JPH0568571A

JPH0568571A - ヒト由来グリオキサラ−ゼｉをコ−ドするｄｎａ

Info

Publication number: JPH0568571A
Application number: JP22633691A
Authority: JP
Inventors: Masashi Kato; 誠志加藤; Nanjiyun Kin; 南順金; Yuri Umezawa; ゆり梅沢
Original assignee: Sagami Chemical Research Institute
Current assignee: Sagami Chemical Research Institute
Priority date: 1991-08-13
Filing date: 1991-08-13
Publication date: 1993-03-23

Abstract

(57)【要約】【目的】ヒト由来グリオキサラーゼＩをコードする遺
伝子を提供し、抗炎症剤の酵素的合成、制癌剤のスクリ
ーニングなどに利用できるグリオキサラーゼＩの生産手
段を提供する。【構成】ヒト細胞ｃＤＮＡライブラリーからのグリオ
キサラーゼＩをコードするｃＤＮＡのクローニング、塩
基配列決定によるヒトグリオキサラーゼＩの一次構造決
定、大腸菌による発現とその活性測定からなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト由来グリオキサラー
ゼＩ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに関す
る。

【０００２】

【従来技術】グリオキサラーゼＩ（Ｅ.Ｃ.４.４.１.
５、ラクトイルグルタチオンリアーゼ）は、メチルグリ
オキサールとグルタチオンからＳーラクトイルグルタチ
オンを生成する反応を触媒する酵素である。本酵素は、
ヒト、ラットなどの緒臓器、酵母、カビ、放線菌、バク
テリアなどに存在することが知られ、それぞれから単離
精製された酵素について以下のような性質が明かにされ
ている（村田ら、蛋白質・核酸・酵素３１：１０１０
−１０２１、１９８６）。ラット肝、ブタ赤血球、ヒト
赤血球など動物細胞由来のグリオキサラーゼＩは、分子
量が４１，０００から４６，０００であり、２０，００
０から２３，０００の２つのサブユニットからなり、等
電点は４.７〜４.８である。酵母由来のものは分子量３
２，０００の単量体からなり、等電点は約７である（Ｍ
ａｒｍｓｔａｌｅｔａｌ., Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｊ.
１８３：２３−３０、１９７９）。大腸菌や光合成細菌
のグリオキサラーゼＩの分子量も同程度であると報告さ
れている。シュードモナス菌由来のグリオキサラーゼＩ
の性質は動物細胞由来のものに近いが、分子量２０，０
００からなる単量体と報告されている（Ｒｈｅｅｅｔ
ａｌ.、Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.Ｒｅｓ.Ｃｏ
ｍｍｕｎ. １４１：９９３−９９９、１９８６）。

【０００３】ヒト由来のグリオキサラーゼＩには３種の
アイソザイムの存在が報告されている（Ａｒｏｎｓｓｏ
ｎｅｔａｌ.、Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ. ９２：
３９０−３９３、１９７９）。しかしこれらのアイソザ
イムの分子量、アミノ酸組成、抗原性などに大きな違い
はなく、イオン交換クロマトグラフィーにより分離出来
ることから、電気的な性質が異なるだけと考えられてい
る。従ってこれら３種のアイソマーは２つの対立遺伝子
に由来する２種のモノマーのホモダイマーならびにヘテ
ロダイマーと考えられる（Ｋｏｍｐｆｅｔａｌ.、Ｈ
ｕｍａｎｇｅｎｅｔｉｋ２７：１４１−１４３、１９
７５）。

【０００４】シュードモナス菌由来のグリオキサラーゼ
Ｉについては、これをコードする遺伝子がクローン化さ
れ、その全塩基配列が決定されている（Ｒｈｅｅｅｔ
ａｌ.、Ａｇｒｉｃ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ. ５２：２２４
３−２２４６、１９８８）。酵母のグリオキサラーゼＩ
についても、その塩基配列はまだ発表されていないが、
すでに遺伝子はクローン化されている（村田、日本農芸
化学会誌６２：１３３１−１３３８、１９８８）。し
かし、ヒトを含む動物細胞由来のグリオキサラーゼＩに
ついては、そのアミノ酸組成は知られているが、アミノ
酸配列はまだ知られておらず、したがって遺伝子もまだ
クローン化されていない。

【０００５】グリオキサラーゼＩの細胞内における本来
の役割はまだ不明であるが、基質であるメチルグリオキ
サールが低濃度で細胞増殖を阻害することから、これを
無毒化する役割を担っていると考えられている。従って
細胞増殖制御において鍵を握る酵素の一つであると思わ
れる。このことを裏付けるように酵母のグリオキサラー
ゼＩ遺伝子を酵母細胞内に導入したところ、発酵工業上
有用な大型酵母が得られた（特開昭６３−４９０７
３）。またメチルグリオキサールは強力な制癌作用を有
することから、グリオキサラーゼＩの阻害剤が制癌活性
を有しているのではないかと考えられ、スクリーニング
の結果制癌作用を有するいくつかの阻害剤が報告されて
いる（村田ら、蛋白質・核酸・酵素３１：１０１０−
１０２１、１９８６；特開昭６３−２１５６２８）。
ただいずれも酵母由来のグリオキサラーゼＩを用いてス
クリーニングが行なわれている。一方反応生成物である
Ｓーラクトイルグルタチオンは抗炎症作用を有すること
から、シュードモナス由来のグリオキサラーゼＩ遺伝子
を大腸菌内で発現させて、これを用いたＳーラクトイル
グルタチオンの製造法が報告されている（特開平１−９
８４８７）。またこの酵素の細胞増殖制御における役割
から考えると、この酵素をコードしている遺伝子の変異
がある種の遺伝病と関連している可能性がある。

【０００６】以上述べたようにグリオキサラーゼＩは広
い用途を有している。特にヒト由来のグリオキサラーゼ
Ｉとその遺伝子はそれぞれ新しい制癌剤の開発や遺伝子
診断などに有用であると考えられる。このような目的の
ためにはそれをコードしている遺伝子が必要である。す
なわち、遺伝子があれば組換え技術の応用によって大量
のグリオキサラーゼＩの生産が可能となるし、遺伝子診
断のプローブとして用いることも出来る。しかしながら
ヒト由来グリオキサラーゼＩの遺伝子はまだクローン化
されていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者はヒト由来の
未知タンパク質を探索する手段として、後述する「ホモ
・プロテインｃＤＮＡバンク」法（特願平２−２３８３
３２）を開発した。本発明者はこの開発した方法に基づ
き鋭意検討した結果、このｃＤＮＡバンクの中に、シュ
ードモナス菌由来のグリオキサラーゼＩとアミノ酸配列
レベルで高い類似性を有するものの明かにその配列が異
なるヒト由来のグリオキサラーゼＩをコードするｃＤＮ
Ａクローンを見いだし、本発明を完成した。すなわち本
発明の目的はヒト由来のグリオキサラーゼＩをコードす
るｃＤＮＡを提供し、ヒトグリオキサラーゼＩの生産手
段を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】ヒトの細胞は５万〜１０
万種類のタンパク質を生産していると推定されている
が、現在その構造と機能が解明されているものは、これ
らのなかのわずか１％程度に過ぎない。本発明者は残る
９９％の未知タンパク質を解明する手段として、以下に
述べる「ホモ・プロテインｃＤＮＡバンク」法を開発す
るに至った（特願平２−２３８３３２）。すなわち、ヒ
ト細胞から単離したｍＲＮＡを鋳型にして、ベクタープ
ライマー法を用いてｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮ
Ａをシーケンスすることによって、一部塩基配列の決定
されたヒトｃＤＮＡ集団（これを「ホモ・プロテインｃ
ＤＮＡバンク」と命名する）を作製する。次に得られた
塩基配列に基づいて既知ＤＮＡデータベースを検索す
る。もし、塩基配列内にオープンリーディングフレーム
が存在する場合には、これをアミノ酸配列に変換した後
プロテインデータベースを検索する。このようにして既
知のタンパク質と塩基配列あるいはアミノ酸配列レベル
で類似性のあるものが見いだされた場合には、そのｃＤ
ＮＡの全塩基配列を決定し、さらにこのｃＤＮＡを微生
物や動物細胞内で発現させ、発現産物の活性を測定する
ことによりｃＤＮＡがコードしているタンパク質の機能
を決定する。

【０００９】このようにして構築した「ホモ・プロテイ
ンｃＤＮＡバンク」内に、シュードモナス菌由来のグリ
オキサラーゼＩとアミノ酸レベルで高い類似性を有する
タンパク質をコードするｃＤＮＡクローンを見いだし
た。このｃＤＮＡを含むプラスミドｐＴＺＧＬＯＩ１の
制限酵素地図を図１に、ｃＤＮＡの全塩基配列およびこ
れがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３
に示した。ｐＴＺＧＬＯＩ１は約２.１ｋｂのｃＤＮＡ
インサートを有している。このｃＤＮＡは５５２ｂｐの
オープンリーディングフレームを有し、１８４アミノ酸
残基からなるタンパク質をコードしている。このアミノ
酸配列をシュードモナス菌由来のグリオキサラーゼＩの
アミノ酸配列と比較すると、図２に示したように、Ｃ末
端側約２／３に高い類似性が認められた。

【００１０】一方ヒトの赤血球から単離されたグリオキ
サラーゼＩについては、分子量とアミノ酸組成が報告さ
れている。それによるとヒトグリオキサラーゼＩは分子
量約２３，０００のサブユニットからなる二量体であ
る。本発明のｃＤＮＡがコードしているタンパク質は、
そのアミノ酸配列から分子量２０，７１９と推定され
た。またアミノ酸組成について文献値（Ｍａｒｍｓｔａ
ｌｅｔａｌ., Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｊ. １８３：２３
−３０、１９７９）と本発明のｃＤＮＡから推定された
値を比較すると、表１に示すようにほぼ一致した。さら
に本発明のｃＤＮＡを発現ベクターに組換え、大腸菌内
で発現させたところ、発現産物は高いグリオキサラーゼ
Ｉ活性を示した。以上のことから本発明のｃＤＮＡはヒ
トグリオキサラーゼＩをコードしていることが判明し
た。

【００１１】したがって本発明はヒトグリオキサラーゼ
ＩをコードするＤＮＡを提供する。すなわち本発明のＤ
ＮＡは配列番号２で表される。本発明のＤＮＡは、本発
明で用いた方法によって得ることが出来るし、本発明で
示したＤＮＡ配列に基づいて作製した合成オリゴヌクレ
オチドをプローブとして、公知の手法で作製されたヒト
細胞のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること
によっても得ることが出来る。また化学合成法によって
作製することも出来る。その際、コードするタンパク質
の配列が同じであるならば、異なるコドンを使用しても
よい。本発明のＤＮＡによってコードされるタンパク質
は、配列番号１からなるタンパク質自体や、この配列の
Ｎ末端のＭｅｔが欠失した１８３アミノ酸残基からなる
タンパク質をあげることが出来る。またグリオキサラー
ゼＩ活性を有している限りＮ末端やＣ末端側のアミノ酸
残基が１個以上欠失したタンパク質をコードしているＤ
ＮＡも本発明の範疇に含まれる。また遺伝的多型性によ
ると思われるアイソマーの存在も知られているが、グリ
オキサラーゼＩ活性を有している限り１〜２個のアミノ
酸残基の変異を引き起こすような多型変異体ＤＮＡも本
発明の範疇に含まれる。

【００１２】本発明のグリオキサラーゼＩをコードする
ＤＮＡは配列番号３に示したようなヒト由来ｃＤＮＡの
一部配列からなる。タンパク質を生産する場合にはこの
中の翻訳領域を用いるが、遺伝子プローブとして用いる
場合には、配列番号３の塩基配列中の５’や３’の非翻
訳領域の塩基配列を用いることも出来る。

【００１３】本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターに組
換えることにより、大腸菌、酵母、枯草菌、動物細胞な
どで発現することが可能である。すなわちそれぞれの発
現ベクターのプロモーターの下流に本発明のＤＮＡを挿
入すればよい。バクテリアの場合、開始コドンを含む合
成オリゴヌクレオチドリンカーを用いて、翻訳領域をＳ
Ｄ領域の下流に挿入する必要がある。その際、本発明で
例示したようなポリメラーゼチエーン反応（ＰＣＲ）法
を用いると容易に組換えができる。すなわち本発明のＤ
ＮＡの開始コドンＡＴＧから始まる約２０塩基に相当す
る部分を５’側プライマーとして、また停止コドン含む
あるいはその下流に位置する配列のアンチセンス鎖を
３’側プライマーとして、ＰＣＲ反応を行ない、オープ
ンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片を作製する。
この際、それぞれのプライマーの５’側には発現ベクタ
ーに挿入する際利用できる制限酵素部位を付加してお
く。この断片を発現ベクターに挿入することによって、
容易にヒトグリオキサラーゼＩを発現するためのベクタ
ーを構築することが出来る。真核細胞用の発現ベクター
の場合には、プロモーターの下流に、本発明のＤＮＡ配
列のうち、開始コドンから停止コドンまでのすべてを含
む任意のＤＮＡ断片を挿入すればよい。なお発現ベクタ
ーとしては市販されている各種プロモーターを有する発
現ベクターを利用することが出来る。

【００１４】

【実施例】次に実施例により発明を具体的に説明する。
ＤＮＡの組換えに関する基本的な操作および酵素反応
は、文献（”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ.
ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、
１９８９）に従った。制限酵素および各種修飾酵素は特
に記載の無い場合宝酒造社製のものを用いた。各酵素反
応の緩衝液組成、並びに反応条件は付属の説明書に従っ
た。合成オリゴヌクレチオドは、ＤＮＡ合成機（アプラ
イドバイオシステムズ社）によって合成した。

【００１５】ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡの調製ヒトリンフォーマ細胞株Ｕ−９３７（ＡＴＣＣＣＲＬ
１５９３）を５％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４
０培地中で５％ＣＯ₂気流下３７℃で培養した後、フォ
ルボールミリステートアセテート（３０ｎｇ／ｍｌ培
地）で１６時間処理し、１.１ｇの細胞を得た。これを
５.５Ｍグアニジウムチオシアネート溶液１６ｍｌに溶
解した後、文献（Ｏｋａｙａｍａｅｔａｌ.、”Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ” Ｖｏｌ.
１６４、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、１９８７）に
従いｍＲＮＡを調製した。これを２０ｍＭＴｒｉｓーＨ
Ｃｌ（ｐＨ７.６）、０.５ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ
で洗浄したオリゴｄＴセルロースカラムにかけ、上掲文
献に従いポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを精製した。このようにし
て７２μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを得た。

【００１６】ｃＤＮＡライブラリーの作製ｐＴＺ１８Ｒ（ファルマシア社）のＥｃｏＲＩーＢａｍ
ＨＩ間にＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＮｏｔＩ
部位を挿入したプラスミド（特願平２−２３８３３２）
をＫｐｎＩで消化後、末端転移酵素により約６０個のｄ
Ｔテールを付加した。これをＥｃｏＲＶ消化して片側の
ｄＴテールを除去したものをベクタープライマーとして
用いた。ｃＤＮＡ合成の反応条件は文献（Ｏｋａｙａｍ
ａｅｌａｌ.、上掲文献）に従った。先に調製した
ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ６μｇを、ベクタープライマー２.２
μｇとアニールさせた後、１４４単位の逆転写酵素（生
化学工業社製）を加え３７℃１時間反応し、第１鎖ｃＤ
ＮＡを合成した。反応液をフェノール抽出、エタノール
沈殿後、２.５μＭｄＣＴＰ存在下１５単位の末端転移
酵素を加えて３７℃３０分間反応しｄＣテール付加を行
なった。反応液をフェノール抽出、エタノール沈殿後、
５０単位のＢｓｔＸＩ（ニューイングランドバイオラボ
ス社製）で５５℃２時間消化した。反応液をフェノール
抽出、エタノール沈殿後、アニールし、３００単位の大
腸菌ＤＮＡリガーゼを添加後１２℃一晩セルフライゲー
ション反応を行なった。反応液にｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、３００単位の大腸菌
ＤＮＡリガーゼ、２０単位の大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼ、１５単位の大腸菌ＲＮａｓｅＨを添加して、１２℃
１時間、次いで２２℃１時間反応させ、ＲＮＡ鎖をＤＮ
Ａに置換した。

【００１７】ホモ・プロテインｃＤＮＡバンクの構築ｃＤＮＡ合成反応液を用いて大腸菌ＮＭ５２２（ファル
マシア社）の形質転換を行なった。形質転換はハナハン
法（Ｄ.Ｈａｎａｈａｎ，Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.１６６：
５５７−５８０、１９８３）に従った。形質転換体の一
部を１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有２ｘＴＹ寒天培
地上に蒔いて３７℃一晩培養した。寒天上に生じた任意
のコロニーを拾い１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有２
ｘＴＹ培地２ｍｌに接種して３７℃２時間培養後、ヘル
パーファージＭＫ１３ＫＯ７（ファルマシア社）を感染
させ、さらに３７℃一晩培養した。培養液を遠心して、
菌体と上清に分け、菌体からはアルカリリシス法により
２本鎖プラスミドＤＮＡを、上清からは常法に従い１本
鎖ファージＤＮＡを単離した。２本鎖プラスミドＤＮＡ
はＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで二重消化した後、０.８％ア
ガロースゲル電気泳動を行ないｃＤＮＡインサートの大
きさを求めた。一方１本鎖ファージＤＮＡは、蛍光色素
で標識したＭ１３リバースプライマーとＴａｑポリメラ
ーゼ（アプライドバイオシステムズ社製キット）を用い
てシーケンス反応を行なった後、蛍光ＤＮＡシーケンサ
ー（アプライドバイオシステムズ社）にかけてｃＤＮＡ
の５’末端約４００ｂｐの塩基配列を決定した。配列デ
ータはホモ・プロテインｃＤＮＡバンクデータベースと
してファイル化した。

【００１８】グリオキサラーゼＩ様タンパク質をコード
するｃＤＮＡのクローニングファイル化した塩基配列をアミノ酸配列に変換後、これ
を用いてプロテインデータベースＰＲＩＮＡＳ（三井情
報開発）のホモロジー検索を行なった。その結果シュー
ドモナス菌由来のグリオキサラーゼＩと高い類似性を有
するクローンが見いだされた。そこでこのクローンから
得られたプラスミドをｐＴＺＧＬＯＩ１と命名した。こ
のプラスミドの制限酵素地図を図１に示す。各断片のサ
ブクローニング並びに欠失体を作製した後、蛍光ＤＮＡ
シーケンサー（アプライドバイオシステムズ社）を用い
て全塩基配列を決定した。その結果を配列番号３に示し
た。１９９５番目以降に約１３０個のポリＡテールが付
加している。５’側のＥｃｏＲＩ断片に５５２ｂｐのオ
ープンリーディングフレームが見い出され、１８４アミ
ノ酸残基からなるタンパク質をコードしていることが示
された。このアミノ酸配列をシュードモナス菌由来のグ
リオキサラーゼＩのアミノ酸配列と比較したところ、図
２に示したように６２番目から１７１番目までの範囲で
５７.５％の類似性が認められた。また得られたアミノ
酸配列から求めたアミノ酸組成をヒト赤血球由来のグリ
オキサラーゼＩのアミノ酸組成と比較したところ、表１
に示したようにＮ末端のＭｅｔを含めないとほぼ一致し
た。従ってヒト赤血球から単離されたグリオキサラーゼ
ＩのＮ末端Ｍｅｔ残基は除去されていると考えられる。

【００１９】グリオキサラーゼＩ発現ベクターの構築図３にグリオキサラーゼＩｃＤＮＡの大腸菌による発現
ベクターの構築法を示した。ｐＴＺＧＬＯＩ１から単離
した約７００ｂｐのＥｃｏＲＩ断片を、ｐＵＣ１９にサ
ブクローニングしｐＵＣＧＬＯＩ１を構築した。このプ
ラスミドを鋳型にして、次に示す２種類の合成オリゴヌ
クレオチドをプライマーとして用いて、ＰＣＲを行なっ
た。配列番号４に示す配列を有するプライマーＰＲ１は
グリオキサラーゼＩの翻訳領域の開始コドンから始まる
２１塩基とその５’末端にＡａｔＩＩ部位を含む。また
配列番号５に示すプライマーＰＲ２はＭ１３のリバース
プライマー配列を含む。したがってＰＣＲ産物は、Ａａ
ｔＩＩ部位、グリオキサラーゼＩの全翻訳領域、一部
３’非翻訳領域、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＭ１３のリバー
スプライマー配列を含むｐＵＣベクター由来の塩基配列
を有することになる。反応条件は、アニーリングが４２
℃２分間、Ｔａｑポリメラーゼ反応が７２℃２分間、変
性が９４℃２分間、３０サイクルで行なった。ＰＣＲ産
物を０.８％アガロースゲル電気泳動にかけて約７００
ｂｐの断片を切り出した後、ＡａｔＩＩ並びにＨｉｎｄ
ＩＩＩ消化を行なった。この断片をｔａｃプロモータ
ー、メタピロカテカーゼのＳＤ配列、ｒｒｎＢＴ₁Ｔ₂タ
ーミネーターを有する発現ベクターｐＭＰＲＡ３（特開
平２−１８２１８６）のＡａｔＩＩーＨｉｎｄＩＩＩ間
に挿入し、グリオキサラーゼＩの発現ベクターｐＭＫＧ
ＬＯＩ１を構築した。この際グリオキサラーゼＩｃＤＮ
Ａインサートを含まないベクター（ｐＭＫ０と命名）が
人工産物として得られたので、以後これを、発現を調べ
るときの対照ベクターとして用いた。

【００２０】グリオキサラーゼＩｃＤＮＡの大腸菌によ
る発現ｐＭＫＧＬＯＩ１による大腸菌ＮＭ５２２の形質転換体
を、各種濃度のメチルグリオキサールと１００μｇ／ｍ
ｌアンピシリンおよび１ｍＭＩＰＴＧを含む最小培地
（０.７％Ｋ₂ＨＰＯ₄、０.３％ＫＨ₂ＰＯ₄、０.５％グ
ルコース、０.１％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、０.０１％ＭｇＳ
Ｏ₄）５ｍｌ中で培養し、その成育曲線を求めた。その
結果を図４に示す。グリオキサラーゼＩｃＤＮＡを持た
ない対照ベクター（ｐＭＫ０）で形質転換した大腸菌で
は１ｍＭのメチルグリオキサール添加によって成育阻害
が起こり、１０ｍＭでは全く成育しないが、ｐＭＫＧＬ
ＯＩ１を含む大腸菌は１ｍＭでは成育阻害は認められ
ず、１０ｍＭでも成育可能であることが示された。この
ことは大腸菌内で発現したグリオキサラーゼＩによって
メチルグリオキサールが分解されたためと考えられる。

【００２１】そこで対照菌並びに発現ベクターを含む大
腸菌を上記と同じ条件で培養後集菌し、超音波破砕を行
なった。この破砕溶液を用いてラッカー法（Ｒａｃｋｅ
ｒ、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.、１９０：６８５ー６９
６、１９５１）によりグリオキサラーゼＩ活性を測定し
た。すなわちグルタチオンとメチルグリオキサールを含
むｐＨ６.６のリン酸緩衝液０.９ｍｌに０.１ｍｌの大
腸菌破砕溶液を添加し、３０℃１０分間反応させ、２４
０ｎｍにおける吸光度変化を測定した。その結果を図５
に示す。破砕液に含まれるタンパク質の量をブラッドフ
ォード法（ＢｉｏーＲａｄ社製キットを使用）により測
定し、試料中に含まれるグリオキサラーゼＩの比活性を
求めたところ、対照（ＮＭ５２２／ｐＭＫ０）では０.
０２μｍｏｌｅ／ｍｉｎ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ、発現
ベクターを有する菌（ＮＭ５２２／ｐＭＫＧＬＯＩ１）
では２.３μｍｏｌｅ／ｍｉｎ／ｍｇｐｒｏｔｅｉｎ
であった。このことから、発現ベクターを含む大腸菌は
グリオキサラーゼＩを発現していることが示された。

【００２２】表１ヒト赤血球グリオキサラーゼＩのア
ミノ酸組成とｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ
酸組成の比較＊文献値をもとに、アミノ酸総数を１８３残基として換
算。

【００２３】

【発明の効果】本発明によりヒトのグリオキサラーゼＩ
をコードしているｃＤＮＡが提供された。本発明のｃＤ
ＮＡを適当な発現ベクターに組換えることにより、微生
物や動物細胞内でヒトグリオキサラーゼＩを大量に発現
することが可能になる。またこの遺伝子を組み込んだ細
胞は有毒なメチルグリオキサール添加に対して耐性にな
ることから、薬剤耐性マーカー遺伝子としても利用でき
る。

【配列表】

【００２４】配列番号：１配列の長さ：１８４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Ala Glu Pro Gln Pro Pro Ser Gly Gly Leu Thr Asp Glu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Ser Cys Cys Ser Asp Ala Asp Pro Ser Thr Lys Asp Phe Leu Leu 20 25 30 Gln Gln Thr Met Leu Arg Val Lys Asp Pro Lys Lys Ser Leu Asp Phe 35 40 45 Tyr Thr Arg Val Leu Gly Met Thr Leu Ile Gln Lys Cys Asp Phe Pro 50 55 60 Ile Met Lys Phe Ser Leu Tyr Phe Leu Ala Tyr Glu Asp Lys Asn Asp 65 70 75 80 Ile Pro Lys Glu Lys Asp Glu Lys Ile Ala Trp Ala Leu Ser Arg Lys 85 90 95 Ala Thr Leu Glu Leu Thr His Asn Trp Gly Thr Glu Asp Asp Ala Thr 100 105 110 Gln Ser Tyr His Asn Gly Asn Ser Asp Pro Arg Gly Phe Gly His Ile 115 120 125 Gly Ile Ala Val Pro Asp Val Tyr Ser Ala Cys Lys Arg Phe Glu Glu 130 135 140 Leu Gly Val Lys Phe Val Lys Lys Pro Asp Asp Gly Lys Met Lys Gly 145 150 155 160 Leu Ala Phe Ile Gln Asp Pro Asp Gly Tyr Trp Ile Glu Ile Leu Asn 165 170 175 Pro Asn Lys Met Ala Thr Leu Met 180 184

【００２５】配列番号：２配列の長さ：５５２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 ATGGCAGAAC CGCAGCCCCC GTCCGGCGGC CTCACGGACG AGGCCGCCCT CAGTTGCTGC 60 TCCGACGCGG ACCCCACTAC CAAGGATTTT CTATTGCAGC AGACCATGCT ACGAGTGAAG 120 GATCCTAAGA AGTCACTGGA TTTTTATACT AGAGTTCTTG GAATGACGCT AATCCAAAAA 180 TGTGATTTTC CCATTATGAA GTTTTCACTC TACTTCTTGG CTTATGAGGA TAAAAATGAC 240 ATCCCTAAAG AAAAAGATGA AAAAATAGCC TGGGCGCTCT CCAGAAAAGC TACACTTGAG 300 CTGACACACA ATTGGGGCAC TGAAGATGAT GCGACCCAGA GTTACCACAA TGGCAATTCA 360 GACCCTCGAG GATTCGGTCA TATTGGAATT GCTGTTCCTG ATGTATACAG TGCTTGTAAA 420 AGGTTTGAAG AACTGGGAGT CAAATTTGTG AAGAAACCTG ATGATGGTAA AATGAAAGGC 480 CTGGCATTTA TTCAAGATCC TGATGGCTAC TGGATTGAAA TTTTGAATCC TAACAAAATG 540 GCAACCTTAA TG 552

【００２６】配列番号：３配列の長さ：１９９５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ起源：生物名：ホモ＝サピエンス細胞の種類：リンフォーマセルライン：Ｕ−９３７配列の特徴：特徴を表す記号：５’ＵＴＲ存在位置：１..８７特徴を決定した方法：Ｐ特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：８８..６３９特徴を決定した方法：Ｐ特徴を表す記号：３’ＵＴＲ存在位置：６４０..１９９５特徴を決定した方法：Ｐ配列 CTAGTTAAGG CGGCACAGGG CCGAGGCGTA GTGTGGGTGA CTCCTCCGTT CCTTGGGTCC 60 CGTCGTCTGT GATACTGCAG TTCAGCC ATG GCA GAA CCG CAG CCC CCG TCC GGC 114 Met Ala Glu Pro Gln Pro Pro Ser Gly 1 5 GGC CTC ACG GAC GAG GCC GCC CTC AGT TGC TGC TCC GAC GCG GAC CCC 162 Gly Leu Thr Asp Glu Ala Ala Leu Ser Cys Cys Ser Asp Ala Asp Pro 10 15 20 25 AGT ACC AAG GAT TTT CTA TTG CAG CAG ACC ATG CTA CGA GTG AAG GAT 210 Ser Thr Lys Asp Phe Leu Leu Gln Gln Thr Met Leu Arg Val Lys Asp 30 35 40 CCT AAG AAG TCA CTG GAT TTT TAT ACT AGA GTT CTT GGA ATG ACG CTA 258 Pro Lys Lys Ser Leu Asp Phe Tyr Thr Arg Val Leu Gly Met Thr Leu 45 50 55 ATC CAA AAA TGT GAT TTT CCC ATT ATG AAG TTT TCA CTC TAC TTC TTG 306 Ile Gln Lys Cys Asp Phe Pro Ile Met Lys Phe Ser Leu Tyr Phe Leu 60 65 70 GCT TAT GAG GAT AAA AAT GAC ATC CCT AAA GAA AAA GAT GAA AAA ATA 354 Ala Tyr Glu Asp Lys Asn Asp Ile Pro Lys Glu Lys Asp Glu Lys Ile 75 80 85 GCC TGG GCG CTC TCC AGA AAA GCT ACA CTT GAG CTG ACA CAC AAT TGG 402 Ala Trp Ala Leu Ser Arg Lys Ala Thr Leu Glu Leu Thr His Asn Trp 90 95 100 105 GGC ACT GAA GAT GAT GCG ACC CAG AGT TAC CAC AAT GGC AAT TCA GAC 450 Gly Thr Glu Asp Asp Ala Thr Gln Ser Tyr His Asn Gly Asn Ser Asp 110 115 120 CCT CGA GGA TTC GGT CAT ATT GGA ATT GCT GTT CCT GAT GTA TAC AGT 498 Pro Arg Gly Phe Gly His Ile Gly Ile Ala Val Pro Asp Val Tyr Ser 125 130 135 GCT TGT AAA AGG TTT GAA GAA CTG GGA GTC AAT TTT GTG AAG AAA CCT 546 Ala Cys Lys Arg Phe Glu Glu Leu Gly Val Lys Phe Val Lys Lys Pro 140 145 150 GAT GAT GGT AAA ATG AAA GGC CTG GCA TTT ATT CAA GAT CCT GAT GGC 594 Asp Asp Gly Lys Met Lys Gly Leu Ala Phe Ile Gln Asp Pro Asp Gly 155 160 165 TAC TGG ATT GAA ATT TTG AAT CCT AAC AAA ATG GCA ACC TTA ATG T 640 Tyr Trp Ile Glu Ile Leu Asn Pro Asn Lys Met Ala Thr Leu Met 170 175 180 184 AGTGCTGTGA GAATTCTCCT TTGAGATTTC AGAAGAAAGG AAACAATGTG ATTCAAGATA 700 TTTACATACC AGAAGCATCT AGGACTGATG GATCACTGTC CCGATTCAAA TTATTCTTCA 760 GTCCATTTCC CCTTCCTATT TCAGCTGTTC CTTTTCACCT AACTGTTCAG TCATTCTGGT 820 TTTCAAGCAG TGCTTTATCT CATGTCCTTG AATATAGTTG TGTAACTTTA TTTTTTAGGT 880 AATAATTAGA ACAGTTCCCT TCAGAGGCTG CATTTGCCTT CTTCTGCCAC CTAAATATTA 940 CTTCCCTTCA AATCTGCCTT TGAATCATCA TTTTTAAAAA AAAATTAACA TGTTTTTGTT 1000 GTAGTTATCT TCTGGGGTTT CAATTCCTCA GAAACAACTT TTTTCACAAC GGAAAGGAAA 1060 GAACACTAGT GTTCCTTCCA GTAAAGTACA AAGTGTTTAT TTTACAAAAG AGTAGGTACT 1120 CTTGAGAGCA ATTCAAATCA TGCTGACAAG GATACTGATA GAAAAAGTGA TTTCTTCTTA 1180 TTATAAAGTA CATTTAAAGT TCAAGGACTA ACCTTATTTA TTTGGGAAAG GGGAGGAGGA 1240 AGGAAATGAT ATGGTACCCA GACACTGGGC TAGGCTGCAA CTTTATCTCA TTTAATACTC 1300 CCAGCTGTCA TGTGAGAAAG AAAGCAGGCT AGGCATGTGA AATCACTTTC ATGGATTATT 1360 AATGGATTTA AGAGGGCATC AATCAGCTCA ACTCAAGATT TCATAATCAT TTTTAGTATT 1420 TAGATTGTGC CTCAAAGTTG TAGTACCTCA CAATACCTCC ACTGGTTTCC TGTTGTAAAA 1480 ACCTTCAGTG AGTTTGACCA TTGTGCTCTT GGCTCTTGGG CTGGAGTACC GTGGTGAGGG 1540 AGTAAACACT AGAAGTCTTT AGTACAAAAC TGCTCTAGGG ACACCTGGTG ATTCCTACAC 1600 AAGTGATGTT TATATTTCTC ATAAAGAGTC TTCCCTATCC CAAGGTCTTC ATGATGCCAG 1660 TAGCCATATA TGATAAATTA TGTTCAGTGA TAACTTAGTT ATCAGAAATC AGCTCAGTGG 1720 TCTTCCCCGC CATGATTCAC ATTTGATGAG TTTTTAAAAA TCAAAGTGAT TTTGAAAATC 1780 TCTAATGGCT CAGAAAATAA AAACATCCAG TTTGTGGATG ACTATATTTA GATTTCTCTA 1840 GACTCTAGTG GAAGACCTTT GGAAAGGCCA TGCCAACCGT GCTTGTACTG CTAGAAGCAC 1900 TTTATGTTTC CTTTTTGGGT GAAATGGATT TATGTGAGTG CTTTAAACAA ATAGCAATAC 1960 TTATAGACTG AAATAAAATG AAACTTCAAA TAAGA 1995

【００２７】配列番号：４配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CCGACGTCAT GGCAGAACCG CAGCCCCCG

【００２８】配列番号：５配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CAGGAAACAG CTATGAC

【００２９】

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＴＺＧＬＯＩ１の制限酵素地図

【図２】本発明のｃＤＮＡがコードするタンパク質のア
ミノ酸配列とシュードモナス菌由来のグリオキサラーゼ
Ｉのアミノ酸配列の比較図

【図３】ヒト由来グリオキサラーゼＩの発現ベクターの
構築工程を示す図

【図４】メチルグリオキサール含有培地中での大腸菌の
成育曲線の図

【図５】吸光度変化測定によるグリオキサラーゼＩ活性
測定をそれぞれ表す図

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年６月３０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２５】配列番号：２配列の長さ：５５２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 ATGGCAGAAC CGCAGCCCCC GTCCGGCGGC CTCACGGACG AGGCCGCCCT CAGTTGCTGC 60 TCCGACGCGG ACCCCAGTAC CAAGGATTTT CTATTGCAGC AGACCATGCT ACGAGTGAAG 120 GATCCTAAGA AGTCACTGGA TTTTTATACT AGAGTTCTTG GAATGACGCT AATCCAAAAA 180 TGTGATTTTC CCATTATGAA GTTTTCACTC TACTTCTTGG CTTATGAGGA TAAAAATGAC 240 ATCCCTAAAG AAAAAGATGA AAAAATAGCC TGGGCGCTCT CCAGAAAAGC TACACTTGAG 300 CTGACACACA ATTGGGGCAC TGAAGATGAT GCGACCCAGA GTTACCACAA TGGCAATTCA 360 GACCCTCGAG GATTCGGTCA TATTGGAATT GCTGTTCCTG ATGTATACAG TGCTTGTAAA 420 AGGTTTGAAG AACTGGGAGT CAAATTTGTG AAGAAACCTG ATGATGGTAA AATGAAAGGC 480 CTGGCATTTA TTCAAGATCC TGATGGCTAC TGGATTGAAA TTTTGAATCC TAACAAAATG 540 ＧＣＡＡＣＣＴＴＡＡＴＧ
５５２

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
むヒト由来グリオキサラーゼＩ活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡ。
【請求項２】前記タンパク質をコードする配列が、配
列番号２で表される塩基配列であることを特徴とする請
求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】請求項２記載のＤＮＡを含み、配列番号
３で表される塩基配列からなるヒト細胞由来ｃＤＮＡ。
【請求項４】配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
むヒト由来グリオキサラーゼＩ活性を有するタンパク質
をコードするＤＮＡが前記タンパク質を発現させうるプ
ロモーターＤＮＡに有効に結合している発現ベクター。