PT871718E - Produção de carboxipeptidase b recombinante, activa sob o ponto de vista enzimático. - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PRODUÇÃO DE CARBOXIPEPTIDASE B RECOMBINANTE, ACTIVA SOB O PONTO DE VISTA ENZIMÃTICO" O presente pedido de patente de invenção é uma continuação, em parte, do pedido de patente de invenção da série n° 08/378.233, registada em 25 de Janeiro de 1995, cujo conteúdo ê aqui incorporado como referência.

Ao longo desta descrição, serão referenciadas várias publicações por números árabes dentro de parêntesis. As citações completas dessas referências podem ser encontradas no final da descrição, imediatamente antes das reivindicações. A descrição dessas publicações, na sua totalidade, é aqui incorporada a título de referência nesta descrição, de modo a descrever de uma forma mais completa o estado da técnica a que pertence a presente invenção. A carboxipeptidase B [hidrolase de peptidil-L-lisina (-L-arginina) EC 3.4.17.2] de ocorrência natural é uma exope-ptidase pancreática contendo zinco que elimina especifica-mente Arg, Lis ou Orn do terminal C dos péptidos (1, 2). A carboxipeptidase B de rato de ocorrência natural é produzida a partir de uma proteína precursora, preprocarboxi-peptidase B, contendo um fragmento de terminal N com 108 aminoácidos de comprimento que inclui a sequência de sinal (13 aminoácidos) e um péptido de activação (95 aminoácidos). A preprocarboxipeptidase B é inactiva sob o ponto de vista enzimático.

Durante o transporte da preprocarboxipeptidase B para o retículo endoplásmico, o péptido de sinal é clivado; o pre- 1 cursor de procarboxipeptidase B, inactivo sob o ponto de vista enzimático, é segregado a partir da célula. A carboxipeptidase B, activa sob o ponto de vista enzimático, é então formada por clivagem do péptido de activação, por meio de tripsina (7) . A carboxipeptidase B madura de rato contém 307 aminoáci-dos (5) e tem um peso molecular aparente de 35 kD. Contém sete resíduos de cisteína, seis dos quais estão emparelhados nas ligações S-S. A carboxipeptidase B é largamente utilizada para fins comerciais e de investigação, tal como na produção de insulina e de outros polipéptidos activos sob o ponto de vista biológico e na análise de sequências de proteínas. A carboxipeptidase B purificada a partir do pâncreas de suínos, disponível comercialmente, é muito cara e não está totalmente isenta de proteases. A sequência parcial de aminoácidos do precursor de procarboxipeptidase B de porcinos e a sequência completa de aminoácidos de carboxipeptidase B de bovinos já foram publicadas (3, 4 respectivamente). Além disso, a sequência completa de nucleótidos do gene de ratos e do ADNc humano já foram publicadas (5, 6 respectivamente).

Yamamoto et al. (6) relataram a expressão recombinante de procarboxipeptidase B humana, inactiva sob o ponto de vista enzimático, a que faltam os primeiros 11 aminoácidos do péptido de activação.

Eles também relataram a expressão recombinante da proteína de fusão de β-galactosidase-procarboxipeptidase B em 2 que faltam os 11 primeiros aminoácidos do péptido de activação à procarboxipeptidase. A publicação da patente de invenção europeia No. 588118 A2 descreve uma proteína relacionada com os ossos, semelhante a carboxipeptidase, designada por OSF-5. Especula-se que a OSF-5 actua como uma molécula de adesão ou um factor de crescimento e que pode ser utilizado como um agente para o tratamento de doenças metabólicas dos ossos. Contudo, nunca foi descrita nenhuma função ou actividade para OSF-5 e nunca foi demonstrada nenhuma produção quer de proteína activa de ocorrência natural nem de proteína activa sob o ponto de vista biológico. 0 isolamento, a clonagem molecular e a caracterização parcial de uma nova carboxipeptidase B do plasma humano foram descritos em Eaton et al. (13). A purificação da carboxipeptidase B humana natural do plasma e a sua clonagem e expressão estão descritas em (14) . Um processo para a purificação de carboxipeptidase B natural com origem num extracto hepatopancreático de lagosta, utilizando, inter alia, croma-tografia de afinidade de quelatos metálicos imobilizados, está descrito em (15). A purificação da procarboxipeptidase B natural a partir de pós anidros desengordurados de pâncreas de boi, utilizando a extracção repetida, está descrita em (16). A recuperação, a purificação e a caracterização parcial de carboxipeptidase B natural obtida a partir de intestino delgado humano utilizando, inter alia, os processos de precipitação de sulfato de amónio e processos cromatográficos estão descritas em (17). 0 isolamento e a caracterização estrutual do ADNc de carboxipeptidase B do pâncreas de rato estão descritos em (18) sem referência à expressão do gene com a subsequente redobragem e clivagem da pró-sequência da proteína de carboxipeptidase B.

Por outro lado, a desactivação de uma protease que pode ser carboxipeptidase do género Kluyveromyces por introdução de uma ou mais modificações genéticas reduzindo assim ou modificando a actividade proteolítica da referida levedura, está descrita em (19) . Vários documentos referem-se a processos para a produção de proteínas. Assim, está descrito, de uma forma geral, um processo para a purificação, de forma recombinante, de proteínas produzidas, que compreende a dissolução de proteínas refrácteís insolúveis numa solução fortemente desnaturante e utilizando uma solução de desnaturação fraca para uma purificação posterior das proteínas já dissolvidas numa solução fortemente desnaturante (20) . Uma revisão dos processos para a purificação específica de produtos de polipéptidos eucarióticos específicos expressos em E. coli é dada por Marson (21). Este documento não se refere a carboxipeptidase B pancreática de mamíferos ou à sua pró-forma. A separação das proteínas naturais encontradas no suco pancreático de ratos, por cromatografia de interacção hidrofóbica, está descrita em (22) ; menciona-se a procarboxipeptidase B. A presente invenção tem por objecto a produção de carboxipeptidase B pancreática de mamífero, recombinante, altamente purificada, activa sob o ponto de vista enzimático e barata. A produção de carboxipeptidase B pancreática de mamífero, activa sob o ponto de vista enzimático, nunca foi referida antes e a presente descrição é nova. A presente invenção tem por objecto um processo de produção de carboxipeptidase B pancreática de mamífero, activa sob o ponto de vista enzimático, que compreende o tratamento de ADN contendo células recombinantes, que codifica procarboxipeptidase B, de tal modo que o ADN dirige a expressão da procarboxipeptidase B, recuperando a procarboxipeptidase B assim expressa, a partir da célula, tratando a procarboxipeptidase B assim recuperada em condições que permitam a dobragem da procarboxipeptidase B, a submissão da procarboxipeptidase B dobrada a clivagem enzimática para produzir carboxipeptidase activa sob o ponto de vista enzima-tico e a purificação da carboxipeptidase B, activa sob o ponto de vista enzimático.

Os mapas de restrição dos plasmidos nas figuras 2 e 3 não identificam todos os sítios de restrição presentes nos plasmidos. Contudo, mostram esses sítios de restrição necessários para um entendimento completo da presente invenção.

Figura l: Aminoácido e sequência de nucleótidos de ADNc correspondente de procarboxipeptidase B pancreática de rato

Mostra a sequência de nucleótidos de ADNc e a correspondente sequência de aminoácidos de procarboxipe-ptidase B pancreática de rato incluindo a sequência madura de nucleótidos de carboxipeptidase B e a sequência de nucleótidos de péptidos de activação. A sequência de ADN difere da sequência de ADN publicada por Clauser et al. (5) por 4 nucleótidos, dois dos quais resultam numa alteração de aminoácidos: Lys14 ->.Asn e Arg142 -+Asp.

Também se mostra a sequência de nucleótidos de ADN destes iniciadores utilizados durante a clonagem (exemplo 1) (em maiúsculas): iniciador da extremidade 5' de procarboxipeptidase B, iniciador da extremidade 5' de carboxipeptidase B e iniciador da extremidade 3' de carboxipeptidase B. 5 A numeração dos aminoácidos foi feita de acordo com a homologia com a carboxipeptidase B proveniente de pâncreas de bovino (10, 12) , em que o primeiro aminoácido (Ala) de carboxipeptidase B madura de rato está numerada com 4. 0 asterisco (*) indica o aminoácido adicional (Leu) que a carboxipeptidase B de rato tem, em comparação com a carboxipeptidase A.

Figura 2: Construção do plasmido pPCB e do plasmido pCPB-C 0 plasmido pABN foi digerido com BamHI e Ncol. Isolou-se o fragmento de 2500 pb e ligou-se ao fragmento de ADNc de carboxipeptidase B de 940 pb de BamHI-Ncol ( obtido como no exemplo 1) . O novo plasmido obtido foi designado por pCPB e foi utilizado para transformar E. coli 4300. O plasmido pCPB foi digerido com BamHI e Ndel de modo a isolar o fragmento grande. O plasmido pCPB foi também digerido com Asei e Seal de modo a isolar o fragmento grande.

Formou-se um heteroduplex misturando os dois fragmentos grandes com um oligonucleótido fosforilado com terminal 5' preparado para a mutagênese específica do sítio (exemplo 1) e com o tampão de polimerase-ligase (5 x tampão: Tris-HCl 32,5 mM, a pH 7,5, MgCl2 40 mM, 2-mercaptoetanol 5 mM, NaCl 0.5 M) (9) . Levou-se a mistura à ebulição de modo a desnaturar as estruturas helicoidais de ADN e arrefeceu-se gradualmente de modo a renaturar o ADN. Os produtos da reacção foram utilizados para transformar a E. coli 1645 por electropo-ração. Avaliaram-se os transformantes por meio do crescimento em ampicilina contendo agar LB e por hibridação diferencial das colónias in situ com oligonucleótido fosforilado com terminal 5' preparado para a mutagênese. 6

Extraiu-se o ADN do plasmido a partir de colónias positivas e, depois da análise da enzima de restrição e da sequenciaçâo dos nucleótidos de ADN, elegeu-se um clone contendo o sítio Spel mutante. 0 novo plasmido obtido foi designado por pCPB-C, que codifica a carboxipeptidase B com uma mutação no amínoácido 290 da cisteína para a serina. O plasmido pCPB-C foi utilizado para transformar E. coli 4300.

Figura 3: Construção do plasmido pProCPB-C e do plasmido

pAProCPB 0 ADNc de procarboxipeptidase B, obtido como se descreveu no exemplo 1, foi clivado com Ndel e Ciai de modo a isolaro fragmento de 470 pb que codifica o péptido de activação e parte de carboxipeptidase B.

Clivou-se o plasmido pCPB com BamHI e Ciai de modo a isolar o fragmento de 470 pb que codifica a parte remanescente de carboxipeptidase B incluindo a mutação de Cis290 -► Ser.

Clivou-se o plasmido pAB com Ndel e BamHI de modo a isolar o fragmento de 2500 pb que codifica todos os elementos necessários para a expressão em bactérias (ver o exemplo 1).

Os três fragmentos anteriores foram ligados e o novo plasmido obtido foi designado por pProCPB-C.

Os plasmídos pProCPB-C e pCPB foram clivados com StuI e Xhol. Isolou-se um fragmento de 3700 pb, que codifica todos os elementos necessários para a expressão em bactérias (ver o exemplo 1) , todo o péptido de activação e parte da carboxipeptidase B, a partir do plasmido ProCPB-C. 7

Isolou-se ura fragmento de 440 pbr que codifica a parte remanescente de carboxipeptidase B, a partir do plasmido pCPB.

Ligaram-se os dois fragmentos e o novo plasmido obtido foi designado por pÀProCPB-C.

Figura 4: Comparação da actividade de carboxipeptidase B recombinante e de carboxipeptidase B de ocorrência natural

Determinou-se a actividade de carboxipeptidase B (Sigma) porcina, comercial e da carboxipeptidase B recombinante tal como descrito no exemplo 5, de acordo com o processo de Folk (11) utilizando o substrato Hipuril-L-Arg. Mediu-se o V0 da reacção catalítica utilizando uma concentração de substrato de 0,025-0,1 mM.

Depositou-se o plasmido pÀProCPB-C em E. coli para prosseguir e em satisfação dos requisitos do Tratado de Budapeste no Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos com o fim do processo de Patente, na American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive,

Rockville, Md. 20852 com o número de acesso da ATCC 69673 em 4 de Agosto de 1994.

Tal como se utiliza aqui, "CPB" significa um polipéptido quer feito por processos de ADN recombinante ou, de algum modo, que tem a mesma ou praticamente a mesma sequência de aminoácidos que a carboxipeptidase B de mamífero, de ocorrência natural. Assim, o termo CPB inclui polipéptidos que diferem por um ou mais aminoácidos, preferencialmente não mais do que 10 aminoácidos, das carboxipeptidases B de ocorrência natural. 8

Tal como se utiliza aqui, "ProPCB" significa um polipéptido quando produzido por técnicas de ADN recombinante ou que de algum modo tem a mesma ou praticamente a mesma sequência de aminoácidos que a procarboxipeptidase B de mamífero de ocorrência natural. Assim, o termo ProPCB inclui polipéptidos que diferem por um ou mais aminoácidos, preferencialmente não mais do que cerca de 10 aminoácidos, das carboxipeptidases B de ocorrência natural.

Os especialistas na matéria podem facilmente determinar quais os resíduos de aminoácidos que podem ser adicionados, eliminados ou substituídos (incluindo com quais aminoácidos essas substituições podem ser feitas) utilizando procedimentos bem estabelecidos, incluindo, por exemplo, processos convencionais para o desenho e produção de sequências de ADN que codificam para a expressão bacteriana de polipéptidos, a modificação do ADNc e as sequências genómicas por meio de técnicas de mutagénese dirigidas ao sítio, a construção de proteínas e de vectores de expressão recombinantes, a expressão bacteriana dos polipéoptidos e a medição da actividade bioquímica dos polipéptidos utilizando ensaios bioquímicos convencionais.

Tal como se utiliza aqui, um CPB "activo sob o ponto de vista enzimático" significa um CPB que possui a actividade biológica de carboxipeptidases B de mamíferos, de ocorrência natural. Para os fins desta definição, a actividade biológica de uma carboxipeptidases B de ocorrência natural é a capacidade para eliminar especificamente a arginina, lisina ou ornitina de terminal C de um péptido.

Praticamente a mesma sequência de aminoácidos é aqui definida como englobando substituições e/ou eliminações e/ou adições de aminoácidos na sequência de aminoácidos e pode englobar até dez (10) resíduos de acordo com os grupos homólogos ou equivalentes descritos, por exemplo, por Lehninger, Biochemistry, 2a ed. Worth Pub., N.Y. (1975), Capítulo 4; Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL Press da Oxford Univ. Press, Oxford, Inglaterra (1989); e Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. 5, The National Biomedical Research Foundation, Maryland (1972), Capítulo 9. Essas substituições são conhecidas pelos especialistas na matéria.

Num enquadramento preferido, o ADN que codifica ProCPB ou CPB pode obter-se de uma origem humana, de rato, bovina ou porcina. O ADN pode ser obtido por transcrição inversa, reacção em cadeia de polimerase (RCP), meios sintéticos ou semi-sintéticos ou por mais do que um destes processos ou por outros processos conhecidos na técnica. 0 ADN que codifica o polipéptido ProCPB ou CPB pode ser mutados por processos conhecidos por especialistas na matéria, por exemplo, Bauer et al. (1985), Gene 3_7: 73-81. A sequência mutada pode ser inserida em vectores de expressão apropriados conforme aqui descrito, que se introduzem em células que são então tratadas de modo a que o ADN mutado dirige a expressão de um polipéptido.

Os especialistas na matéria compreenderão que o plasmido depositado em ligação com o presente pedido de patente de invenção pode ser facilmente alterado por técnicas conhecidas (por exemplo, por mutagénese dirigida ao sítio ou por inserção de ligantes) para codificar a expressão de um polipéptido. Essas técnicas estão descritas em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2S edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Exemplos de vectores que podem ser utilizados para expressar o ácido nucleico que codifica ProCPB ou CPB são vírus tais como vírus bacterianos, por exemplo, bacteriófagos (tal como fago lambda), cosmidos, plasmidos e outros vectores, ADNc que codifica ProCPB ou CPB é inserido nos vectores apropriados por processos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, utilizando sítios convencionais de enzimas de endonuclease de restrição, tanto os inseridos como o adn do vector podem ser ambos clivados para criar terminações complementares cujas bases se emparelham umas com as outras e se ligam então com uma ligase de ADN. Alternativamente, sequências de bases que comportam ligantes sintéticos, complementares de um sítio de restrição no ADN do vector podem ser ligadas ao ADN da inserção, que é então digerido com a enzima de restrição que corta nesse sítio. Há outros meios que também são válidos.

Os vectores da presente invenção compreendem uma sequência que codifica ProCPB ou CPB podem ser adaptados para expressão numa gama de células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, por exemplo bactérias, leveduras, fungos, células de insectos ou células de outros mamíferos tal como células de OHC (ovário de hamster chinês), de embriões de galinhas, de fibroblastos de rim ou outras linhas de células conhecidas.

Estes vectores compreendem, adicionalmente, os elementos reguladores necessários para a expressão do gene clonado na célula hospedeira de tal modo colocada relativamente ao ácido nucleico que codifica ProCPB ou CPB que afecta a sua expressão.

Os elementos reguladores requeridos para a expressão incluem sequências de promotores e de operadores e um sítio de ligação do ribosoma. Por exemplo, um vector de expressão bacteriana pode incluir uma sequência de promotor-operador tal como ÀPL0L ou promotores de deo. Para o início da transfecção, podem utilizar-se os sítios de ligação do ribosoma XCn ou deo. Esses vectores podem ser obtidos comercialmente ou conjugados a partir das sequências descritas, por processos bem conhecidos na técnica, por exemplo, na co-atribuída patente de invenção norte-americana US n° 4.831.120, publicada em 16 de Maio de 1989 e na c na co-atribuída patente de invenção norte-americana US n° 5.143.836, publicada em 1 de Setembro de 1992, que descrevem processos que dizem respeito ao promotor XPL e a co-atribuída publicação do pedido de patente de invenção europeia n° 303.972 publicada em 22 de Fev. de 1989, que descreve processos que dizem respeito ao promotor deo. Também podem estar presentes outros elementos apropriados tais como repressores e melhoradores. Os especialistas na matéria sabem como utilizar elementos reguladores apropriados para vários sistemas de expressão.

Os plasmidos de expressão da presente invenção compreendem elementos reguladores apropriados que se posicionam dentro do plasmido relativamente ao ADN que codifica os polipéptidos ProCPB ou CPB de modo a efectuar a expressão do polipéptido ProCPB ou CPB numa célula hospedeira apropriada. Esses elementos reguladores são promotores e operadores, por exemplo deoPiP2 e XPL e sítios de ligação do ribosoma, por exemplo, deo e Cu, assim como repressores e melhoradores.

Em enquadramentos preferidos da presente invenção, os elementos reguladores são posicionados próximo e a montante do ADN que codifica o ProCPB ou o CPB.

Os plasmídos da presente invenção também contêm um codão de iniciação de ATG. 0 ADN que codifica ProCPB ou CPB está em fase com o codão de iniciação de ATG.

Os plasmídos da presente invenção também contêm uma sequência de ADN que compreende uma origem de replicação de um plasmido bacteriano capaz de replicação autónoma numa célula hospedeira. As origens apropriadas de replicação podem ser obtidas a partir de numerosas fontes, tal como a partir do plasmido pBR322 (N° de acesso da ATCC 37017).

Os plasmídos da presente invenção também contêm uma sequência de ADN que contém um gene associado com um traço fenotípico seleccionável ou identificável que se manifesta quando o plasmido está presente na células hospedeira tal como um gene resistente a um fármaco, por exemplo, resistência a ampicilina, a cloranfenicol ou a tetraciclina.

As células hospedeiras bacterianas preferidas são células de E. coli. Um exemplo de uma célula de E. coli apropriada é a estirpe 4300, mas outras estirpes de E. coli e outras bactérias também podem ser utilizadas como hospedeiros para os plasmídos.

As bactérias utilizadas como hospedeiros podem ser qualquer estirpe incluindo estirpes auxotróficas (tal como A1645), prototróficas (tal como A4255), e estirpes líticas; estirpes F+ e F"; estirpes que comportam a sequência do c857 do pró-fago λ comportando estirpes do repressor (tal como Ά1645 e A4255) e estirpes desprovidas dos repressores de deo e/ou o gene de deo (ver a publicação do pedido de patente de invenção europeia No. 0303972, publicada em 22 de Fev. de 1989) . A estirpe 4300 de E. coli foi depositada com o n° de acesso da ATCC 69363.

Todas as estirpes hospedeiras de E. coli descritas antes podem ser "curadas" dos plasmidos que comportam por processos bem conhecidos na técnica, por exemplo, o processo do brometo de etídio descrito por R. P. Novick em Bacteriol. Review 33, 210 (1969). A presente invenção tem por objecto um processo de produção de CPB activa sob o ponto de vista enzimãtico que compreende o tratamento de uma células recombinante contendo ADN que codifica ProCPB, de tal modo que o ADN dirige a expressão de ProCPB, recuperando da célula o ProCPB assim expresso, tratando o ProCPB recuperado em condições que permitem a dobragem de ProCPB submetendo o ProCPB à clivagem enzimática para produzir CPB activo sob o ponto de vista enzimático e purificando o CPB activo sob o ponto de vista enzimático.

Num enquadramento preferido, a recuperação de ProCPB da célula recombinante compreende o rompimento da parede da célula da célula recombinante ou ddos seus fragmentos para produzir um lisado, isolando o precipitado celular do lisado por centrifugação e solubilização do precipitado intracelular num tampão apropriado.

Num outro enquadramento, o tratamento do ProCPB recuperado compreende a incubação do ProCPB à temperatura ambiente durante um período de cerca de 20-24 horas a um pH de cerca de 9-9,5.

Ainda num outro enquadramento, o tratamento do ProCPB recuperado compreende a incubação do ProCPB à temperatura ambiente durante um período de cerca de 20-24 horas a um pH de cerca de 9-9,5, na presença de ZnCl2, glutationa oxidada (GSSG) e glutationa reduzida (GSH). Considera-se que a submissão de ProCPB dobrado a clivegem enzimática compeende o ajustamento do pH para cerca de 8,5 e a clivagem de ProCPB com tripsina a 37 °C durante cerca de 60 minutos.

Também se considera que a purificação de CPB activa sob o ponto de vista enzimático compreende a cromatografia de permuta iónica.

Será evidente para os especialistas na matéria que se pode utilizar qualquer processo de cromatografia de permuta iónica. Prefere-se uma coluna de permuta iónica fraca tal como DEAE-Sefarose. As colunas de permuta aniónica fraca normalmente têm como grupo funcional uma amina terciária (dietilaminocetilo), mas também se pode utilizar etil-amina quaternária ou amina quaternária. A matriz pode basear-se em compostos inorgânicos, resinas sintéticas, polissacáridos ou polímeros orgânicos,-matrizes possíveis são agarose, celulose, trisacrilo, dextrano, pérolas de vidro, pérolas de oxirano acrílico, acrilamida, copolímero de agaro-se/poliacrilamida ou polímeros hidrofílicos de vinilo.

Também se considera que a purificação de CPB activa sob o ponto de vista enzimático compreende a cromatografia de permuta iónica e a cromatografia hidrofóbica.

Será evidente para os especialistas na matéria que se pode utilizar qualquer coluna hidrofóbica. Prefere-se a de fenil-sefarose. 0 grupo funcional pode ser fenilo, benzilo, octilo ou butilo. A matriz pode ser qualquer uma das discutidas antes.

Noutro enquadramento preferido, a purificação da CPB activa sob o ponto de vista enzímãtico compreende a cromatografia de permuta iónica e a cromatografia hidrofóbica e diafiltração.

Num enquadramento especificamente preferido, o ProCPB é expresso pelo plasmido ρλ ProCPB depositado com o n° de acesso da ATCC 69673. A presente invenção tem ainda por objecto CPB activa sob o ponto de vista enzimãtico, isenta de outras substâncias de origem de mamíferos.

Os exemplos que se seguem foram estabelecidos para ajudar à compreensão da presente invenção e não pretendem e não foram preparados para, de alguma forma, limitar o âmbito da presente invenção. Os exemplos não incluem descrições detalhadas para processos convencionais utilizados na construção dos vectores, a inserção de genes que codificam os polipéptidos nesses vectores ou a introdução dos plasmidos resultantes nos hospedeiros. Os exemplos também não incluem a descrição detalhada para processos convencionais utilizados para fazer o ensaio de polipéptidos produzidos por esses sistemas de vectores hospedeiros. Esses processos são bem conhecidos pelos especialistas na matéria e estão descritos em numerosas publicações, cujas descrições são aqui incorporadas como referência nesta descrição, incluindo, a título de exemplo, o seguinte:

Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. (1989)

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold

Spring Harbor Laboratory Press. EXEMPLO 1: Clonagem do ADNc de carboxipeptidase B de rato por

RCP l. Amplificação de ADN

Extraiu-se o ARN total a partir do pâncreas de ratos Sprague-Dawley. Isolou-se a partir do ARN total, isolou-se 40 pg de ARNm de poli A+ (por meio de coluna de oligo dT -celulose) . Utilizou-se uma alíquota (10 pg) do ARNm de poli A+ assim obtido como matriz numa reacção de transcrição inversa, na presença de um iniciador da extremidade 3' de carboxipeptidase B sintética (5) (figura 1).

Nas sínteses que se seguem do ADN complementar de hélice simples (ADNC hs) , o ARNm precipitou no seio de etanol. Submeteu-se então uma alíquota de ADNc-hs a uma amplificação por RCP:

Para a amplificação do ADN que codifica CPB (940 pb) , utilizou-se um iniciador sintético correspondente à terminação 3' de carboxipeptidase B e um iniciador sintético correspondente à terminação 5' da carboxipeptidase B madura (figura 1),

Para a amplificação do ADN que codifica ProCPB (1230 pb), utilizou-se um iniciador sintético correspondente à terminação 3' de carboxipeptidase B e um iniciador sintético correspondente à terminação 5' da procarboxipeptidase B (figura 1).

As condições de amplificação por RCP foram as seguintes:

Terminação 3' iniciadora 2. Terminação 5' iniciadora 3. ADNc-hs 1.

2 gg 2 gg 5 gL 4. Tampão: dNTP's

0,2 mM

Tris-HCl

50 mM KC1

20 mM

MgCl2 5. Taq Polimerase I

8 mM 2,5 unidades

100 gL 50 gL

Volume total: 6. Óleo mineral (contra evaporação) 7. 1 ciclo x [1' a 92 °C; 2' a 40 °C e 4' a 8. 72 °C] 9. 35 ciclos x [1' a 92 °C; 2' a 53 °C e 3' a 72 °C] 1 ciclo x [1' a 92 °C; 2' a 53 °C e 15' a 72 °C]

Analisaram-se os produtos de amplificação por RCP num gel de agarose a 1 %. Os controlos não amplificados e os marcadores da dimensão foram também incluídos. Observaram-se duas bandas distintas de cerca de 940 pb e de 1230 pb. A banda de 940 pb representa a sequência de nucleótidos de CPB e a banda de 1230 pb representa a sequência de nucleótidos de ProCPB que inclui a sequência de nucleótidos do péptido de activação.

No seguimento da amplificação por PCR, purificou-se o ADN da mistura reaccional por meio de extracções no seio de clorofórmio e de acetato de amónio e precipitação no seio de isopropanol.

II. Plasmido pCPB O plasmido pCPB (figura 2) foi construído fazendo a digestão do ADNc de CPB com BamHI e Ncol e, no seguimento da purificação do gel, a sub-clonagem do fragmento no fragmento BamHI e Ncol de 2500 pb do plasmido pABN, que codifica os elementos que se seguem, necessários para a expressão em bactérias: (i) o promotor λΡΒ que permite a expressão do gene a partir de células de E. coli por indução, isto é, aumentando a temperatura de 3 0 °C para 42 °C que inactiva o repressor sensível à temperatura cl857; (ii) o sítio de ligação ribosómico (slr) de deo; (iii) o terminador da transcrição trc (8); (iv) o gene de resistência à ampicilina do plasmido pBR3 22; e (v) a origem de replicação de pBR322.

III. Plasmido pCPB-C A sequência de aminoácidos da carboxipeptidase de ocorrência natural contém 7 resíduos de cisteína, seis dos quais nas ligações S-S e um dos quais (Cis290) é um resíduo de cisteína livre (1). Os requerentes crêem que este resíduo de cisteína livre pode formar ligações S-S inter- ou intra-moleculares indesejáveis durante a redobragem da CPB recombinante. Cis290 não está presente no sítio catalítico nem no sítio de ligação do substrato da carboxipeptidase B e, aparentemente, não é necessário para a actividade enzimática da enzima (1,2). Foi por isso decidido produzir uma CPB em que a cisteína é substituída por serina; esta CPB é designada por CPB-C.

Preparou-se um oligonucleótido fosforilado de extremidade 5' contendo 2 substituições de nucleótidos:

Tre Cis ......ACC TGT...... sequência origina em

carboxipeptidase B

Tre Ser 5· ATC CGC CAG ACT AGT GAG GAG ACA ATG 31 sequência mutante

Spel

Este oligonucleótido foi utilizado para substituir a sequência de nucleótidos que codifica Cis290 com uma sequência de nucleótido que codifica serina no plasmido pCPB por mutagénese dirigida ao sítio, conforme descrito na figura 2 (9). 0 plasmido obtido de novo foi designado por pCPB-C.

IV. Plasmido pProCPB-C

Construiu-se um plasmido designado por pProCPB-C comportando a sequência de nucleótidos de ProCPB-C (contendo a mutação de Cis290 -+ Ser) (figura 3) e utilizou-se para transformar 4300 de E, coli.

V. Plasmido pXProCPB

Construiu-se um plasmido designado por pÀProCPB comportando a sequência de nucleótidos de ProCPB (figura 3) e utilizou-se para transformar 4300 de E, coli. Este plasmido foi depositado na ATCC com o n° de acesso da ATCC 69673 em 4 de Agosto de 1994.

Preparou-se o ADN do plasmido a partir dos plasmidos pCPB, pCPB-C, pXProCPB, pProCPB-C e submeteu-se à análise de enzima de restrição e â sequenciação de nucleótidos para verificar a presença das sequências correctas.

Exemplo 2: Fermentação, condições de crescimento e purificação de ProCPB e CPB. I Culturas concentradas

As culturas concentradas de 4300 de E. coli comportando o plasmido pXProCPB cresceram em meio LB complementado com ampicilina (100 pg/mL). II Inoculo 0 inoculo propagou-se em 100 mL de meio LB complementado com ampicilina (100 pg/mL) a 3 0 °C até a concentração das células atingir uma D.0.86o de 2,0. O meio de produção (meio LB complementado com ampicilina (100 pg/mL)) foi inoculado, incubado a 30 °C, arejado, agitado e manteve-se o pH a 7,2 com NH3. Adicionou-se vinte gramas à cultura durante o crescimento. Quando a concentração das células atingiu uma D.O.seo de 12, aumentou-se a temperatura para 42 °C para permitir a expressão de ProCPB. Passadas duas horas, a concentração de células atingiu uma D.0.860 de 22-29 e colheram-se as bactérias. III. Purificação

ProPCB expresso pelo plasmido pÀProCPB acumulado no precipitado intracelular que foi isolado pelo seguinte processo: 40 gramas (peso anidro) do bolo bacteriano foi suspenso em 450 mL de tampão contendo PMSF 1 mM (Sigma) , Tris-HCl 50 mM, a pH 8, EDTA 10 mM e tratou-se com lisizoma (Sigma) até a uma concentração final de 50 pg/mlL at 37 °C. durante 2 horas.

Submeteu-se então a mistura a ultra-sons e adicionou-se Triton X-100 (Merck) até a uma concentração final de 2 % e agitou-se durante 2 horas à temperatura ambiente. O precipitado intracelular impuro foi aglomerado por centrifugação (14000 rpm, 30 min., 4 °C) e lavou-se com água. 0 precipitado intracelular compreendendo ProCPB foi dissolvido em tampão B contendo NaCl 25 mM, ureia 8 M, DTT 10 mM, Bis-Tris 20 mM, a pH 7. Fez-se a cromatografai da solução numa coluna de DEAE-Sefarose de fluxo rápido equilibrada em tampão B, eluíu-se a proteína com cerca de NaCl 100 mM em tampão B e ProCPB precipitou no seio de (NH4)2 S04 a 40 %, a 0 °C.

Descobriu-se mais tarde que a CPB activa sob o ponto de vista enzimático podia ser produzida apenas por via da produção da proteína precursora. Contudo, inicialmente, os polipéptidos CPB e CPB-C foram produzidos de uma forma semelhantes â produção de ProCPB produzida antes; ProCPB-C foi também produzida de uma forma semelhante. Os plasmidos utilizados foram pCPB, pCPB-C e pProCPB-C respectivamente (tal como descrito no exemplos 1) . As condições de crescimento de E. coli comportando estes plasmidos e a purificação dos polipéptidos foram praticamente as descritas 22 antea para ProCPB excepto no tampão utilizado par dissolver o precipitado intracelular compreendendo CPB ou CPB-C recombinantes contidos em etanolamina 20 mM, a pH 9, DTT 10 mM e ureia 8 M.

Note-se que neste caso, os polipêptidos produzidos e purificados conforme descrito antes não tinham actividade enzimãtica. A dobragem dos polipêptidos, numa tentativa para produzir proteínas activas sob o ponto de vista enzmático está descrita no exemplo 3.

Exemplo 3: Dobragem e activação de ProCPB-C

Os polipêptidos CPB e CPB-C foram produzidos tal como descrito no exemplo 2, mas verificou-se que não tinham actividade enzimãtica. Utilizaram-se processos de dobragem conhecidos (tal como se descreve a seguir) mas não se obteve nenhuma proteína com actividade enzimãtica.

Para resolver o problema da incapacidade de obter proteína activa sob o ponto de vista enzimático, desenvolveu-se um processo alternativo envolvendo a expressão e a dobragem da proteína precursora seguido do tratamento para eliminar a porção do péptido de activação da proteína precursora dobrada. Isto resultou num processo que se descreve a seguir. A ProCPB-C, produzida como se descreveu no exemplo 2, foi dissolvida a 10 mg/mL em urea 8 M, HC1 5 mM e diluiu-se para 1 mg/mL em glicina 100 mM, ZnCl2 0,2 mM a pH 9, 10 e 11. Estas foram as soluções de dobragem. 23

Realizou-se a dobragem por incubação das soluções de dobragem anteriores durante 17 horas à temperatura ambiente. A ProCPB-C assim produzida não tinha actividade enzimática nesta etapa (ver quadro 1). 0 pH da solução contendo a ProCPB-C dobrada foi então ajustado para cerca de 8,5 com HC1 e tratou-se com tripsina (1:200 p/p) durante 30 minutos a 37 °C para eliminar o péptido de activação. Para terminar a reacção, adicionou-se PMSF até a uma concentração final de 0,1 mM.

Ensaiou-se assim a actividade enzimática do CPB-C dobrado assim obtido (quadro I) de acordo com Folk (1970) (11) : Define-se uma unidade de actividade (u) como a quantidade de enzima que catalisa a hidrólise de 1 pmole de substrato de Hipuril-L-Arg, por minuto, a 25 °C, causando um aumento na absorvência de 0,12 a 254 nm e 1 cm de comprimentos de caminho. A actividade específica da carboxipeptidase B porcina (Sigma) é de 230 u/mg.

Quadro I: Actividade específica de ProCPB-C (e de CPB-C dela derivada)em várias condições:

Reacção Actividade específica (u/mg) 1. Apenas substrato 0,0 2. Dobragem a pH 9, tratamento com tripsina, sem ProCPB-C presente 0,0 3. Dobragem a pH 9, tratamento com tripsina 4,3 4. Apenas dobragem a pH 9 0,0 5. Dobragem a pH 10, tratamento com tripsina 1,7 6. Dobragem a pH 11, tratamento com tripsina 0,3 7. CPB porcina comercial 230 0 quadro I indica que se obteve CPB-C activa sob o ponto de vista enzimático após a dobragem de ProCPB-C e o tratamento com tripsina da ProCPB-C, utilizando as condições descritas antes. 0 quadro I indica ainda que a actividade específica de CPB-C é maior quando o pH na mistura de dobragem é 9 , do que na mistura de dobragem é 10 ou 11.

Exemplo 4: Condições de dobragem melhoradas

As experiências que se seguem foram realizadas de modo a estabelecer uma dobragem e condições de activação óptimas.

Os requerentes assumiram que quanto mais elevada for a actividade específica da CPB-C obtida pela clivagem de tripsina da ProCPB-C dobrada, então mais óptimas serão as condições de dobragem de ProCPB-C. Para além das experiências referidas a seguir, realizaram-se controlos "apenas com substrato" e com "carboxipeptidase porcina comercial".

Inicialmente, os resultados (conforme descrito no exemplo 3) melhoraram quando se realizou a dobragem utilizando 0,05-0,1 mg/mL de ProCPB-C a pH 9,5.

I. O efeito da temperatura na dobragem de ProCPB-C A dobragem de ProCPB-C foi realizada por incubação de 0,05 mg/mL de polipéptido em glicina 100 mM, a pH 9,5 durante 90 horas, à temperatura de 10-37 °C. Trataram-se as amostras de ProCPB-C dobradas cora tripsina (1:200 p/p) e mediu-se a actividade específica da CPB-C assim obtida, tal como se descreveu no exemplo 3. Obteve-se a actividade específica mais elevada de CPB-C obteve-se quando se realizou a dobragem de ProCPB-C entre 20 °C.-30 °C.

II. O efeito da glutationa oxidada e reduzida na dobragem de ProCPB-C

Realizou-se a dobragem de ProCPB-C por incubação de 0,05 mg/mL de polipéptido em tampão de glicona 100 mM, a pH 9,5, ZnCl2 0,01 mM a 25 °C, na presença de glutationa oxidada e reduzida (GSSG/GSH) ou ácido ascórbico (quadro II). Em seguida, trataram-se as soluções incubadas com tripsina (1:200 p/p) durante 1 hora a 37 °C e mediu-se a actividade específica de CPB-C assim obtida.

Quadro II: Actividade específica de CPB-C em função da presença de oxidante/resutor na solução de dobragem

Oxidante/reductor adicionado à solução de dobragem Actividade específica (u/mg) 18 Horas 45 Horas GSSG 0,1 mM 2,18 16,39 GSSG 0,1 mM, GSH 1 mM 16,37 26,90 Ácido ascõrbico* 16,5 M 4,06 9,24 Controlo (nenhum dos anteriores adicionado) 1,19 5,39 * Adicionou-se o ácido ascõrbico a uma concentração de 2,5 mole por uma mole do grupo SH. 0 quadro II indica que a adição combinada de GSSG e GSH causa um aumento dramático na actividade específica de CPB-C e presumivelmente na eficiência de dobragem de ProCPB-C. GSSH isoladamente aumentou a eficiência da dobragem de ProCPB-C o mesmo acontecendo com o ácido ascórbico, embora em menor extensão.

Numa outra série de experiências verificou-se que a dobragem óptima de ProCPB-C se obtém por adição de GSSG 0,1 mM e GSH 0,5 mM à solução de dobragem. III. Activação de ProCPB-C dobrado por tripsina

Estabeleceu-se que a CPB-C mais activa se obteve por clivagem de ProCPB-C por meio de tripsina para eliminar o péptido de activação quando se tratou a solução de dobragem incubada com tripsina 1:50 p/p durante 1 hora a 37 °C.

IV. 0 efeito do pH na dobragem de ProCPB-C

Determinou-se o efeito do pH na dobragem de ProCPB-C numa série de reacções em condições previamente optimizadas.

Realizou-se a dobragem de ProCPB-C a 0,1 mg/mL em glicina 100 mM, ZnCl2 0,02 mM, glutationa reduzida 0,5 mM (GSH), glutationa oxidada 0,1 mM (GSSG) a 25 °C., durante 24 horas a vários valores de pH (entre 8,75-10,00). Trataram-se amostras de ProCPB-C dobrado com tripsina (1:50 p/p; dissolvida em HC1 1 mM, CaCl2 10 mM) e mediu-se a actividade específica da CPB-C assim obtida, conforme descrito no Exemplo 3.

Obteve-se a mais elevada actividade específica de CPB-C quando a dobragem de ProCPB-C foi realizada a pH de 9,25.

V. 0 efeito de ZnCl2 na dobragem de ProCPB-C 0 efeito da concentração de ZnCl2 na solução de dobragem na dobragem de ProCPB-C foi determinada numa série de reacções em condições previamente optimizadas, a uma concentração de ZnCl2 2-20 vezes superior à concentração estimada de CPB-C (mole/mole), a actividade específica da CPB-C produzida foi a mais elevada. Quando se realizou a dobragem sem a adição de ZnCl2 e se adicionou EDTA à mistura de dobragem para quelar quaisquer iões bivalentes residuais, a actividade específica da CPB-C decresceu para zero.

VI. O efeito da concentração da proteína da dobragem de Pro-CPB-C

Realizou-se a dobragem de ProCPB-C durante 24 horas em condições óptimas (tal como se determinou antes) nas concentrações de proteína indicadas no quadro III. Depois da digestão tríptica mediu-se a actividade da CPB-C, conforme descrito no Exemplo 3.

Quadro III: Actividade específica da CPB-C em função da concentração de proteína na solução de dobragem

Concentração da proteína (mg/mL) Actividade específica (u/mg) 0,05 35,1 0,10 31,8 0,20 20,3 O quadro III indica que a actividade específica da CPB-C foi a mais elevada a uma concentração de proteína de 0,05 mg/mL.

VII. Tempo de dobragem em função da actividade específica da CPB-C

Determinou-se o tempo de dobragem óptimo de ProCPB-C numa série de reacções em condições previamente optimizadas.

Realizou-se a dobragem de ProCPB-C 0,1 mg/mL em glicina, a pH 9,25, GSSG 0,1 mM, GSH 0,5 mM e ZnCl2 0.01 M. Trataram-se amostras de ProCPB-C dobrada com tripsina (1:50 p/p) mediu-se a actividade específica da CPB-C assim produzida, conforme descrito no Exemplo 3 em vários momentos (entre 0-40 horas) depois do início da dobragem.

Obteve-se a mais elevada actividade específica de CPB-C quando a dobragem de ProCPB-C foi clivada com tripsina 20 horas depois do início da dobragem. A dobragem durante mais do que 20 horas não alterou a actividade específica da CPB-C.

Exemplo 5: Dobragem e activação das diferentes proteínas de CPB

Dobrou-se cada uma das CPB, CPB-C, ProCPB e ProCPB-C produzidas e purificadas, conforme descrito no Exemplo 2, a 0,1 mg/mL em tampão de glicina 100 mM, a pH 9,25, ZnCl2 0,01 mM, GSH 0,5 mM, GSSG 0.1 mM à temperatura ambiente durante 24 horas, i.e. as condições de dobragem utilizadas foram praticamente as condições óptimas estabelecidas no exemplo 4. O pH de cada solução contendo CPB, CPB-C, ProCPB ou ProCPB-C dobradas, foi ajustado para 8,5 com HC1 e trataram-se as soluções contendo CPB, CPB-C, ProCPB ou ProCPB-C com tripsina (1:50 p/p) durante 1 hora a 37 °C para eliminar o péptido de activação. Para terminar a reacção, asicionou-se PMSF até a uma concentração final de 0,1 mM. Mediu-se a actividade específica das CPB, CPB-C, ProCPB e ProCPB-c conforme descrito no Exemplo 3.

Quadro IV: Actividade específica das CPB, CPB-C, ProCPB e ProCPB-C depois da dobragem e activação em condições óptimas

Incrustamento Actividade específica (u/mg) - sem tratamento Controlos1 com tripsina 0,00 - sem proteína 0,00 Incrustamento -CPB 0,00 - CPB-C 0,08 - ProCPB 42,90 - ProCPB-C 20,90 x0 controlo "sem tripsina" foi feito apenas para ProCPB-C, 0 quadro IV indica que a CPB, activa sob o ponto de vista enzimático, pode ser produzida apenas a partir de céllas que expressam o precursor que contém o peptide de activação. Assim, o péptido de activação é necessário para corrigir a dobragem de CPB. 0 quadro IV também indica que a CPB com actividade específica óptima é produzida a partir da dobragem e activação de ProCPB (expressa pelo plasmido ÂProCPB) que contém o resíduo Cis290 e não da dobragem e activação de

ProCPB-C que contém a mutação Cis290 -<· Ser. Assim, a Cis290 é aparentemente necessária para a dobragem óptima e/ou para a actividade mais elevada de CPB. 30

Exemplo 6: Dobragem melhorada de ProCPB

Verificou-se que as condições de dobragem óptima de ProCPB eram praticamente idênticas às condições de dobragem óptimas para ProCPB-C determinadas no exemplo 4.

Realizou-se um processo simplificado para a dobragem e activação de ProCPB utilizando um precipitado intracelular impuro omitindo a necessidade da etapa de purificação inicial, conforme descrito no exemplo 2, parte III.

Verificou-se que o precipitado intracelular impuro contendo ProCPB (produzido conforme descrito no exemplo 2) podia ser dissolvido a concentrações de proteína elevadas (quadro V) no seio de glicina 100 mM, a pH 9,5 e ureia 8M.

Realizou-se a dobragem em condições optimizadas durante 24 horas à temperatura ambiente. Subiu-se o pH para o pH óptimo de 9,5 (previamente determinado). Clivou-se a ProCPB dobrada com tripsina (1:50 p/p) e mediu-se a actividade específica de CPB conforme descrito no exemplo 3.

Quadro V: Actividade específica de CPB em função da concentração de proteína na solução de dobragem compreendendo precipitado intracelular impuro

Concentração de proteína (mg/mL) Actividade específica (u/mg} 0,1 10,5 0,2 10,9 0,5 11, 9 1,0 12,1 2,0 11,4 31 0 quadro V indica que a CPB, activa sob o ponto de vista enzimático, pode ser obtido por dobragem de ProCPB a partir de precipitado intracelular impuro, seguida da digestão tríptica. Além disso, a CPB, é activa sob o ponto de vista enzimático, a um nível semelhante em todas as concentrações de proteína medidas. Isto é um resultado inesperado, dado que a actividade específica da CPB, purificada em DEAE-Sefarose antes da dobragem (exemplo 2), diminuiu quando a concentração de proteína aumentou na mistura de dobragem. Aparentemente, o precipitado intracelular contém factores que ajudam â dobragem de ProCPB. II. Aumento de CPB por dobragem de ProCPB a partir de precipitado intracelular impuro (i) Produção

Purificou-se a CPB até próximo da homogeneização a partir de 42 litros de E. coli 4300 contendo o plasmido pÀProCPB-C e expressando ProCPB. As condições de fermentação e de crescimento foram praticamente as mesmas que as descritas no exemplo 2.

Lavou-se o precipitado intracelular impuro em água e dissolveu-se a 20 mg/mL em glicina 100 mM, a pH 9,5, ureia 8 M e diluiu-se para 1 mg/mL com glicina 100 mM, a pH 9,5. Adicionou-se ZnCl2 0,1 mM, GSH 0,5 mM e GSSG 0,1 mM e incubou-se a solução de dobragem resultante a 25 ° C. durante 24 horas. Ajustou-se então o pH para 8,5 com HC1 e digeriu-se a ProCPB dobrada com tripsina (20 pg/mL) a 37 °C. durante 1 hora. Inactivou-se a tripsina com PMSF 0,1 mM. (ii) Purificação

Carregou-se o CPB activo sob o ponto de vista enzimático numa coluna de DEAE-Sefarose de fluxo rápido (Pharmacia) equilibrada com Tris-HCl 20 til, a pH 8 a 20 mg por mL de resina. Eluiu-se a CPB com NaCl 80 mM, Tris-HCl 20 mM, a pH 8. Adicionou-se sulfato de amónio (0,8 M) ao conjunto dos produtos eluidos de DEAE a que se aplicou uma cromatogradia numa coluna de DEAE-Sefarose de fluxo rápido (Pharmacia) equilibrada com Tris-HCl 20 mM, a pH, sulfato de amónio 0.8 M. Eluiu-se a CPB com sulfato de amónio 0.4 M, concentrou-se, tratou-se por diafiltração contra NaCl 100 mM, Tris-HCl 20 mM, a pH 8 e armazenou-se a -20 “C.

No processo de purificação anterior, trataram-se 42 litros de E. coli 4300 comportando o plasmido p.ÀProCPB a uma D.0.66o =36conforme se descreveu antes e obteve-se 1,25 grama de CPB activa sob o ponto de vista enzimático, com uma actividade específica de 637 u/mg. 0 rendimento global do processo foi de cerca de 60 %. A actividade específica da carboxipeptidase B porcina comercial, medida em condições experimentais idênticas, foi de 298 u/mg.

Exemplo 7: Caracterização da CPB activa sob o ponto de vista enzimático A CPB produzida como se discutiu nos exemplos 5 e 6 tem propriedades bioquímicas e enzimáticas comparáveis com a carboxipeptidase B porcina. 0 coeficiente de extinção da CPB recombinante, calculado com base na composição dos seus aminoácidos é de ε1 %2eo = 19,7. O coeficiente de extinção da carboxipeptidase B porcina comercial é de ε1 *28o = 21,4 (1) . A CPB reeombinante tem uma actividade específica de 637 u/mg (substrato de Hipuril-L-Arg) e contém 1 mole de Zn por mole de enzima como se determinou por absorção atómica. A análise da sequência de aminoácidos de terminal N revelou, Ala-Ser-Gli-His-Ser, como esperado, a partir das análises das sequências de aminoácidos de carboxipeptidase B madura de rato (5). 0 pH óptimo para a actividade de CPB reeombinante foi determinado utilizando 25 mM dos tampões seguintes: NaOAc, a pH 4-6; Bis-Tris, a pH 6-75; Tris-HCl a pH 7.5-9; e Glicina, a pH 9-12. Mediu-se a actividade específica de CPB conforme descrito no exemplo 3. A actividade enzimática óptima da CPB obteve-se a pH 8. A incubação de CPB a 55 ° C. causou uma perda de 50% da actividade e a inactivação completa ocorreu a 65 °C. A análise cinética da CPB reeombinante foi realizada utilizando substrato de Hipuril-L-Arg (figura 4). Houve inibição da actividade da CPB para concentrações de substrato de 0,5 mM.

Estudos adicionais revelaram que a CPB reeombinante foi inibida pela catálise do produto de arginina, que é um inibidor concorrente de carboxipeptidase B. A curva de Líneweaver-Burk correspondente mostrou um valor de Km de 0,38 mM. A CPB reeombinante foi também inibida por 1,10-fenantrolina, um agente quelante de um ião bivalente forte, demonstrando assim a importância dos iões de Zn para a actividade enzimática de CPB. Na presença de 1,10- fenantrolina 1 mM, observou-se 50 % de perda da actividade de 1 mg/mL de CPB recombinante.

Exemplo 8: Conversão de pró-insulina em insulina por meio de CPB A mini-insulina, tal como descrito na patente de invenção europeia EP 347781 Bl, pode ser convertida em insulina por tratamento com tripsina e CPB recombinante, conforme produzida nos exemplos 5 e 6. A tripsina cliva especificamente entre o resíduo de arginina e a cadeia A. A CPB em sequida hidrolisa especificamente o resíduo de arginina da terminação C da cadeia B. A insulina humana comercial (Boehringer-Mannheim) pode ser utilizada como um padrão assim como a mini-pró-insulina clivada pela tripsina e a carboxipeptidase B porcina comercial e a mini-pró-insulina clivada apenas pela tripsina.

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LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Bio-Technology General Corp.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: PRODUÇÃO DE

CARBOXIPEPTIDASE B ACTIVA SOB 0 PONTO DE VISTA ENZIMÁTICO (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 8

(iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA

(A) ENDEREÇO: Cooper & Dunham LLP (B) RUA: 1185 Avenue of the Américas (C) CIDADE: New York (D) ESTADO: New York (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 10036 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Floppy disk

(B) COMPUTADOR: compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO : PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO DE PATENTE DE INVENÇÃO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: Ainda desconhecido (B) DATA DE REGISTO: 25-JAN-1996 (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) ADVOGADO/AGENTE DE INFORMAÇÃO: (A) NOME: White, John P. (B) NÚMERO DE REGISTO: 28.678

(C) REFERÊNCIA/NÚMERO DE ETIQUETA: 0336/43847-A-PCT (ix) INFORMAÇÃO DE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (212) 278-0400 (B) TELEFAX: (212) 391-0525 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-PARALELO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: GCGCATATGC ATGCTTCCGA GGAGCACTTT GATGGC 3 6 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 285 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (II) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-PARALELO; NÃO (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1.285 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUENCIA: SEQ ID NO: 2: CAT GCT TCC GAG GAG CAC TTT GAT GGC AAC CGG GTG TAC CGT GTC AGT 48 His Ala Ser Glu Glu His Fen Asp Gli Asn Arg Vai Tir Arg Vai Ser 1 5 10 15 GTA CAT GGT GAA GAT CAC GTC AAC TTA ATT CAG GAG CTA GCC AAC ACC 96 Vai His Gli Glu Asp His Vai Asn Leu Ile Gin Glu Leu Ala Asn Tre 20 25 30 AAA GAG ATT GAT TTC TGG AAA CCA GAT TCT GCT ACA CAA GTG AAG CCT 144 Lis Glu Ile Asp Fen Trp LÍS Pro Asp Ser Ala Tre Gin Vai Lís Pro 35 40 45 38 CTC ACT ACA GTT GAC TTT CAT GTT AAA GCA GAA GAT GTT GCT GAT GTG 192 Leu Tre Tre Vai Asp Fen His val Lis Ala Glu Asp Val Ala Asp Val 50 55 60 GAG AAC TTT CTG GAG GAG AAT GAA GTT CAC TAT GAG GTA CTG ATA AGC 240 Glu Asn Fen Leu Glu Glu Asn Glu Val His Tir Glu Val Leu Ile Ser 65 70 75 80 AAC GTG AGA AAT GCT CTG GAA TCC CAG TTT GAT AGC CAC ACC CGT 285 Asn Vai Arg Asn Ala Leu Glu Ser Gin Fen Asp Ser His Tre Arg 85 90 95 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 3; (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 95 aminoãcidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

His Ala Ser Glu Glu His Fen Asp Gli Asn Arg Vai Tir Arg Vai Ser 1 5 10 15

Vai His Gli Glu Asp His Vai Asn Leu Ile Gin Glu Leu Ala Asn Tre 20 25 30

Lis Glu Ile Asp Fen Trp Lis Pro Asp Ser Ala Tre Gin Vai Lis Pro 35 40 45

Leu Tre Tre Vai Asp Fen His Vai Lis Ala Glu Asp Vai Ala Asp Vai 50 55 60

Glu Asn Fen Leu Glu Glu Asn Glu Vai His Tir Glu Vai Leu Ile Ser 65 70 75 80 39

Asn Vai Arg Asn Ala Leu Glu Ser Gin Fen Asp Ser Hls Tre Arg 85 90 95 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL; simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-PARALELO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: GCGCCATGGC AAGTGGACAC AGCTACACCA AGTACAAC 38 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIAS: (A) COMPRIMENTO: 927 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ΑΝΤΙ-PARALELO: NO (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..927 40 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: GCA AGT GGA CA C AGC TAC ACC AAG TAC AAC AAC TGG GAA ACG ATT GAG 48 Ala Ser Gli His Ser Tir Tre Lis Tir Asn Asn Trp Glu Tre ile Glu 100 105 110 GCG TGG ATT CAA CAA GTT GCC ACT GAT AAT CCA GAC CTT GTC ACT CAG 96 Ala Trp Ile Gin Gin Vai Ala Tre Asp Asn Pro Asp Leu Vai Tre Gin 115 120 125 AGC GTC ATT GGA ACC ACA TTT GAA GGA CGT AAC ATG TAT GTC CTC AAG 144 Ser Vai ile Gli Tre Tre Fen Glu Gli Arg Asn Met Tir Vai Leu Lis 130 135 140 ATT GGT AAA ACT AGA CCG AAT AAG CCT GCC ATC TTC ATC GAT TGT GGT 192 Ile Gli Lis Tre Arg Pro Asn Lis Pro Ala Ile Fen Ile Asp Cis Gli 145 150 155 TTC CAT GCA AGA GAG TGG ATT TCT CCT GCA TTC TGT CAG TGG TTT GTG 240 Fen His Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala Fen Cis Gin Trp Fen Vai 150 165 170 175 AGA GAG GCT GTC CGT ACC TAT AAT CAA GAG ATC CAC ATG AAA CAG CTT 288 Arg Glu Ala Vai Arg Tre Tir Asn Gin Glu Ile His Met Lis Gin Leu 180 185 190 CTA GAT GAA CTG GAT TTC TAT GTT CTG CCT GTG GTC AAC ATT GAT GGC 336 Leu Asp Glu Leu Asp Fen Tir Vai Leu Pro Vai Vai Asn Ile Asp Gli 195 200 205 TAT GTC TAC ACC TGG ACT AAG GAC AGA ATG TGG AGA AAA ACC CGC TCT 384 Tir Vai Tir Tre Trp Tre Lis Asp Arg Met Trp Arg Lis Tre Arg Ser 210 215 220 ACT ATG GCT GGA AGT TCC TGC TTG GGT GTA GAC CCC AAC AGG AAT τ*τχ 432 Tre Met Ala Gli Ser Ser Cis Leu Gli Vai Asp Pro Asn Arg Asn Fen 225 230 235 AAT GCT GGC TGG TGT GAA GTG GGA GCT TCT CGG AGT CCC TGC TCT GAA 480 Asn Ala Gli Trp Cis Glu Vai Gli Ala Ser Arg Ser Pro Cis Ser Glu 240 245 250 255 ACT TAC TGT GGA CCA GCC CCA GAG TCT GAA AAA GAG ACA AAG GCC CTG 528 41

Tre Tir Cis Gli Pro Ala Pro Glu Ser Glu Lis Glu Tre Lis Ala Leu 260 265 270 GCA GAT TTC ATC CGC AAC AAC CTC TCC ACC ATC AAG GCC TAC CTG ACC 576 Ala Asp Fen Ile Arg Asn Asn Leu Ser Tre Ile Lis Ala Tir Leu Tre 275 280 285 ATC CAC TC A TAC TCA CAG ATG ATG CTC TAC CCT TAC TCC TAT GAC TAC 624 Ile His Ser Tir Ser Gin Met Met Leu Tir Pro Tir Ser Tir Asp Tir 290 295 300 AAA CTG CCT GAG AAC TAT GAG GAA TTG AAT GCC CTG GTG AAA GGT GCG 672 Lis Leu Pro Glu Asn Tir Glu Glu Leu Asn Ala Leu Vai Lis Gli Ala 305 310 315 GCA AAG GAG CTT GCC ACT CTG CAT GGC ACC AAG TAC ACA TAT GGC CCA 720 Ala Lis Glu Leu Ala Tre Leu His Gli Tre Ij r s Tir Tre Tir Gli Pro 320 325 330 335 GGA GCT ACA ACA ATC TAT CCT GCT GCT GGG GGA TCT GAC GAC TGG TCT 768 Gli Ala Tre Tre Ile Tir Pro Ala Ala Gli Gli Ser Asp Asp Trp Ser 340 345 350 TAT GAT CAG GGA ATC AAA TAT TCC TTT ACC TTT GAA CTC CGG GAT ACA 816 Tir Asp Gin Gli Ile Lis Tir Ser Fen Tre Fen Glu Leu Arg Asp Tre 355 360 365 GGC TTC TTT GGC TTT CTC CTT CCT GAG TCT CAG ATC CGC CAG ACC TGT 864 Gli Fen Fen Gli Fen Leu Leu Pro Glu Ser Gin Ile Arg Gin Tre Cis 370 375 380 GAG GAG ACA ATG CTT GCA GTC AAG TAC ATT GCC AAT TAT GTC CGA GAA 912 Glu Glu Tre Met Leu Ala Vai Lis Tir Ile Ala Asn Tir Vai Arg Glu 385 390 395 CAT CTA TB.T J. X *·ρΊ\ r* IHSj TGA 927 HÍS Leu Tir * * 400 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 6: 42 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 309 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Ala Ser Gli His Ser Tir Tre Lis Tir Asn Asn Trp Glu Tre Ile Glu 1 5 10 15 Ala Trp Ile Gin Gin Vai Ala Tre Asp Asn Pro Asp Leu Vai Tre Gin 20 25 30 Ser Vai Ile Gli Tre Tre Fen Glu Gli Arg Asn Met Tir Vai Leu Lis 35 40 45 Ile Gli Lis Tre Arg Pro Asn Lis Pro Ala Ile Fen Ile Asp Cis Gli 50 55 60 Fen His Ala Arg Glu Trp Ile Ser Pro Ala Fen Cis Gin Trp Fen Vai 65 70 75 80 Arg Glu Ala Vai Arg Tre Tir Asn Gin Glu Ile His Met Lis Gin Leu 85 90 95 Leu Asp Glu Leu Asp Fen Tir Vai Leu Pro Vai Vai Asn Ile Asp Gli 100 105 110 Tir Vai Tir Tre Trp Tre Lis Asp Arg Met Trp Arg L1 s Tre Arg Ser 115 120 125 Tre Met Ala G1 i Ser Ser Cis Leu Gli Vai Asp Pro Asn Arg Asn Fen 130 135 140 Asn Ala Gli Trp Cis Glu Vai Gli Ala Ser Arg Ser Pro Cis Ser Glu 145 150 155 160 Tre Tir Cis Gli Pro Ala Pro Glu Ser Glu Lis Glu Tre Lis Ala Leu 165 170 175 43

Ala Asp Fen lie Arg Asn Asn Leu Ser Tre Ile Lis Ala Tir Leu Tre 180 185 190

Ile His Ser Tir Ser Gin Met Met Leu Tir Pro Tir Ser Tir Asp Tir 195 200 205

Lis Leu Pro Glu Asn Tir Glu Glu Leu Asn Ala Leu Vai Lis Gli Ala 210 215 220

Ala Lis Glu Leu Ala Tre Leu His Gli Tre Lis Tir Tre Tir Gli Pro 225 230 235 240

Gli Ala Tre Tre Ile Tir Pro Ala Ala Gli Gli Ser Asp Asp Trp Ser 245 250 255

Tir Asp Gin Gli Ile Lis Tir Ser Fen Tre Fen Glu Leu Arg Asp Tre 250 255 270

Gli Fen Fen Gli Fen Leu Leu Pro Glu Ser Gin Ile Arg Gin Tre Cis 275 280 285

Glu Glu Tre Met Leu Ala Vai Lis Tir Ile Ala Asn Tir Vai Arg Glu 290 295 300

His Leu Tir * * 305 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: 44 CGCGGATCCT CACTAATATA GATGTTCTCG GACATAATT 39 (2) INPFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUTURA HELICOIDAL: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: ATCCGCCAGA CTAGTGAGGA GACAATG 27

Lisboa, 8 de Junho de 2007 45

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo de produção de CPB (carboxipeptidase B) pan-creãtica de mamífero, activa sob o ponto de vista enzima-tico, caracterizado pelo facto de compreender: (a) o tratamento de uma célula recombinante contendo ADN que codifica ProCPB, de tal modo que o ADN dirige a expressão de ProCPB; (b) a recuperação do ProCPB assim expresso, da célula,· (c) o tratamento do ProCPB recuperado em condições que permitam a dobragem do ProCPB; (d) a submissão do ProCPB assim dobrado a clivagem enzimática para produzir CPB activa sob o ponto de vista enzimático; (e) a purificação da CPB activa sob o ponto de vista enzimático.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a recuperação da (b) compreender: (i) o rompimento da parede da célula da célula recombinante para produzir um lisado; (ii) o isolamento do precipitado intracelular a partir do lisado, por centrifugação; (iii) a solublização do precipitado intracelular num tampão apropriado. 1
3. 3. Processo de acordo cora a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o tratamento da etapa (c) compreender a incubação de ProCPB à temperatura ambiente, durante um período de 20-24 horas a um pH de cerca de 9-9,5.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o tratamento da etapa (c) compreender a incubação de ProCPB à temperatura ambiente, durante um período de 20-24 horas a um pH de cerca de 9-9,5, na presença de ZnCl2, glutationa oxidada e glutationa reduzida.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a etapa (d) compreender: (i) o ajustamento do pH para cerca de 8,5; e (ii) a clivagem de ProCPB com tripsina.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a purificação da etapa (e) compreender uma cromatografia de permuta iónica.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a purificação da etapa (e) compreender uma cromatografia de permuta iónica e uma cromatografia hidrofóbica.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a purificação da etapa (e) compreender uma cromatografia de permuta iónica, uma cromatografia hidrofóbica e uma diafiltração. 2
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação l, caracterizado pelo facto de a ProCPB ser expressa pelo plasmido ρλ ProCPB depositado com o n° de acesso na ATCC 69673. Lisboa, 8 de Junho de 2007 3