属)、链孢霉属、柄锈菌属、小核菌属、木霉属和红酵母属(法夫属)；种类包括(但不限于)红酵母(红法夫酵母)。 
如上文所论述，可将多种生物体中的任一种用作本发明的宿主细胞。在本发明的某些实施例中，宿主细胞将为解脂耶氏酵母细胞。解脂耶氏酵母的优势例如包括遗传学和分子生物学易处理、基因组序列的可用性(例如参看Sherman等人Nucleic Acids Res.32(Database issue)：D315-8，2004)、对各种节省成本的生长条件的适合性和生长到高细胞密度的能力。此外，解脂耶氏酵母为自然产油生物体，因此可能需要比其它生物体所需的处理少的处理即可产生产油、产类胡萝卜素的解脂耶氏酵母菌株。另外，已对解脂耶氏酵母取得丰富的工业规模生产经验。 
酿酒酵母也特别因为其实验易处理性和研究者已对所述生物体积累丰富经验而成为 本发明的有用宿主细胞。尽管在高碳条件下培养酵母菌可能导致乙醇产量的增加，但这一般可通过方法和/或基因改变来处理。 
其它有用的宿主包括实验上易处理并且自然产类胡萝卜素的红酵母(红法夫酵母)。红酵母(红法夫酵母)菌株可产生若干种类胡萝卜素，包括虾青素。 
黑曲霉和高山被孢霉分别积累大量的柠檬酸和脂肪酸；高山被孢霉还可产油。 
链孢霉属或赤霉属也极为有用。其自然不产油且倾向于产生极少量的类胡萝卜素，因此可能需要根据本发明进行广泛修饰。从实验角度看，认为链孢霉属和赤霉属相对易于处理。这两者都为丝状真菌，因此，由于克服对所述菌株的利用是必需的，故工业规模生产将成为一种挑战。 
卷枝毛霉为另一种可用的有用种类。尽管其分子遗传学比一些其它的生物体不易理解，但由于其自然产生β-胡萝卜素，故可能需要比其它可用种类少的修饰。 
可对布拉氏霉进行分子遗传学修饰，但可能需要大量尝试。另外，由于例如可能需要将两种交配型混合，故节省成本的发酵条件可为一项挑战。须霉属真菌也可能成为有可能引起发酵过程中的挑战的原因，并且这些真菌还可能比若干种其它潜在的宿主生物体不易于处理。 
所属领域技术人员应理解，对用于本发明中的特定宿主细胞的选择还将影响(例如)对将要引入所述细胞的任何异源多肽所利用的表达序列的选择，并且还会影响培养条件的各个方面等。现已对本发明中所利用的不同宿主细胞的不同基因调控要求、蛋白质靶向序列要求和培养要求有所了解(例如参看，关于耶氏酵母属的Barth等人FEMSMicrobiol Rev.19：219，1997；Madzak等人JBiotechnol.109：63，2004；例如参看，关于红酵母属的Verdoes等人Appl Environ Microbiol 69：3728-38，2003；Visser等人FEMSYeast Res 4：221-31，2003；Martinez等人Antonie Van Leeuwenhoek.73(2)：147-53，1998；Kim等人Appl Environ Microbiol.64(5)：1947-9，1998；Wery等人Gene.184(1)：89-97，1997；例如参看，关于酵母菌属的Guthrie和Fink Methods in Emymology194：1-933，1991)。举例来说，在某些方面，可有益地包括宿主细胞的靶向序列(或其密切相关的类似物)以指引异源蛋白质亚细胞定位。因此，可将所述有用的靶向序列加到异源序列中以用于具活性的适当胞内定位。在其它方面(例如，线粒体靶向序列的加入方而)，可去除异源靶向序列或使所选异源序列改变(例如，改变或移除原始生物体植物叶绿体靶向序列)。 
工程设计产油能力 
所有活的生物体都合成脂质以用于其膜和各种其它结构中。然而，大部分生物体都不会积累超过其细胞干重约10％的总脂质，且所述脂质中的大部分一般会保留在细胞膜内。 
已进行大量生物化学工作来定义赋予微生物产油能力所必需的代谢酶(主要是出于工程设计单细胞油作为花生四烯酸和二十二碳六烯酸的工业来源的目的；例如参看Ratledge Biochimie 86：807，2004，所述文献的全部内容都是以引用的方式并入本文中)。尽管在本发明之前，这项生物化学工作相当引人注目，但尚无有关通过基因工程设计编码关键代谢酶的基因已重新建立产油能力的报导。 
应注意，当在碳过量和氮或其它养分有限的条件下生长时，产油生物体通常仅积累脂质。在这些条件下，生物体易于耗尽有限的养分，但持续吸收碳源。“过量”的碳将被引入脂质生物合成中，因此脂质(通常为三酰基甘油)通常以团体的形式积累于胞质中。 
一般说来，普遍认为，为能够产油，生物体需在胞质中产生乙酰辅酶A和NADPH，随后这两种物质可由脂肪酸合酶机器利用而产生脂质。在至少一些产油生物体中，乙酰辅酶A是通过催化以下反应的ATP-柠檬酸裂解酶的作用而产生于胞质中： 
(1)柠檬酸+CoA+ATP→乙酰-CoA+草酰乙酸+ADP+Pi。 
当然，为了使ATP-柠檬酸裂解酶在胞质中产生适量的乙酰辅酶A，其必须首先具有可用的其底物柠檬酸库。柠檬酸是通过三羧酸(TCA)循环而产生于所有真核细胞的线粒体中，且可通过柠檬酸/苹果酸移位酶而移到胞质中(以交换苹果酸)。 
在大多数产油生物体和一些不产油生物体中，在线粒体中作为TCA循环的部分运作的酶异柠檬酸脱氢酶具有强AMP依赖性。因此，当将线粒体中的AMP耗尽时，这种酶将失去活性。当异柠檬酸脱氢酶无活性时，异柠檬酸会积累于线粒体中。随后这一经积累的柠檬酸可能通过顺乌头酸酶的作用而与柠檬酸达到平衡。因此，在低AMP条件下，柠檬酸会积累于线粒体中。如上文所述，可轻易地将线粒体中的柠檬酸转运到胞质中。 
认为在产油生物体中起始导致细胞质柠檬酸积累(且因此乙酰辅酶A积累)的级联的AMP耗尽是因上文所提及的养分耗尽而发生。当使产油细胞在存在过量碳源的情况下而在限制氮或一些其它养分的条件下生长时，将强烈诱导催化以下反应的AMP脱氨酶的活性： 
(2)AMP→肌苷5′-一磷酸+NH3。 
这种酶活性的增加将耗尽胞质与线粒体中的细胞AMP。普遍认为耗尽线粒体中的AMP会使AMP依赖性异柠檬酸脱氢酶失活，从而导致柠檬酸积累于线粒体中，且因此 在胞质中积累。这一系列事件以图解描述于图2中。 
如上文所述，产油能力需要胞质乙酰辅酶A与胞质NADPH。认为在许多产油生物体中，适量的胞质NAPDH是通过苹果酸酶(图2中的酶3)作用而提供。然而，一些产油生物体(例如，油脂酵母属和一些假丝酵母属)中似乎不具有苹果酸酶，因此显然其它酶可提供可比拟的活性，但预期专用的NADPH来源可能为脂肪酸合成所需(例如参看Wynn等人，Microbiol 145：1911，1999；Ratledge Adv.Appl.Microbiol.51：1，2002，所述文献各自是以全文引用的方式并入本文中)。 
因此，根据本发明，可通过修饰胞质乙酰辅酶A和/或NADPH产生中所涉及的一种或一种以上多肽的表达或活性来增强宿主生物体的产油能力。举例来说，根据本发明修饰乙酰辅酶A羧化酶、丙酮酸脱羧酶、异柠檬酸脱氢酶、ATP-柠檬酸裂解酶、苹果酸酶和AMP脱氨酶中一种或一种以上酶的表达或活性可增强产油能力。根据本发明可利用或获得从而增强产油能力的示范性多肽包括(但不限于)那些分别提供于表1、表2、表3、表4、表5和表6中的乙酰辅酶A羧化酶、丙酮酸脱羧酶、异柠檬酸脱氢酶、ATP-柠檬酸裂解酶、苹果酸酶和AMP脱氨酶多肽。 
在本发明的一些实施例中，当使用产油宿主细胞时，与产油能力相关的酶和调控组分已处于适当位置，但可视需要(例如)通过改变一种或一种以上产油多肽的表达或活性和/或通过引入一种或一种以上异源产油多肽来进行修饰。在使用不产油宿主细胞的本发明的那些实施例中，一般预期将引入至少一种或一种以上异源产油多肽。 
本发明不仅涵盖引入异源产油多肽，而且还涵盖调节异源或内源产油多肽的表达或活性水平，包括(例如)改变组成性或可诱导性表达模式。在本发明的一些实施例中，表达模式经调节从而能够无需在限制养分的条件下生长以诱导产油能力。举例来说，可利用包含调控序列(例如，启动子元件、终止子元件)的改变和/或加入的基因修饰，以赋予对表达模式的特定调控。所述基因修饰可与内源基因组合利用(例如，用于调控内源产油多肽)；或者，可包括所述基因修饰从而赋予对至少一种异源多肽(例如，产油多肽)表达的调控。举例来说，包括(但不限于)Tef1、Gpd1启动子在内的启动子可与内源基因和/或异源基因组合使用以用于修饰内源产油多肽和/或异源产油多肽的表达模式。类似地，示范性终止子序列包括(但不限于)使用解脂耶氏酵母XPR2终止子序列。 
在一些实施例中，将至少一种产油多肽引入宿主细胞中。在本发明的一些实施例中，将多种(例如两种或两种以上)不同的产油多肽引入相同的宿主细胞中。在一些实施例中，多种产油多肽含有来自相同原始生物体的多肽；在其它实施例中，多种多肽包括独 立地选自不同原始生物体的多肽。 
根据本发明可引入宿主细胞中或在宿主细胞中进行修饰的各种产油多肽的代表性实例包括(但不限于)提供于表1-6中的那些多肽。如上文所述，预期这些多肽中至少一些(例如，苹果酸酶和ATP-柠檬酸裂解酶)应合意地协调作用，且可能与一种或一种以上脂肪酸合酶组分一起作用，因此，在本发明的一些实施例中，将需要利用两种或两种以上来自相同原始生物体的产油多肽。 
总的说来，用于本发明中的产油多肽的原始生物体包括(但不限于)布拉氏霉、假丝酵母属、隐球菌属、小克银汉霉属、油脂酵母属、被孢霉属、毛霉菌属、须霉属、腐霉属、红冬孢酵母属、红酵母属、毛孢子菌属、耶氏酵母、曲霉、葡萄孢属、尾孢属、镰孢菌属(赤霉属)、克鲁维酵母属、链孢霉属、青霉属、毕赤酵母属(汉森氏酵母属)、柄锈菌属、酵母菌属、小核菌属、木霉属和红酵母属(法夫属)。在一些实施例中，乙酰辅酶A羧化酶、ATP-柠檬酸裂解酶、苹果酸酶和/或AMP脱氨酶多肽的原始物种包括(但不限于)钩巢曲霉、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、藤仓镰孢霉、乳酸克鲁维酵母、粗糙链孢霉、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)和解脂耶氏酵母；在一些实施例中，丙酮酸脱羧酶或异柠檬酸脱氢酶多肽的原始物种包括(但不限于)粗糙链孢霉、红酵母属红酵母(红法夫酵母)、黑曲霉、酿酒酵母、卷枝毛霉、粘红酵母、产朊假丝酵母、高山被孢霉和解脂耶氏酵母。 
工程设计类胡萝卜素的产生 
类胡萝卜素是由类异戊二烯前体合成，所述前体中有一部分还涉及在类固醇和固醇的生产中。大部分常见类异戊二烯生物合成路径(有时称为“甲羟戊酸路径”)大致描述于图3中。如图所示，乙酰辅酶A经由羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)而转化成甲羟戊酸。随后将甲羟戊酸磷酸化且转化成五碳化合物异戊烯基焦磷酸(IPP)。使IPP异构化为二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)后，与额外的IPP分子进行的三个连续缩合反应将产生十碳分子香叶基焦磷酸(GPP)，随后产生十五碳分子法尼基焦磷酸(FPP)且最终产生二十碳化合物香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)。 
经一些生物体(尤其细菌)利用且有时称为“甲羟戊酸非依赖性路径”的可选类异戊二烯生物合成路径描述于图4中。这一路径是由从丙酮酸和甘油醛-3-磷酸合成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DOXP)起始。随后DOXP经由图4中所示的一系列反应而转化成IPP，其异构化成为DMAPP且随后经由GPP和FPP而转化成如图3所示且如上文所论述的GGPP。 
已对多种生物体中类异戊二烯生物合成中所涉及的各种蛋白质进行鉴别并对其特性进行描述。此外，类异戊二烯生物合成路径中的各个方面在真菌、细菌、植物和动物王国中始终保守。举例来说，已对多种生物体和细胞中与图3中所示的乙酰乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、IPP异构酶、FPP合酶和GGPP合酶对应的多肽进行鉴别，并且将其从所述生物体和细胞中分离。多种所述多肽的代表性实例提供于表7-15中。可利用或获得一种或一种以上选自表7-15中任一表所提供的多肽的多肽以用于本发明的方法和组合物中。 
根据本发明，可通过修饰类异戊二烯生物合成过程中所涉及的一种或一种以上蛋白质的表达或活性来调节宿主生物体中类胡萝卜素的产量。在一些实施例中，所述修饰涉及将一种或一种以上异源类异戊二烯生物合成多肽引入宿主细胞中；另外或其它，可对一种或一种以上内源或异源类异戊二烯生物合成多肽的表达或活性进行修饰。考虑到类异戊二烯生物合成多肽组分的可观保守性，预期异源类异戊二烯生物合成多肽甚至在显著差异的生物体中通常也会起作用。此外，引入一种以上异源类异戊二烯生物合成多肽应为合乎需要的，在许多情况中，来自不同原始生物体的多肽将一起起作用。在本发明的一些实施例中，将多种不同的异源类异戊二烯生物合成多肽引入相同的宿主细胞中。在一些实施例中，所述多种多肽仅含有来自相同原始生物体的多肽(例如，相同原始生物体的两种或两种以上序列或源自相同生物体的序列)；在其它实施例中，所述多种多肽包括独立地选自来自不同原始生物体的多肽的多肽(例如，至少两种独立原始生物体的两种或两种以上序列，或源自至少两种独立原始生物体的序列)。 
在利用异源类异戊二烯生物合成多肽的本发明的一些实施例中，原始生物体包括(但不限于)布拉氏霉属、假丝酵母属、隐球菌属、小克银汉霉属、油脂酵母属、被孢霉属、毛霉菌属、须霉属、腐霉属、红冬孢酵母属、红酵母属、毛孢子菌属、耶氏酵母、曲霉属、葡萄孢属、尾孢属、镰孢菌属(赤霉属)、克鲁维酵母属、链孢霉属、青霉属、毕赤酵母属(汉森氏酵母属)、柄锈菌属、酵母菌属、裂殖酵母菌属、小核菌属、木霉属、黑粉菌属和红酵母属(法夫属)的真菌。在某些实施例中，原始生物体属于以下种类，包括(但不限于)新型隐球菌、藤仓镰孢霉、乳酸克鲁维酵母、粗糙链孢霉、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、玉米黑粉菌和解脂耶氏酵母。 
如上文所述，类异戊二烯生物合成路径中还涉及非类胡萝卜素化合物的生产，诸如固醇、类固醇和维生素(诸如维生素E或维生素K)。因此对类异戊二烯生物合成路径中 的中间体起作用并且将其转入非类胡萝卜素化合物的生物合成中的蛋白质为类胡萝卜素生物合成的间接抑制剂(例如参看图5，其说明将类异戊二烯中间体引导到其它生物合成路径中的点)。因此，认为所述蛋白质为类异戊二烯生物合成竞争剂多肽。预期降低所述类异戊二烯生物合成竞争剂多肽的水平或活性将使根据本发明的宿主细胞中类胡萝卜素的产量增加。 
在本发明的一些实施例中，可降低或去除宿主细胞中内源类异戊二烯生物合成竞争剂多肽的产量或活性。在一些实施例中，可通过用麦角固醇生物合成路径中的小分子酶抑制剂处理宿主生物体来达成所述类异戊二烯生物合成竞争剂多肽活性的降低或去除。麦角固醇生物合成路径中的酶例如包括角鲨烯合酶、角鲨烯环氧酶、2，3-氧代角鲨烯-羊毛固醇环化酶、细胞色素P450羊毛固醇14α-脱甲基酶、C-14固醇还原酶、C-4固醇甲基氧化酶、SAM：C-24固醇甲基转移酶、C-8固醇异构酶、C-5固醇去饱和酶、C-22固醇去饱和酶和C-24固醇还原酶。认为这些酶中的每一种都为类异戊二烯生物合成竞争剂多肽。还可认为这些酶的调控剂为类异戊二烯生物合成竞争剂多肽(例如，酵母蛋白Sut1(Genebank寄存编号JC4374 GI：2133159)和Mot3(Genebank寄存编号NP_013786GI：6323715))，其可具有或可不具有其它生物体中的同系物。 
在其它实施例中，可通过降低泛醌生物合成路径的活性来达成类异戊二烯生物合成竞争剂多肽活性的降低或去除。泛醌生物合成中的约定步骤为由哺乳动物中的酪氨酸或苯丙氨酸或细菌中的分支酸形成对羟基苯甲酸(PHB)，随后使PHB与异戊二烯前体缩合，导致异戊二烯基的加成。这一反应是由PHB-聚异戊二烯基转移酶催化。泛醌的类异戊二烯侧链是由异戊二烯基二磷酸合酶确定。由PHB与十异戊二烯基二磷酸的缩合反应产生的3-十异戊二烯基-4-羟基苯甲酸将经历其它修饰(其包括羟基化、甲基化和脱羧)，以便形成泛醌(CoQ10)。因此，抑制导致法尼基焦磷酸成为扩展类异戊二烯的异戊二烯基二磷酸合酶或抑制PHB聚异戊二烯基转移酶可用于增加类胡萝卜素生物合成中可用类异戊二烯的量。(异戊二烯基二磷酸合酶和PHB-聚异戊二烯基转移酶的实例分别描述于表29和30中)。 
已知的类异戊二烯生物合成竞争剂酶的小分子抑制剂包括(但不限于)萨拉哥酸(zaragosic acid)(包括其类似物，诸如TAN1607A(Biochem Biophys Res Commun 1996年2月15日，219(2)：515-520))、RPR 107393(3-羟基-3-[4-(喹啉-6-基)苯基]-1-氮杂双环[2-2-2]辛烷二盐酸盐；J Pharmacol Exp Ther.1997年5月，281(2)：746-52)、ER-28448(5-{N-[2-丁烯基-3-(2-甲氧基苯基)]-N-甲基氨基}-1，1-亚戊基双(膦酸)三钠盐；Journal of Lipid Research，第41卷，1136-1144，2000年7月)、BMS-188494(The Journal of ClinicalPharmacology，1998；38：1116-1121)、TAK-475(1-[2-[(3R，5S)-1-(3-乙酰氧基-2，2-二甲基丙基)-7-氯-1，2，3，5-四氢-2-氧代-5-(2，3-二甲氧基苯基)-4，1-苯并氮杂卓-3-基]乙酰基]哌啶-4-乙酸；Eur J Pharmacol 2003年4月11日；466(1-2)：155-61)、YM-53601((E)-2-[2-氟-2-(亚喹咛环-3-基)乙氧基]-9H-咔唑单盐酸盐；Br J Pharmacol.2000年9月；131(1)：63-70)或抑制角鲨烯合酶的角鲨抑素I(squalestatin I)、抑制角鲨烯环氧酶的特比萘芬(terbinafine)、抑制细胞色素P450羊毛固醇14α-脱甲基酶的各种唑类和抑制C-14固醇还原酶和C-8固醇异构酶的芬普福(fenpropimorph)。在其它实施例中，可利用异源类异戊二烯生物合成竞争剂多肽(无论功能性或非功能性多肽；在一些实施例中，可使用显性阴性突变体)。 
一种可用于本发明中的特殊类异戊二烯生物合成竞争剂多肽为已从多种生物体中鉴别出来并予以表征的角鲨烯合酶；表16中包括角鲨烯合酶多肽序列的代表性实例。在利用角鲨烯合酶(或角鲨烯合酶的变体)的本发明的一些实施例中，原始生物体包括(但不限于)粗糙链孢霉、红酵母(红法夫酵母)、黑曲霉、酿酒酵母、卷枝毛霉、粘红酵母、产朊假丝酵母、高山被孢霉和解脂耶氏酵母。 
类胡萝卜素生物合成路径从形成GGPP点处与类异戊二烯生物合成路径分开。类胡萝卜素生物合成中的约定步骤为通过由八氢番茄红素合酶(通常称为crtB，参看图6)催化的两个GGPP分子头-头缩合来形成八氢番茄红素。经一系列各自使共轭双键的数量增加2个的脱氢反应将八氢番茄红素经由链孢红素转化成番茄红素。所述路径可在产生番茄红素之前和之后的多个点处分叉，因此可产生多种类胡萝卜素。举例来说，环化酶对番茄红素起作用将产生γ-胡萝卜素；而以去饱和酶对番茄红素起作用将产生3，4-二脱氢番茄红素。γ-胡萝卜素是通过环化酶作用而转化成β-胡萝卜素。β-胡萝卜素可经加工成多种产物中的任一种(例如参看图6C)，包括虾青素(经由海胆酮、羟基海胆酮和芬尼黄质(phoenicoxanthin))。 
根据本发明，可通过修饰类胡萝卜素生物合成中所涉及的一种或一种以上蛋白质的表达或活性来调节宿主生物体中类胡萝卜素的产量。如所述，在一些实施例中，需要将自然产生一种或一种以上类胡萝卜素的生物体用作宿主细胞。在一些其它情况中，关注的焦点将为(例如)通过增加自然产生的类胡萝卜素的合成中所涉及的一种或一种蛋白质的水平和/或活性，和/或通过降低竞争性生物合成路径中所涉及的一种或一种以上蛋白质的水平或活性来增加所述类胡萝卜素的产量。另外或其它，在一些实施例中，将需要产生一种或一种以上并非宿主细胞自然产生的类胡萝卜素的产量。 
根据本发明的一些实施例，将需要将一种或一种以上异源产类胡萝卜素多肽引入宿主细胞中。如所属领域技术人员显而易见，可使用多种异源多肽中的任一种；例如将考虑选择产量有待增强的特定类胡萝卜素。本发明不仅涵盖引入异源产类胡萝卜素多肽，而且还涵盖调节异源或内源产类胡萝卜素多肽的表达或活性，例如包括改变组成性或可诱导性表达模式。在本发明的一些实施例中，表达模式经调节，从而能够无需在限制养分的条件下生长以诱导产油能力。举例来说，可利用包含调控序列(例如，启动子元件、终止子元件)的改变和/或加入的基因修饰，以赋予对表达模式的特定调控。所述基因修饰可与内源基因组合利用(例如，用于调控内源产类胡萝卜素多肽)；或者，可包括所述基因修饰从而赋予对至少一种异源多肽(例如，产类胡萝卜素多肽)的表达的调控。举例来说，包括(但不限于)Tef1、Gpd1启动子在内的启动子可与内源基因和/或异源基因组合使用以用于修饰内源产类胡萝卜素多肽和/或异源产类胡萝卜素多肽的表达模式。类似地，示范性终止子序列包括(但不限于)使用解脂耶氏酵母XPR2终止子序列。 
如图6和文献中所述，类胡萝卜素生物合成中所涉及的蛋白质包括(但不限于)八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素环化酶、类胡萝卜素酮酶、类胡萝卜素羟化酶、虾青素合酶(见于一些原始生物体中的单一多功能酶，通常具有酮酶与羟化酶活性)、类胡萝卜素ε羟化酶、番茄红素环化酶(β和ε亚单位)、类胡萝卜素葡糖基转移酶和酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶。这些类胡萝卜素生物合成多肽的代表性实例序列提供于表17-25中。 
由于叶黄素的环状端基上存在含氧官能团，故可将其与其它类胡萝卜素相区别。举例来说，叶黄素和玉米黄素在其每一末端环结构上都含有单一羟基，而虾青素在每一末端环上都含有酮基与羟基。这一特性使得叶黄素的极性比胡萝卜素(诸如β-胡萝卜素和番茄红素)的极性强，且因此使其在脂肪和脂质中的溶解性显著降低。已发现自然存在的叶黄素通常是呈末端羟基酯(即脂肪酸单酯和二酯)的形式。在某些种类的细菌中，其还作为糖苷存在。通过加入酯部分可极大地改变叶黄素的溶解性和可分散性，且已知酯化也可影响指定类胡萝卜素的可吸收性和/或生物可用性。本发明的目的在于使积累于产油酵母的胞内三酰基甘油酯部分内的特定叶黄素的量最大化，且达成这一目标的一个机制为增加所积累的叶黄素产物的疏水性。一种达成这一目的的方式是对目标叶黄素化合物的脂肪酰基单酯和/或二酯的产生进行工程设计。 
多种酶可起到酯化类胡萝卜素的作用。举例来说，已在若干种细菌种类中鉴别出类胡萝卜素葡糖基转移酶(例如参看表24)。此外，在三酰基甘油生物合成的最后步骤中 起作用的酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)和酰基辅酶A：单酰基甘油酰基转移酶(MGAT)很可能在叶黄素酯化反应中起到额外作用。代表性DGAT多肽展示于表25中。此外，其它酶可对类胡萝卜素和具有类似结构的分子(例如固醇)进行特异性修饰并且可用于修饰和酯生产中。 
在本发明的一些实施例中，类胡萝卜素生物合成多肽的潜在原始生物体包括(但不限于)自然产类胡萝卜素的自然产油或不产油真菌属。这些真菌属包括(但不限于)葡萄孢属、尾孢属、镰孢菌属(赤霉属)、毛霉菌属、链孢霉属、须霉属、柄锈菌属、红酵母属、小核菌属、木霉属和红酵母属。示范性种类包括(但不限于)粗糙链孢霉、红酵母(红法夫酵母)、卷枝毛霉和粘红酵母。当然，类胡萝卜素是由多种不同的生物体产生，诸如植物、藻类、酵母、真菌、细菌、蓝藻等。任何所述生物体都可为本发明的类胡萝卜素生物合成多肽的原始生物体。 
应理解，根据本发明对宿主细胞所作的特定产类胡萝卜素修饰将受需要产生何种类胡萝卜素影响。举例来说，类异戊二烯生物合成多肽与大多数类胡萝卜素的生产相关。类胡萝卜素生物合成多肽也广泛相关。酮酶尤其与角黄素的生产相关，而羟化酶与叶黄素和玉米黄素的生产相关。羟化酶与酮酶(或虾青素合酶)尤其可用于生产虾青素。 
类胡萝卜素的产生和分离 
如上文所论述，脂质体在产油生物体中的积累一般是通过在存在过量碳源和有限氮源的情况下生长相应生物体来诱导。先前已针对多种不同的产油生物体确立用于诱导所述积累的特定条件(例如参看Wolf(编)Nonconventional yeasts in biotechnology第1卷，Springer-Verlag，Berlin，Germany，第313-338页；Lipids 18(9)：623，1983；Indian J.Exp.Biol.35(3)：313，1997；J.Ind.Microbiol.Biotechnol.30(1)：75，2003；Bioresour Technol.95(3)：287，2004，各所述文献都是以全文引用的方式并入本文中)。 
一般来说，在允许积累占细胞干重至少约20％的脂质的条件下培育本发明的经修饰宿主细胞将是合乎人意的。在其它实施例中，本发明的经修饰宿主细胞是在允许积累占其细胞干重至少约15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或甚至80％或更多脂质的条件下生长。在某些实施例中，所利用的宿主细胞为自然产油且经诱导以产生所需水平的脂质的细胞。在其它实施例中，宿主细胞为自然产生脂质但已经工程设计以增加脂质产量从而产生所需含量的脂质且达成积累的细胞。 
在一些实施例中，本发明的宿主细胞并非自然产油的细胞，但已经工程设计以产生 脂质从而能获得所需水平的脂质产生。所属领域技术人员将理解，一般说来，有效诱导原始生物体中脂质积累的生长条件也可能对于诱导已引入原始生物体的产油多肽的宿主细胞中脂质的积累有用。当然，根据宿主细胞的特征，可能需要进行修饰，所述修饰是在所属领域技术人员的技术范围内。 
所属领域技术人员还应理解，一般需要确保本发明的经修饰宿主细胞产生所需类胡萝卜素是在与诱导产油能力从而使类胡萝卜素积累于脂质体中相关的适当时间时发生。在一些实施例中，需要诱导不会自然产生类胡萝卜素的宿主细胞中产生类胡萝卜素，从而产生可检测水平的类胡萝卜素。在某些方面，不会自然产生某种(某些)类胡萝卜素的宿主细胞能够产生其它类胡萝卜素(例如，某些宿主细胞可自然产生β-胡萝卜素，但可能不会自然产生虾青素)；在其它方面，所述宿主细胞不会自然产生任何类胡萝卜素。在其它实施例中，将需要增加自然产生低水平类胡萝卜素的宿主细胞中类胡萝卜素的产量，从而使所述类胡萝卜素的可检测水平增加。在某些方面，自然产生类胡萝卜素(例如，β-胡萝卜素)的宿主细胞还产生其它类胡萝卜素(例如，虾青素)；在其它方面，自然产生类胡萝卜素(例如β-胡萝卜素)的细胞不产生其它类胡萝卜素。 
在本发明的某些实施例中，将需要积累占细胞干重大于至少约1％的水平的类胡萝卜素(即，考虑所有所产生的类胡萝卜素的总量)。在一些实施例中，积累于脂质体中的总类胡萝卜素将达到占其总细胞干重至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％或更高的水平。在本发明的某些实施例中，将需要实现占细胞干重大于至少约1％的脂质体中类胡萝卜素积累的总含量(即，考虑所有所产生的类胡萝卜素的总量)。在一些实施例中，积累于脂质体中的总类胡萝卜素将达到占其总细胞干重至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％或更高的水平。 
已证实，细菌产类胡萝卜素基因可转移到其它生物体中，且因此尤其适用于本发明中(例如参看Miura等人，Appl.Environ.Microbiol.64：1226，1998)。在其它实施例中，可能需要利用来自其它原始生物体的基因，诸如植物、藻类或微藻类；这些生物体将提供酮酶和羟化酶多肽的多个潜在来源。其它有用的原始生物体包括多肽的真菌、酵母、昆虫、原生动物和哺乳动物来源。 
在某些实施例中，卷枝毛霉多功能八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶和粗糙链孢霉八氢番茄红素脱氢酶基因都可在解脂耶氏酵母中表达。随后，粗糙链孢霉羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的催化结构域的过度表达，和/或用角鲨烯合酶抑制剂萨拉哥酸处理经修饰的解脂耶氏酵母菌株将进一步增加类胡萝卜素的产量。最后，编码类胡萝卜素羟化酶和类胡萝卜素酮酶的副球菌(Paracoccus marcusii)基因将在解脂耶氏酵母产β-胡萝卜素菌株中表达，且这一修饰将导致虾青素的积累。可在能采用的其它产油或不产油宿主生物体中使用利用相同的同源或功能类似的产类胡萝卜素多肽进行的增强类胡萝卜素生产的类似方法。 
应注意，对于产生一种以上类胡萝卜素的本发明的生物体来说，通过调节生长条件来调节所产生的个别类胡萝卜素的相对量有时是可能的。举例来说，据报导，控制培养期间培养物中的溶解氧浓度可调控某些类胡萝卜素(例如β-胡萝卜素、海胆酮、β-隐黄素、3-羟基海胆酮、asteroidenone、角黄素、玉米黄素、金盏花红素、金盏花黄素和虾青素)的相对产量(例如参看Tsubokura等人的美国专利第6,825,002号，所述专利的完整内容是以引用的方式并入本文中)。 
尤其在针对虾青素生产的本发明的实施例中，通常将需要利用一个或一个以上来自自然产虾青素生物体的基因。但当拟表达多种异源多肽时，可能需要利用相同的原始生物体或利用密切相关的原始生物体。 
本发明所提供的一个优势在于，除允许产生高水平的类胡萝卜素外，由于所产生的化合物积累于产油生物体内的脂质体中，故本发明还使这些所产生的化合物易于分离。已于多种产油生物体中确立分离脂质体的方法和系统(例如参看美国专利第5,164,308号、第5,374,657号、第5,422,247号、第5,550,156号、第5,583,019号、第6,166,231号、第6,541,049号、第6,727,373号、第6,750,048号和第6,812,001号，所述专利中每一者都是以全文引用的方式并入本文中)。简单来说，经常通过喷雾干燥、过滤或离心从培养物中回收细胞。在一些情况下，将细胞均质化且随后使其经历超临界液体萃取或溶剂萃取(例如，用诸如氯仿、己烷、二氯甲烷、甲醇、异丙醇、乙酸乙酯等溶剂)，得到粗油性悬浮液。如所属领域所知，可视情况将所述油性悬浮液加以精制。经精制的油状物可直接用作饲料或食品添加剂。另外或其它，可使用常规技术从油状物中分离出类胡萝卜素。 
考虑到类胡萝卜素一般对氧化反应敏感，故本发明的许多实施例中都在类胡萝卜素分离过程中和/或分离之后使用氧化稳定剂(例如，生育酚、维生素C、促长啉(ethoxyquin)、 维生素E、BHT、BHA、TBHQ等或其组合)。另外或其它，可使用例如以蛋白质微胶囊化以增加氧化的实体障壁和/或改进处理(例如参看美国专利申请案2004/0191365)。 
用途 
根据本发明产生的类胡萝卜素可用于多种应用中的任一种中，例如开发其生物或营养特性(例如，抗氧化剂、抗增生等)和/或其色素特性。举例来说，根据本发明，类胡萝卜素可用于药物(例如参看，Bertram，Nutr.Rev.57：182，1999；Singh等人，Oncology12：1643，1998；Rock，Pharmacol.Ther.75：185，1997；Edge等人，J.Photochem Photobiol41：189，1997；美国专利申请案2004/0116514；美国专利申请案2004/0259959)、食品补充剂(例如参看，Koyama等人，J.Photochem Photobiol 9：265，1991；Bauernfeind，Carotenoids as colorants and vitamin A precursors，Academic Press，NY，1981；美国专利申请案2004/0115309；美国专利申请案2004/0234579)、电光应用、动物饲料添加剂(例如参看，Krinski，Pure Appl.Chem.66：1003，1994；Polazza等人，Meth.Enzymol.213：403，1992)、化妆品(作为抗氧化剂和/或作为化妆品，包括芳香剂；例如参看美国专利申请案2004/0127554)等中。根据本发明产生的类胡萝卜素还可用作制备其它化合物(例如类固醇等)的中间体。 
举例来说，虾青素和/或其酯可用于多种医药应用和健康食品中，包括治疗发炎性疾病、哮喘、异位性皮炎、敏感症、多发性骨髓瘤、动脉硬化症、心血管疾病、肝病、脑血管疾病、血栓症、血管生成相关疾病(包括癌症、风湿病、糖尿病视网膜病变、黄斑变性和脑部病症)、高脂质血症、肾缺血、糖尿病、高血压、肿瘤增生和转移和代谢病症。此外，类胡萝卜素和虾青素可用于预防和治疗疲劳、改善由发炎性疾病引起的肾病的肾功能并且预防和治疗其它与生活习惯相关的疾病。另外，已发现虾青素作为各个生物学过程的抑制剂的作用，包括白细胞介素抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、磷酸酯酶A2抑制剂、环氧化酶-2抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、毛细管内皮细胞增生抑制剂、脂肪氧化酶抑制剂。例如参看，20060126公开的日本公开案第2006022121号(20051017申请的JP申请案第2005-301156号)、20060119公开的日本公开案第2006016408号(20051017申请的JP申请案第2005-301155号)、20060119公开的日本公开案第2006016409号(20051017申请的JP申请案第2005-301157号)、20060119公开的日本公开案第2006016407号(20051017申请的JP申请案第2005-301153号)、20060112公开的日本公开案第2006008717号(20051017申请的JP申请案第2005-301151号)、20060112公开的日本公开案第2006008716号(20051017申请的JP申请案第2005-301150号)、20060112 公开的日本公开案第2006008720号(20051017申请的JP申请案第2005-301158号)、20060112公开的日本公开案第2006008719号(20051017申请的JP申请案第2005-301154号)、20060112公开的日本公开案第2006008718号(20051017申请的JP申请案第2005-301152号)、20060112公开的日本公开案第2006008713号(20051017申请的JP申请案第2005-301147号)、20060112公开的日本公开案第2006008715号(20051017申请的JP申请案第2005-301149号)、20060112公开的日本公开案第2006008714号(20051017申请的JP申请案第2005-301148号)、20060112公开的日本公开案第2006008712号(20051017申请的JP申请案第2005-301146号)。 
应理解，在本发明的一些实施例中，将由如本文所述的经处理宿主细胞产生的类胡萝卜素并入上下文中的宿主细胞的终产物(例如，食品或饲料补充剂、药物、化妆品、含染料物品等)中。举例来说，可将宿主细胞冻干、冷冻干燥、冷冻或以其它方式灭活，且随后可将全细胞并入终产物中或用作终产物。也可在并入所述产物中之前对宿主细胞进行处理(例如经由溶解)以增加生物可用性。另外或其它，终产物中可仅并入一部分从全细胞中分离的宿主细胞(例如，按尺寸、溶解性分离)。举例来说，在本发明一些实施例中，将脂质小滴从宿主细胞中分离，并且将其并入终产物中或用作终产物。在其它实施例中，分离类胡萝卜素本身或个别类胡萝卜素化合物并且将其再调配成终产物。 
如上文所述，脂肪酸和糖苷酯为自然界中可见的主要类胡萝卜素酯，但可合成其它酯(例如，用有机酸或无机磷酸)以产生有用的产物形式。对于传递而言，也可将类胡萝卜素酯调配成酯盐的形式(例如参看，美国专利公开案第20050096477号)。 
并入指定产物中的类胡萝卜素的量可视产物和所涉及的特定类胡萝卜素而显著变化。剂量可例如在小于0.01重量％到大于1重量％、10重量％、20重量％、30重量％或更多产物的范围内；在一些情况下，所述类胡萝卜素可包含100％产物。 
在本发明的一些实施例中，将一种或一种以上所产生的类胡萝卜素并入食品或饲料(例如，食品补充剂)组分中。根据本发明，对可并入类胡萝卜素的食品的类型并未特别限制，且其包括饮料，诸如茶、果汁和酒；甜食，诸如果子冻和饼干；含脂肪食品和饮料，诸如奶制品；加工食品，诸如米和软米(或粥)；婴儿配方等。在本发明这一方面的一些实施例中，由于类胡萝卜素可促进并入某些含脂肪食品中，故在可食用脂质体内并入所述类胡萝卜素可为有益的。 
可并入本发明所产生的类胡萝卜素的饲料的实例(例如)包括宠物食品，诸如猫食、狗食等；观赏鱼、养殖鱼或甲壳动物等的饲料；农场动物(包括家畜且另外包括水产养 殖业中喂养的鱼或甲壳动物)的饲料。可并入本发明所产生的类胡萝卜素的食品或饲料物质优选可合乎作为预定接受者的生物体的口味。这一食品或饲料物质可具有当前对食品物质已知的任何物理特性(例如，固体、液体、软)。 
在本发明的一些实施例中，可将一种或一种以上所产生的类胡萝卜素并入化妆品中。所述化妆品的实例(例如)包括护肤品(例如，洗液、乳液、面霜等)、唇膏、防晒化妆品、化妆品、香水、日用品(例如，牙膏、漱口水、防口臭试剂、固体肥皂、液体肥皂、洗发精、护理液)等。 
在一些实施例中，将一种或一种以上所产生的类胡萝卜素并入药物中。所述药物的实例(例如)包括各类片剂、胶囊、饮用剂、锭剂、漱口剂等。在一些实施例中，所述药物适于局部应用。并未对剂型作特别限制，且其包括胶囊、油、颗粒剂、浓缩细粒(granulasubtilae)、冻干粉(pulveres)、片剂、丸剂、锭剂等。由于油和充油胶囊在制造过程中无成分分解，且由于易于将本发明的含类胡萝卜素脂质小滴并入油基调配物中，故其可提供额外优势。 
可根据所属领域中已确立的技术(例如包括如美国药典(United StatesPharmacopoeia)中所述的常用程序)制备本发明的药物。 
可将根据本发明产生的类胡萝卜素并入任何含色素的产品(例如包括织物、油漆等)中。还可将其并入作为环境指示剂的产品中，或用作检测剂的诸如生物感应器的仪器中。 
例证：
下表26描述以下例证中所使用的解脂耶氏酵母菌株： 
表26：解脂耶氏酵母菌株 
 NRRLY-1095 野生型二倍体  
 ATCC76861 MATB ura2-21 lyc1-5 LYS1-5B  
 ATCC76982 MATB ade1 leu2-35 lyc1-5 xpr2  
 ATCC201249 MATA ura3-302 leu2-270 lys8-11PEX17-HA  
 MF346 MATA ura2-21 ATCC76861×ATCC201249
 MF350 MATB ura2-21 leu2-35 ade1 ATCC76982×MF346
(LYC1、LYS1、XPR2和PEX17的基因型未经交叉确定，也未关于ATCC菌株进行验证。) 
本文所述的所有基础分子生物学和DNA操作程序一般是根据Sambrook等人或Ausubel等人所述进行(Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T(编).1989.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press：New York；Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，Moore DD，Seidman JG，Smith JA，Struhl K(编).1998.Current Protocols inMolecular Biology.Wiley：New York)。 
实例1：产生用于构造类胡萝卜素菌株的质粒
产生用于构造产类胡萝卜素菌株的质粒。以下部分将描述编码产类胡萝卜素多肽的质粒的产生。这些研究中所使用的质粒和有关其构造的细节描述于表27中。其它质粒构造细节和对其用途的描述可见于相关章节的内容中。除非另作说明，否则所有PCR扩增都使用NRRL Y-1095基因组DNA作为模板。下文中所述的URA5基因为具有上述ura2-21营养缺陷型的等位基因。GPD1和TEF1启动子是来自解脂耶氏酵母，且XPR2终止子也是来自解脂耶氏酵母。 
GGS1为编码解脂耶氏酵母基因的基因，所述解脂耶氏酵母基因编码香叶基香叶基焦磷酸合酶。核酸编码序列和pMB4591与pMB4683的经编码Ggs1蛋白如下所示： 
atggattataacagcgcggatttcaaggagatatggggcaaggccgccgacaccgcgctgctgggaccgtacaactacctcgccaacaaccggggccacaacatcagagaacacttgatcgcagcgttcggagcggttatcaaggtggacaagagcgatctcgagaccatttcgcacatcaccaagattttgcataactcgtcgctgcttgttgatgacgtggaagacaactcgatgctccgacgaggcctgccggcagcccattgtctgtttggagtcccccaaaccatcaactccgccaactacatgtactttgtggctctgcaggaggtgctcaagctcaagtcttatgatgccgtctccattttcaccgaggaaatgatcaacttgcatagaggtcagggtatggatctctactggagagaaacactcacttgcccctcggaagacgagtatctggagatggtggtgcacaagaceggtggactgtttcggctggctctgagacttatgctgtcggtggcatcgaaacaggaggaccatgaaaagatcaactttgatctcacacaccttaccgacacactgggagtcatttaccagattctggatgattacctcaacctgcagtccacggaattgaccgagaacaagggattctgcgaagatatcagcgaaggaaagttttcgtttccgctgattcacagcatacgcaccaacccggataaccacgagattctcaacattctcaaacagcgaacaagcgacgcttcactcaaaaagtacgccgtggactacatgagaacagaaaccaagagtttcgactactgcctcaagaggatacaggccatgtcactcaaggcaagttcgtacattgatgatctagcagcagctggccaegatgtctccaagctacgagccattttgcattattttgtgtccacctctgactgtgaggagagaaagtactttgaggatgcgcagtga 
mdynsadfkeiwgkaadtallgpynylanmghnirehliaafgavikvdksdletishitkilhnssllvddvednsmlrrglpaahclfgvpqtinsanymyfvalqevlklksydavsifteeminlhrgqgmdlywretltcpsedeylemvvhktgglfrlaklmlsvaskqedhekinfdlthltdtlgviyqilddylnlqsteltenkgfcedisegkfsfplihsirtnpdnheilnilkqrtsdaslkkyavdymrtetksfdyclkriqamslkassyiddlaaaghdvsklrailhyfvstsdceerkyfedaq。 
表27：质粒 
质粒 主链 插入物 寡核苷酸或来源
pMB4529 PCR2.1 3.4kb ADE1 PCR产物 MO4475&MO4476
pMB4534 PCR2.1 2.1kb LEU2 PCR产物 MO4477&MO4478
[0131] 
 pMB4535 PCR2.1 1.2kb URA5 PCR产物 MO4471&MO4472
 pMB4589  pMB4535(KpnI+SpeI) 1.2kb GPD1启动子(KpnI+NotI)；0.14kb XPR2终止子(NotI+SpeI) MO4568&MO4591；MO4566&MO4593
 pMB4590  pMB4535(KpnI+SpeI) 0.4kb TEF1启动子(KpnI+NotI)；0.14kb XPK2终止子(NotI+SpeI) MO4571&MO4592；MO4566&MO4593
 pMB4591  pMB4590(NheI+MluI) 1.0kb GGS7 ORF(XbaI+MluI) MO4534&MO4544
 pMB4597  pMB4534(Acc65I+5peI) GPD7启动子&XPR2终止子(Acc65I+SpeI) 来自pMB4589
 pMB4603  pMB4597(RsrII+MluI) 残余主链&TEF1启动子(RsrII+MluI) 来自pMB4590
 pMB4616  pMB4529(RsrII+SpeI) 残余主链&GPD1启动子&XPR2终止子(RsrII+SpeI) 来自pMB4589
 pMB4629  pMB4616(RsrII+MluI) 残余主链&TEF1启动子(RsrII+MluI) 来自pMB4590
 pMB4631  pMB4603(KpnI+NheI) 1.2kbGPD1启动子(KpnI+NheI)； MO4568&MO4659
 pMB4628  pMB4603 Carp 参看1A
 pMB4637  pMB4629(NheI+MluI) l.5kb hmg1截短ORF(XbaI+MluI) 参看1D
 pMB4638  pMB4629 carB(i-) 参看1B
 pMB4660  pMB4638(+URA3) carB(i-) 参看1C
 pMB4662  pMB4631(SpeI+MoI) 1.8kh URA3片段(SpeI+BsaI) MO4684&MO4685参看1C
 pMB4683  pMB4662(Acc65I+ MluI) 1.4kb tflp-GGS1片段((Acc65I+MluI) 来自pMB4591
 pMB4692  pMB4662(Acc65I+ MluI) 0.4Kb TEF1启动子(Acc65I+NheI)；0.55kb crtZ ORF(XbaI+MluI) 参看1E
 pMB4698  pMB4629(NheI+MluI) 0.9kb crtW ORF(XbaI+MluI) 参看1F
 pMB4599  pBluescriptSKII-(EcoRV) 1.9kb carRP基因 MO4525&MO4541
 pMB4606  pBluescriptSKII-(EcoRV) 1.9kb carB基因 MO4530&MO4542
 pMB4613  pMB4599(Acc65l+ PpuMI) carRP(i-) 参看文中
 pMB4619  pBluescriptSKII-(BamHI +Acc65I)) carB(i-) 参看文中
上表27中所提及的某些寡核苷酸如下所示： 
MO4471 5′-CTGGGTGACCTGGAAGCCTT 
MO4472 5′-AAGATCAATCCGTAGAAGTTCAG 
MO4475 5′-AAGCGATTACAATCTTCCTTTGG 
MO4476 5′-CCAGTCCATCAACTCAGTCTCA 
MO4477 5′-GCATTGCTTATTACGAAGACTAC 
MO4478 5′-CCACTGTCCTCCACTACAAACAC 
MO4534 5′-CACAAACGCGTTCACTGCGCATCCTCAAAGT 
MO4544 5′-CACAATCTAGACACAAATGGATTATAACAGCGCGGAT 
MO4566 5′-CACAAACTAGTTTGCCACCTACAAGCCAGAT 
MO4568 5′-CACAAGGTACCAATGTGAAAGTGCGCGTGAT 
MO4571 5′-CACAAGGTACCAGAGACCGGGTTGGCGG 
MO4591 5′-CACAAGCGGCCGCGCTAGCATGGGGATCGATCTCTTATAT 
MO45925′-CACAAGCGGCCGCGCTAGCGAATGATTCTTATACTCAGAAG 
MO45935′-CACAAGCGGCCGCACGCGTGCAATTAACAGATAGTTTGCC 
MO4659  5′-CACAAGCTAGCTGGGGATGCGATCTCTTATATC 
1A：产生编码八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶的pMB4628(teflp-carRP LEU2)：由卷枝毛霉(ATCC 90680)基因组DNA使用MO4525和MO4541扩增含内含子的carRP： 
MO45255′-CACAAACGCGTTTAAATGGTATTTAGATTTCTCATT 
MO4541 5′-CACAATCTAGACACAAATGCTGCTCACCTACATGGA； 
并且用T4聚核苷酸激酶使所得1.9kb片段磷酸化。将所得片段的平末端与经EcoRV裂解的pBluescriptSKII接合，得到pMB4599。将来自pMB4599的1.9kb XbaI-MluI片段插入NheI-和MluI-裂解的pMB4603中，得到pMB4628。编码含内含子的核酸的序列和pMB4628的经编码CarRP蛋白如下所示： 
atgctgctcacctacatggaagtccacctctactacacgctgcctgtgctgggcgtcctgtcctggctgtcgcggccgtactacacagccaccgatgcgctcaaattcaaatttctgacactggttgccttcacgaccgcctccgcctgggacaactacattgtctaccacaaggcgtggtcctactgccccacctgcgtcaccgctgtcattggctacgtgcccttggaggagtacatgttcttcatcatcatgactctgttgaccgtggcattcaccaatctggtgatgcgctggcacctgcacagcttctttatcaggcctgaaacgcccgtcatgcagtccgtcctggtccgtcttgtccccataacagccttattaatcactgcatacaaggcttgggtaagcaaacaaacaaatgatgtgccgcatcgcattttaatattaaccattgcatacacagcatttggcggtccctggaaagccactgttctacggatcatgcattttgtggtacgcctgtccggttttggccttattgtggtttggtgctggcgagtacatgatgcgtcgtccgctggcggtgctcgtctccattgcgctgcccacgctgtttctctgctgggtcgatgtcgtcgctattggcgccggcacatgggacatttcgctggccacaagcaccggcaagttcgtcgtgccccacctgcccgtggaggaattcatgttctttgcgctaattaataccgttttggtatttggtacgtgtgcgatcgatcgcacgatggcgatcctccacctgttcaaaaacaagagtccttatcagcgcccataccagcacagcaagtcgttcctccaccagatcctcgagatgacctgggccttctgtttacccgaccaagtgctgcattcagacacattccacgacctgtccgtcagctgggacatcctgcgcaaggcctccaagtccttttacacggcctctgctgtctttcccggcgacgtgcgccaagagctcggtgtgctatacgccttttgcagagccacggacgatctctgcgacaacgagcaggtccctgtgcagacgcgaaaggagcagctgatactgacacatcagttcgtcagcgatctgtttggccaaaagacaagcgcgccgactgccattgactgggacttttacaacgaccaactgcctgcctcgtgcatctctgccttcaagtcgttcacccgtttgcgccatgtgctggaagctggagccatcaaggaactgctcgacgggtacaagtgggatttggagcgtcgctccatcagggatcaggaggatctcagatattactcagcttgtgtcgccagcagtgttggtgaaatgtgcactcgcatcatactggcccacgccgacaagcccgcctcccgccagcaaacacagtggatcattcagcgtgcgcgtgaaatgggtctggtactccaatatacaaacattgcaagagacattgtcaccgacagcgaggaactgggcagatgctacctgcctcaggattggcttaccgagaaggaggtggcgctgattcaaggcggccttgcccgagaaattggcgaggagcgattgctctcactgtcgcatcgcctcatctaccaggcagacgagctcatggtggttgccaacaagggcatcgacaagctgcccagccattgtcaaggcggcgtgcgtgcggcctgcaacgtctatgcttccattggcaccaagctcaagtcttacaagcaccactatcccagcagagcacatgtcggcaattcgaaacgagtggaaattgctcttcttagcgtatacaacctttacaccgcgccaattgcgactagtagtaccacacattgcagacagggaaaaatgagaaatctaaataccatttaa； 
mlltymevhlyytlpvlgvlswlsrpyytatdalkfkfltlvafttasawdnyivyhkawsycptcvtavigyvpleeymffiimtlltvaftnlvmrwhlhsffirpetpvmqsvlvrlvpitallitaykawhlavpgkplfygscilwyacpvlallwfgageymmrrplavlvsialptlflcwvdvvaigagtwdislatstgkfvvphlpveefmffalintvlvfgtcaidrtmailhlfknkspyqrpyqhsksflhqilemtwafclpdqvlhsdtfhdlsvswdilrkasksfytasavfpgdvrqelgvlyafcratddlcdneqvpvqtrkeqlilthqfvsdlfgqktsaptaidwdfyndqlpascisafksftrlrhvleagaikelldgykwdlerrsirdqedlryysacvassvgemctriilahadkpasrqqtqwiiqraremglvlqytniardivtdseelgrcylpqdwltekevaliqgglareigeerllslshrliyqadelmvvankgidklpshcqggvraacnvyasigtklksykhhypsrahvgnskrveiallsvynlytapiatsstthcrqgkmlnti 
或者，还将pMB4599用作模板以供使用MO4318、MO4643、MO4644和MO4639进行的PCR扩增并产生0.5kb和0.95kb片段： 
MO4318  5′-GTAAAACGACGGCCAGT 
MO4643  5′-CACACGGTCTCATGCCAAGCCTTGTATGCAGTGATTAA 
MO4639  5′-CCACTGTGTTTGCTGGCGG 
MO4644  5′-CACACGGTCTCTGGCATTTGGCGGTCCCTGGAAA， 
随后分别用Acc65I与BsaI和BsaI与PpuMI裂解所述片段。将这些片段与已经Acc65I 和PpuMI消化的pMB4599接合，得到具有无内含子carRP的pMB4613。可将来自pMB4613的1.85kb XbaI-MluI片段插入NheI-和MluI-裂解的pMB4603中得到pCarRPdelI。 
1B：产生编码八氢番茄红素脱氢酶的pMB4638(teflp-carB ADE1)：由卷枝毛霉(ATCC 90680)基因组DNA使用MO4530和MO4542扩增含内含子的carB： 
MO4530 5′-CACAAACGCGTTTAAATGACATTAGAGTTATGAAC 
MO4542 5′-CACAATCTAGACACAAATGTCCAAGAAACACATTGTC， 
并且用T4聚核苷酸激酶将所得1.9kb片段磷酸化，且将平末端与经EcoRV裂解的pBS-SKII-接合，得到pMB46O6。随后将pMB4606用作模板以供使用MO4318与MO4648和MO4646与MO4647和MO4343与MO4645进行的PCR扩增： 
MO4318  5′-GTAAAACGACGGCCAGT 
MO4648  5′-CACAAGGTCTCAAGCACGCATCCCGGAACTG 
MO4646  5′-CACACGGTCTCAGGCATGTCGCCCTACGATGC 
MO4647  5′-CACACGGTCTCATGCTTGCACCCACAAAGAATAGG 
MO4343  5′-CAGGAAACAGCTATGAC 
MO4645  5′-CACACGGTCTCTTGCCC ATATACATGGTCTGAAACG， 
产生0.4kb和0.85kb和0.7kb的片段，随后分别用Acc65I与BsaI和BsaI和BsaI与BamHI裂解所述片段。将这些片段与已经Acc65I和BamHI切断的pBS-SKII-接合，得到具有无内含子carB的pMB4619。将来自pMB4619的1.75kb XbaI-MluI片段插入NheI-和MluI-裂解的pMB4629中，得到pMB4638。所得核酸编码序列和pMB4638的经编码CarB蛋白如下所示： 
atgtccaagaaacaeattgtcattatcggtgctggcgtgggtggcacggctacagctgctcgtttggcccgcgaaggcttcaaggtcactgtggtggagaaaaacgactttggtggcggccgctgctccttgatccatcaccagggccatcgctttgatcagggcccgtcgctctacctgatgcccaagtactttgaggacgcctttgccgatctggacgagcgcattcaagaccacctggagctgctgcgatgcgacaacaactacaaggtgcactttgacgacggtgagtcgatccagctgtcgtctgacttgacacgcatgaaggctgaattggaccgcgtggagggcccccttggttttggccgattcctggatttcatgaaagagacacacatccactacgaaagcggcaccctgattgcgctcaagaagaatttcgaatccatctgggacctgattcgcatcaagtacgctccagagatctttcgcttgcacctgtttggcaagatctacgaccgcgcttccaagtacttcaagaccaagaagatgcgcatggcattcacgtttcagaccatgtatatgggcatgtcgccctacgatgcgcctgctgtctacagcctgttgcagtacaccgagttcgctgaaggcatctggtatccccgtggcggcttcaacatggtggttcagaagctagaggcgattgcaaagcaaaagtacgatgccgagtttatctacaatgcgcctgttgccaagattaacaccgatgatgccaccaaacaagtgacaggtgtaaccttggaaaatggccacatcatcgatgccgatgcggttgtgtgtaacgcagatctggtctatgcttatcacaatctgttgcctccctgccgatggacgcaaaacacactggcttccaagaaattgacgtcttcttccatttccttctactggtccatgtccaccaaggtgcctcaattggacgtgcacaacatctttttggccgaggcttatcaggagagctttgacgaaatcttcaaggactttggcctgccttctgaagcctccttctacgtcaatgtgccctctcgcatcgatccttctgctgctcccgacggcaaggactctgtcattgtcttggtgcctattggtcatatgaagagcaagacgggcgatgcttccaccgagaactacccggccatggtggacaaggcacgcaagatggtgctggctgtgattgagcgtcgtctgggcatgtcgaatttcgccgacttgattgagcatgagcaagtcaatgatcccgctgtatggcagagcaagttcaatctgtggagaggctcaattctgggtttgtctcatgatgtgcttcaggtgctgtggttccgtcccagcacaaaggattctaccggtcgttatgataacctattctttgtgggtgcaagcacgcatcccggaactggtgttcccattgtccttgcaggaagcaagctcacctctgaccaagttgtcaagagctttggaaagacgcccaagccaagaaagatcgagatggagaacacgcaagcacctttggaggagcctgatgctgaatcgacattccctgtgtggttctggttgcgcgctgccttttgggtcatgtttatgttcttttacttcttccctcaatccaatggccaaacgcccgcatcttttatcaataatttgttacctgaagtattccgcgttcataactctaatgtcatttaa， 
mskkhiviigagvggtataarlaregfkvtvvekndfgggrcslihhqghrfdqgpslylmpkyfedafadlderiqdhlellrcdnnykvhfddgesiqlssdltrmkaeldryegplgfgrfldfrnkethihyesgtlialknfesiwdlirikyapeifrlhlfgkiydraskyfktkkmrmaftfqtmymgmspydapavysllqytefaegiwyPrggfhmvvqkleaiakqkydaefiynapvakintddatkqvtgvtlenghiidadavvcnadlvyayhnllppcrwtqntlaskkltsssisfywsmstkvpqldvhniflaeayqesfdeifkdfglpseasfyvnvpsridpsaapdgkdsvivlvpighmksktgdastenypamvdkarkmvlavierrlgmsnfadlieheqvrndpavwqskfnlwrgsilglshdvlqvlwfrpstkdstgrydnlffvgasthpgtgvpivlagskltsdqvvksfgktpkprkiementqapleepdaestfpvwfwlraafwvmfmnffyffpqsngqtpasfinnllpevfrvhnsnvi。 
1C：产生编码八氢番茄红素脱氢酶的pMB4660(tef1p-carB URA3)：将来自pMB4638的4.3kb XhoI-NotI片段和1.8kb NotI-SpeI片段与由使用MO4684和MO4685进行的解脂耶氏酵母基因组DNA的PCR扩增所产生的1.9kb BsaI-和SpeI-裂解URA3基因接合，得到pMB4660： 
MO4684  5′-CATTCACTAGTGGTGTGTTCTGTGGAGCATTC 
MO4685  5′-CACACGGTCTCATCGAGGTGTAGTGGTAGTGCAGTG。 
所得核酸编码序列和pMB4660的经编码CarB(i)蛋白如下所示： 
atgtccaagaaacacattgtcattatcggtgctggcgtgggtggcacggctacagctgctcgtttggcccgcgaaggcttcaaggtcactgtggtggagaaaaacgactttggtggcggccgctgctccttgatccatcaccagggccatcgctttgatcagggcccgtcgctctacctgatgcccaagtactttgaggacgcctttgccgatctggacgagcgcattcaagaccacctggagctgctgcgatgcgacaacaactacaaggtgcactttgacgacggtgagtcgatccagctgtcgtctgacttgacacgcatgaaggctgaattggaccgcgtggagggcccccttggttttggccgattcctggatttcatgaaagagacacacatccactacgaaagcggcaccctgattgcgctcaagaagaatttcgaatccatctgggacctgattcgcatcaagtacgctccagagatctttcgcttgcacctgtttggcaagatctacgaccgcgcttccaagtacttcaagaccaagaagatgcgcatggcattcacgtttcagaccatgtatatgggcatgtcgccctacgatgcgcctgctgtctacagcctgttgcagtacaccgagttcgctgaaggcatctggtatccccgtggcggcttcaacatggtggttcagaagctagaggcgattgcaaagcaaaagtacgatgccgagtttatctacaatgcgcctgttgccaagattaacaccgatgatgccaccaaacaagtgacaggtgtaaccttggaaaatggccacatcatcgatgccgatgcggttgtgtgtaacgcagatctggtctatgcttatcacaatctgttgcctccctgccgatggacgcaaaacacactggcttccaagaaattgacgtcttcttccatttccttctactggtccatgtccaccaaggtgcctcaattggacgtgcacaacatctttttggccgaggcttatcaggagagctttgacgaaatcttcaaggactttggcctgccttctgaagcctccttctacgtcaatgtgccctctcgcatcgatccttctgctgctcccgacggcaaggactctgtcattgtcttggtgcctattggtcatatgaagagcaagacgggcgatgcttccaccgagaactacccggccatggtggacaaggcacgcaagatggtgctggctgtgattgagcgtcgtctgggcatgtcgaatttcgccgacttgattgagcatgagcaagtcaatgatcccgctgtatggcagagcaagttcaatctgtggagaggctcaattctgggtttgtctcatgatgtgcttcaggtgctgtggttccgtcccagcacaaaggattctaccggtcgttatgataacctattctttgtgggtgcaagcacgcatcccggaactggtgttcccattgtccttgcaggaagcaagctcacctctgaccaagttgtcaagagctttggaaagacgcccaagccaagaaagatcgagatggagaacacgcaagcacctttggaggagcctgatgctgaatcgacattccctgtgtggttctggttgcgcgctgccttttgggtcatgtttatgttcttttacttcttccctcaatccaatggccaaacgcccgcatcttttatcaataatttgttacctgaagtattccgcgttcataactctaatgtcatttaa； 
mskkhiviigagvggtataarlaregfkvtvvekndfgggrcslihhqghrfdqgpslylmpkyfedafadlderiqdhlellrcdnnykvhfddgesiqlssdltrmkaeldrvegplgfgrfldfinkethihyesgtlialkknfesiwdlirikyapeifrlhlfgkiydraskyfktkmrmaftfqtrnymgmspydapavysllqytefaegiwyprggfnnmvvqkleaiakqkydaefiynapvakintddatkqvtgvtlenghiidadavvcnadlvyayhnllppcrwtqntlaskkltsssisfywsmstkvpqldvhniflaeayqesfdeifkdfglpseasfyvnvpsridpsaapdgkdsvivlvpighmksktgdastenypatmvdkarkmvlavierrlgmsnfadlieheqvndpavwqskfnlwrgsilglshdvlqvlwfrpstkdstgrydnlffvgasthpgtgvpivlagskltsdqvvksfgktpkprkiementqapleepdaestfpvwfwlraafwvmfmffyffpqsngqtpasfinnllpevfrvhnsnvi 
1D：产生pMB4637和编码截短型HMG1的pTef-HMG
为产生HMG-CoA还原酶基因(其还编码源自酿酒酵母的77个氨基酸的前导序列)的截短型变异体，合成以下寡核苷酸： 
引物O   5′-TTCTAGACACAAAAATGGCTGCAGACCAATTGGTGA 
引物P   5′-CATTAATTCTTCTAAAGGACGTATTTTCTTATC 
引物Q   5′-GTTCTCTGGACGACCTAGAGG 
MO4658  5′-CACACACGCGTACACCTATGACCGTATGCAAAT。 
使用基因组DNA作为模板，使用引物O和P来扩增编码Met-Ala的0.23kb片段， 随后扩增酿酒酵母的Hmg1蛋白的残基530到604。使用基因组DNA作为模板，使用引物Q和MO4658扩增编码解脂耶氏酵母的Hmg1蛋白的C末端448个残基的1.4kb片段。将这些片段与适当的克隆载体接合，并且通过测序来验证所得质粒，将其命名为pOP和pQMO4658。用XbaI和AseI释放OP片段，并且用MaeI和MluI释放QMO4658。随后将这些片段与经XbaI和MluI切断的ADE1TEF1p表达载体pMB4629接合以产生TefHMG。 
或者，可在无如上表所述的酿酒酵母序列的情况下，使用引物MO4658(如上文所述)和MO4657修饰来自解脂耶氏酵母的自然HMG1基因，从而得到pMB4637： 
MO4657 5′-CACACTCTAGACACAAAAATGACCCAGTCTGTGAAGGTGG。 
所得核酸编码序列和pMB4637的经编码Hmg1截短蛋白如下所示： 
atgacccagtctgtgaaggtggttgagaagcacgttcctatcgtcattgagaagcccagcgagaaggaggaggacacctcttctgaagactccattgagctgactgtcggaaagcagcccaagcccgtgaccgagacccgttctctggacgacctagaggctatcatgaaggcaggtaagaccaagcttctggaggaccacgaggttgtcaagctctctctcgagggcaagcttcctttgtatgctcttgagaagcagcttggtgacaacacccgagctgttggcatecgacgatctatcatctcccagcagtctaataccaagactttagagacctcaaagcttccttacctgcactacgactacgaccgtgtttttggagcctgttgcgagaacgttattggttacatgcctctccccgttggtgttgctggccccatgaacattgatggcaagaactaccacattcctatggccaccactgagggttgtcttgttgcctcaaccatgcgaggttgcaaggccatcaacgccggtggcggtgttaccactgtgcttactcaggacggtatgacacgaggtccttgtgtttccttcccctctctcaagcgggctggagccgctaagatctggcttgattccgaggagggtctcaagtccatgcgaaaggccttcaactccacctctcgatttgctcgtctccagtctcttcactctacccttgctggtaacctgctgtttattcgattccgaaccaccactggtgatgccatgggcatgaacatgatctccaagggcgtcgaacactctctggccgtcatggtcaaggagtacggcttccctgatatggacattgtgtctgtctcgggtaactactgcactgacaagaagcccgcagcgatcaactggatcgaaggccgaggcaagagtgttgttgccgaagccaccatccctgctcacattgtcaagtctgttctcaaaagtgaggttgacgctcttgttgagctcaacatcagcaagaatctgatcggtagtgccatggctggctctgtgggaggtttcaatgcacacgccgcaaacctggtgaccgccatctaccttgccactggccaggatcctgctcagaatgtcgagtcttccaactgcatcacgctgatgagcaacgtcgacggtaacctgctcatctccgtttccatgccttctatcgaggtcggtaccattggtggaggtactattttggagccccagggggctatgctggagatgcttggcgtgcgaggtcctcacatcgagacccccggtgccaacgcccaacagcttgctcgcatcattgcttctggagttcttgcagcggagctttcgctgtgttctgctcttgctgccggccatcttgtgcaaagtcatatgacccacaaccggtcccaggctcctactccggccaagcagtctcaggccgatctgcagcgtctacaaaacggttcgaatatttgcatacggtcatag 
mtqsvkvvekhvpiviekpsekeedtssedsieltvgkqpkpvtetrslddleaimkagktklledhevvklslegklplyalekqlgdntravgirrsiisqqsntktletsklpylhydydrvfgaccenvigymplpvgvagpmnidgknyhipmattegclvastmrgckainagggvttvltqdgmtrgpcvsfpslkragaakiwldseeglksmrkafinstsrfarlqslhstlagnllfiffrtttgdamgmnmiskgvehslavmvkeygfpdmdivsvsgnyctdkkpaainwiegrgksvvaeatipahivksvlksevdalvelnisknligsamagsvggfnahaanlvtaiylatgqdpaqnvessncitlmsnvdgnllisvsmpsievgtigggtilepqgamlemlgvrgphietpganaqqlariiasgvlaaelslcsalaaghlvqshmthnrsqaptpakqsqadlqrlqngsnicirs。 
1E：产生编码胡萝卜素羟化酶的pMB4692(URA3 tef1p-crtZ)：基于新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorans)的蛋白质序列，使用解脂耶氏酵母密码子偏性合成以下胡萝卜素羟化酶(CrtZ)ORF序列： 
5’-ttctagacacaaaaatgggtggagccatgcagaccctcgctgctatcctgatcgtcctcggtacagtgctcgctatggagtttgtcgcttggtcttctcataagtatatcatgcatggcttcggatggggatggcatagagaccatcacgagccccatgagggatttcttgagaagaatgacttatacgccatcgttggcgctgccctctcgatactcatgtttgccctcggctctcccatgatcatgggcgctgacgcctggtggcccggaacctggatcggactcggtgtcctcttctatggtgtcatctataccctcgtgcacgacggtctggtgcaccaacgatggtttagatgggtgcctaaacgaggttacgccaaacgactcgtgcaggcccataagctgcaccacgccaccattggcaaggaaggaggcgtctcattcggtttcgtgttcgcccgagatcccgccgttctgaagcaggagcttcgagctcaacgagaagcaggtatcgccgtgctgcgagaggctgtggacggctagacgcgt 
使用XbaI和MluI裂解这一序列，并且将其连同来自pMB4629的Acc65I-NheI TEF1启动子片段与经Acc65I和MluI切断的pMB4662接合，从而得到pMB4692。上文以粗体下划线标示核酸编码序列。所得pMB4692的经编码crtZ蛋白如下所示： 
mggamqtlaailivlgtvlamefvawsshkyimhgfgwgwhrdhhephegflekndlyaivgaalsilmfalgspmimgadawwpgtwiglgvlfygviytlvhdglvhqrwfrwvpkrgyakrlvqahklhhatigkeggvsfgfvfardpavlkqelraqreagiavlreavdg。 
1F：产生编码胡萝卜素酮酶的pMB4698(ADE1 tef1p-crtW)：基于具有从马尾藻海(Sargasso Sea)(Genebank寄存编号AACY01034193.1)分离的环境序列(evvironmentalsequence)的蛋白质序列，合成以下胡萝卜素酮酶(CrtW)ORF序列： 
5’-ttctagacacaaaaatgactcgatctatttcctggccttccacctactggcacctccagccctcctgttcttcttgggtcgcaaacgaattctctcctcaagcccgaaaaggtctcgtcctcgctggtctcattggttccgcttggctgcttactctcggacttggcttttcccttcccctccatcaaacgagctggcttctcatcggttgtctcgttctccttagatctttcctgcacaccggactttttatcgttgcccatgacgctatgcacgcttctcttgttcctgaccaccctggccttaaccgttggattggacgtgtctgtcttctcatgtatgctggactctcctacaaaagatgctgccgaaatcaccgtcgacaccaccaagcccctgaaacagttgaagaccctgactaccaacgatgcactaacaacaatatcctcgactggtacgttcactttatgggaaattacctcggatggcaacaattgcttaatctctcttgcgtttggctcgctctcaccttccgtgtttctgactactctgctcaattcttccacctgctccttttctctgtccttcctctcatcgtctcctcctgtcaactcttcctcgtgggaacctggctgccacaccgacgaggcgctactactcgacccggcgttaccactcgatccctgaacttccaccctgctctttccttcgctgcttgctaccacttcggttaccaccgtgaacaccatgaatctccctctactccttggttccaacttcctaaactc cgagaaggttctctcatctaaacgcgt。 
使用XbaI和MluI裂解这一序列，并且将其与经NheI和MluI切断的pMB4629接合，从而得到pMB4698。上文以粗体下划线标示核酸编码序列。所得pMB4698的经编码crtW蛋白如下所示： 
mtrsiswpstywhlqpscsswvanefspqarkglvlagligsawlltlglgfslplhqtswlligclvllrsflhtglfivahdamhaslvpdhpglnrwigrvcllmyaglsykrccrnhnhhqapetvedpdyqrctnnnildwyvhfmgnylgwqqllnlscvwlaltfrvsdysaqffhllfsvlplivsscqlflvgtwlphrrgattrpgvttrslnfhpalsfaacyhfgyhrehhespstpwfqlpklregsli。 
实例2：工程设计解脂耶氏酵母以增加类胡萝卜素产量
2A：产生表达香叶基香叶基焦磷酸合酶和八氢番茄红素脱氢酶的解脂耶氏酵母：用URA5上游已经SspI裂解的pMB4591(tef1p-GGS1)转化MF350(MATB ura2-21 leu2-35ade1)；鉴别在ura2位点处载有质粒的Ura+转化株，并将其命名为MF364。随后用ADE1处已经SspI裂解的pMB4638(tef1p-carB)将其转化，并且选择在ade1位点处具有质粒的原养型转化株。将所述转化株命名为MF502。 
2B：产生表达香叶基香叶基焦磷酸合酶、八氢番茄红素脱氢酶和八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶的解脂耶氏酵母：用已经SspI处理的pMB4628(tef1p-carRP)转化MF502。选择两天或三天生长后在转化培养板(具有1％葡萄糖和0.1％谷氨酸[YNBglut]的YNB琼脂)上呈无色、橙色或深橙色的九个原养菌落。在30C下于YPD中生长4天后，两个菌落、即MF597和MF600(呈深橙色者)产生大于每克细胞干重(DCW)4mg的胡萝卜素。Southern分析揭示基因组DNA中具有来自MF597和MF600的不同单一KpnI-HindIII谱带，并无谱带表示在leu2-270处发生同源整合。 
2C.产生表达八氢番茄纤素合酶/番茄纤素环化酶和八氢番茄红素脱氢酶的解脂耶氏酵母：用SspI裂解的pMB4628转化ATCC201249(MATA ura3-302 leu2-270 lys8-11)。汇集数百个Leu+菌落，使其再生长并且用URA3上游已经SalI裂解的pMB4660(TEF1p-carB)对其进行转化。选择在30℃下于YNBglut加0.6mM赖氨酸上培养5天 后呈亮黄色的一个菌落(称为MF447)，并且发现在YPD中生长4天后，其产生每克细胞干重0.2mg胡萝卜素。 
用1g/L 5-氟乳清酸和经选择的Ura-分群激发MF447。意外地是，发现其都保留与其亲本相同的黄色外观，这表明功能性URA3基因未随着功能性CarB酶的丧失而丧失。Southern分析证实，由KpnI-HindIII消化MF447 DNA得到的两个片段都含有URA3p杂交序列，其中仅一个序列还与carB杂交。另一序列在MF578中缺乏，选择Ura3-分群以供进一步处理。质粒营救(plasmid rescue)和对菌株MF447、MF597(实例2c)和MF600(实例2c)中涵盖carRP内含子的DNA序列的分析揭示，外显子1与外显子2相邻，且彼此由缺乏初始内部SspI位点(存在于pMB4628中)的内含子序列分离。 
2D：产生表达八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶、八氢番茄红素脱氢酶和香叶基香叶基焦磷酸合酶的解脂耶氏酵母：用已经SalI(URA3上游)或经StuI(GGSl ORF内)裂解的pMB4683(tef1p-GGS1)转化MF578。在两种情况下，Ura+Leu+菌落在YNBglut+Lys和YPD上都呈亮橙色，并且当如上文所述生长时，若干菌落产生大于每克细胞干重4mg胡萝卜素。如通过Southern分析所推断，一个菌落、即MF633在GGS1位点处含有单一质粒拷贝。其它菌落出现非同源或更复杂的整合。 
2E：产生表达八氢番茄红素合酶/番茄红素环化酶、八氢番茄红素脱氢酶和香叶基香叶基焦磷酸合酶的解脂耶氏酵母：使MF364与MF578杂交，并且将来自所得二倍体的孢子接种于YPD上在30℃下培养2到3天。通过PCR筛选存在tefp-carB、tefp-carRP和tefp-GGS1的橙色Leu+Ade-Ura-菌落，且筛选在YPD培养基中生长后具有高类胡萝卜素产量(大于每克细胞干重4mg)的菌落。选择满足这些标准并且展现对5-氟乳清酸的抗性(表明其具有ura3-302等位基因)的菌落以供进一步研究，且在下文中将其称为GBRPua菌株。选择所述菌株以供进一步分析和修饰用。 
实例3：自解脂耶氏酵母细胞中萃取类胡萝卜素
使用YPD培养基(1％酵母萃取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)对所产生的菌株进行摇瓶测试。在30C下使125ml烧瓶中的20ml培养物生长。从72-96小时培养物中采集解脂耶氏酵母细胞，并且进行萃取以确定类胡萝卜素的形式和数量。将1.8ml培养物放入Eppdendorf管中。使细胞颗粒化，并用1ml H2O洗涤两次。第二次洗涤后，将再悬浮的细胞转移到顶部具有刺孔的经预先称重的卡口瓶盖管(snap-cap tube)中，并且将细胞冻干整夜。干燥完成后，对管称重以便计算细胞干重。将0.25ml来自相同摇瓶的培养物放入2ml螺口瓶盖管中以用于类胡萝卜素萃取。使细胞颗粒化，并且抽吸上清液。可在-80 ℃下冷冻并储存球状细胞。将等体积的立方氧化锆颗粒和1ml冰冷的萃取溶剂(含有0.01％丁基羟基甲苯(BHT)的50/50v/v己烷与乙酸乙酯的混合物)加到细胞小球中。随后在4℃下以最大速度搅动(Mini-BeadBeater-8，BioSpec Products，Inc.)混合物5分钟。接着，以最大速度使混合物旋转1分钟，并且收集上清液，且将其保藏于冷的16ml玻璃小瓶中。将剩余细胞碎片再萃取至少3次，但未加入氧化锆颗粒；将所有上清液都汇集于所述16ml玻璃小瓶中。萃取后，在4℃下于Sorvall台式离心机中以2000rpm使玻璃小瓶旋转5分钟，并且将上清液转移到新的冷16ml玻璃小瓶中。使用Speed Vac浓缩上清液(室温下在暗处)，并且将样本储存于-20℃或-80℃下直到即将进行HPLC分析。在进行HPLC分析前，将样本再悬浮于1ml冰冷的溶剂中且随后将其转移到冷的琥珀色小瓶中。在整个方案中，需要注意避免与氧、光、热和酸接触。 
实例4：通过HPLC量化类胡萝卜素的产量
为对类胡萝卜素进行分析，将样本再悬浮于冰冷的萃取溶剂(含有0.01％丁基羟基甲苯(BHT)的50/50v/v己烷与乙酸乙酯的混合物)中。在25℃下，使用装备有WatersXBridge C18柱(3.5μm，2.1×50mm)和Thermo Basic 8保护柱(2.1×10mm)的Alliance2795 HPLC(Waters)拆分类胡萝卜素；将确认的类胡萝卜素样本用作标准品。流动相和流动速率展示于下文中(溶剂A＝乙酸乙酯；溶剂B＝水；溶剂C＝甲醇；溶剂D＝乙腈)。注入体积为10μL。检测器为Waters 996光电二极管阵列检测器。亲脂性分子的滞留时间包括虾青素(1.159分钟)、玉米黄素(1.335分钟)、β-阿朴-8′-胡萝卜醛(2.86分钟)、麦角固醇(3.11分钟)、番茄红素(3.69分钟)、β-胡萝卜素(4.02分钟)和八氢番茄红素(4.13分钟)。虾青素、玉米黄素、β-阿朴-8′-胡萝卜醛、番茄红素和β-胡萝卜素是在475nm下检测，而麦角固醇和八氢番茄红素是在286nm下检测。 
表28：亲脂性分子的滞留时间 
时间(分钟) 流速(mL/min) A％ B％ C％ D％ 曲线
  0.50 0.0 20.0 0.0 80.0  
3.00 1.00 20.0 0.0 0.0 80.0 6
4.50 1.00 80.0 0.0 20.0 0.0 6
5.50 1.00 0.0 0.0 60.0 40.0 6
6.50 1.00 0.0 0.0 80.0 20.0 6
7.50 1.00 0.0 0.0 100.0 0.0 6
8.50 1.00 0.0 0.0 100.0 0.0 6
9.50 1.00 0.0 20.0 0.0 80.0 6
10.50 0.50 0.0 20.0 0.0 80.0 6
[0212]  实例5：HMG-CoA还原酶的截短形式的表达引起类胡萝卜素产量增加
为增加类胡萝卜素产量，通过引入HMG-CoA还原酶基因的截短变异体来增加通过类异戊二烯路径的碳流。 
在一种方法中，将HMG-CoA还原酶基因(其还编码源自酿酒酵母菌Hmg1的77个氨基酸的前导序列)的截短变异体引入GRPBua菌株(如上文实例2E中所述)中。可在GRPBua菌株中用SnaBI、BbvCI或Bsu36I裂解质粒pTefHMG以指引在ade1位点处的整合，或用BamHI裂解以指引在HMG1位点处的整合，或用EcoRV裂解以促进随机整合，从而使其恢复成腺嘌呤原养型。筛选类胡萝卜素产量增加的所得Ade+转化株。 
或者，可在无如上文实例1D所述的酿酒酵母序列的情况下修饰来自解脂耶氏酵母的自然HMG1基因，从而得到pMB4637。可如关于pTefHMG所述对这一质粒进行消化，并且将其转化到GRPBua菌株中，且如所述，筛选类胡萝卜素产量增加的所得转化株。 
在另一种方法中，可利用粗糙链孢霉HMG-CoA还原酶基因的截短变异体，并且将其引入解脂耶氏酵母菌株中。为产生适于表达异源HMG-CoA还原酶的质粒，通过用GPD启动子代替ICL1启动子并通过加入赋予腐草霉素(phleomycin)抗性的序列来对p641P(Yeast 2001；18(2001)：97-113)进行修饰。用以下两种引物来扩增解脂耶氏酵母基因组DNA： 
GPDdist：5′CACACGGTacctgtaggttgggttgggtg 
GPDprox：5′CACACGGATCCtgtttaattcaagaatgaatatagagaagagaag， 
并且用BamHI和KpnI裂解所得片段(0.7kb)，且将其与BamHI-和KpnI-裂解的p641P接合，产生质粒“p641Pgpd”。随后在钩巢曲霉GPD启动子的控制下，将ble基因从pBCphleo(Silar，Fungal Genetics Newsletter 42：73)切除，得到3.2 kb BclI-BamHI片段，并以使BamHI位点与GPD启动子最接近的方向将所述片段插入“p641Pgpd”中唯一的BamHI位点中，得到“p641Pgpdble”。 
用以下两种引物扩增粗糙链孢霉基因组DNA： 
Neuhmg fwd：5′CACACGGATCCACATCAACAatggcatctgccacccttcccc 
Neuhmg rev：5′CACACGGATCcaagtgctgacgcggaacttg， 
且用BamHI裂解所得片段，并以正确的方向将其插入BamHI消化的“p641Pgpdble”中。所得质粒“pZg”含有在组成性GPD启动子控制下编码粗糙链孢霉羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(Genebank寄存编号：XP_324892)的截短型胞质催化结构域的序列。可将这一质粒引入上文实例2E中所产生的解脂耶氏酵母菌株中，并通过其对腐草霉素(100μg/ml)的抗性选择转化株。如上文所述，测试所得转化株的β-胡萝卜素产量。 
实例6：将异源胡萝卜素羟化酶和胡萝卜素酮酶基因引入产类胡萝卜素的解脂耶氏酵母菌株中以产生虾青素
为将胡萝卜素羟化酶和胡萝卜素酮酶引入产类胡萝卜素的解脂耶氏酵母中，可依次将上文实例1E和1F中所述的pMB4692和pM4698引入GRPBua菌株(如实例2E中所述)中。为引入pMB4692，可用SalI或BsrGI裂解质粒以指引在ura3位点处的整合，或用XbaI裂解以促进随机整合，从而选择尿嘧啶原养型。筛选在YPD中产生玉米黄素的具有pMB4692的GRPBua Ura+转化株。用pMB4698(其可经PpuMI、SspI或BbvCI裂解以指引在ade1位点处的整合，或用EcoRV裂解以促进随机整合)转化产玉米黄素细胞，并且筛选产生虾青素的原养型菌落。 
或者，质粒转化的顺序可颠倒，其中首先转化pMB4698并且关于腺嘌呤原养型选择转化株。筛选产生角黄素的具有pMB4698的GRPBua Ade+转化株。用pMB4692转化产角黄素的GRPBua[pMB4698]细胞，并且筛选产生虾青素的原养型菌落。 
在另一种方法中，可将来自副球菌的类胡萝卜素酮酶和类胡萝卜素羟化酶基因引入上文实例2中所述的菌株中，以便将β-胡萝卜素转化成虾青素。用以下两种引物扩增副球菌基因组DNA： 
CrtZ fwd：5′CACACCGTCTCAAatgaccaatttcctgatcgtcgtc 
CrtZ rev：5′CACACAGATCtcacgtgcgctcctgcgcc， 
且用BsmBI裂解所得片段，用DNA聚合酶的Klenow片段进行修饰，并用BglH裂解。将这一片段插入PmlI-和BamHI-裂解的pINA1269(J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2(2000)：207-216)中，所述质粒含有hp4d启动子、XPR2终止子、可选LEU2基因和在大肠杆菌中选择和繁殖必需的序列。所得质粒“pA”含有在hp4d启动子控制下编码副球菌(crtZ基因)(Genebank寄存编号CAB56060.1)胡萝卜素羟化酶的序列。 
“pYEG1TEF”是通过用LIP2终止子代替XPR2终止子如下进行修饰。用AvrH消化pINA1291，用DNA聚合酶的Klenow片段进行修饰并用EcoRI裂解，且将含有LIP2t的小片段与已经SacH消化、在存在dNTP的情况下经T4 DNA聚合酶修饰并经EcoRI裂解的“pYEG1TEF”接合。将所得质粒称为“pYEG1TEF-LIP2t”。 
为扩增类胡萝卜素酮酶基因，用以下两种引物扩增副球菌基因组DNA： 
CrtW fwd：5′CACACCCTAGGCCatgagcgcacatgccctgc 
CrtW rev：5′CACACAAGCTTtcatgcggtgtcccccttg， 
且用AvrII和HindIII裂解所得片段，并将其插入AvrH-和HindIII-裂解的“pYEG1TEF-LIP2t”中。所得质粒“pBt”含有在组成性TEF1启动子控制下编码胡萝 卜素酮酶(crtW基因)(Genebank寄存编号CAB56059.1)的序列。 
为将两个表达盒并入单一质粒中，将“pBt”用ClaI裂解，用DNA聚合酶的Klenow片段修饰，并用EcoRI裂解，且分离含crtW的片段，将其与经NotI裂解的磷酸化寡核苷酸接头对混合： 
5′AATTCGCGGCCGCT和 
5′AGCGGCCGCG， 
并且将其与经NotI消化的“pA”接合。所得质粒“pABt”含有TEF1p/crtW/LIP2t盒和hp4d/crtZ/XPR2t盒以及可选择的LEU2基因。 
可将“pABt”引入上文实例4中所述的解脂耶氏酵母菌株(TEF1p/al-1/XPR2t；hp4d/carRP/LIP2t； GPDp/HMGR截短)中，并关于亮氨酸原养型选择转化株。 
实例7：编码角鲨烯合酶的解脂耶氏酵母ERG9基因的部分失活导致类胡萝卜素产量增加
7A.为使编码角鲨烯合酶的ERG9基因部分失活，将相邻的FOL3基因中断，从而引起对甲酰四氢叶酸的需求。随后，用部分跨越所述两个基因的突变诱发DNA片段转化这一菌株，并且筛选角鲨烯合酶活性降低的Fol+转化株。 
合成以下寡核苷酸： 
引物K  5′-CCTTCTAGTCGTACGTAGTCAGC； 
引物L  5′-CCACTGATCTAGAATCTCTTTCTGG， 
并且将其用于使用Pfu聚合酶进行的对跨越大部分FOL3基因的2.3kb解脂耶氏酵母基因组DNA片段的扩增。将所得片段用XbaI裂解并磷酸化，随后将其与已经KpnI裂解、在存在dNTP的情况下经T4 DNA聚合酶(T4pol)处理且随后经XbaI裂解的pBluescriptSK-接合。接着，将称为pBS-fol3的所得质粒用Acc65I和EcoRI裂解，以如上所述的T4pol处理，并且将其与来自pMB4529的3.4kb EcoRV-SpeI ADE1片段(经T4pol处理)接合。 
可用BsiWI和XbaI裂解所得质粒pBSfol3Aade以释放5.5kb片段，使用所述片段将上文所述的GRBPua菌株转化成腺嘌呤原养型。筛选需要甲酰四氢叶酸的所得Ade+转化株，并且通过PCR分析筛选同源整合的所述转化株。 
可用通过使用以下引物且以解脂耶氏酵母基因组DNA作为模板的突变诱发PCR扩增所产生的3.5kb DNA片段转化具有所得fol3ΔADE1等位基因的菌株： 
    引物M  5′-GGCTCATTGCGCATGCTAACATCG； 
引物N  5′-CGACGATGCTATGAGCTTCTAGACG。 
使用所得含有FOL3 ORF的N末端四分之三序列和ERG9 ORF的C末端十分之九序列的片段转化菌株。通过对诸如萨拉哥酸、伊曲康唑(itraconazole)或氟康唑(fluconazole)的药剂的敏感性筛选角鲨烯合酶活性降低的所得Fol+Ade-转化株。此外，筛选类胡萝卜素产量增加的所得转化株。 
7B.或者，可克隆7A中所产生的PCR片段并且以移除ERG9基因的3′-未翻译区域的方式加以改变。以此片段替代fol3ΔADE1的中断处将导致角鲨烯合酶表达减少[Schuldiner等人(2005)，Cell 123：507-519][Muhlrad和Parker(1999)，RNA 5：1299-1307]，这可如7A中所述予以证实。这一方法也可用于使用ADE1标记中断ERG9 3′-UTR的Fol+ Ade-菌株中。 
7C.在另一方法中，可使用质粒改组(plasmid shuffling)技术[Boeke等人(1987)，Methods Enzymol.154：164-175]并且使用药物敏感性作为表型来鉴别酿酒酵母中部分缺陷的ERG9等位基因。可使用标准分子遗传学技术将缺陷型基因转移到解脂耶氏酵母中。 
实例8：用类异戊二烯生物合成竞争剂多肽的抑制剂处理产类胡萝卜素解脂耶氏酵母菌株导致类胡萝卜素产量增加
如上文所述，用角鲨烯合酶抑制剂萨拉哥酸(0.5μM萨拉哥酸)处理实例2中所产生的培养物并监测β-胡萝卜素的产量。 
实例9：构造产油酿酒酵母菌株
在酿酒酵母菌株中过度表达编码粗糙链孢霉ATP-柠檬酸裂解酶、酿酒酵母AMP脱氨酶和卷枝毛霉胞质苹果酸酶的两个亚单位的基因，以便增加总脂质含量。可将使用相同的同源或功能类似的产油多肽进行的增强脂质产量的类似方法用于诸如红酵母(红法夫酵母)的其它宿主生物体中。 
使用Qiagen RNAEasy试剂盒(Qiagen，Valencia，CA.)由粗糙链孢霉培养物所制备的冻干生物菌体来制备信使RNA。随后，以含有mRNA模板和以下引物对中的任一者的两个反应进行RT-PCR。 
acl1： 
1fwd：5′CACACGGATCCTATAatgccttccgcaacgaccg 
1rev：5′CACACACTAGttaaatttggacctcaacacgaccc； 
acl2： 
2fwd：5′CACACGGATCCAATATAAatgtctgcgaagagcatcctcg 
2rev：5′CACACGCATGCttaagcttggaactccaccgcac。 
用SpeI和BamHI裂解由acl1反应得到的片段，并且用BamHI和SphI裂解由acl2反应得到的片段，且将两个片段与已经NheI和SphI消化的Yep24一起接合，得到质粒“p12”。使用以下引物由酿酒酵母基因组DNA扩增双向GAL1-10启动子： 
gal10：5′CACACGGATCCaatmcaaaaattcttactttttttttggatggac 
gal1：5′CACACGGATCCttttttctccttgacgttaaagtatagagg， 
且用BamHI裂解所得0.67kb片段，并以任一方向将其与BamHI消化的“p12”接合以得到“p1gal2”和“p1gal1”，其分别含有GAL1-acl1/GAL10-acl2和GAL10-acl1/GAL1-acl2(Genebank寄存编号：acl1：CAB91740.2；acl2：CAB91741.2)。 
为扩增编码AMP脱氨酶的酿酒酵母基因和适于表达此基因的启动子，在单独反应中使用以下两个引物对扩增酿酒酵母基因组DNA： 
AMD1 ORF：
AMD1fwd：5′CACACGAGCTCAAAAatggacaatcaggctacacagag 
AMD1rev：5′CACACCCTAGGtcacttttcttcaatggttctcttgaaattg 
GAL7p：
gal7prox：5′CACACGAGCTCggaatattcaactgtttttttttatcatgttgatg 
gal7dist：5′CACACGGAtccttcttgaaaatatgcactctatatcttttag， 
且用SacI和AvrII裂解由AMD1反应得到的片段(2.4kb)，并且用BamHI和SphI裂解由GAL7反应得到的片段(0.7kb)，且将两个片段与已经NheI和BamHI消化的YEp13一起接合，得到质粒“pAMPD”。这一质粒具有在半乳糖可诱导的GAL7启动子控制下编码AMP脱氨酶的酿酒酵母基因AMD1。 
如上文所述，由冻干的卷枝毛霉生物菌体制备信使RNA并且将mRNA模板用于以两种引物进行的RT-PCR反应中： 
MAEfwd：5′CACACGCTAGCTACAAAatgttgtcactcaaacgcatagcaac 
MAErev：5′CACACGTCGACttaatgatctcggtatacgagaggaac， 
且用NheI和SalI裂解所得片段，并且将其与XbaI-和XhoI-消化的pRS413TEF(Mumberg，D等人(1995)Gene，156：119-122)接合，得到质粒“pTEFMAE”，其含有在组成性TEF1启动子控制下编码卷枝毛霉胞质NADP+依赖性苹果酸酶(E.C.1.1.1.40；mce基因；Genebank寄存编号：AY209191)的序列。 
将质粒“p1gal2”、“pAMPD”和“pTEFMAE”依次转化到酿酒酵母菌株中以保留尿嘧啶(“p1gal2”)、亮氨酸(“pAMPD”)和组氨酸(“pTEFMAE”)原养型(Guthrie和Fink Methods in Enzymology 194：1-933，1991)。遵循在如实例3中所述的缺乏尿嘧啶、亮 氨酸和组氨酸的合成完全(SC)培养基中或在2步骤发酵方法中进行的摇瓶测试，测试所得转化株中的总脂质含量。在所述2步骤方法中，将1.5ml来自含有缺乏尿嘧啶、亮氨酸和组氨酸的SC培养基的整夜2ml旋转管培养物中的细胞离心，以蒸馏水洗涤并且将其再悬浮于适于脂质积累的20ml限氮培养基(30g/L葡萄糖、1.5g/L酵母萃取物、0.5g/L NH4Cl、7g/L KH2PO4、5g/L Na2HPO4-12H2O、1.5g/L MgSO4-7H2O、0.08g/LFeCl3-6H2O、0.01g/L ZnSO4-7H2O、0.1g/L CaCl2-2H2O、0.1mg/L MnSO4-5H2O、0.1mg/LCuSO4-5H2O、0.1mg/L Co(NO3)2-6H2O；pH 5.5(J Am Oil Chem Soc 70：891-894(1993)))中。 
使用荧光探针、尼罗红(Nile Red)分析经修饰和对照酿酒酵母菌株的胞内脂质含量(J Microbiol Meth(2004)56：331-338)。简单来说，用尼罗红对在缓冲液中稀释的细胞染色，在488nm下激发，并且获取400nm-700nm波长范围内的荧光发射光谱，且将其与未经尼罗红染色的细胞的相应光谱相比较。为证实由快速评估方法得到的结果，如所述，通过对由干细胞直接转甲基酯化得到的总脂肪酸进行气相色谱分析来测定总脂质含量(Appl Microbiol Biotechnol.2002 Nov；60(3)：275-80)。未经转化的酿酒酵母菌株在YPD和脂质积累培养基中生长后分别产生6％和10％的总脂质(以细胞干重计)。表达多种产油多肽的酵母菌株在YPD和脂质积累培养基中生长后分别产生17％和25％的总脂质。 
实例10：将异源胡萝卜素羟化酶引入产类胡萝卜素解脂耶氏酵母菌菌株中以产生玉米黄素
用已经SalI裂解的pMB4692转化MF578(tef-carRP tef-carB)。通过PCR分析推断含有tef-crtZ的若干Ura+菌落能够在YPD摇瓶中产生玉米黄素，且在一种情况下，所有胡萝卜素都耗尽。 
本说明书全文参考以下各表： 
表1.乙酰辅酶A羧化酶多肽的实例 
Figure S2006800088162D00441
表2.丙酮酸脱羧酶多肽的实例 
Figure S2006800088162D00451
表3.异柠檬酸脱氢酶多肽的实例 
Figure S2006800088162D00461
表4.ATP-柠檬酸裂解酶多肽的实例 
Figure S2006800088162D00471
表5.苹果酸酶多肽的实例 
Figure S2006800088162D00481
Figure S2006800088162D00491
    行  Genbank 寄存编号     Genbank GI
    181  JC5967     7431234
    182  NP_197960     15239517
    183  NP_651959     21356279
    184  CAB64263     6634090
    185  BAB20887     54606800
    186  EAL27424     54638022
    187  NP_006671     5729920
    188  AAB08874     1561774
    189  1PJLH     33358128
    190  1GZ4D     22218682
    191  1QR6B     5822327
    192  1PJ3D     39654475
    193  P22178     126736
    194  XP_410305     49097690
    195  AAH22472     18490280
表6.AMP脱氨酶多肽的实例 
Figure S2006800088162D00511
表7.乙酰乙酰辅酶A硫解酶多肽的实例 
    行  Genbank 寄存编号     Genbank GI
    1  P10551     135758
    2  Q04677     418002
    3  Q12598     34925109
    4  T10247     7433657
    5  T42741     11257345
    6  AAL18924     16417944
    7  AAM67058     21618008
    8  AAO51605     28829030
    9  AAU95618     53854350
    10  AAU95619     53854352
    11  BAA97003     8777413
    12  CAE76429     38567134
    13  BAK90852     46431255
    14  EAL32264     54643520
    15  NP_015297     6325229
    16  NP_568694     30695411
    17  NP_572414     24640423
    18  NP_596686     19113478
    19  NP_851154     30695409
    20  NP_908411     34894172
    21  NP_974900     42573608
    22  NP_974901     42573610
    23  NP_984262     45188039
    24  XP_389497     46134945
    25  XP_401186     49074048
    26  XP_405546     49087148
    27  XP_449306     50293789
    28  XP_449306     50293789
    29  XP_450298     50899020
    30  XP_453599     50307241
    31  XP_460741     50424309
    32  XP_500646     50546253
表8.HMG-CoA合酶多肽的实例 
Figure S2006800088162D00531
表9.HMG-CoA还原酶多肽的实例 
Figure S2006800088162D00541
表10.甲羟戊酸激酶多肽的实例 
Figure S2006800088162D00551
    行  Genbank 寄存编号     Genbank GI
    89  NP_560495     18313828
    90  YP_187834     57866187
    91  EAK40782     44602942
    92  CAC51370     15212070
    93  AAG02424     9937364
    94  YP_185521     57651465
    95  YP_040044     49482820
    96  YP_194037     58337452
    97  D86675     25400965
    98  NP_763916     27467279
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    102  H89827     25507776
    103  ZP_003149     48861061
    104  EAK17824     44570143
    105  EAH86276     44235719
    106  YP_118418     54024176
    107  ZP_003196     48865749
    108  AAG02430     9937372
    109  NP_269075     15674901
    110  NP_802520     28896170
    111  AAL97579     19748102
    112  ZP_003666     56808907
    113  NP_965060     42519130
    114  NP_819639     29653947
    115  EAD97024     43484567
    116  BAD86800     57753870
表11.磷酸甲羟戊酸激酶多肽的实例 
    行  Genbank 寄存编号     Genbank GI
    1  AAA34596     171479
    2  XP_452514     50305111
    3  NP_985210     45190956
    4  XP_446144     50287429
    5  XP_462340     50427455
    6  EAL04096     46444824
    7  EAL03941     46444668
    8  XP_503619     50552418
    9  XP_389940     46136497
    10  XP_329795     32418634
    11  XP_369652     39976529
    12  XP_406448     49089559
    13  NP_593421     19114333
    14  XP_568385     58261950
    15  EAL17628     50254887
    16  AAL18926     16417948
    17  BAD43274     51969164
    18  BAD44652     51971975
    19  XP_398375     49068172
    20  BAD44486     51971643
    21  F90479     25393214
    22  YP_194039     58337454
表12.甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶多肽的实例 
Figure S2006800088162D00571
    行  Genbank 寄存编号     Genbank GI
    89  BAD07376     40882372
    90  NP_968512     42523132
    91  EAI06705     44265427
    92  YP_060018     50914046
    93  AAG02451     9937401
    94  NP_269076     15674902
    95  ZP_003666     56808906
    96  NP_688323     22537472
    97  NP_735832     25011437
    98  EAC40267     43149093
    99  AAL97580     19748103
    100  EAI76915     44367119
    101  EAD35042     43339207
    102  YP_073129     51598941
    103  EAI90092     44385501
    104  BAB07818     9711347
    105  EAD72850     43433025
    106  NP_212820     15595031
    107  YP_124337     54297968
    108  YP_096056     52842257
    109  EAA39903     29248368
    110  EAH06252     44088237
    111  YP_127354     54294939
    112  EAD45753     43361830
    113  NP_802519     28896169
表13.IPP异构酶多肽的实例 
Figure S2006800088162D00591
Figure S2006800088162D00601
表14.FPP合酶多肽的实例 
    行  Genbank 寄存编号     Genbank GI
    89  CAA87327     1160178
    90  BAD20729     47776234
    91  BAC53873     30984142
    92  BAB69490     15991313
    93  NP974565     42572937
    94  CAA08918     5678609
    95  AAP86267     32527731
    96  AAO17735     30522953
    97  AAK71861     14647139
    98  AAL73357     18478919
    99  AAO63552     29124957
    100  CAI00471     56498227
    101  NP_701155     23508486
    102  XP_474180     50929305
    103  AAL73358     18478922
    104  EAH48995     44167328
    105  NP_493027     17508563
    106  CAE71711     39580204
    107  XP_487220     51766977
表15.GGPP合酶多肽的实例 
Figure S2006800088162D00631
Figure S2006800088162D00641
Figure S2006800088162D00651
    行     Genbank    寄存编号     Genbank GI
    273     YP_175959     56964228
    274     YP_186407     57650478
    275     YP_190690     58038726
    276     AAW66658     58201026
    277     YP_194187     58337602
    278     YP_197469     58579257
    279     YP_201938     58582922
    280     YP_196510     58617311
表16.角鲨烯合酶多肽的实例 
    行  Genbank 寄存编号     Genbank GI
    1  AAA34597     171481
    2  CAA42583     3686
    3  Q9HGZ6     51704336
    4  BAB12207     9955387
    5  XP_453457     50306959
    6  Q752X9     51701405
    7  O74165     51701378
    8  XP_458579     50420093
    9  EAK95451     46436082
    10  P78589     2499979
    11  Q9Y753     51701459
    12  XP_407513     49092104
    13  XP_364394     39958237
    14  Q7S4Z6     51701416
    15  CAD60581     27764301
    16  XP_389557     46135731
    17  NP_595363     19112155
    18  B48057     477750
    19  NP_034321     34328173
    20  CAH92517     55731622
    21  AAF00038     6002565
    22  P53798     1706773
    23  NP_004453     31542632
    24  AAP36671     30584837
    25  1EZFC     11514497
    26  AAH09251     14328083
    27  AAH84016     54035372
    28  I52090     2136196
    29  XP_420043     50745256
    30  AAH81810     51858605
    31  CAE48363     50841455
    32  XP_569783     58265254
    33  XP_569782     58265252
    34  XP_534557     57105080
    35  XP_401989     49075920
[0327] 表17.八氢番茄红素脱氢酶多肽的实例 
Figure S2006800088162D00671
Figure S2006800088162D00681
Figure S2006800088162D00691
Figure S2006800088162D00711
表18.八氢番茄红素合酶多肽和番茄红素环化酶多肽的实例 
Figure S2006800088162D00721
Figure S2006800088162D00731
  行  Genbank 寄存编号     Genbank GI
  273  ZP_002450     47575031
  274  ZP_002680     48763469
  275  ZP_002710     48766450
  276  ZP_002791     48782680
  277  ZP_002892     48832182
  278  ZP_002916     48834623
  279  ZP_003036     48849426
  280  ZP_003269     48893702
  281  ZP_003351     52007802
  282  ZP_003487     53730362
  283  ZP_003501     53759405
  284  ZP_003591     53798896
  285  ZP_003628     54030691
表19.类胡萝卜素酮酶多肽的实例 
Figure S2006800088162D00761
    行  寄存编号     GI编号
    89  XP_380194     46102628
    90  XP_383758     46115480
    91  XP_405100     49086048
    92  XP_409222     49095522
    93  YP_102417     53725671
    94  YP_108945     53719959
    95  YP_132414     54302421
    96  YP_154670     56459389
    97  YP_166682     56696325
    98  YP_168846     56698471
    99  YP_172377     56751676
    100  ZP_001068     23124870
    101  ZP_001112     53688676
    102  ZP_001607     53764743
    103  ZP_001757     46118877
    104  ZP_001787     53736018
    105  ZP_002218     46321435
    106  ZP_002456     47575608
    107  ZP_003028     48848557
    108  ZP_003107     48856640
    109  ZP_003264     48893204
    110  ZP_003458     53688805
    111  ZP_003513     53763576
表20.类胡萝卜素羟化酶多肽的实例 
Figure S2006800088162D00781
表21.虾青素合酶多肽和假定虾青素合酶多肽的实例 
行 Genebank寄 存编号  Genebank GI
1  AAM56288  21501451
2  XP_571276  58268240
3  EAL20013  50257304
4  XP_401804  49075484
5  XP_397817  49067054
6  XP_399595  49070612
7  XP_403279  49079218
8  XP_382294  46110473
9  XP_406021  49088382
10  XP_381224  46108332
11  XP_391479  46139577
12  XP-569261  58264210
13  EAL22841  50260180
14  XP_359866  39940658
表22.类胡萝卜素ε羟化酶多肽的实例 
寄存编号  GI 蛋白质描述
ABB52076  79155148 推定ε环胡萝卜素羟化酶[胡萝卜属野胡萝卜(Daucus carotasubsp.sativus)]
BAD94136  62319017 细胞色素P450样蛋白[拟南芥(Arabidopsis thaliana)]
ABD28565  87162770 E类P450，I组[蒺藜苜蓿(Medicago tmncatula)]
AAT28222  47498772 推定97B2样细胞色素P450[银杏(Ginkgo biloba)]
ABC68396  85001685 细胞色素P450单加氧酶CYP97A[大豆(Glycine max)]
ABC59110  84514203 细胞色素P450单加氧酶CYP97B[蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)]
NP 190881  42565881 LUT1(叶黄素缺陷型1)；结合氧[拟南芥]
ABB47954  78708979 推定细胞色素P450单加氧酶[水稻(日本水稻型(japonicacultivar-group))]
NP 922604  37536604 推定细胞色素P450单加氧酶[水稻(日本水稻型)]
表23.番茄红素环化酶多肽(β和ε亚单位)的实例 
寄存编号 GI 蛋白质描述
AAK07431 12746307 番茄红素ε-环化酶[侧金盏花(Adonis palaestina)]
ABB52073 79154988 推定番茄红素ε环化酶[胡萝卜属野胡萝卜]
Q38932 27735211 番茄红素ε环化酶，叶绿体前体
AAB53336 1399181 番茄红素ε环化酶
AAG10428 9971816 ε环化酶[万寿菊(Tagetes erecta)]
AAK07434 12746313 番茄红素ε-环化酶[莴苣(Lactuca sativa)]
AAM45382 21360359 ε环化酶[万寿菊]
O65837 11132841 番茄红素ε环化酶，叶绿体前体
AAL69394 18419661 番茄红素ε-环化酶[菠菜(Spinacia oleracea)]
BAE79549 87299433 番茄红素ε-环化酶[菊花(Chrysanthemum x morifolium)]
XP 463351 50901836 推定番茄红素ε-环化酶[水稻(Gaponica cultivar型)]
AAS48096 44887640 ε番茄红素环化酶[柑橘(Citrus sinensis)]
AAX92679 62638188 番茄红素ε环化酶[文日(Citrus maxima)]
AAL92114 19569601 番茄红素ε-环化酶[葡萄柚(Citrus x paradisi)]
AAK07433 12746311 番茄红素ε-环化酶[马铃薯(Solanum tuberosum)]
AAL47019 17864021 番茄红素ε-环化酶[柑橘]
AAT46065 48686703 叶绿体番茄红素ε-环化酶前体[莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)]
BAD07293 40809769 番茄红素ε-环化酶[柠檬(Citrus limon)]
BAD07285 40809753 番茄红素ε-环化酶[柑橘]
BAD07277 40809737 番茄红素ε-环化酶[蜜柑(Citrus unshiu)]
EAJ62839 44489138 未知[环境序列]
BAE43547 73993068 推定番茄红素β环化酶[落羽杉(Taxodium distichum var.distichum)]
BAE43550 73993074 推定番茄红素β环化酶[落羽杉]
BAE43557 73993088 推定番茄红素β环化酶[池杉(Taxodium distichum var.imbricarium)]
BAE43558 73993090 推定番茄红素β环化酶[池杉]
BAE43553 73993080 推定番茄红素β环化酶[池杉]
BAE43545 73993064 推定番茄红素β环化酶[落羽杉]
BAE43556 73993086 推定番茄红素β环化酶[池杉]
BAE43552 73993078 推定番茄红素β环化酶[落羽杉]
BAE43560 73993094 推定番茄红素β环化酶[池杉]
BAE43554 73993082 推定番茄红素β环化酶[池杉]
BAE43551 73993076 推定番茄红素β环化酶[落羽杉]
BAE43519 73993012 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉(Cryptomeria japonica)]
BAE43535 73993044 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAE43541 73993056 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAE43542 73993058 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAE43517 73993008 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAE43534 73993042 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAE43537 73993048 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
[0349] 
BAE43533  73993040 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAD02774  38603277 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAD02766  38603261 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAE43540  73993054 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAE43514  73993002 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAE43544  73993062 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAE43538  73993050 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAE43528  73993030 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAE43546  73993066 推定番茄红素β环化酶[落羽杉]
BAE43526  73993026 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAE43543  73993060 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAD02742  38603213 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAD02770  38603269 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAE43522  73993018 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAE43559  73993092 推定番茄红素β环化酶[池杉]
BAE43527  73993028 推定番茄红素β环化酶[日本柳杉]
BAE43548  73993070 推定番茄红素β环化酶[落羽杉]
AAF44700  14550425 番茄红素β-环化酶[甘橘]
BAE43555  73993084 推定番茄红素β环化酶[池杉]
BAE43549  73993072 推定番茄红素β环化酶[落羽杉]
AAUl4144  51922063 番茄红素β-环化酶[柑橘]
AAN86060  27261727 番茄红素环化酶[蜜柑]
AAR89632  40756518 番茄红素-β-环化酶[文旦]
AAM21152  20530862 番茄红素β-环化酶[柑橘]
AAD38049  13959731 番茄红素环化酶[葡萄柚]
AAU05146  51511939 番茄红素β-环化酶[柑橘]
AAU05145  51511937 番茄红素β-环化酶[柑橘]
AAK07430  12746305 番茄红素β-环化酶[侧金盏花(Adonis palaestina)]
ABB72443  82394885 番茄红素β-环化酶[柑橘]
BAE79544  87299423 番茄红素β-环化酶[菊花]
BAE78471  85717882 番茄红素β环化酶[西洋蒲公英(Taraxacum officinale)]
O43415  11133019 番茄红素β环化酶，叶绿体前体
AAF23013  6665782 番茄红素ε-环化酶[胡萝卜(Daucus carota)]
ABB52071  79154899 推定番茄红素β环化酶[胡萝卜属野胡萝卜]
AAW88382  59665024 番茄红素β-环化酶[枸杞(Lycium barbarum)]
AAG10429  9971818 β环化酶[万寿菊]
AAM45381  21360357 β环化酶[万寿菊]
AAM14335  20259239 推定番茄红素β环化酶[拟南芥]
AAO18661  27728515 番茄红素β-环化酶[玉米(Zea mays)]
AAA81880  735882 番茄红素环化酶
Q43503  11133022 番茄红素β环化酶，叶绿体前体
S66350  2129931 番茄红素β-环化酶(EC 5.5.1.-)-番茄
XP 464409  50905841 推定番茄红素β-环化酶[水稻(日本水稻型)]
[0350] 
CAD70565  45237491 番茄红素环化酶[红木(Bixa orellana)]
Q43578  11133025 番茄红素β环化酶，叶绿体前体
AAL92175  19569782 β-番茄红素环化酶[宫灯百合(Sandersonia aurantiaca)]
AAX54906  61742130 推定叶绿体番茄红素β环化酶前体[莱茵衣藻]
S66349  2129954 番茄红素β-环化酶(EC 5.5.1.-)-烟草
AAG21133  10644119 成色素细胞特异性番茄红素β-环化酶[番茄(Lycopersiconesculentum)]
CAB92977  8247354 新叶黄素合酶[马铃薯]
CAB93342  8249885 新叶黄素合酶[番茄]
Q9SEA0  11131528 辣椒红(Capsanthin)/辣椒玉红素(capsorubin)合酶，叶绿体前体
Q42435  12643508 辣椒红/辣椒玉红素合酶，叶绿体前体
AAO64977  37730608 番茄红素β环化酶[雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)]
Q40424  11133011 番茄红素β环化酶，叶绿体前体
ABB52072  79154940 推定辣椒红-辣椒玉红素合酶[胡萝卜属野胡萝卜]
     
AAQ02668  33304511 番茄红素环化酶[谷子(Setaria italica)]
CAA54961  840729 推定成色素细胞氧化-还原酶[辣椒(Capsicum annuum)]
EAJ62838  44489136 未知[环境序列]
YP_401079  81300871 番茄红素环化酶β和ε[细长聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 7942]
YP_172741  56752040 番茄红素环化酶[细长聚球藻PCC 6301]
ZP_011...  88808972 番茄红素β环化酶[聚球藻属WH 7805]
EAK50052  44615956 未知[环境序列]
NP_892751  33861190 推定番茄红素ε环化酶[海洋原绿球藻(原绿球藻subsp.pastoris)品系CCMP1986]
NP_875182  33240240 番茄红素ε环化酶[海洋原绿球藻品系CCMP1375]
YP_382237  78213458 番茄红素环化酶，β和ε[聚球藻属CC9605]
YP_397130  78779018 番茄红素环化酶，β和ε[原绿球藻品系MIT 9312]
NP_896821  33865262 番茄红素β环化酶[原绿球藻WH 8102]
YP 397570  78779458 番茄红素环化酶，β和ε[原绿球藻品系MIT 9312]
ZP 010...  87302144 番茄红素环化酶[聚球藻属WH 5701]
EAK17149  44569190 未知[环境序列]
YP_291882  72382527 番茄红素环化酶，β和ε[原绿球藻品系NATL2A]
NP_875528  33240586 番茄红素β环化酶相关脱氢酶[海洋原绿球藻品系CCMP1375]
NP_893181  33861620 推定番茄红素β环化酶[海洋原绿球藻品系CCMP1986]
NP_895600  33864040 推定番茄红素ε环化酶[原绿球藻品系MIT 9313]
EAI47456  44325573 未知[环境序列]
YP_291268  72381913 番茄红素环化酶，β和ε[原绿球藻品系NATL2A]
ZP_010...  84517806 番茄红素β环化酶相关脱氢酶[原绿球藻品系MIT 9211]
AAF34191  6970079 番茄红素ε环化酶[胡萝卜]
ZP_010...  84518202 番茄红素ε环化酶[原绿球藻品系MIT 9211]
YP_376736  78184301 番茄红素环化酶，β和ε[聚球藻属CC9902]
ZP_003...  66796756 番茄红素环化酶，β和ε[Deinococcus geothermalis DSM 11300]
[0351] 
NP_894954  33863394 推定番茄红素β环化酶[原绿球藻品系MIT 9313]
AAT76051  50365502 番茄红素环化酶[克里曼丁橘(Citrus Clementina)]
EAK22047  44576122 未知[环境序列]
NP_294525  15805827 番茄红素环化酶[耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)R1]
表24.类胡萝卜素葡糖基转移酶多肽的实例 
寄存编号GI GI 蛋白质描述
AAA21261 148395 CrtX[成团泛菌(Pantoea agglomerans)]
AAN85597 27228291 玉米黄素葡糖基转移酶[玉米细菌性枯萎病菌(Pantoeastewartii)]
BAB79601 18143446 crtX[(成团泛菌pv.milletiae)]
AAZ73147 72536082 玉米黄素葡糖基转移酶[肠杆菌科细菌(Enterobacteriaceaebacterium)DC413]
AAZ73128 72536060 玉米黄素葡糖基转移酶[肠杆菌科细菌DC260]
AAZ73140 72536074 玉米黄素葡糖基转移酶[肠杆菌科细菌DC416]
Q01330 231911 玉米黄素葡糖基转移酶
ZP_006... 71674312 UDP-糖基转移酶，MGT[红海束毛藻(Trichodesmiumerythraeum)IMS101]
NP_439972 16329244 玉米黄素葡糖基转移酶[聚球藻属PCC 6803]
EAH29368 44130903 未知[环境序列]
ZP_005... 67926135 玉米黄素葡糖基转移酶，假定蛋白[Crocosphaera watsonii WH8501]
YP_378763 78188425 假定蛋白Cag_0447[目绿菌(Chlorobium chlorochromatii)CaD3]
ZP_005... 68549418 糖基转移酶，1型[Pelodictyon phaeoclathratiforme BU-1]
ZP_010... 85713606 糖基转移酶，1型[硝化杆菌(Nitrobacter sp.)Nb-311A]
YP_317171 75674750 糖基转移酶，1型[维氏硝化杆菌(Nitrobacter winogradskyi)Nb-255]
ZP 006... 69929171 糖基转移酶，1型[汉堡硝化杆菌(Nitrobacter hamburgensis)XI4]
ZP 009... 84500589 假定蛋白OB2597_11541[Oceanicola batsensis HTCC2597]
ZP_009... 83953176 假定蛋白NAS141_12746[Sulfitobacter sp.NAS-14.1]
ZP_009... 83942121 假定蛋白EE36 07793[Sulfitobacter sp.EE-36]
YP_508020 89052569 糖基转移酶，1型[Jannaschia sp.CCS1]
ZP_010... 85704103 假定蛋白ROS217_13931[玫瑰杆菌属(Roseovarius sp.)217]
ZP_009... 83370850 可能的糖基转移酶[耐氨光合细菌(Rhodobacter sphaeroides)ATCC 17025]
ZP_006... 69934465 糖基转移酶，1型[脱氮副球菌(Paracoccus denitfificans)PD1222]
ZP_009... 83949880 可能的糖基转移酶[Roseovarius nubinhibens ISM]
YP_376237 78183803 推定糖基转移酶[聚球藻属CC9902]
YP_376129 78183695 可能的糖基转移酶[聚球藻属CC9902]
YP_374296 78186253 假定蛋白Plut_0365[绿色非硫黄细菌(Pelodictyon luteolum)DSM 273]
[0354] 
ZP_010... 87301651 推定糖基转移酶[聚球藻属WH 5701]
ZP_011... 88809938 推定糖基转移酶[聚球藻属WH 7805]
BAE47471 78483937 类胡萝卜素葡糖基转移酶[副球菌属N81 106]
ZP_010... 87303273 可能的糖基转移酶[聚球藻属WH 5701]
YP_376127 78183693 可能的糖基转移酶[聚球藻属CC9902]
YP_501334 88196509 假定蛋白SAOUHSC_02880[金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus subsp.aureus)NCTC 8325]
YP_187370 57652300 糖基转移酶，2型家族蛋白[金黄色葡萄球菌COL]
CAA66627 1340131u 未命名蛋白产物[金黄色葡萄球菌]
YP_041987 49484763 推定糖基转移酶[金黄色葡萄球菌MRSA252]
YP_417885 82752144 假定蛋白SAB2436c[金黄色葡萄球菌RP 122]
YP_252404 70725490 假定蛋白SH0489[溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)JCSC1435]
NP_693379 23099913 假定蛋白OB2458[Oceanobacillus iheyensis HTE831]
ZP_008... 82501285 保守的假定蛋白[解糖纤维素菌(Caldicellulosiruptorsaccharolyticus)DSM 8903]
ZP_010... 87303565 段定蛋白WH5701 09900[聚球藻属WH 5701]
表25.酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)多肽的实例 
寄存编号  GI 蛋白质描述
XP_957022  85082953 假定蛋白[粗糙链孢霉N150]
XP_386864  46124621 假定蛋白FG06688.1[玉蜀黍赤霉PH-1]
XP_755172  71000982 二酰基甘油O-酰基转移酶DGAT[烟曲霉Af293]
XP_663763  67539978 假定蛋白AN6159.2[钩巢曲霉FGSC A4]
BAE65302  83775179 未命名蛋白产物[米曲霉]
XP_502557  50550169 假定蛋白[解脂耶氏酵母]
AAS78662  56199782 二酰基甘油酰基转移酶[大豆]
ABB84383  82582915 二酰基甘油酰基转移酶[麻疯树(Jatropha curcas)]
AAV31083  54145459 1，2-二酰基-sn-甘油：乙酰辅酶A酰基转移酶[卫矛(Euonymusalatus)]
AAG23696  10803053 二酰基甘油酰基转移酶[紫苏(Perilla frutescens)]
AAF64065  7576941 推定二酰基甘油酰基转移酶[甘蓝型油菜(Brassica napus)]
AAS01606  41387497 酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶1[非洲木犀榄(Oleaeuropaea)]
AAT73629  50299542 酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶[大豆]
AAM03340  67043496 推定二酰基甘油酰基转移酶[旱金莲(Tropaeolum majus)]
XP_645633  66824557 假定蛋白DDB0202877[盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)]
AAF19345  6625653 二酰基甘油acylCoA酰基转移酶[烟草(Nicotiana tabacum)]
AAY40785  63376239 二酰基甘油酰基转移酶DGAT2[芥菜(Brassica juncea)]
AAW47581  57231736 二酰基甘油酰基转移酶[水稻(日本水稻型)]
AAR11479  38146080 二酰基甘油酰基转移酶[蓖麻(Ricinus communis)]
AAY40784  63376226 二酰基甘油酰基转移酶DGAT1[芥菜]
[0357] 
AAP68322 31711932 At2gl9450[拟南芥]
AAW51456 57545061 二酰基甘油酰基转移酶[日本百脉根(Lotus corniculatus var.aponicus)1
AAD45536 5579408 推定二酰基甘油酰基转移酶[甘蓝型油菜]
BAD53762 53791817 推定酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶[水稻(日本水稻型)]
NP_956024 41054343 假定蛋白LOC325875[斑马鱼(Danio rerio)]
AAL49962 18642598 二酰基甘油酰基转移酶1[西藏黄牛(Bos taurus)]
XP_930884 89028385 类似于二酰基甘油O-酰基转移酶1(甘油二酯酰基转移酶)(ACAT相关基因)[智人]
NP_777118 27819636 二酰基甘油O-酰基转移酶1[西藏黄牛]
Q9GMF1 18202926 二酰基甘油O-酰基转移酶1(甘油二酯酰基转移酶)
NP_036211 6912332 二酰基甘油0-酰基转移酶1[智人]
AAH06263 34782946 DGAT1蛋白[智人]
XP_780515 72006039 类似于二酰基甘油O-酰基转移酶1[紫海胆(Strongylocentrotuspurpuratus)]
AAD40881 5225382 推定二酰基甘油酰基转移酶[甘蓝型油菜]
XP_539214 73974769 类似于二酰基甘油O-酰基转移酶1(ACAT相关基因产物1)同功异形物1[狗(Canis familiaris)]
AAZ22403 71063860 二酰基甘油O-酰基转移酶1[水牛(Bubalus bubalis)]
NP_999216 47522918 二酰基甘油酰基转移酶[猪(Sus scrofa)]
NP_001... 50539976 假定蛋白LOC436731[斑马鱼]
XP_849176 73974767 类似于二酰基甘油O-酰基转移酶1(ACAT相关基因产物1)同功异形物2[狗]
NP_505828 71997360 H19N07.4[秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)]
AAF82410 9049538 二酰基甘油酰基转移酶[秀丽隐杆线虫]
CAE75170 39591950 假定蛋白CBG23 107[Caenorhabditis briggsae]
XP_626337 66358318 二酰基甘油酰基转移酶1[微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)IowaII]
XP_668402 67624239 酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶1相关酶[人隐孢子虫(Cryptosporidium hominis)TU502]
AAP94208 33113253 酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶1相关酶[刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)]
AAP94209 33113255 酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶1相关酶[刚地弓形虫]
XP_579557 62652535 预期：二酰基甘油O-酰基转移酶1[褐家鼠(Rattus norvegicus)]
BAC66171 29170489 二酰基甘油酰基转移酶[小白鼠(Mus musculus)]
Q9ERM3 18202872 二酰基甘油O-酰基转移酶1(甘油二酯酰基转移酶)
AAL78366 18698659 酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶[黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)]
NP_995724 45552403 CG31991-PD，同功异形物D[黑腹果蝇]
NP_724017 24584734 CG31991-PC，同功异形物C[黑腹果蝇]
XP_858062 73974765 类似于二酰基甘油O-酰基转移酶1(ACAT相关基因产物1)同功异形物3[狗]
XP 728984 82915156 假定蛋白PY01256[约氏疟原虫(Plasmodium yoelii yoelii)品系17XNL]
[0358] 
CAG11944  47225461 未命名蛋白产物[金娃娃(Tetraodon nigroviridis)]
BAD27526  50199438 酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶[真核生物合成构筑体]
XP_317656  31226099 ENSANGP00000002281[疟蚊(Anopheles gambiae)品系PEST]
AAV59457  55733950 推定二酰基甘油酰基转移酶[水稻(日本水稻型)]
EAL33593  54644853 GA16599-PA[果蝇(Drosophila pseudoobscura)]
XP_678753  68073677 二酰基甘油O-酰基转移酶[伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)品系ANKA]
XP_520014  55631434 预期：类似于二酰基甘油O-酰基转移酶1(甘油二酯酰基转移酶)[大猩猩(Pan troglodytes)]
CAG10815  47219451 未命名蛋白产物[金娃娃]
XP_624754  66522700 预期：类似于ENSANGP00000002281[西方蜜蜂(Apismellifera)]
CAC69884  15620769 二酰基甘油酰基转移酶I[褐家鼠]
XP_686181  68363630 预期：类似于二酰基甘油O-酰基转移酶1(甘油二酯酰基转移酶)[斑马鱼]
XP_734008  70921323 二酰基甘油O-酰基转移酶[夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudichabaudi)]
XP_73128  68062248 假定蛋白PB300300.00.0[伯氏疟原虫品系ANKA]
AAS72376  45642963 乙酰辅酶A：胆固醇酰基转移酶β[刚地弓形虫]
AAS72375  45642961 乙酰辅酶A：胆固醇酰基转移酶α[刚地弓形虫]
NP_586145  9074639 固醇O-酰基转移酶[兔脑原虫(Encephalitozoon cuniculi)GB-M1]
XP_640280  66812202 假定蛋白DDB0205259[Dicryostelium discoideum]
AAY40783  63376221 二酰基甘油酰基转移酶[芥菜]
XP_765774  71032265 二酰基甘油O-酰基转移酶[小泰勒虫(Theileria parva)品系Muguga]
Q876L2  34582301 固醇O-酰基转移酶2(固醇酯合酶2)
XP_571260  58268208 固醇O-酰基转移酶[新型隐球菌新生变种JEC21]
EAL20032  50257323 假定蛋白CNBF3580[新型隐球菌新生变种B-3501A]
XP_954478  84999514 acyl transferase[环形泰勒虫(Theileria annulata)品系Ankara]
XP_505086  50555355 假定蛋白[解脂耶氏酵母]
NP 588558  19076058 假定蛋白SPCP1E11.05c[粟酒裂殖酵母972h-]
AAC49441  1389739 乙酰辅酶A：固醇酰基转移酶
NP_014416  6324346 乙酰辅酶A：固醇酰基转移酶，Are1p的同功酶；Are2p[酿酒酵母]
XP_750354  70991010 固醇O-酰基转移酶APE2[烟曲霉Af293]
XP_382192  46110268 假定蛋白FG02016.1[玉蜀黍赤霉PH-1]
BAE54934  83764790 未命名蛋白产物[米曲霉]
XP_885914  76617939 类似于固醇O-酰基转移酶2(胆固醇酰基转移酶2)(ACAT-2)同功异形物2[西藏黄牛]
XP_591251  76617937 类似于固醇O-酰基转移酶2(胆固醇酰基转移酶2)(ACAT-2)同功异形物1[西藏黄牛]
BAC00846  21392392 乙酰辅酶A：胆固醇酰基转移酶2[褐家鼠]
NP_649816  28571583 CG8112-PA[黑腹果蝇]
[0359] 
NP_666176  22122547 固醇O-酰基转移酶2[小白鼠]
O88908  18202245 固醇O-酰基转移酶2(胆固醇酰基转移酶2)(ACAT-2)
XP_761502  71022545 假定蛋白UM05355.1[玉米黑粉菌521]
NP_714950  40254723 固醇O-酰基转移酶2[褐家鼠]
EAQ86094  88178626 假定蛋白CHGG 07347[球毛壳菌(Chaetomium globosum)CBS148.51]
XP_461395  50425599 假定蛋白DEHA0F25652g[汉氏德巴利氏酵母(Debaryomyceshansenii)CBS767]
XP_661812  67527926 假定蛋白AN4208.2[钩巢曲霉FGSC A4]
AAH96091  64654094 固醇O-酰基转移酶2[智人]
O75908  18202149 固醇O-酰基转移酶2(胆固醇酰基转移酶2)(ACAT-2)
AAH96090  64652990 固醇O-酰基转移酶2[智人]
AAK48829  13898623 乙酰辅酶A：胆固醇酰基转移酶-2[智人]
XP_543637  73996435 预期：类似于固醇O-酰基转移酶2[狗]
O77759  18202176 固醇O-酰基转移酶2(胆固醇酰基转移酶2)(ACAT-2)
AAO32474  28564191 ARE2[saccharomyces castellii]
XP_323485  32405744 假定蛋白[粗糙链孢霉]
NP_982606  45184888 AAR065Cp[高氏假囊酵母(Eremothecium gossypii)]
NP_593708  19114620 假定蛋白SPAC13G7.06[粟酒裂殖酵母972h-]
AAO32554  28564940 ARE2[克鲁弗酵母]
EAL28962  54639560 GA20833-PA[果蝇]
XP_449806  50294790 假定蛋白CAGL0M10571g[光滑假丝酵母CBS138]
NP_033256  84619697 固醇O-酰基转移酶1[小白鼠]
Q61263  18202591 固醇O-酰基转移酶1(胆固醇酰基转移酶1)(ACAT-1)
BAC34925  26342537 未命名蛋白产物[小白鼠]
XP_452607  50305295 未命名蛋白产物[乳酸克鲁维酵母]
NP_001...  77735363 假定蛋白LOC504287[西藏黄牛]
Q60457  18202585 固醇O-酰基转移酶1(胆固醇酰基转移酶1)(ACAT-1)
XP_320321  58393811 ENSANGP00000016512[疟蚊品系PEST]
XP_320320  58393809 ENSANGP00000016486[疟蚊品系PEST]
O70536  18202126 固醇O-酰基转移酶1(胆固醇酰基转移酶1)(ACAT-1)
XP_714776  68482533 乙酰辅酶A胆固醇酰基转移酶[白假丝酵母SC5314]
P84285  56404462 固醇O-酰基转移酶2(固醇酯合酶)(ASAT)
AAH77916  50416229 Soatl-prov蛋白[非洲爪蟾(Xenopus laevis)]
XP_692855  68364838 预期：类似于Soatl-prov蛋白[斑马鱼]
CAI13574  55960156 固醇O-酰基转移酶(乙酰辅酶A：胆固醇酰基转移酶)1[智人]
AAL56227  18028942 胆固醇酰基转移酶1[西部低地大猩猩(Gorilla gorilla)]
AAL56228  18028944 胆固醇酰基转移酶1[红毛猩猩(Pongo pygmaeus)]
AAC37532  4878022 乙酰辅酶A：胆固醇酰基转移酶[智人]
2201440A  1585676 乙酰辅酶A/胆固醇酰基转移酶
Q876L3  34582302 固醇O-酰基转移酶1(固醇酯合酶1)
BAE01048  67969393 未命名蛋白产物[食蟹猴(Macaca fascicularis)]
XP_514030  55588858 预期：假定蛋白XP_514030[大猩猩]
XP_547445  73961286 类似于固醇O-酰基转移酶1(胆固醇酰基转移酶1)(ACAT-1)
[0360] 
    [狗]
EAQ84619  88177151 假定蛋白CHGG 08633[球毛壳菌CBS 148.51]
O77761  18202178 固醇O-酰基转移酶1(胆固醇酰基转移酶1)(ACAT-1)
XP_422267  50751122 预期：类似于固醇O-酰基转移酶1(胆固醇酰基转移酶1)(ACAT-1)[红原鸡(Gallus gallus)]
XP_693284  68392980 预期：类似于固醇O-酰基转移酶1(胆固醇酰基转移酶1)(ACAT-1)[斑马鱼]
AAT92940  51013293 YCR048W[酿酒酵母]
XP_956576  85080625 假定蛋白[粗糙链孢霉N150]
XP_624691  66564061 预期：类似于ENSANGP00000016486[西方蜜蜂]
CAF96514  47222847 未命名蛋白产物[金娃娃]
XP_788209  72085563 预期：类似于固醇O-酰基转移酶1[紫海胆]
XP_445307  50285757 未命名蛋白产物[光滑假丝酵母]
CAE70002  39596364 假定蛋白CBG16409[Caenorhabditis briggsae]
CAG07990  47225647 未命名蛋白产物[金娃娃]
NP 510623  17549960 B0395.2[秀丽隐杆线虫]
AAX28331  76157393 SJCHGC04421蛋白[日本血吸虫(Schistosomajaponicum)]
CAI96158  66347204 二酰基甘油O-酰基转移酶[水牛]
XP_390039  46136695 假定蛋白FG09863.1[玉蜀黍赤霉PH-1]
XP_643169  66819019 假定蛋白DDB0203882[盘基网柄菌]
AAO53095  28850306 假定蛋白[盘基网柄菌]
AAB06959  1515472 乙酰辅酶A：胆固醇酰基转移酶[西班牙野兔(Oryctolaguscuniculus)]
NP_945619  39933343 推定藻酸酯o-酰基转移酶AlgI[沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA009]
ZP_008...  77691302 膜结合O-酰基转移酶MB OAT[沼泽红假单胞菌BisB5]
XP_465546  50908115 推定蜡合酶[水稻(日本水稻型)]
表29：异戊二烯基二磷酸合酶多肽的实例 
29A：需要线粒                       体靶向序列的细菌蛋白  
寄存编号 GI 描述
ZP_009... 83373595 反式-己异戊二烯基转移酶[浑球红细菌(Rhodobactersphaeroides)ATCC 170291
ZP_009... 83371280 反式-己异戊二烯基转移酶[浑球红细菌ATCC 170251
CAD24417 20429105 十异戊二烯基二磷酸合酶[Paracoccus zeaxanthinifaciens]
ZP_010... 85705714 香叶基香叶基焦磷酸合酶/聚异戊二烯合酶[玫瑰杆菌属217]
ZP_010... 84515724 十异戊二烯基二磷酸合酶[Loktanella vestfoldensis SKA53]
YP_165582 56695234 十异戊二烯基二磷酸合酶[Silicibacter pomeroyi DSS-3]
ZP_010... 86139019 十异戊二烯基二磷酸合酶[玫瑰杆菌属MED 1931
ZP_009... 83941379 十异戊二烯基二磷酸合酶[Sulfitobacter sp.EE-36]
ZP_009... 83854856 十异戊二烯基二磷酸合酶[Sulfitobacter sp.NAS-14.1]
ZP_006... 69299873 法尼基转移酶[Silicibacter sp.TM1040]
[0363] 
ZP_010... 84683979 香叶基香叶基焦磷酸合酶/聚异戊二烯合酶[红细菌HTCC2654]
ZP_009... 84500217 十异戊二烯基二磷酸合酶[Oceanicola batsensis HTCC2597]
ZP_009... 83952381 十异戊二烯基二磷酸合酶[Roseovarius nubinhibens ISM]
ZP_006... 69937106 反式-己异戊二烯基转移酶[脱氮副球菌PD1222]
ZP_005... 68180845 反式-己异戊二烯基转移酶[Jannaschia sp.CCS1]
ZP_008... 78495595 聚异戊二烯合酶[沼泽红假单胞菌BisBIS]
AAY82368 67866738 十异戊二烯基二磷酸合酶[根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)]
NP_353656 15887975 假定蛋白AGR_C_1125[根癌土壤杆菌菌株C58]
ZP_008... 77688465 法尼基转移酶[沼泽红假单胞菌BisB5]
NP_531334 17934544 辛异戊二烯基二磷酸合酶[根癌土壤杆菌菌株C58]
YP_484709 86748213 法尼基转移酶[沼泽红假单胞菌HaA2]
AAP56240 37903500 十异戊二烯基二磷酸合酶[根癌土壤杆菌]
YP_192388 58040424 十异戊二烯基二磷酸合酶[氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)621H]
     
29B：亚单位1-含有线粒体靶向序列的蛋白质    
寄存编号 GI 描述
T43193 11279237 反式-戊异戊二烯基转移酶同源融合酵母(粟酒裂殖酵母)
AAD28559 4732024 反式-异戊二烯基转移酶[智人]
AA107275 78070698 反式-异戊二烯基转移酶[小白鼠]
BAE48216 81157931 十异戊二烯基二磷酸合酶亚单位1[智人]
AAH49211 29165656 PDSS1蛋白[智人]
Q33DR2 85700953 十异戊二烯基二磷酸合酶亚单位1(茄呢基-二磷酸合酶亚单位1)(反式-异戊二烯基转移酶)
XP_507706 55633583 预期：类似于TPRT蛋白[大猩猩]
XP_586717 76632198 预期：类似于反式-异戊二烯基转移酶[西藏黄牛]
XP_849908 73948851 预期：类似于反式-异戊二烯基转移酶[狗]
     
29C：亚单位2-含有线粒体靶向序列的蛋白质    
寄存编号 GI 描述
O13851 60389474 十异戊二烯基二磷酸合酶亚单位2(十异戊二烯基焦磷酸合酶亚单位2)
BAE48218 81157935 茄呢基二磷酸合酶亚单位2[小白鼠]
BAE48217 81157933 十异戊二烯基二磷酸合酶亚单位2[智人]
表30：PHB-聚异戊二烯基转移酶多肽的实例 
GI 蛋白质描述
51013645 YNR041C[酿酒酵母]
50285815 未命名蛋白产物[光滑假丝酵母]
50311051 未命名蛋白产物[乳酸克鲁维酵母]
45200866 AGL231Wp[高氏假囊酵母]
[0366] 
50555263 假定蛋白[解脂耶氏酵母]
68473193 对羟基苯甲酸：聚异戊二烯基转移酶[白假丝酵母SC5314]
50410039 假定蛋白DEHA0A14212g[汉氏德巴利氏酵母CBS767]
83769349 未命名蛋白产物[米曲霉]
70994900 对羟基苯甲酸-聚异戊二烯基转移酶前体[烟曲霉Af293]
19114131 假定蛋白SPAC56F8.04c[粟酒裂殖酵母972h-]
39973573 假定蛋白MG01067.4[稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)70-15]
85078920 与对羟基苯甲酸聚异戊二烯基转移酶相关的蛋白质，线粒体前体[粗糙链孢霉N150]
76660839 预期：类似于对羟基苯甲酸-聚异戊二烯基转移酶，线粒体[西藏黄牛]
52138578 对羟基苯甲酸-聚异戊二烯基转移酶，线粒体[智人]
18088424 COQ2蛋白[智人]
47221448 未命名蛋白产物[金娃娃]
58385249 ENSANGP00000012220[疟蚊品系PEST]
50746583 预期：类似于假定蛋白CL640[红原鸡]
54638587 GA21912-PA[果蝇]
21355567 CG9613-PA[黑腹果蝇]
71005862 假定蛋白UM01450.1[玉米黑粉菌521]
所属领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的特定实施例的许多等效内容。本发明的范围不打算受限于上文的实施方式，而是如以下权利要求中所述。 

Claims (38)

1.一种重组耶氏酵母属(Yarrowia)真菌，其特征在于：
a.所述真菌因可以积累占其细胞干重至少约20％的脂质而为产油真菌；且
b.所述耶氏酵母属真菌产生至少一种类胡萝卜素，并且其可积累占其细胞干重至少约1％的所产生的类胡萝卜素；
其中所述真菌包含至少一种产类胡萝卜素修饰，且其中所述至少一种产类胡萝卜素修饰赋予所述真菌产生占其细胞干重至少约1％的水平的所述至少一种类胡萝卜素的能力，或赋予所述真菌产生至少一种所述真菌不会自然产生的类胡萝卜素的能力，
其中所述至少一种产类胡萝卜素修饰增加或降低产类胡萝卜素多肽的表达或活性，所述产类胡萝卜素多肽选自由以下多肽组成的群组：八氢番茄红素合酶多肽、八氢番茄红素脱氢酶多肽、和番茄红素环化酶多肽。
2.根据权利要求1所述的耶氏酵母属真菌，其中所述耶氏酵母属真菌为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株。
3.根据权利要求1所述的耶氏酵母属真菌，其中所述真菌含有至少一种产油修饰。
4.根据权利要求3所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种产油修饰改变所述真菌的产油能力。
5.根据权利要求3所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种产油修饰增加至少一种产油多肽的表达或活性。
6.根据权利要求3所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种产油修饰降低至少一种产油多肽的表达或活性。
7.根据权利要求3所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种产油修饰增加至少一种产油多肽的表达或活性，并且降低至少一种其它产油多肽的表达或活性。
8.根据权利要求5或6所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种产油多肽选自由以下多肽组成的群组：乙酰辅酶A羧化酶多肽、丙酮酸脱羧酶多肽、异柠檬酸脱氢酶多肽、ATP-柠檬酸裂解酶多肽、苹果酸酶多肽、AMP脱氨酶多肽和其组合。
9.根据权利要求5或6所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种产油多肽为至少一种选自由表1到表6中任一表中的多肽组成的群组的多肽。
10.根据权利要求5或6所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种产油修饰包含在所述真菌中表达至少一种异源产油多肽。
11.根据权利要求10所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种产油修饰包含表达至少一种编码所述至少一种异源产油多肽的异源基因。
12.根据权利要求10所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种异源产油多肽包含至少两种异源产油多肽。
13.根据权利要求12所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少两种异源产油多肽是来自单一原始生物体。
14.根据权利要求12所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少两种异源产油多肽是来自至少两种不同的原始生物体。
15.根据权利要求1所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种产类胡萝卜素修饰赋予所述真菌产生占其细胞干重至少约1％的水平的所述至少一种类胡萝卜素的能力。
16.根据权利要求1所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种产类胡萝卜素修饰赋予所述真菌产生至少一种所述真菌不会自然产生的类胡萝卜素的能力。
17.根据权利要求1所述的耶氏酵母属真菌，其中所述真菌另外包含至少一种产油修饰，其中所述产油修饰改变所述真菌的产油能力或赋予所述真菌产油能力。
18.根据权利要求1所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种类胡萝卜素选自由虾青素、β-胡萝卜素、角黄素、玉米黄素、叶黄素、番茄红素和其组合组成的群组。
19.根据权利要求1所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种类胡萝卜素主要为虾青素。
20.根据权利要求1所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种产类胡萝卜素修饰增加至少一种产类胡萝卜素多肽的表达或活性并且降低至少一种其它产类胡萝卜素多肽的表达或活性。
21.根据权利要求1或20所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种产类胡萝卜素修饰包含表达至少一种异源产类胡萝卜素多肽。
22.根据权利要求21所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种产类胡萝卜素修饰包含表达至少一种编码所述至少一种异源产类胡萝卜素多肽的异源基因。
23.根据权利要求21所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种异源产类胡萝卜素多肽包含至少两种异源产类胡萝卜素多肽。
24.根据权利要求23所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少两种异源产类胡萝卜素多肽是来自单一原始生物体。
25.根据权利要求23所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少两种异源产类胡萝卜素多肽是来自至少两种不同的原始生物体。
26.根据权利要求1-7和15-20中任一权利要求所述的耶氏酵母属真菌，其特征在于所述真菌积累细胞质体形式的脂质。
27.根据权利要求26所述的耶氏酵母属真菌，其中所述至少一种类胡萝卜素积累于所述细胞质油体中。
28.一种解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)菌株，其包含一种或一种以上产类胡萝卜素修饰，使得所述菌株积累占其细胞干重1％到10％的至少一种类胡萝卜素，其中所述解脂耶氏酵母菌株包含选自由表达以下异源多肽的修饰组成的群组的产类胡萝卜素修饰：八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、和番茄红素环化酶。
29.根据权利要求28所述的菌株，其另一特征在于，其积累占其细胞干重20％到50％的脂质。
30.根据权利要求29所述的菌株，其中所述菌株积累占其细胞干重20％到50％的细胞质油体形式的脂质。
31.根据权利要求28至30中任一权利要求所述的菌株，其中所述菌株积累占其细胞干重1％-10％的β-胡萝卜素。
32.根据权利要求28至30中任一权利要求所述的菌株，其中所述菌株积累占其细胞干重1％-10％的虾青素或叶黄素。
33.一种产生类胡萝卜素的方法，所述方法包含以下步骤：
a.在允许产生所述类胡萝卜素的条件下，培养前述权利要求中任一权利要求所述的耶氏酵母属真菌；
b.和分离所述所产生的类胡萝卜素。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述分离步骤包含分离培养基以获得至少一个富含类胡萝卜素的部分。
35.根据权利要求33所述的方法，其中：所述培养步骤包含在允许将所述类胡萝卜素积累于细胞质油体中的条件下培养所述耶氏酵母属真菌，且所述分离步骤包含分离从所述细胞质油体得到的油。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述类胡萝卜素选自由以下物质组成的群组：虾青素、β-胡萝卜素、角黄素、玉米黄素、叶黄素、番茄红素和其组合。
37.根据权利要求33所述的方法，其中所述类胡萝卜素包含虾青素。
38.一种制备含有类胡萝卜素的食品或饲料添加剂的方法，所述方法包含以下步骤：
a.在允许产生所述类胡萝卜素的条件下，培养权利要求1至32中任一权利要求所述的耶氏酵母属真菌；
b.分离所述类胡萝卜素；和
c.将所述经分离的类胡萝卜素与一种或一种以上其它食品或饲料添加剂组分组合。
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