JP3120684B2

JP3120684B2 - ゲラニルゲラニル二リン酸を合成する変異型ファルネシル二リン酸合成酵素及びそれをコードするｄｎａ

Info

Publication number: JP3120684B2
Application number: JP07025253A
Authority: JP
Inventors: あゆみ小池; 充生小畑; 徳三西野; 信一大沼; 武中沢; 協三小倉; 種俊古山
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 1995-02-14
Filing date: 1995-02-14
Publication date: 2000-12-25
Anticipated expiration: 2015-12-25
Also published as: EP0733709A2; JPH08214877A; EP0733709A3; DE69534198T2; EP0733709B1; US5766911A; DE69534198D1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ファルネシル二リン酸
合成酵素の修飾により得られる、ゲラニルゲラニル二リ
ン酸合成酵素及びその製造方法、並びにそのための遺伝
子系及びその製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】自然界には、炭素数５のイソプレン単位
を基本骨格に持つ鎖状イソプレノイド化合物が多種多様
に存在しており、各種生物の生命活動に重要な役割を果
たしている。その鎖延長機構には、炭素数５のイソペン
テル二リン酸（ＩＰＰ）がその異性体であるジメチルア
リル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）に順次縮合することからな
る一連の触媒反応を行うプレニルトランスフェラーゼと
いう酵素（総称）が働いていることが知られている。イ
ソプレノイド化合物の中でも、炭素数１５のファルネシ
ル二リン酸（ＦＰＰ）はゲラニルゲラニル二リン酸（Ｇ
ＧＰＰ）からキノン類へ至る経路やスクアレンからステ
ロイドに至る経路、さらにはファルネシル化蛋白質、ド
リコールなどの生合成経路につながる重要な分岐点に位
置している。

【０００３】プレニルトランスフェラーゼの特徴とし
て、それぞれの鎖長の生成物は異なる酵素によって得ら
れることが挙げられる。しかしこれらの酵素はイソプレ
ン単位の鎖延長反応を行うという点においては共通の触
媒機能を持っており、事実、アミノ酸配列の相同性など
から基質と結合し、単一縮合に必須なアミノ酸等につい
ては解明されつつある。しかし鎖長を決定する機能につ
いてはまだ不明である。

【０００４】イソプレノイド単位から、ゲラニル二リン
酸、ファルネシル二リン酸、及びゲラニルゲラニル二リ
ン酸への合成経路を図１に示す。この合成経路において
ファルネシル二リン酸を合成するプレニルトランスフェ
ラーゼをファルネシル二リン酸合成酵素と称し、ゲラニ
ルゲラニル二リン酸を合成するプレニルトランスフェラ
ーゼをゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素と称する。フ
ァルネシル二リン酸合成酵素は、バシルス・ステアロサ
ーモフィルス（文献：J.Biochem. 113, 355-363(1993))
のほか、大腸菌（E.Coli）（文献：J.Biochem. 108, 99
5-1000(1990)）、酵母（文献：J.B.C. 264, 19176-1918
4(1989) ）、ラット（文献：Mol.Cell.Biol.７，3138-3
146(1987) ）、及びヒト（文献：J.B.C. 265, 4607-461
4(1990)）においても知られており、それらのアミノ酸
配列も知られている。

【０００５】また、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素
もロドシュードモナス・カプスラタ（Rhodopseudomonas
capusulata）（文献：J.Bacteriol. 154, 580-590(19
83)）、エルウィニア・ウレドボラ（ Erwinia uredovo
ra ）（J.Bacteriol. 172,6704-6712(1990) ）、スルフ
ォロバス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocal
darius）、（J.B.C., 269，14792-14797(1994) ）など
において知られている。しかしながら、ファルネシル二
リン酸合成酵素を修飾することによりゲラニルゲラニル
二リン酸合成酵素が得られるという知見は存在しない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、フ
ァルネシル二リン酸合成酵素の修飾により得られる新規
なゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素、及びその製造方
法、並びにそのための遺伝子系及びその製造方法等を提
供しようとするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、ファルネシル
二リン酸合成酵素をコードする遺伝子に変異処理を施
し、該変異処理を施した遺伝子を発現せしめ、そしてゲ
ラニルゲラニル二リン酸合成酵素を生成せしめる遺伝子
を選択することを特徴とする、ゲラニルゲラニル二リン
酸合成酵素をコードする遺伝子の製造方法を提供する。

【０００８】本発明はまた、上記の方法により製造され
得る、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする
遺伝子、該遺伝子を含んで成る発現ベクター及び該ベク
ターにより形質転換された宿主を提供する。本発明はま
た、上記の遺伝子を発現せしめることを特徴とするゲラ
ニルゲラニル二リン酸合成酵素の製造方法、及びこの製
造方法により得ることができるゲラニルゲラニル二リン
酸合成酵素を提供する。

【０００９】他の観点において、本発明は、ファルネシ
ル二リン酸合成酵素の生来のアミノ酸配列に対して１個
〜少数個のアミノ酸配列が置換、欠失及び／又は付加に
より修飾されてなるアミノ酸配列を有する、ゲラニルゲ
ラニル二リン酸合成酵素を提供する。本発明はさらに、
上記ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードする遺
伝子、該遺伝子を含んで成るベクター、特に発現ベクタ
ー、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主等の
遺伝子系を提供する。

【００１０】本発明はさらに、上記宿主を培養し、培養
物からゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素を採取するこ
とを特徴とするゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の製
造方法を提供する。本発明はまた、基質であるイソペン
テニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸、ゲラニル二
リン酸、ファルネシル二リン酸のいずれかに本発明のゲ
ラニルゲラニル二リン酸合成酵素を作用せしめることを
特徴とする、ゲラニルゲラニル二リン酸又はゲラニルゲ
ラニオールの製造方法を提供する。

【００１１】

【具体的な説明】本発明の遺伝子は、ファルネシル二リ
ン酸合成酵素をコードする遺伝子に変異処理を施し、該
変異処理された遺伝子を発現せしめ、ゲラニルゲラニル
二リン酸合成酵素活性を有する蛋白質を生成せしめる遺
伝子を選択することにより得られる。

【００１２】本発明において使用する、ファルネシル二
リン酸合成酵素をコードする遺伝子としては、その由来
を問わず使用することができる。例えばバシルス・ステ
アロサーモフィルス、大腸菌、酵母、ヒト、ラット、等
由来のファルネシル二リン酸合成酵素及びそれをコード
する遺伝子が知られており、それらの酵素のアミノ酸配
列は、図２に示すごとく高い相同性を有する。従って、
本発明においては具体例としてバシルス・ステアロサー
モフィルス由来の遺伝子を用いるが、バシルス・ステア
ロサーモフィルス由来のファルネシル二リン酸合成酵素
のアミノ酸配列と高い相同性、例えば２０％以上の相同
性を有するアミノ酸配列を有する酵素をコードしている
遺伝子であれば、いずれの由来のものであってもよい。
この様な遺伝子源として、例えばバシルス・ステアロサ
ーモフィルス、大腸菌、酵母、ヒト、ラット、等を用い
ることができる。

【００１３】変異処理の対象となる遺伝子としては、フ
ァルネシル二リン酸合成酵素をコードしており、変異処
理に対して感受性のものであれば、ＲＮＡでもＤＮＡで
もよいが、取扱の便利の点からＤＮＡが好ましく、高い
変異効率を得る観点から、特に一本鎖形態にしたＤＮＡ
が好ましい。一本鎖ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡから一本鎖
ＤＮＡを調製するための常法に従って、例えば二本鎖型
にしたファージに目的とする遺伝子を組み込んで宿主、
例えば大腸菌に導入し、それを培養して溶菌液からファ
ージを回収することにより、あるいは目的とする二本鎖
ＤＮＡを含有するプラスミドを宿主に導入し、ヘルパー
ファージを感染させた後に培養して溶菌液からファージ
を回収することにより得られる。

【００１４】遺伝子の変異は、遺伝子を人為的に変異せ
しめるための常法により行うことができる。この方法と
しては、Ｘ線や紫外線を照射して行う物理的方法、変異
原物質により処理して行う化学的方法、ＤＮＡポリメラ
ーゼによるシスインコーポレーション、合成オリゴヌク
レオチドを利用した方法等が挙げられる。操作の便利さ
や変異効率の観点から化学的方法が好ましい。変異原と
しては、亜硝酸塩、例えば亜硝酸ナトリウム、等を用い
ることができる。一本鎖ＤＮＡに変異を生じさせるため
には亜硝酸塩が特に好ましい。亜硝酸塩等の変異原の濃
度は０．０１〜２Ｍ程度、例えば０．１〜１Ｍ程度であ
り、２０〜３０℃において、１０〜１２０分間処理すれ
ばよい。

【００１５】変異処理した遺伝子の中から、ゲラニルゲ
ラニル二リン酸合成酵素活性を有する蛋白質をコードし
ている遺伝子を選択するには、変異処理した遺伝子を発
現ベクターに組み込み、それを宿主に導入して遺伝子を
発現せしめ、発現生成物がゲラニルゲラニル二リン酸合
成酵素活性を有するか否か試験すればよい。ゲラニルゲ
ラニル二リン酸はフィトエン合成酵素によりフィトエン
に変換され、さらにフィトエン不飽和化酵素により赤色
のリコペンに変換される。

【００１６】従って、例えばフィトエン合成酵素及びフ
ィトエン不飽和化酵素の遺伝子を組み込んだ発現プラス
ミドを宿主、例えば大腸菌に導入し、さらに被験ＤＮＡ
を含有する発現プラスミドを導入して、該宿主を培養す
れば、被験遺伝子がゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素
をコードしている場合、その遺伝子の発現により生成し
たゲラニルゲラニル二リン酸がさらにリコペンにまで変
換され、コロニーが赤色となる。従って、赤色コロニー
を選択することにより、極めて容易に、且つ効率的に目
的とする遺伝子を選択することができる。

【００１７】本発明はまた、ファルネシル二リン酸合成
酵素の生来のアミノ酸配列に対して１個〜少数個のアミ
ノ酸が修飾されているアミノ酸配列を有し、ゲラニルゲ
ラニル二リン酸合成酵素活性を有する蛋白質、すなわち
ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素を提供する。ここ
で、アミノ酸の修飾とは、あるアミノ酸の他のアミノ酸
による置換、アミノ酸の欠失、もしくはアミノ酸の付
加、又はこれらの組合わせを意味する。アミノ酸の置換
が特に好ましい。修飾されるアミノ酸の数として「少数
個」とは、通常１５個程度、好ましくは１０個程度、さ
らに好ましくは５個程度である。すなわち、本発明にお
ける修飾アミノ酸数は１〜１５個程度、好ましくは１〜
１０個程度、特に好ましくは１〜５個程度である。

【００１８】アミノ酸の修飾の部分は、例えば前記のご
とくして変異処理及びゲラニルゲラニル二リン酸合成酵
素をコードしている遺伝子の選択を行った後、選択され
た遺伝子の塩基配列を決定し、その塩基配列に基いてア
ミノ酸配列を推定し、そしてその推定されたアミノ酸配
列と、対応する生来のアミノ酸配列とを比較して、変化
しているアミノ酸部位を決定すればよい。この様にして
決定したアミノ酸配列の１例を図４に示す。

【００１９】図４においては、Ｗ．Ｔと称する列にバシ
ルス・ステアロサーモフィルスのファルネシル二リン酸
合成酵素の生来のアミノ酸配列が１文字表示により示さ
れており、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４は、ファルネシル二リン
酸合成酵素のアミノ酸配列中のアミノ酸の置換によりゲ
ラニルゲラニル二リン酸合成酵素としての活性を有する
に至った酵素のアミノ酸配列の代表例を示す。Ｎｏ．１
〜Ｎｏ．４の配列において、アミノ酸記号を示した部位
は、アミノ酸の置換が生じている部位及び置換により導
入されたアミノ酸の種類を示し、記載のない部位は、
Ｗ．Ｔで示す生来のアミノ酸配列と同じ配列を示す。

【００２０】変異体酵素Ｎｏ．１には、８１位（Ｔｙｒ
→Ｈｉｓ）及び２７５位（Ｌｅｕ→Ｓｅｒ）の２ケ所に
変異を有する。変異体酵素Ｎｏ．２は３４位（Ｌｅｕ→
Ｖａｌ）及び５９位（Ａｒｇ→Ｇｌｎ）に２ケ所の変異
を有する。変異体酵素Ｎｏ．３は１５７位（Ｖａｌ→Ａ
ｌａ）及び１８２位（Ｈｉｓ→Ｔｙｒ）の２ケ所に変異
を有する。また変異体酵素Ｎｏ．４は８１位（Ｔｙｒ→
Ｈｉｓ）、２３９位（Ｐｒｏ→Ａｒｇ）及び２６５位
（Ａｌａ→Ｔｈｒ）の３ケ所に変異を有する。これらの
変異体酵素のアミノ酸配列Ｎｏ．１〜４及びそれをコー
ドするＤＮＡの塩基配列を、それぞれ配列番号：１〜４
に示し、生来のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基
配列を配列番号：５に示す。

【００２１】本発明においては、具体例として、バシル
ス・ステアロサーモフィルス由来のファルネシル二リン
酸合成酵素のアミノ酸配列を例にとるが、図２及び図３
に示すごとく、ファルネシル二リン酸合成酵素は、霊長
類であるヒトを含む真核生物由来のものから、細菌を含
む原核生物由来のものまで、広範囲の種にわたって高い
相同性を有している。従って、広範囲の種に由来する酵
素に本発明を適用することにより新規なゲラニルゲラニ
ル二リン酸合成酵素を得ることができる。

【００２２】アミノ酸修飾、例えば置換の具体例として
は、図４から明らかな通り、バシルス・ステアロサーモ
フィルス由来のファルネシル二リン酸合成酵素のアミノ
酸配列の第３４位、第５９位、第８１位、第１５７位、
第１８２位、第２３９位、第２６５位及び第２７５位が
挙げられ、他の種からの酵素においては、図２及び図３
に示す配列における上記のアミノ酸部位に対応する部位
におけるアミノ酸を同様に置換した場合も、同様の効果
が得られると推定される。

【００２３】本発明はまた、上記の種々のゲラニルゲラ
ニル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子に関する。こ
れらの遺伝子は、対応する生来のアミノ酸配列をコード
する遺伝子から、前記の変異により得ることができる。
また一旦アミノ酸の変異部位が定まれば、常法により、
変異誘発プライマーを用いる部位特定変異誘発によって
も、目的とする遺伝子を得ることができる。さらには、
全アミノ酸配列が定まれば、それをコードするＤＮＡを
常法に従って化学合成することもできる。

【００２４】本発明の遺伝子を得るための出発材料とな
る、ファルネシル二リン酸合成酵素をコードする遺伝子
は種々の生物種からすでにクローニングされており、そ
れらを用いることができる。例えば、バシルス・ステア
ロサーモフィルス由来の遺伝子はJ.Biochem. 113, 355-
363(1993) に記載されており、大腸菌由来の遺伝子はJ.
Biochem. 108, 995-1000(1990)に記載されており、酵母
由来の遺伝子はJ.B.C.264, 19176-19184(1989) に記載
されており、ラット由来の遺伝子はMol.Cell.Biol.７，
3138-3146(1987) に記載されており、そしてヒト由来の
遺伝子はJ.B.C.265, 4607-4614(1990) に記載されてい
る。

【００２５】本発明はさらに、上記の遺伝子（ＤＮＡ）
を含んで成る発現ベクター、該発現ベクターにより形質
転換された組換え宿主、及び該組換え宿主を用いての該
酵素の製造方法、に関する。宿主に大腸菌を用いる場合
を例にとれば、ＤＮＡからｍＲＮＡを転写する過程とｍ
ＲＮＡからタンパク質を翻訳する過程など遺伝子の発現
調節機能があることが知られている。

【００２６】ｍＲＮＡの合成を調節するプロモーター配
列として、天然に存在する配列（たとえばｌａｃ，ｔｒ
ｐ，ｂｌａ，ｌｐｐ，ＰＬ，ＰＲ，ｔｅｔ，Ｔ３，Ｔ７
など）以外にも、それらの変異体（例えばｌａｃＵＶ
５）や天然にあるプロモーター配列を人工的に融合した
（例えばｔａｃ，ｔｒｃなど）配列が知られており、本
発明にも使用できる。ｍＲＮＡからタンパク質を合成す
る能力を調節する配列として、リボソームバインディン
グサイト（ＧＡＧＧおよびその類似配列）配列と開始コ
ドンであるＡＴＧまでの距離が重要であることは既知で
ある。また、３′側に転写終了を指令するターミネータ
ー（例えば、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２を含むベクターがファル
マシア社から市販されている）が組換え体でのタンパク
質合成効率に影響する事はよく知られている。

【００２７】本発明の組換えベクターを調製するのに使
用できるベクターとしては、市販のものをそのまま用い
るか、または目的に応じて誘導した各種のベクターを挙
げることができる。例えば、ｐＭＢ１由来のレプリコン
を持つｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２７，ｐＫＫ２２３−
３，ｐＫＫ２３３−２，ｐＴｒｃ９９Ａ等や、コピー数
が向上するように改変したｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９，ｐ
ＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，ｐＴＶ１１８Ｎ，ｐＴＶ１
１９Ｎ，ｐＨＳＧ２９８，ｐＨＳＧ３９６等、またｐ１
５Ａ由来のレプリコンを持つｐＡＣＹＣ１７７やｐＡＣ
ＹＣ１８４等、さらにはｐＳＣ１０１やＣｏｌＥ１やＲ
１やＦ因子などに由来するプラスミドが挙げられる。

【００２８】また、プラスミド以外にも、λファージや
Ｍ１３ファージのようなウイルスベクターやトランスポ
ゾンによっても遺伝子導入が可能である。これらベクタ
ーについてはＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ
（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，
Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ発行）や
Ｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒ（Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌ
ｓ，Ｂ．Ｅ．Ｅｎｇｅｒ・Ｖａｌｋ，Ｗ．Ｊ．Ｂｒａｍ
ｍａｒ著Ｅｌｓｅｖｉｅｒ発行）や各社カタログに記載
されている。

【００２９】特に、ｐＴｒｃ９９（ファルマシア社より
販売）は、選択マーカーのアンピシリン耐性遺伝子以外
に、プロモーター及び制御遺伝子としてＰｔｒｃ及びｌ
ａｃＩ^q、リボソームバインディングサイトとしてＡＧ
ＧＡという配列、ターミネーターとしてｒｒｎＢＴ１Ｔ
２を持ち、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子の
発現調節機能を持つ、好ましいベクターとして挙げられ
る。

【００３０】これらのベクターへの、ゲラニルゲラニル
二リン酸合成酵素をコードするＤＮＡ断片および必要に
より前記酵素の遺伝子を発現調節する機能を有するＤＮ
Ａ断片の組み込みは、適当な制限酵素とリガーゼを用い
る既知方法で行うことができ、具体的には後述の方法に
従うのが都合よい。このような組換えベクターで遺伝子
導入できる微生物としてはエシェリヒア・コリー（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）属などに属する微生物も利用することができ
る。この形質転換も常法、たとえばＭｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆ
ｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒ
ｅｓｓ発行）やＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇＶｏｌ．Ｉ〜
III （Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編ＩＲＬＰＲＥＳＳ発
行）などに記載された、ＣａＣｌ₂法やプロトプラスト
法により行うことができる。

【００３１】以上、エシェリヒア・コリーを用いて発現
させる場合の発現方法を具体的に記載したが、本発明に
よれば、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素をコードす
るＤＮＡは、常法に従って常用の発現ベクターに挿入し
た後、宿主細胞、例えば他の細菌を含めての原核性細
胞、酵母等の単細胞性宿主を含めての下等真核性細胞、
カイコなどの高等真核性細胞等を形質転換した後、これ
らの宿主細胞を培養することにより、ゲラニルゲラニル
二リン酸合成酵素を製造することができる。

【００３２】これらの形質転換体または組換え微生物細
胞は、通常大腸菌の培養に用いられる培地で培養する
と、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素を菌体内に蓄積
する。菌体からのゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素の
採取は、菌体を物理的または適当な細胞溶解性酵素の存
在する環境下で処理して溶菌した後、細胞破砕物を除去
し、次いで、酵素の一般的な単離精製方法によって行う
ことができる。細胞溶解性酵素としてはリゾチームを用
いることが好ましく、また物理的処理には超音波を用い
ることが好ましい。

【００３３】また５５℃程度の熱処理をすることによ
り、多くの大腸菌由来のタンパク質は不溶性の沈殿とし
て除去できる。酵素の単離精製には、ゲル濾過・イオン
交換、疎水性・逆相・アフィニティーなどの各種クロマ
トグラフィー処理や限外濾過法などを単独または組み合
わせて行えばよい。単離・精製工程を通じて、目的とす
る酵素の安定化を図るための安定剤として、たとえば、
β−メルカプトエタノールやジチオトレイトールなどの
還元剤、ＰＭＳＦやＢＳＡなどのプロテアーゼへの保護
剤、マグネシウムなどの金属イオンを処理液に共存させ
てもよい。

【００３４】本発明はまた、前記の酵素を、基質に使用
させることを特徴とする、ゲラニルゲラニル二リン酸又
はゲラニルゲラニオールの製造方法に関する。基質とし
てはイソペンテニル二リン酸、ジメチルアリル二リン
酸、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸等を使用
することができる。

【００３５】

【実施例】特に、実施例により、本発明をさらに具体的
に記載するが、本発明の範囲はこれに限定されるもので
はない。実施例１．変異遺伝子の作製（図５）出発遺伝子材料として、バシルス・ステアロサーモフィ
ルスのファルネシル二リン酸合成酵素をコードする遺伝
子を含有するプラスミドｐＦＥ１５（特開平５−２１９
９６１）中の翻訳開始コドンをＡＴＧに変えることによ
り得られた、ファルネシル二リン酸合成酵素大量発現系
プラスミド（ｐＥＸ１１）(J. Biochem.113, 355-363
(1993)) を用いた。

【００３６】また変異導入法はＲ．Ｍ．Ｍｙｅｒｓら
(Sciense. 229, 242-247 (1985)) を参考とした。まず
ｐＥＸ１１のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIII 断片に存在するＦ
ＰＰ合成酵素遺伝子を切り出し、ｐＴＶ１１８Ｎ（入手
先：宝酒造）に組み込んだプラスミドを大腸菌を宿主と
して培養した。ｐＴＶ１１８ＮはヘルパーファージＭ１
３Ｋ０７（入手先：宝酒造）の感染により一本鎖ＤＮＡ
となって優先的にファージ粒子内に包み込まれ、菌体外
へ放出される。よって培養液を遠心分離した上清から一
本鎖ＤＮＡを回収した。

【００３７】これに亜硝酸ナトリウム（１Ｍ又は０．２
Ｍ濃度）によってランダムに変異を導入し、ＡＭＶ逆転
写酵素ＸＬ（Ｅ．Ｃ．２．７．７．７）で二本鎖ＤＮＡ
に再生した。このファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子
部分をｐＴｒｃ９９Ａ（入手先：ファルマシア社）及び
ｐＴＶ１１８Ｎに組み込み、既知のエルウィニア・ウレ
ドボラ（Erwinia uredovora ）由来フィトエン合成酵
素、フィトエン不飽和化酵素の遺伝子を組み込んだ大腸
菌を形質転換し、赤色コロニーを選別した。選別法のし
くみについては以下に述べる。

【００３８】以下に述べるスクリーニング法は大沼ら
(J. Biol. Chem., 269, 14792-14797(1994)) による。
植物病原菌エルウィニア・ウレドボラ（Erwinia uredov
ora ）由来のｃｒｔＢ（フィトエン合成酵素遺伝子）、
ｃｒｔＩ（フィトエン不飽和化酵素）遺伝子を組み込ん
だプラスミドｐＡＣＹＣ−ＩＢを持つ大腸菌を変異プラ
スミドで形質転換した。現在、大腸菌はゲラニルゲラニ
ル二リン酸合成酵素遺伝子を持たないとされている。も
し変異プラスミドがゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素
活性を有しているならば、ｐＡＣＹＣ−ＩＢの働きによ
り大腸菌内に赤色のリコペンが生成し着色コロニーがで
きる。しかし活性のないものは、無色のままである。こ
のような色覚的に選別することによりゲラニルゲラニル
二リン酸合成酵素活性を検出できた。

【００３９】変異プラスミドにより形質転換した結果、
赤色コロニーを検出できた。その選別効率はＮａＮＯ₂
の濃度が１Ｍで処理したものは１．３２×１０^-3（７，
６００コロニー中１０コロニー）、０．２Ｍで処理した
ものは５．９８×１０^-5（１６，７２０コロニー中１コ
ロニー）となりＮａＮＯ₂の濃度が高いほど変異が導入
されやすく、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素活性を
示したものが得られた。

【００４０】これらのコロニー中４コロニーを選択し、
それに含まれるプラスミド中の酵素コード領域の塩基配
列及び該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を決定し
た。その結果を配列番号：１〜４に示す。また、これら
の配列と生来の配列（配列番号：５）との比較から、変
異しているアミノ酸配列を図４に示す。変異酵素は４種
類の遺伝子によりコードされている４種類について検討
した。それらをそれぞれＮｏ．１〜４とする。

【００４１】実施例２．変異酵素の生産大腸菌をＬＢ培地で３７℃で一晩培養したものを３，０
００×ｇ、４℃、５分で集菌し、超音波破砕用緩衝液
（５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．０）、１０mM ２
−メルカプトエタノール、１mM ＥＤＴＡ）で懸濁した
後、超音波破砕した。再び５，０００×ｇ、４℃、２０
分遠心分離した上清を大腸菌由来の酵素を失活させるた
めに５５℃で一時間熱処理し粗酵素抽出液として用い
た。反応は以下の組成で行った（表１）。

【００４２】

【表１】

【００４３】反応溶液を５５℃、３０分で酵素反応を行
った後、水飽和１−ブタノールで生成物を抽出し液体シ
ンチレーションカウンターでブタノール層の放射能量を
測定した。また残りのブタノール層を酸性ホスファター
ゼ処理した後、ペンタンで生成物を抽出しＴＬＣによっ
て生成物を分析した。ＴＬＣ分析の結果、アリル性基質
としてジメチルアリル二リン酸を用いた場合とゲラニル
二リン酸を用いた場合両方に同じような結果が得られた
（注、それぞれのサンプルは、放射能量をほぼ等しくな
るように反応させているため、バンドの濃さと比活性と
は関係がない）。

【００４４】Ｎｏ．１とＮｏ．４はファルネシル二リン
酸よりもゲラニルゲラニル二リン酸を多く生成してお
り、ゲラニルゲラニル二リン酸生産には適していると思
われる。またＮｏ．２とＮｏ．３はゲラニルゲラニル二
リン酸の生成は少量であった。特にＮｏ．２はゲラニル
ゲラニル二リン酸のバンドは見えないが多量の酵素を用
いたとき、ゲラニルゲラニル二リン酸を生成していた。
また（ａｌｌ−Ｅ）−ファルネシル二リン酸をプライマ
ーとして用いた場合、やはりそれぞれゲラニルゲラニル
二リン酸を生成しておりしかもそれらは（ａｌｌ−Ｅ）
体であった。結果を図６〜図９に示す。また粗酵素抽出
液を用いた場合の比活性と生成物比（ＧＧＯＨ／ＦＯ
Ｈ）を下の表２に示した。

【００４５】

【表２】

【００４６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：８９４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：起原：バシルス・ステアロサーモフィルス配列の特徴：ファルネシル二リン酸合成酵素をコードす
るＤＮＡの変異体（１）配列： ATG GCG CAG CTT TCA GTT GAA CAG TTT CTC AAC GAG CAA AAA CAG 45 Met Ala Gln Leu Ser Val Glu Gln Phe Leu Asn Glu Gln Lys Gln 5 10 15 GCG GTG GAA ACA GCG CTC TCC CGT TAT ATA GAG CGC TTA GAA GGG 90 Ala Val Glu Thr Ala Leu Ser Arg Tyr Ile Glu Arg Leu Glu Gly 20 25 30 CCG GCG AAG CTG AAA AAG GCG ATG GCG TAC TCA TTG GAG GCC GGC 135 Pro Ala Lys Leu Lys Lys Ala Met Ala Tyr Ser Leu Glu Ala Gly 35 40 45 GGC AAA CGA ATC CGT CCG TTG CTG CTT CTG TCC ACC GTT CGG GCG 180 Gly Lys Arg Ile Arg Pro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Val Arg Ala 50 55 60 CTC GGA AAA GAC CCG GCG GTC GGA TTG CCC GTC GCC TGC GCG ATT 225 Leu Gly Lys Asp Pro Ala Val Gly Leu Pro Val Ala Cys Ala Ile 65 70 75

【００４７】 GAA ATG ATC CAT ACG CAC TCT TTG ATC CAT GAT GAT TTG CCG AGC 270 Glu Met Ile His Thr His Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ser 80 85 90 ATG GAC AAC GAT GAT TTG CGG CGC GGC AAG CCG ACG AAC CAT AAA 315 Met Asp Asn Asp Asp Leu Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys 95 100 105 GTG TTC GGC GAG GCG ATG GCC ATC TTG GCG GGG GAC GGG TTG TTG 360 Val Phe Gly Glu Ala Met Ala Ile Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu 110 115 120 ACG TAC GCG TTT CAA TTG ATC ACC GAA ATC GAC GAT GAG CGC ATC 405 Thr Tyr Ala Phe Gln Leu Ile Thr Glu Ile Asp Asp Glu Arg Ile 125 130 135 CCT CCT TCC GTC CGG CTT CGG CTC ATC GAA CGG CTG GCG AAA GCG 450 Pro Pro Ser Val Arg Leu Arg Leu Ile Glu Arg Leu Ala Lys Ala 140 145 150 GCC GGT CCG GAA GGG ATG GTC GCC GGT CAG GCA GCC GAT ATG GAA 495 Ala Gly Pro Glu Gly Met Val Ala Gly Gln Ala Ala Asp Met Glu 155 160 165 GGA GAG GGG AAA ACG CTG ACG CTT TCG GAG CTC GAA TAC ATT CAT 540 Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Leu Glu Tyr Ile His 170 175 180 CGG CAT AAA ACC GGG AAA ATG CTG CAA TAC AGC GTG CAC GCC GGC 585 Arg His Lys Thr Gly Lys Met Leu Gln Tyr Ser Val His Ala Gly 185 190 195 GCC TTG ATC GGC GGC GCT GAT GCC CGG CAA ACG CGG GAG CTT GAC 630 Ala Leu Ile Gly Gly Ala Asp Ala Arg Gln Thr Arg Glu Leu Asp 200 205 210

【００４８】 GAA TTC GCC GCC CAT CTA GGC CTT GCC TTT CAA ATT CGC GAT GAT 675 Glu Phe Ala Ala His Leu Gly Leu Ala Phe Gln Ile Arg Asp Asp 215 220 225 ATT CTC GAT ATT GAA GGG GCA GAA GAA AAA ATC GGC AAG CCG GTC 720 Ile Leu Asp Ile Glu Gly Ala Glu Glu Lys Ile Gly Lys Pro Val 230 235 240 GGC AGC GAC CAA AGC AAC AAC AAA GCG ACG TAT CCA GCG TTG CTG 765 Gly Ser Asp Gln Ser Asn Asn Lys Ala Thr Tyr Pro Ala Leu Leu 245 250 255 TCG CTT GCC GGC GCG AAG GAA AAG TTG GCG TTC CAT ATC GAG GCG 810 Ser Leu Ala Gly Ala Lys Glu Lys Leu Ala Phe His Ile Glu Ala 260 265 270 GCG CAG CGC CAT TCA CGG AAC GCC GAC GTT GAC GGC GCC GCG CTC 855 Ala Gln Arg His Ser Arg Asn Ala Asp Val Asp Gly Ala Ala Leu 275 280 285 GCC TAT ATT TGC GAA CTG GTC GCC GCC CGC GAC CAT TAA 894 Ala Tyr Ile Cys Glu Leu Val Ala Ala Arg Asp His *** 290 295

【００４９】配列番号：２配列の長さ：８９４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：起原：バシルス・ステアロサーモフィルス配列の特徴：ファルネシル二リン酸合成酵素をコードす
るＤＮＡの変異体（２）

【００５０】配列： ATG GCG CAG CTT TCA GTT GAA CAG TTT CTC AAC GAG CAA AAA CAG 45 Met Ala Gln Leu Ser Val Glu Gln Phe Leu Asn Glu Gln Lys Gln 5 10 15 GCG GTG GAA ACA GCG CTC TCC CGT TAT ATA GAG CGC TTA GAA GGG 90 Ala Val Glu Thr Ala Leu Ser Arg Tyr Ile Glu Arg Leu Glu Gly 20 25 30 CCG GCG AAG GTG AAA AAG GCG ATG GCG TAC TCA TTG GAG GCC GGC 135 Pro Ala Lys Val Lys Lys Ala Met Ala Tyr Ser Leu Glu Ala Gly 35 40 45 GGC AAA CGA ATC CGT CCG TTG CTG CTT CTG TCC ACC GTT CAG GCG 180 Gly Lys Arg Ile Arg Pro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Val Gln Ala 50 55 60 CTC GGC AAA GAC CCG GCG GTC GGA TTG CCC GTC GCC TGC GCG ATT 225 Leu Gly Lys Asp Pro Ala Val Gly Leu Pro Val Ala Cys Ala Ile 65 70 75 GAA ATG ATC CAT ACG TAC TCT TTG ATC CAT GAT GAT TTG CCG AGC 270 Glu Met Ile His Thr Tyr Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ser 80 85 90 ATG GAC AAC GAT GAT TTG CGG CGC GGC AAG CCG ACG AAC CAT AAA 315 Met Asp Asn Asp Asp Leu Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys 95 100 105 GTG TTC GGC GAG GCG ATG GCC ATC TTG GCG GGG GAC GGG TTG TTG 360 Val Phe Gly Glu Ala Met Ala Ile Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu 110 115 120 ACG TAC GCG TTT CAA TTG ATC ACC GAA ATC GAC GAT GAG CGC ATC 405 Thr Tyr Ala Phe Gln Leu Ile Thr Glu Ile Asp Asp Glu Arg Ile 125 130 135

【００５１】 CCT CCT TCC GTC CGG CTT CGG CTC ATC GAA CGG CTG GCG AAA GCG 450 Pro Pro Ser Val Arg Leu Arg Leu Ile Glu Arg Leu Ala Lys Ala 140 145 150 GCC GGT CCG GAA GGG ATG GTC GCC GGT CAG GCA GCC GAT ATG GAA 495 Ala Gly Pro Glu Gly Met Val Ala Gly Gln Ala Ala Asp Met Glu 155 160 165 GGA GAG GGG AAA ACG CTG ACG CTT TCG GAG CTC GAA TAC ATT CAT 540 Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Leu Glu Tyr Ile His 170 175 180 CGG CAT AAA ACC GGG AAA ATG CTG CAA TAC AGC GTG CAC GCC GGC 585 Arg His Lys Thr Gly Lys Met Leu Gln Tyr Ser Val His Ala Gly 185 190 195 GCC TTG ATC GGC GGC GCT GAT GCC CGG CAA ACG CGG GAG CTT GAC 630 Ala Leu Ile Gly Gly Ala Asp Ala Arg Gln Thr Arg Glu Leu Asp 200 205 210 GAA TTC GCC GCC CAT CTA GGC CTT GCC TTT CAA ATT CGC GAT GAT 675 Glu Phe Ala Ala His Leu Gly Leu Ala Phe Gln Ile Arg Asp Asp 215 220 225 ATT CTC GAT ATT GAA GGG GCA GAA GAA AAA ATC GGC AAG CCG GTC 720 Ile Leu Asp Ile Glu Gly Ala Glu Glu Lys Ile Gly Lys Pro Val 230 235 240 GGC AGC GAC CAA AGC AAC AAC AAA GCG ACG TAT CCA GCG TTG CTG 765 Gly Ser Asp Gln Ser Asn Asn Lys Ala Thr Tyr Pro Ala Leu Leu 245 250 255 TCG CTT GCC GGC GCG AAG GAA AAG TTG GCG TTC CAT ATC GAG GCG 810 Ser Leu Ala Gly Ala Lys Glu Lys Leu Ala Phe His Ile Glu Ala 260 265 270

【００５２】 GCG CAG CGC CAT TTA CGG AAC GCC GAC GTT GAC GGC GCC GCG CTC 855 Ala Gln Arg His Leu Arg Asn Ala Asp Val Asp Gly Ala Ala Leu 275 280 285 GCC TAT ATT TGC GAA CTG GTC GCC GCC CGC GAC CAT TAA 894 Ala Tyr Ile Cys Glu Leu Val Ala Ala Arg Asp His *** 290 295

【００５３】配列番号：３配列の長さ：８９４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：起原：バシルス・ステアロサーモフィルス配列の特徴：ファルネシル二リン酸合成酵素をコードす
るＤＮＡの変異体（３）配列： ATG GCG CAG CTT TCA GTT GAA CAG TTT CTC AAC GAG CAA AAA CAG 45 Met Ala Gln Leu Ser Val Glu Gln Phe Leu Asn Glu Gln Lys Gln 5 10 15 GCG GTG GAA ACA GCG CTC TCC CGT TAT ATA GAG CGC TTA GAA GGG 90 Ala Val Glu Thr Ala Leu Ser Arg Tyr Ile Glu Arg Leu Glu Gly 20 25 30 CCG GCG AAG CTG AAA AAG GCG ATG GCG TAC TCA TTG GAG GCC GGC 135 Pro Ala Lys Leu Lys Lys Ala Met Ala Tyr Ser Leu Glu Ala Gly 35 40 45

【００５４】 GGC AAA CGA ATC CGT CCG TTG CTG CTT CTG TCC ACC GTT CGG GCG 180 Gly Lys Arg Ile Arg Pro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Val Arg Ala 50 55 60 CTC GGA AAA GAC CCG GCG GTC GGA TTG CCC GTC GCC TGC GCG ATT 225 Leu Gly Lys Asp Pro Ala Val Gly Leu Pro Val Ala Cys Ala Ile 65 70 75 GAA ATG ATC CAT ACG TAC TCT TTG ATC CAT GAT GAT TTG CCG AGC 270 Glu Met Ile His Thr Tyr Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ser 80 85 90 ATG GAC AAC GAT GAT TTG CGG CGC GGC AAG CCG ACG AAC CAT AAA 315 Met Asp Asn Asp Asp Leu Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys 95 100 105 GTG TTC GGC GAG GCG ATG GCC ATC TTG GCG GGG GAC GGG TTG TTG 360 Val Phe Gly Glu Ala Met Ala Ile Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu 110 115 120 ACG TAC GCG TTT CAA TTG ATC ACC GAA ATC GAC GAT GAG CGC ATC 405 Thr Tyr Ala Phe Gln Leu Ile Thr Glu Ile Asp Asp Glu Arg Ile 125 130 135 CCT CCT TCC GTC CGG CTT CGG CTC ATC GAA CGG CTG GCG AAA GCG 450 Pro Pro Ser Val Arg Leu Arg Leu Ile Glu Arg Leu Ala Lys Ala 140 145 150 GCC GGT CCG GAA GGG ATG GCC GCC GGT CAG GCA GCC GAT ATG GAA 495 Ala Gly Pro Glu Gly Met Ala Ala Gly Gln Ala Ala Asp Met Glu 155 160 165 GGA GAG GGG AAA ACG CTG ACG CTT TCG GAG CTC GAA TAC ATT CAT 540 Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Leu Glu Tyr Ile His 170 175 180

【００５５】 CGG TAT AAA ACC GGG AAA ATG CTG CAA TAC AGC GTG CAC GCC GGC 585 Arg Tyr Lys Thr Gly Lys Met Leu Gln Tyr Ser Val His Ala Gly 185 190 195 GCC TTG ATC GGC GGC GCT GAT GCC CGG CAA ACG CGG GAG CTT GAC 630 Ala Leu Ile Gly Gly Ala Asp Ala Arg Gln Thr Arg Glu Leu Asp 200 205 210 GAA TTC GCC GCC CAT CTA GGC CTT GCC TTT CAA ATT CGC GAT GAT 675 Glu Phe Ala Ala His Leu Gly Leu Ala Phe Gln Ile Arg Asp Asp 215 220 225 ATT CTC GAT ATT GAA GGG GCA GAA GAA AAA ATC GGC AAG CCG GTC 720 Ile Leu Asp Ile Glu Gly Ala Glu Glu Lys Ile Gly Lys Pro Val 230 235 240 GGC AGC GAC CAA AGC AAC AAC AAA GCG ACG TAT CCA GCG TTG CTG 765 Gly Ser Asp Gln Ser Asn Asn Lys Ala Thr Tyr Pro Ala Leu Leu 245 250 255 TCG CTT GCC GGC GCA AAG GAA AAG TTG GCG TTC CAT ATC GAG GCG 810 Ser Leu Ala Gly Ala Lys Glu Lys Leu Ala Phe His Ile Glu Ala 260 265 270 GCG CAG CGC CAT TTA CGG AAC GCC GAC GTT GAC GGC GCC GCG CTC 855 Ala Gln Arg His Leu Arg Asn Ala Asp Val Asp Gly Ala Ala Leu 275 280 285 GCC TAT ATT TGC GAA CTG GTC GCC GCC CGC GAC CAT TAA 894 Ala Tyr Ile Cys Glu Leu Val Ala Ala Arg Asp His ***

【００５６】配列番号：４配列の長さ：８９４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：起原：バシルス・ステアロサーモフィルス配列の特徴：ファルネシル二リン酸合成酵素をコードす
るＤＮＡの変異体（４）配列： ATG GCG CAG CTT TCA GTT GAA CAG TTT CTC AAC GAG CAA AAA CAG 45 Met Ala Gln Leu Ser Val Glu Gln Phe Leu Asn Glu Gln Lys Gln 5 10 15 GCG GTG GAA ACA GCG CTC TCC CGT TAT ATA GAG CGC TTA GAA GGG 90 Ala Val Glu Thr Ala Leu Ser Arg Tyr Ile Glu Arg Leu Glu Gly 20 25 30 CCG GCG AAG CTG AAA AAG GCG ATG GCG TAC TCA TTG GAG GCC GGC 135 Pro Ala Lys Leu Lys Lys Ala Met Ala Tyr Ser Leu Glu Ala Gly 35 40 45 GGC AAA CGA ATC CGT CCG TTG CTG CTT CTG TCC ACC GTT CGG GCG 180 Gly Lys Arg Ile Arg Pro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Val Arg Ala 50 55 60 CTC GGC AAA GAC CCG GCG GTC GGA TTG CCC GTC GCC TGC GCG ATT 225 Leu Gly Lys Asp Pro Ala Val Gly Leu Pro Val Ala Cys Ala Ile 65 70 75 GAA ATG ATC CAT ACG CAC TCT TTG ATC CAT GAT GAT TTG CCG AGC 270 Glu Met Ile His Thr His Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ser 80 85 90

【００５７】 ATG GAC AAC GAT GAT TTG CGG CGC GGC AAG CCG ACG AAC CAT AAA 315 Met Asp Asn Asp Asp Leu Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys 95 100 105 GTG TTC GGC GAG GCG ATG GCC ATC TTG GCG GGG GAC GGG TTG TTG 360 Val Phe Gly Glu Ala Met Ala Ile Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu 110 115 120 ACG TAC GCG TTT CAA TTG ATC ACC GAA ATC GAC GAT GAG CGC ATC 405 Thr Tyr Ala Phe Gln Leu Ile Thr Glu Ile Asp Asp Glu Arg Ile 125 130 135 CCT CCT TCC GTC CGG CTT CGG CTC ATC GAA CGG CTG GCG AAA GCG 450 Pro Pro Ser Val Arg Leu Arg Leu Ile Glu Arg Leu Ala Lys Ala 140 145 150 GCC GGT CCG GAA GGG ATG GTC GCC GGT CAG GCA GCC GAT ATG GAA 495 Ala Gly Pro Glu Gly Met Val Ala Gly Gln Ala Ala Asp Met Glu 155 160 165 GGA GAG GGG AAA ACG CTG ACG CTT TCG GAG CTC GAA TAC ATT CAT 540 Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Leu Glu Tyr Ile His 170 175 180 CGG CAT AAA ACC GGG AAA ATG CTG CAA TAC AGC GTG CAC GCC GGC 585 Arg His Lys Thr Gly Lys Met Leu Gln Tyr Ser Val His Ala Gly 185 190 195 GCC TTG ATC GGC GGC GCT GAT GCC CGG CAA ACG CGG GAG CTT GAC 630 Ala Leu Ile Gly Gly Ala Asp Ala Arg Gln Thr Arg Glu Leu Asp 200 205 210 GAA TTC GCC GCC CAT CTA GGC CTT GCC TTT CAA ATT CGC GAT GAT 675 Glu Phe Ala Ala His Leu Gly Leu Ala Phe Gln Ile Arg Asp Asp 215 220 225

【００５８】 ATT CTC GAT ATT GAA GGG GCA GAA GAA AAA ATC GGC AAG CGG GTC 720 Ile Leu Asp Ile Glu Gly Ala Glu Glu Lys Ile Gly Lys Arg Val 230 235 240 GGC AGC GAC CAA AGC AAC AAC AAA GCG ACG TAT CCA GCG TTG CTG 765 Gly Ser Asp Gln Ser Asn Asn Lys Ala Thr Tyr Pro Ala Leu Leu 245 250 255 TCG CTT GCC GGC GCG AAG GAA AAG TTG ACG TTC CAT ATC GAG GCG 810 Ser Leu Ala Gly Ala Lys Glu Lys Leu Thr Phe His Ile Glu Ala 260 265 270 GCG CAG CGC CAT TTA CGG AAC GCC GAC GTT GAC GGC GCC GCG CTC 855 Ala Gln Arg His Leu Arg Asn Ala Asp Val Asp Gly Ala Ala Leu 275 280 285 GCC TAT ATT TGC GAA CTG GTC GCC GCC CGC GAC CAT TAA 894 Ala Tyr Ile Cys Glu Leu Val Ala Ala Arg Asp His *** 290 295

【００５９】配列番号：５配列の長さ：８９４配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：起原：バシルス・ステアロサーモフィルス配列の特徴：ファルネシル二リン酸合成酵素をコードす
る生来のＤＮＡ配列： ATG GCG CAG CTT TCA GTT GAA CAG TTT CTC AAC GAG CAA AAA CAG 45 Met Ala Gln Leu Ser Val Glu Gln Phe Leu Asn Glu Gln Lys Gln 5 10 15

【００６０】 GCG GTG GAA ACA GCG CTC TCC CGT TAT ATA GAG CGC TTA GAA GGG 90 Ala Val Glu Thr Ala Leu Ser Arg Tyr Ile Glu Arg Leu Glu Gly 20 25 30 CCG GCG AAG CTG AAA AAG GCG ATG GCG TAC TCA TTG GAG GCC GGC 135 Pro Ala Lys Lys Lys Lys Ala Met Ala Tyr Ser Leu Glu Ala Gly 35 40 45 GGC AAA CGA ATC CGT CCG TTG CTG CTT CTG TCC ACC GTT CAG GCG 180 Gly Lys Arg Ile Arg Pro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Val Gln Ala 50 55 60 CTC GGC AAA GAC CCG GCG GTC GGA TTG CCC GTC GCC TGC GCG ATT 225 Leu Gly Lys Asp Pro Ala Val Gly Leu Pro Val Ala Cys Ala Ile 65 70 75 GAA ATG ATC CAT ACG TAC TCT TTG ATC CAT GAT GAT TTG CCG AGC 270 Glu Met Ile His Thr Tyr Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ser 80 85 90 ATG GAC AAC GAT GAT TTG CGG CGC GGC AAG CCG ACG AAC CAT AAA 315 Met Asp Asn Asp Asp Leu Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys 95 100 105 GTG TTC GGC GAG GCG ATG GCC ATC TTG GCG GGG GAC GGG TTG TTG 360 Val Phe Gly Glu Ala Met Ala Ile Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu 110 115 120 ACG TAC GCG TTT CAA TTG ATC ACC GAA ATC GAC GAT GAG CGC ATC 405 Thr Tyr Ala Phe Gln Leu Ile Thr Glu Ile Asp Asp Glu Arg Ile 125 130 135 CCT CCT TCC GTC CGG CTT CGG CTC ATC GAA CGG CTG GCG AAA GCG 450 Pro Pro Ser Val Arg Leu Arg Leu Ile Glu Arg Leu Ala Lys Ala 140 145 150

【００６１】 GCC GGT CCG GAA GGG ATG GTC GCC GGT CAG GCA GCC GAT ATG GAA 495 Ala Gly Pro Glu Gly Met Val Ala Gly Gln Ala Ala Asp Met Glu 155 160 165 GGA GAG GGG AAA ACG CTG ACG CTT TCG GAG CTC GAA TAC ATT CAT 540 Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Leu Glu Tyr Ile His 170 175 180 CGG CAT AAA ACC GGG AAA ATG CTG CAA TAC AGC GTG CAC GCC GGC 585 Arg His Lys Thr Gly Lys Met Leu Gln Tyr Ser Val His Ala Gly 185 190 195 GCC TTG ATC GGC GGC GCT GAT GCC CGG CAA ACG CGG GAG CTT GAC 630 Ala Leu Ile Gly Gly Ala Asp Ala Arg Gln Thr Arg Glu Leu Asp 200 205 210 GAA TTC GCC GCC CAT CTA GGC CTT GCC TTT CAA ATT CGC GAT GAT 675 Glu Phe Ala Ala His Leu Gly Leu Ala Phe Gln Ile Arg Asp Asp 215 220 225 ATT CTC GAT ATT GAA GGG GCA GAA GAA AAA ATC GGC AAG CCG GTC 720 Ile Leu Asp Ile Glu Gly Ala Glu Glu Lys Ile Gly Lys Pro Val 230 235 240 GGC AGC GAC CAA AGC AAC AAC AAA GCG ACG TAT CCA GCG TTG CTG 765 Gly Ser Asp Gln Ser Asn Asn Lys Ala Thr Tyr Pro Ala Leu Leu 245 250 255 TCG CTT GCC GGC GCG AAG GAA AAG TTG GCG TTC CAT ATC GAG GCG 810 Ser Leu Ala Gly Ala Lys Glu Lys Leu Ala Phe His Ile Glu Ala 260 265 270 GCG CAG CGC CAT TTA CGG AAC GCC GAC GTT GAC GGC GCC GCG CTC 855 Ala Gln Arg His Leu Arg Asn Ala Asp Val Asp Gly Ala Ala Leu 275 280 285

【００６２】 GCC TAT ATT TGC GAA CTG GTC GCC GCC CGC GAC CAT TAA 894 Ala Tyr Ile Cys Glu Leu Val Ala Ala Arg Asp His *** 290 295

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ファルネシル二リン酸及びゲラニルゲ
ラニル二リン酸の合成経路を示す図である。

【図２】図２は、種々の種に由来するファルネシル二リ
ン酸合成酵素のアミノ酸配列の相同性を示す図である。
図中Ａ〜Ｅのわく内の配列は、比較的相同性が高く、酵
素活性に関与していると予想される領域を示す。

【図３】図３は、種々の種に由来するファルネシル二リ
ン酸合成酵素のアミノ酸配列の相同性を示す図である。
図中のＦ及びＧのわく内の配列は、比較的相同性が高
く、酵素活性に関与していると予想される領域を示す。

【図４】図４は、バシルス・ステアロサーモフィルス由
来のファルネシル二リン酸合成酵素の生来のアミノ酸配
列（Ｗ．Ｔと表示）、及びその変異体であってゲラニル
ゲラニル二リン酸合成酵素活性を有する酵素（Ｎｏ．１
〜Ｎｏ．４）のアミノ酸配列の変異部位を示す。

【図５】図５は、本発明の変異体遺伝子の作製方式を模
式的に示す図である。

【図６】図６は、基質ジメチルアリル二リン酸に本発明
の酵素を作用させた場合の生成物を示すＴＬＣ図であ
る。

【図７】図７は、基質ゲラニル二リン酸に本発明の酵素
を作用させた場合の生成物を示すＴＬＣ図である。

【図８】図８は、基質（ａｌｌ−Ｅ）−ファルネシル二
リン酸に本発明の酵素を作用させた場合の生成物を示す
ＴＬＣ図である。

【図９】図９は、基質（ａｌｌ−Ｅ）ファルネシル二リ
ン酸に本発明の酵素を作用させた場合の生成物を示すＴ
ＬＣ図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07） (72)発明者大沼信一宮城県仙台市青葉区川内川前町46−１レジデンス広瀬102号 (72)発明者中沢武宮城県仙台市青葉区土樋１−４−３コーポ土樋102 (72)発明者小倉協三宮城県仙台市太白区上野山２−11−16 (72)発明者古山種俊宮城県仙台市青葉区花壇４−17−108 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12N 1/00 - 1/38 C12N 15/00 - 15/90 C12P 1/00 - 41/00 G01N 33/50 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（ＧＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：５に示すファルネシル二リン
酸合成酵素のアミノ酸配列において、３４位、５９位、
８１位、１５７位、１８２位、２３９位、２６５位及び
２７５位から選択された１〜複数個の部位、あるいはこ
れらの部位に対応する他のファルネシル二リン酸合成酵
素のアミノ酸配列中の部位、におけるアミノ酸が他のア
ミノ酸に置換されており、ゲラニルゲラニル二リン酸を
合成することができる変異型酵素。
【請求項２】配列番号：１に示すアミノ酸配列を有す
る、ゲラニルゲラニル二リン酸を合成する変異型ファル
ネシル二リン酸合成酵素。
【請求項３】配列番号：２に示すアミノ酸配列を有す
る、ゲラニルゲラニル二リン酸を合成する変異型ファル
ネシル二リン酸合成酵素。
【請求項４】配列番号：３に示すアミノ酸配列を有す
る、ゲラニルゲラニル二リン酸を合成する変異型ファル
ネシル二リン酸合成酵素。
【請求項５】配列番号：４に示すアミノ酸配列を有す
る、ゲラニルゲラニル二リン酸を合成する変異型ファル
ネシル二リン酸合成酵素。
【請求項６】請求項１〜５のいずれか１項に記載のゲ
ラニルゲラニル二リン酸を合成する変異型酵素をコード
する遺伝子。
【請求項７】請求項６に記載の遺伝子を含んで成る発
現ベクター。
【請求項８】請求項７に記載の発現ベクターにより形
質転換された組換え宿主。
【請求項９】請求項１〜６のいずれか１項に記載の変
異型酵素の製造方法において、該酵素をコードする遺伝
子を含んで成る発現ベクターにより形質転換された宿主
を培養することを特徴とする、前記酵素の製造方法。
【請求項１０】基質イソペンテニル二リン酸、ジメチ
ルアリル二リン酸、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二
リン酸のいずれかに、請求項１〜６のいずれか１項に記
載の変異型酵素を作用させることを特徴とする、ゲラニ
ルゲラニル二リン酸又はゲラニルゲラニオールの製造方
法。