JPH03187398A - 一工程セフアロスポリンｃアミダーゼ酵素、これをコードする遺伝子及び適切な宿主におけるその発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はセファロスポリンＣ及び誘導体を列挙した配列
のセファロスポリンＣアミダーゼ活性で処理することを
コードするセファロスポリンＣ及びその誘導体を対応す
る７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）及び誘
導体に一工程変換する改良された方法および該酵素をエ
ンコードするＤＮＡ及び適当なプロモーターの制御下通
当な宿主例えばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種に於け
るその発現に関する。

本発明は更に後述される特定のアミノ酸配列及び物理的
／化学的特性を有する酵素セファロスポリンＣアミダー
ゼ並びに一工程セファロスボリンＣアミダーゼとしての
酵素活性を有するそのいずれかのサブユニットに関する
。

本発明はまた更に後述される、酵素セファロスポリンＣ
アミダーゼをエンコードし、該酵素を発現することがで
きるヌクレオチド塩基配列を有するＤＮＡ断片に関する
。

本発明はまた適当ないずれかの原核又は真核宿主、特に
バシラス属、その中でも特にバチルスメガテリウム（ｍ
ｅｇａｔｅｒｉｕａ＋）及びバチルスズブチリス（ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）に於けるＤＮＡ断片即ち酵素セファロス
ポリンＣアミダーゼをコードする遺伝子の発現に関する
。これは以下で更に詳しく説明されるがバチルス・メガ
テリウムの特定菌株からセファロスポリンＣアミダーゼ
活性をコードする遺伝子をクローニングし、これをプロ
モーター配列例えば強力な構成的プロモーターに融合さ
せ、得られた構築体により、所望の宿主例えばバチルス
・ズブチリス及びバチルス・メガテリウムを形質転換す
ることによって達成される。この宿主は適当な培地中で
維持される。セファロスポリンＣアミダーゼ活性は監視
され酵素の回収は常法によって行なわれる。

本発明は酵素切断（脱アシル化）、特にセファロスポリ
ンＣの７−アミノアジボイル側鎖（７−α−アミノアジ
ピルとも呼ばれる）の一工程切断の分野にある。７−ア
旦ノアシボイル側鎖がアミド結合の切断によって除去さ
れることから変換を達成する特定の酵素は本明細書では
アミダーゼと呼ばれる。セファロスポリンＣ自体は現在
市販されているほとんど全てのセファロスポリンの出発
点である発酵産物である。しかしながらこれらの種々の
市販セファロスポリンを生産する合成操作は基本的に７
−アミツセフアロスボラン酸からスタートするが、これ
は７−アミノアジポイル側鎖の切断によりセファロスポ
リンＣから誘導されなければならない。

現在当業界で選択される７−アミノアジポイル側鎖を切
断する方法は化学的方法である。塩基性イ旦ノーハロゲ
ン化物法は７−アミノアジポイル側鎖のアミノ及びカル
ボキシル基の保護を必要とし、これを達成するいくつか
の方法が現在使用されている。しかしながら現在使用さ
れてはいるが化学的切断方法は重大な欠点を有する。こ
れらの中には多段階及び複雑な工程、非常に低い操作温
度、高価な試薬、廃水処理問題が生じる無視できない量
の工程副生酸物及び化学処理開始前に極めて不純な出発
物質の精製を必要とすることなどがある。その結実現在
使用されている化学的方法より経済的に７−７５ノセフ
アロスボラン酸を供給するためにセファロスポリンＣの
酵素的脱アシル化ができる微生物学的又は発酵方法の探
索が進行中である。

しかしながらうまく行く微生物学的方法の探索は概ね商
業規模のものに関しては明らかに無駄であった。これは
フェニルアセチル側鎖を有するペニシリンＧが種々の微
生物により生産されるペニシリンアシラーゼを用いる酵
素切断により脱アシル化に成功していることと対照的に
セファロスポリンＣ分子のアミノアジポイル側鎖の特有
の性質に起因する。他方文献に於けるセファロスポリン
Ｃの一工程酵素脱アシル化の成功例は、しばしば再現性
がないかあるいは最底の収率しか得られない。

その上今日までのところセファロスポリンＣのアミノア
ジポイル側鎖の一工程切断を得ることができるバチルス
属からの酵素、セファロスポリンＣアミダーゼの分離及
び配列決定に成功したちのはなかった。またセファロス
ポリンＣアミダーゼ酵素をコードする遺伝子は分離及び
配列決定されておらずあるいはその遺伝子の原核宿主に
於ける発現も成功していない。

現在行われているセファロスポリンＣの酵素切断を得る
試みが記載されている文献の要約を以下に示す。

１、一工程酵素脱アシル　：　Ｃｅ　ｈＣ−７−ＡＣＡ
Ｄｅｖ、　Ｉｎｄ、　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、　　第５巻
３４９頁（１９６４年）米国特許第３．２３９．３９４
号 （メルク） 微生物のスクリーニング及び選別のための土壌濃縮法　
　　　　Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ日本特許公報　５
３−９４０９３　（１９７８年）（明治）　　Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、　ＢＮ−１８８日本特許公報　
５２−１４３２８９　（１９７７年）米国特許第４．１
４１，７９０号 （明治）　　　　　　　柱匪杜紅旦ｕｓ　ｓｐ。

Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｓｐ。

米国特許第４，７７４．１７９号（１９８８年）日本特
許公報　６１−２１０９７　（１９８６年）（アサヒ）
　　　　　　　Ｐｓｅｕｄｏａ＋ｏｎｓ　ｓｐ。

５Ｒ−８３及び５Ｅ−４９５ 仏特許第２．２４１．５５７号（１９７５年）（アリニ
ス）　　　　　　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｃｅｒｅｕｓｖ
ａｒ、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ 日本特許公報５２−０８２７９１　（１９７７年）（東
洋醸造）　　ＮＲＲＬ　Ｂ　５３８５Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　　鱈灸佳虹！璋 Ｎ−（Ｎ’−フェニルチオカルバモイル）−セファロス
ポリンＣ７−ＡＣＡ 西独特許第３，４４７，０２３号（１９８６年）（ヘキ
スト）　　　　　　　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｍｅｇａｔ
ｅｒｕｉｍα−ケト酸の存在下　酵素はｂ−アミノ酸ト
ランスアミナーゼである。

日本特許公報　５８−１９０３９９　（１９Ｂ３年〉（
塩野義）　　　　　　　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　懸思封旦
艮ペニシリチクム（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｔｉｃｕｍ）変
異株ＡＴＣＣ１４９４５ 米国特許第３．１４４，３９５（１９６４年）（オリン
　マチェソン） 英国特許第２．１４２．３３６Ａ号（１９８５年）（ス
クイツブ）Ｂ、憇［ｋ皿艮 二工程酵素脱アシル化：ＣｅｈＣ→７−ＡＣＡ米国特許
第３，９６０，６６２号（１９７６年）Ａｇｒｉｃ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、第４５巻１５６１〜６７（１９
８１年）（東洋醸造） Ｄ−アミノ酸オキシダーゼにょる脱アミノ化次いで脱ア
シル化 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ。

欧州特許出願第０２７５９０１−Ａ２号（１９８８年）
（ヘキスト） ｉ　　）　　Ｃｅｐｈ　　ＣＧＬ−７−ＡＣＡ”Ｔｒｉ
　ｏｎｏ　ｓｉｓ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ〔英国特許第
３，８０１，４５８号（１９７４年）（グラクツ）〕 ｉｉ〉 ＧＬ−７ ＡＣＡ” ＡＣＡ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 日本特許公報５２−１２８２９３　（１９７７年）　Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ５３−８６０９４　　（１９７８年）Ａ
ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ（万有）　　　　　　　　　　
　　　Ａ　ｌｃａ　ｌ　ｉｇｅｎｅｓ＊　ＧＬ−７−Ａ
ＣＡ　＝グルタリル　７−ＡＣＡ＝３−アセトキシメチ
ル−７−β−（４−カルボキシブタンアミド）　Ｃｅｐ
ｈ　−３−エム−４−カルボン酸 米国特許第３．８２１，０８１号（１９７４年）Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　　ｍｅｇａｔｅｒｕｉｍＰｒｏｃｅｓｓ　
Ｂｉｏ　Ｃｈｅｍ、第１１巻　２１頁（１９７６年）（
東洋醸造） 米国特許第３，７４９，６４１号（１９７３年）（成田
）　　　　　　　　６１種の異る属米国特許第３，９１
５，７９８号（１９７５年）ベルギー特許第７８０，６
７６号 （東洋醸造） Ａ　　ｔｈｒｏｂａ　　ｔ　　　５ｉｉｐＬＬ１暉αヱ
引】Ｌｕり東ｈｉｌａ ｂ）フェノキシ７−ＡＤＣＡ→７−ＡＤＣＡ米国特許第
３，８８０，７１３号（１９７５年）（グラクツ）　　
　　　　　Ｅｒ１ｖｉｎｉａ　ａｒｏｉｄｅａｅＣ）セ
ファロチン→７−ＡＣＡ 米国特許第３．５２２，２５０号（１９７０年）米国特
許第３．９３０，９４９号（１９７６年）（バイエル）
　　　　　　　Ｅ、　ｃｏｌｉペニシリン　アシラーゼ 米国特許第３，９６２．０３６号（１９７６年）（チバ
ガイギー）　　上、□且 １、土鮎ｌ達拝見神− ３−低級アルコ　　Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓキシ−７−
アシ　　旧ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｏｓｅｕｓルセファ
ロスボ　　Ｍ、　Ｉ　５ｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓリン； アシラーゼ活性 を有する微生物 １ヒ１■４狙すｆａｅｃａｌｉｓ Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　　ｃｌｏａｃａｅＦｕｓａｒｉ
ｕｍ　　ａｒｅｎａｃｅｕｍＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ Ａｓ　ｅｒ　１ｌｅｕｓ　ｏｃｈｒａｃｅｕｓ升力±副
す１副 ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ Σ罰」桟Ｊ呼□狙 １ａｖｅｎｄｕｌａｅ 日本特許公報５Ｏ−１０７１８６（１９７５年）（東洋
ブリューイング） Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ。

フェニルアセト　　Ｂａｃｉｌｌｕｓ。

アミド７−ＡＣＡ　　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ。

誘導体が脱アシ　　Ｋ１ｕｙｖｅｒａ＋ル化される　　
　　ＭｔＣｒＯＣＯＣＣ１ｌＳ＋Ｎｏｃａｒｄｉａ＋ Ｐｒｏ　ｔｅｕｓ　。

Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ。

酵素アシル化：１−ＡＣＡ→その他 米国特許第３，９４５，８８８号（１９７６年）（蔵出
）１．並置 Ｂａｃｉｌｌｕｓ。

７−ＡＣＡ　　−＋　　セフ、Ｄス　　　　Ｐｒｏｔｅ
ｕｓ。

ポリン　　　　　　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ＋日本特許
公報５４−１１０３９４ （万有） ７−ＡＣＡ　　−）　　セフ７ピリン　　　Ａｒｔｈｒ
ｏｂａｃｔｅｒｖｉｓｃｏｓｕｓ ７、一工程／２酵素 日本特許公報６３ （アサヒ） 脱アシル化：　ＣｅｐｈＣ→７−ＡＣＡ７４．４８Ｂ　
（１９８８年） ガ山個叶ハ１Ｌ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ。

Ｃｏｍａｏ＋ｏｎａｓ。

Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ及びＧＬ〜７−ＡＣ’Ａ”ア
シラーゼ構成物の組換え体の大腸菌における発現 本発明によれば式Ｉの化合物を式■の化合物に一工程で
変換することができる酵素セファロスポリンＣアミダー
ゼで化合物Ｉの化合物を処理し、該酵素が次の一次翻訳
産物アミノ酸配列又はその翻訳後修飾体を包含している
ことをコードする。

ＭＫＦ　ＩＫＳＦ　ＴＬＶ ＮΔＶＤＡＡＡＡＩ　Ｑ ＫＧＫＰ　ＩＰＦＳＫＲ ＱＹＴＤＥＮＶＫＫＬ ΔＬＴＫＥＶＱＫＲＥ ＦＤＶＱＫＭＧＡＮＳ ＮＲ３ＴＡＤＶＫＥＧ ＳＧ　ＩＭＶＰＤＹＧＦ Ｔ　Ｔ　ＴＡＳＶＳＥＴ　Ｉ ＫＰＱＨＴＧＮＶＱＡ ＮＧＡＶＹＰＹＴＡＥ ＫＡＫＷＮＥＫＤＫＥ Ｃ ＴＦＳＦＦＣＭＩＴＰ ＬＳＬＮＶＶＥＰＭＭ ＨＴＴＧＫＡＶＧＶＰ ＱＮＮＱＡＡＡＮＶＥ ＧＴＭＴＴＥＤＬＥＮ ＰＥＹＬＨＹＬＴＥＡ ＤＰＷＫＹＥＧＴＥＰ ＭＬＮＮＥＭＴＤＦＤ ＭＮＶＬＤＨＱＭＬ　Ｉ Ｖ　Ｉ　ＦＤＹＥＫＧＫＭ ＱＭＫＬ　ＩＮＥＫＰＹ ＡＬＬＥＫＤＰＡＤ　１ ＡＦＡＳＶＰＧＶＤＫ ＳＧ　ＩＧＧＧＧＦ　ＩＭ ＧＴＬＫＧＶＥＴＡＬ ＶＰＮＣ；ＱＰＬＫＥＧ ＹＶＶＫＥＲＥＰ　ＩＲ ＭＨＬＡＦＡＤＲＡＡ ＴＳＭＫＫＶＫＥＥＫ ＡＴＰＧＧＶＮＱＶＥ ＱＤＡ　ＩＬＡＰＲＩＹ ＹＧＧＡＤＮＴＲＥＧ ＩＱＳＤＫＬＬＬＧＬ ＥＤＰＥＤＤＧＳＶＴ ＳＭＧＲＧＡＴＫＧ　Ｉ ＩＹＮＫＫＥＮＫ　ＩＴ ＥＫＹＧＴＬＤ　ｌ５Ｑ ＤＴＬＶＱＰＤＬＡＫ ＳＥＹＲＧＹＥＬＡＣ； ＹＭＡＤＥＤＦＹＤＶ ＴＰ　ＩＧＱＴＴＨＦＳ ＰＧＫＲＰＲＳＳＭＳ ＳＡＧＹＰＴＶＲＷＥ ＴＶＱＧＶＹＮＶＳＹ ＧＶＩＧＴＧＤＬＥＴ １１ＦＨＳＫＦＫＦＨ ＶＳＶＳＨＰＬＡＡＥ ＭＬＤＳＲＥＭＡＰＱ Ｖ［）ＰＡＩＫＱＡＥ ＴＬＫＬ　ｒＫＫＱＧｓ ＡＡＳＰＳＳＧＳＬＴ ＰＴＫＧＬＬＤＥＤＹ ＶＭＤＫＷＧＮＭＶＡ ＰＴＦＶＬＫＤＧＮＰ ＰＧＩＥＱＮＴＲＬＥ ＫＳＫＫＰＫＥ　ＩＫＥ ＦＲＰＤＫＫＳＹＬＰ ＭＶＤＮＴＬＲＤＥＥ ＡＧ　ＩＫＩＬＫＱＧＧ ＮＶＴＰＥＬＦＬＤＧ ＫＧＶＫＶＮＷＩＴＡ ＥＶＦＹＳＧＱＩＧＫ ＶＱＱＩＬＥＬＭＥＧ ＩＫＥＲＲＫＩ　ＩＮＰ ＹＴＴＴＩ　ＥＱＶＦＧ ＦＭＡ　ＩＧＳＰＧＧＡ ＬＭＧＫＧＨＶＹＥＥ ＥＫＫＧＰＦＴＬＫＶ ＶＩＫＶＡＫＳＬＧＹ ＦＥＶＩＶＶＬＴＬＮ 上記配列に対して次のアミノ酸略語が使用される。

Ａ１ａ＝Ａ；　Ａｒｇ＝Ｒ；　Ａｇｎ＝Ｎ；　Ａｓｐ＝
Ｄ；　Ｃｙｓ＝Ｃ；　Ｇｌｎ＝Ｑ；　Ｇｌｕ＝Ｅ；Ｇ１
ｙ＝Ｇ；　ＨｉｓｚＨ；　１１ｅ＝工；　ＬｅｕｘＬ；
　ＬｙｇｘＫ；　ＭｅｔｘＭ；　ＰｈｅｚＦ；Ｐｒｏ＝
Ｐ；　Ｓｅｒ＋＋−Ｓ；　ＴｈｒｘＴ；τｒｐｘＷ；　
ＴｒｙｘＹ；　ＶａｌｓｍＶ。

式 （式中 Ｒ１はＨＯＺＣＣＨ（ＣＨ２）３ＣＯ−である。

Ｈ２ Ｒ２は−Ｈである。

Ｒ３は−Ｈ又は−０ＣＮＨｚ又はＣＨＪ’（Ｒ’は−Ｈ
１０Ｈ又は−０ＣＣＨｚである）である。

Ｍは一イオン、−Ｈ、アルカリ金属又は他の医薬的に使
用し得る塩、医薬的に使用し得るエステル又は容易に除
去し得るカルボキシル保護基である。） で表わされるセファロスポリンＣ及びその誘導体（式中
Ｒ２、Ｒｆｆ及びＭは上で定義した通りである。） で表わされる７−アミノセファロスポラン酸に一工程変
換する方法が提供される。

本発明はまたセファロスポリンＣのアミノアシボイル側
鎖を一工程切断して７−ＡＣＡを得ることができ、すぐ
上の項で列挙した一次翻訳産物アミノ酸配列及びそのい
ずれかの翻訳後修飾を有し、以下で詳しく記載される物
理的／化学的特性を有する酵素、セファロスポリンＣア
ミダーゼを提供するものである。

本発明はさらに更に精製、分離、配列決定をしたＤＮＡ
断片即ち上の項で列挙したアミノ酸配列を有する酵素セ
ファロスポリンＣアミダーゼをコードする遺伝子を提供
するものである。該遺伝子のヌクレオチド塩基配列は以
下に示されその前後に続く制御配列のヌクレオチド塩基
も同様である。

この遺伝子はバチルス・メガテリウムの特定の菌株から
分離され、以下で記載される検定によりセファロスポリ
ンＣアミダーゼ活性を有することが見い出された。

本発明によればまた更に酵素をコードする遺伝子配列を
プロモーター配列、例えば強力な構成的プロモーター配
列に融合し得られた構成体を適当なベクターにクローニ
ングし、該ベクターで適当な宿主を形質転換することに
より上で示したアミノ酸配列を有するセファロスポリン
Ｃアミダーゼ酵素を適当な原核又は真核宿主、例えばバ
チルス種に於て発現させる方法が提供される。この方法
の詳細は以下に示される。

バチルス・メガテリウム及びバチルス・ズブチリス宿主
に形質導入された、該遺伝子と後述する１４１／１４２
プロモ一ター配列の融合構成体を含むベクターはアメリ
カンタイプカルチュアコレクション（ＡＴＣＣ）、１２
３０１パークラウンドライブ　ロックビル　メリーラン
ド２０８５２に寄託されており、寄託番号６８０２４及
び６８０２３で各々指定されている。

一工程酵素切断プロセス 上記式■の化合物に関してＲ１基はセファロスポリンＣ
７−ア壽ノアシボイル側鎖であるＨ（ｈＣＣＪＩ（ＣＨ
ｚ）＋Ｃ０一部分を定義する。

Ｈｚ “°Ｍ”基に対する“容易に除去し得るカルボキシル保
護基”という表現はカルボキシル基の水素に置き換わっ
て該基を後の合成で使用されるいかなる試薬とも反応し
ないようにする通常の置換基を意味する。このようなカ
ルボキシル保護基は該基を含む望ましくない競争反応が
起こることを妨げるためにしばしば必要となる。通常の
保護置換基は“容易に除去し得る”ものでなければなら
ずこれは選択的に除去し得ることを意味し、即ち、セフ
ァロスポリン核と側鎖で行なわれる通常の方法の過程中
除去されるようなものではなく、一方ではセファロスポ
リン核の塩基性環構造又はそれの保護されていない置換
基を妨害するほどは苛酷でない方法によって除去される
ようなものである。

また、式■でＭ＝Ｈである場合は生理的ｐＨにおいてＮ
Ｈ”とＣＯＯ−基により両性イオンが形成され、その場
合Ｍは実際はアニオンを示す−であることが注目される
。

Ｒ３基は典型的な発酵産物に特有の種々の置換基を含む
ように定義され、例えばセファロスポリンＣに対してＲ
３はＣ１ｈＲ’でありＲ４は一〇ＣＣＦＩ　ｚである。

Ｒ３は定義する置換基は全て主に上で述べた理由から本
発明のセファロスポリンＣアミダーゼの酵素作用をいか
なる方法でも妨害しないことが予想される。

従って本発明の方法によればデスアセトキシセファロス
ポリンＣ（Ｒ３＝ＣＨｔＲ’　、Ｒ’＝Ｈ）はセファロ
スポリンＣの７−アミノセファロスポラン酸（７−ＡＣ
Ａ）への変換と実質的に同程度まで７−アミツデスアセ
トキシセフアロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）に変換され
うる。これは３位の官能基が基質と酵素との結合に決定
的でないという事実に起因する。

セファロスポリンＣ及び誘導体を７−アミノセファロス
ポラン酸及び誘導体に一工程酵素変換する、本発明に関
する方法は次の通り図式的に示される。

更に詳細には、セファロスポリンＣの７−アミノセファ
ロスポラン酸への変換は次の通り例示することができる
。

本発明の方法は、本発明のセファロスポリンＣアミダー
ゼを式Ｉの化合物とこれらの化合物の式■の化合物への
酵素変換が起こるように有効に接触させる方法であれば
いかなる方法でも行なうことができる。これは最も広義
の“処理する”という言葉の定義である。通常注入流と
して細胞を含まない粗セファロスポリンＣ又は誘導体の
プロスを使用し、これを粗セファロスポリンＣアミダー
ゼブロスとバッチ法で処理することが好ましい。

最初に反応物の実質的な精製を全く必要としないことか
らこの方法が最も効率がよい。勿論変更は可能である。

例えば反応物に互いに接触させる前に所望されるどのよ
うな程度までも精製することができる。またバッチ法で
はなく連続方式でプロセスを行なうことが可能である。

反応物自体の接触はプロセス工学の進歩につれて種々の
方法で変更することができる。従ってセファロスポリン
Ｃアミダーゼに固定化酵素カラムを使用し、式■の化合
物をこのカラムに通過させることができる。

このようなプロセス工学の別の具体例は膜反応器に関す
ることである。反応物の好ましい接触方法は固定化酵素
カラムを経由するものである。

実験に使用する以下の具体例はセファロスポリンＣの酵
素脱アシル化を示すために現在使用される方法を記載し
、これは主に酵素の濃度を増加して多量の７−アミノセ
ファロスポラン酸の生産を促進するためにセファロスポ
リンＣアミダーゼの予備的精製を含む。従って実施例の
方法は商業的生産に利用される方法を必ずしも示唆しな
い。

セファロスポリンＣアミダーゼ 本発明のセファロスポリンＣアミダーゼ酵素を生じる一
次翻訳産物又は前駆体はメチオニン（Ｎｅｔ）で始まり
システィン（ＣＶ２）で終わる７２２個のアミノ酸を包
含し、その配列は上で示される。一次翻訳産物は処理さ
れ、即ち産生宿主によって修飾されて本質的に２つのサ
ブユニットからなる活性酵素が得られその開始アミノ酸
配列は次の通り全配列中にアンダーラインされる。

ＭＫＦ　ＩＫＳＦ　ＩＬＶ ＮＡＶＤＡＡＡＡ　ＩＱ ＫＧＫＰ　Ｉ　ＰＦＳＫＲ ＱＹＴＤＥＮＶＫＫＬ ΔＬＴＫＥＶＱＫＲＥ ＦＤＶＱＫＭＧＡＮＳ ＮＲ３ＴＡＤＶＫＥＧ ＳＧ　ＩＭＶＰＤＹＧＦ ＴＩＩＡＳＶＳＥＴＩ ＫＰＱＨＩＧＮＶＱＡ ＮＧＡＶＹＰＹＴＡＥ ＫＡＫＷＮＥＫＤＫＥ Ｃ ＴＦＳＦＦＣＭＩＴＰ ＬＳＬＮＶＶＥＰＭＭ Ｅ（ＴＴＧＫＡＶＧＶＰ ＱＮＮＱＡＡＡＮＶＥ ＧＴＭＴＴＥＤＬＥＮ ＰＥＹＬ）（ＹＬＴＥＡ ＤＰＷＫＹＥＧＴＥＰ ＭＬＮＮＥＭＴＤＦＤ ＭＮＶＬＤＨＱＭＬ　Ｉ Ｖ　Ｉ　ＦＤＹＥＫＧＫＭ ＱＭＫＬ　ＴＮＥＫＰＹ ＡＬＬＥＫＤＰＡＤ　１ ＡＦＡＳＶＰＧＶＤＫ ＳＧ　ＩＧＧＧＧＦ　ＩＭ ＧＴＬＫＧＶＥＴＡＬ ＶＰＮＧＱＰＬＫＥＧ ＹＶＶＫＥＲＥＰ　ＩＲ ＭＨＬＡＦＡＤＲＡＡ ＴＳＭＫＫＶＫＥＥＫ ＡＴＰＧＧＶＮＱＶＥ ＱＤＡＩＬＡＰＲＩＹ ＹＧＧＡＤＮＴＲＥＧ ＩＱＳＤＫＬＬＬＧＬ ＥＤＰＥＤＤＧＳＶＴ ＳＭＧＲＧＡＴＫＧ　Ｉ ＩＹＮＫＫＥＮＫ　ＩＴ ＥＫＹＧＴＬＤＩＳＱ ＤＴＬＶＱＰＤＬＡＫ ＳＥＹＲＧＹＥＬＡＧ ＹＭＡＤＥＤＦＹＤＶ ＴＰ　ＩＧＱＴＴＨＦＳ ＰＧＫＲＰＲＳＳＭＳ ＳＡＧＹＰＴＶＲＷＥ ＴＶＱＧＶＹＮＶＳＹ ＧＶ　Ｉ　ＧＴＧＤＬＥＴ Ｉ　ＴＦＨＳＫＦＫＦＨ ＶＳＶＳＨＰＬＡＡＥ ＭＬＤＳＲＥＭＡＰＱ ＶＩＤＰＡＩＫＱＡＥ ＴＬＫＬＩＫＫＱＧＳ ＡＡＳＰＳＳＧＳＬＴ ＰＴＫＧＬＬＤＥＤＹ ＶＭＤＫＷＧＮＭＶＡ ＰＴＦＶＬＫＤＧＮＰ ＰＧＩ　ＥＱＮＴＲＬＥ ＫＳＫＫＰＫＥ　ＩＫＥ ＦＲＰＤＫＫＳＹＬＰ ＭＶＤＮＴＬＲＤＥＥ ＡＧＩＫＩＬＫＱＧＧ ＮＶＴＰＥＬＦＬＤＧ ＫＧＶＫＶＮＷＩＴＡ ＥＶＦＹＳＧＱＩＧＫ ＶＱＱＩＬＥＬＭＥＧ ＩＫＥＲＲＫＩ　ＩＮＰ ＹＴＴＴＩ　ＥＱＶＦＧ ＦＭＡ　ＩＧＳＰＧＧＡ ＬＭＧＫＧ）（ＶＹＥＥ ＥＫＫＧＰＦＴＬＫＶ Ｖ　ＩＫＶＡＫＳＬＧＹ ＦＥＶ　ＩＶＶＬＴＬＮ 遺伝子産物即ち７２２個のアく）酸を包含している一次
翻訳産物は本明細書で記載される酵素的に活性であると
いう点で本発明の一部である。また上述したようにその
酵素的に活性なサブユニット、特に本質的に酵素活性を
生じる翻訳後修飾も含まれる。別の人工的変更も可能で
ある。予測では本発明のセファロスポリンＣアミダーゼ
の小さい方のサブユニットあるいは同一酵素の異なるコ
ンホメーションはその配列が本明細書に列挙された酵素
の全酵素活性を保持する。本発明のアミダーゼ酵素のこ
れらの形はその完全な機能等傷物であって本発明の一部
であると考える。これらの形は単独遺伝子産物即ちＤＮ
Ａの単一遺伝子ユニットから造られ、翻訳後に構造的に
修飾されるタンパクであることから微小不均一形と呼ば
れることがある。生化学者によく知られた手法を用いて
本発明のセファロスポリンＣアミダーゼ酵素に種々の変
化を起し、次にセファロスポリンＣアミダーゼとしての
酵素活性を後述される検定を用いて迅速且つ効率よく評
価することが可能である。このようなよく知られた手法
にはＮ−末端に於けるアセチル化、グリコジル化、リン
酸化及びタンパク質分解がある。タンパク質分解にはエ
キソタンパク質分解があり、１個以上の末端アミノ酸を
順番に酵素的に切断してもとの遺伝子産物より少ないア
ミノ酸を有する微小不均一形を生成することができる。

タンパク質分解にはアミノ酸配列中の特定の場所でペプ
チドを切断するエンドプロテアーゼの作用の結果生じる
エンドタンパク質修飾も含むことができる。同様の修飾
は精製プロセス中で起こることがあり微小不均一形の生
産をもたらすことがある。しかしながら精製中に生じる
最も普通の修飾はタンパク質分解であるが一般にプロテ
アーゼ阻害剤の使用によって最小限に抑えられる。

よく知られている通り、酵素の生化学作用はそのアミノ
酸配列だけでなく全体の高次構造によっても決定される
。その上酵素の高次構造は環境上誘起される変化例えば
ｐＨ，温度、溶媒系、培地、イオン的要因等を受けやす
い。このような環境上誘起される酵素の高次構造の変化
がセファロスボリンＣアミダーゼ活性の喪失を生じない
かぎり酵素の種々の高次構造は本発明の一部である。

上で列挙した本発明のセファロスポリンＣアミダーゼ酵
素のアミノ酸配列は酵素をコードする遺伝子のＤＮＡ配
列解析によって推定され、それらの結果の正確さはバチ
ルス・メガテリウムの３つの異なった菌株からの３つの
独立した分離物の配列決定をすることによって実証され
た。しかしながら１００％の正確さは全体として保証で
きないことから、それが独自に持っている多くの物理的
及び化学的特性によって本発明のセファロスポリンＣア
ミダーゼ酵素を同定することも望ましいと考えられた。

このようなデータを得た酵素の精製については以下で更
に詳しく説明される。これらのデータは次の表に示され
る。

Ａ、構造 １　ゲル濾過による見掛けのＭＷ　：　１２６．０００
２　サブユニットＭＷ（ＳＯＳ　ＰＡＧＥによる）：α
（大）：４５ｋａ；β（小）：３７ｋｄ３　化学量論：
α（２）β（２）オリゴマー（ＭＷ　　約１６５ｋｄ） ４　比活性：１〜３μモル　７−ＡＣＡ／■酵素／時間
（酵素の希釈により増加する）Ｂ、速度論 １　至適温度＝３７〜４０°Ｃ ２至適ｐｕ　　：’ｒ〜８ ３　安定なｐＨ範囲：５．０〜８．０ ４　活性は１０〜１５％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウムで
促進される ５　に旧１．３ｍＭセファロスポリンＣアミダーゼ〔グ
ルタリル−４−アミノベンゾエートによるに＋＋＋は約
Ｍであるが代謝回転数は２０倍高い〕 ６　基質特異性 ＤＡＣ＞Ｃｅｐ　ｈＣ＞ＤＡＯＣ ■２．５％　　９．１％　　２．３％ （３時間に於ける７−ＡＣＡ産生％） （ＤＡＣ＝デスアセチルセファロスポリンＣ１ＤＡＯＣ
−デスアセトキシセファロスポリンＣ〕 Ｃ１阻害剤 ｌ　　ＰｅｎＧ又は６−ＡＰＡによって阻害されない２
　強力な阻害剤（１０ｍＭに於ける＞９０％阻害）グリ
シン　　　Ｌ−アラニン グルタメート　Ｄ−アラニン グルタミン 酵素をコードする遺伝子 本発明の一次翻訳産物セファロスボリンＣアξダーゼ酵
素をコードする遺伝子は７２２個のコドンを含みこれは
一次翻訳産物酵素の７２２個のアミノ酸に相当する。コ
ドンの正確な配列は以下に示され遺伝子それ自体は配列
を示すために用いられる番号系のヌクレオチド塩基１で
始まり塩基２１６６で終わる。遺伝子配列の前にあるヌ
クレオチド塩基（コドン）の配列、塩基−１６３〜−１
と遺伝子配列の後に続く塩基（コドン）の配列、ヌクレ
オチド塩基２１６７〜２３７０は遺伝子が分離されたバ
チルス・メガテリウム細胞中の遺伝子の調節配列を含む
。先行配列は具体的にはプロモーター配列及びリポソー
ム結合部位を含む。これらの追加の配列は遺伝子の一部
ではないが原核宿主バチルス種における遺伝子の効率の
良い転写に関与する可能性があるため、本発明の一部で
ある。ヌクレオチド塩基の全配列は次の表でコンパクト
にした形で示される。

上で示したヌクレオチドの特定の配列のほかに本発明の
セファロスポリンＣアミダーゼ遺伝子は種々のエンドヌ
クレアーゼ即ち制限酵素が遺伝子を切断する点でも特異
的に特徴づけられる。これらは次のチャートに要約され
示される。全酵素は全て６塩基又はそれ以上の長さの認
識配列を１つ有する。

本発明の遺伝子のヌクレオチド塩基の及び翻訳された本
発明の酵素のそれに対応するアミノ酸の特定構成を次の
表で％に基づいて示す。

ＴＴ ＴＴＣ ＴＡ ＴＴＣ Ｐｈｅ Ｐｈｅ ｅｕ ｅｕ ２．６％ １．１％ ２．２％ １．２％ ＴＧＴ ＴＧＣ ＴＧＡ ＣＧ ｅｒ ｅｒ ｅｒ ｅｒ １．０％ 、４％ １．４％ 、８％ ＡＴ ＡＣ ＡＡ ＡＧ ＴＴ ＴＣ ＴＡ ＴＴＣ ｅｕ ｅｕ ｅｕ ｅｕ １．２％ 、３％ １．１％ 、７％ ＴＧＴ ＴＧＣ ＴＧＡ ＣＧ Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ｐｒ。

Ｐｒ。

１．０％ １．０％ １．９％ １．７％ ＡＴ ＡＣ ＡＡ ＡＧ ＴＴ ＴＣ ＴＡ ＴＴＣ １ｅ １ｅ １ｅ Ｍｅｔ ２．９％ １．７％ １．８％ ３．７％ ＴＧＴ ＴＧＣ ＴＧＡ ＣＧ ｈｒ ｈｒ ｈｒ ｈｒ １．７％ １．２％ １．５％ １．８％ ＡＴ ＡＣ ＡＡ ＡＧ ＴＴ ＴＣ ＴＡ ＴＴＣ ａｌ ａｌ ａｌ ａ１ ２．２％ １．０％ ２．８％ １．５％ ＴＧＴ ＴＧＣ ＴＧＡ ＣＧ ｌａ ｌａ ｌａ ｌａ ２．１％ １、１％ ２．６％ １．０％ ＡＴ ＡＣ ＡＡ ＡＧ Ｔｙｒ　　２５　３．５％　ＴＧＴ　　ＣｙｓＴｙｒ　
　　２　．３％　ＴＧＣＣｙｓ−−ＴＧＡ Ｏ−−ＴＧＧＴｒｐ 、３％ 、０％ 、７％ ｉｓ ｉｓ ｌｎ ｌｎ １．０％ 、４％ ３．７％ 、０％ ＧＴ ＧＣ ＧＡ ＧＧ ｒｇ ｒｇ ｒｇ ｒｇ 、３％ 、４％ 、０％ 、０％ ｓｎ ｓｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ ３．６％ 、６％ ７．３％ ２．１％ ＧＴ ＧＣ ＧＡ ＧＧ ｅｒ ｅｒ ｒｇ ｒｇ １．１％ 、４％ １．７％ 、３％ ｓｐ ｓｐ ｌｕ ｌｕ ４．７％ 、７％ ６．０％ １．９％ ＧＴ ＧＣ ＧＡ ＧＧ ｌｙ １ｙ ｌｙ １ｙ １．９％ １．５％ ４．６％ 、８％ 本発明の目的はまた適当な原核又は真核宿主例えばバチ
ルス種に於て発現させることによりセファロスポリンＣ
アミダーゼ酵素を改良された収率で製造する方法を提供
することであり、該宿主はプロモーター配列例えば強力
な構成的プロモーターへ該遺伝子を融合させた構成体で
形質転換される。このプロセスの要素はすぐ次で詳しく
記載される。

部位時　的−験　　・　銖 プロモーター配列例えば強力な構成的プロモーター配列
に融合したセファロスポリンＣアミダーゼをコードする
遺伝子を包含している構成体による原核又は真核宿主の
形質転換にはベクターの使用が必要である。好適な原核
宿主であるバチルス種に関しては、ベクター構築を容易
にするために、部位特異的試験管内変異誘発によってＢ
ａｍＨ１部位をアミダーゼコード配列の前に導入し、翻
訳の開始点から２９塩基対上流のチミン（Ｔ）残基をシ
トシン（Ｃ）残基に変換した。これは次のオリゴヌクレ
オチドを合成することによって遠戚された。

５１　　ＡＡＴＧＡＴＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＴ　
　３１このオリゴヌクレオチドをＭ　１３＋＋＋ｐ１９
にクローン化したセファロスポリンＣアミダーゼ遺伝子
にハイブリダイズさせ、標準の変異誘発反応はＤＮＡ第
３巻、４７９〜４８８頁（１９８４年）に記載される形
式で行なった。適切な塩基変更を取込んだ変異体は新し
いＢａ５８１部位が存在することによって同定され、Ｄ
ＮＡ配列決定によって確認された。

変更配列及びセファロスポリンＣアミダーゼ構造遺伝子
に対するその位置は以下に示される。

−２０−１０＋１ ★　　　　　　　★　　　　　　　　★　　　　　　　
　★ＡＡＣＡ Ｂａｍｆｌ工 Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ な　　　プロモーターの人 ＤＮＡ第５巻、２１９〜２２５頁（１９８６年）に記載
されたように、ｐＵＢｌｌｏのＨｐａ■プロモーターに
基づく台底プロモーターは次の方法で合威した０次の配
列を有する２つのオリゴヌクレオチド（各々１４１及び
１４２）を合威した。

ＡＴＡ−３１ （オリゴヌクレオチド１４２） ２つのオリゴヌクレオチドは各オリゴヌクレオチドの末
端の１６塩基対にかけて相補的である。従ってこれらは
互いにハイブリットを形威し、ＤＮＡポリメラーゼＩク
レノウ断片とデオ″キシヌクレオチドの混合物により補
填された。これは各オリゴヌクレオチドの５′端に存在
するＢａｗｌ　Ｉサイトによってクローニングに適した
２本鎖構造となった。

バシラス原核宿主に於けるセファロスポリンＣアミダー
ゼ遺伝子の発現に適した他のプロモーターも合成するこ
とができ、本発明の一部であると考えられる０例えば次
のプロモーターを合威し、９０／９１と命名した。

ＴＡＴＡＡコ ＴＴＣＴＣＡＴＡＧｍＧＡＡＧＧＡＴＣＣ−３’このプ
ロモーターＣよ強力なバチルスプロモーターであること
がＪ９Ｍｏ１．　Ｒｉａｌ、第１８６巻５４７〜５５Ｊ
Ｊ（１９８５年）に報告されており、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を発現させると
き上述した１４１／１４２プロモーターより１０倍活性
が強いことが確定している。

また天然のバチルス・メガテリウムプロモーターである
別の適切なプロモーターが見い出され分離されている。

これはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ遺伝子を発現させるとき１４１／１４２プロモーター
より約５倍活性があることが見い出された。その塩基対
配列は次の通りである。

ＴＡＴＡＴＡＴＣＡ Ｉ セファロスポリンＣアミダーゼ遺伝子の強力な台底構成
的プロモーターへの 上記“部位特異的試験管内変異誘発”の項で記載した変
更５′配列を有するセファロスポリンＣアミダーゼ遺伝
子と、すぐ上の項に記載した合成強力構成的プロモータ
ーをＢａ−〇１部位で結合した。

この融合産物の詳しい説明はすぐ下の項に示され、種々
のプロモーター領域（Ａ＋Ｔ、　−３５，−１０）、リ
ボゾーム結合部位（ＲＢＳ）及び翻訳の開始点を含む。

ベクター　ｃｐｃ−ｔの ラベルされたｐＣＰＣ−１、セファ、ロスボリンＣアミ
ダーゼ発現ベクターは、強力な構成プロモーター１４１
／１４２に融合させたアミダーゼ遺伝子をジーン第２９
巻、２１〜２６頁（１９８４年）に記載されるバチルス
／大腸菌シャトルベクターｐＭＫ４にクローン化するこ
とにより構成した。

、−Ｚｏｏ　　　　　　−９０−８０−７０−６０！　
ＡＣＡ　　ＧＣＣＴＣＧ　　ＣＡＧ　ＡＧＣＡＣＡ　　
ＣＡＣｕ　λＡＴ　ＡＴＡ　ＡＡＧ　　ＴＡ？　ＧＴＧ
Ｂａｒｍズ　　　　　　　　　　　　Ａ　＋　τ　領　
　　域　　　　　　　　−３５ＴＴＡ　ＴＡＣＴＴＴ　
ＡＣＴ　ＴＧＧ　ＡＡＧ　ＴＧＧ　ＴＴＧ　鉱ｕ猛ＡＴ
Ｇ　ＧＴＣＡ’ｒＴ　ＴＴＧ　払Ｕ記ＢａｍＨＩ　　　
　　　　　　　　　　朋５１４１／１４２　　配列　　
　　遺伝子配列　′★　　　　　　　　　　　★ ＧＡＣＴＡＡ　Ｔｒｒ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＴＴｒ　ＡＴ
Ａ　ＡＡＡ　ＡＧＴ　ｍ　ＡＴＴ　ＴｒＡ　ＧＴｒ　Ａ
ＣＴ　ＴｒＣＡＧＴＭｅｔ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　ＸＸｅ　
Ｌｙｅ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔ
ｈｒ　Ｐｈｅ　５ｅｒ★　　　　　　　　　　★　　　
　　　　　　　責ＴｒＣｍ　ＴＧＴ　ＡＴＧ　ＡＴｒ　
ＡＣＡ　　ＣＣＧ　　ＧＣＴ　’ｊＴＴ　ＧＣＡ　ＡＧ
Ｔ　ＧＴＣＣＣＴ　ＧＧＡ　ＧＴＧ　　ＧＡＴＰｈｅ　
ｌ’ｈｅ　Ｃｙｇ　Ｍｅｔ　１１＠　’Ｔｈｒ　Ｐｒｏ
　Ａｌａ　ｔｈｅ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　
Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｇ２バチルス・ズブチリス及びバチ
ルス・メガテリウム述したｐＣＰＣ−１ベクターをバチ
ルス・ズブチリスＡＴＣＣ３９６２０及びバチルス・メ
ガチリウムＮＰ−１にＭｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎ
ｅｔ、第１６８巻、１１１〜１１５頁（１９７９年）及
びＪ、　Ｂａｃｔ。

第１４２巻、５０８〜５１２頁（１９８０年）に記載さ
れるような標準法で形質導入した。“ＮＰ１′はセファ
ロスポリンＣアミダーゼをほとんどあるいは全く産生し
ないバチルス・メガテリウム株を示す。形質転換体及び
対照培養液をクロラムフェニルコール１０μｇ／ｄ、を
含むＬＢ培地で一晩培養し、これを用いてクロラムフェ
ニコール１０μｇ／ｄを含む発酵培地（ＦＭ）の培養液
に接種した。これらの培養液を２８℃で３〜４日振盪し
ながら増殖させた。上清を硫酸アンモニウム沈殿（７５
％硫酸アンモニウム画分）で５倍に濃縮し、基質として
セファロスポリンＣを用いてセファロスポリンＣアミダ
ーゼ活性を検定した。

２００μｌ検定混合液は５０　ｓＭ　ＫＩＰＯｎ　（ｐ
Ｈ７，５）、５％グリセロール及び１５％Ｎ）１．ｓＯ
，中セファロスポリンＣ（最終濃度）２■／ｄと５倍濃
縮培養上清１８０μｌを含有した。セファロスポリンＣ
からの７−アミツセフアロスボラン酸（７−ＡＣＡ）の
遊離をＨＰＬＣで検定した。

ｐＣＰＣ−１で形質転換したバチルス・メガテリウムＮ
Ｐ−１は反応混合液ｌ１１当り３時間検定時間当り７−
ＡＣＡ　　１５７μｇを遊離したが、一方、ＮＰ−１の
対照培養液は７−ＡＣＡ約２μｇを遊離した。ｐＣＰＣ
−１で形質転換したバチルス・サチリスＡＴＣＣ３９６
２０は７−ＡＣＡｏ、５２μｇを遊離したが、一方バチ
ルス・ズブチリス３９６２０の対照培養液は陰性であっ
た。

γ−グルタミルーｐ−アミノ安息香酸をセファロスポリ
ンＣアミダーゼの基質として使用したとき、セファロス
ポリンＣアミダーゼ活性はＬＢ培地で増殖した一夜培養
液にも見い出すことができた。ｐＣＰＣ−１で形質転換
したバチルス・ズブチリス３９６２０は２．７単位の活
性を生じた（１単位は１ナノモルのｐ−アミノ安息香酸
（ＰＡＢＡ）／分／−培養上清の遊離と定義される）が
対照培養液は陰性であった。基質としてＴ−グルタミル
−ｐ−アミノ安息香酸を用いるとｐＣＰＣ−１で形質転
換したＢ、メガテリウムＮＰ−１は３．５単位のアミダ
ーゼ活性を生じたが、対照培養液は陰性であった。

原核宿主 上で示した通り、セファロスポリンＣアミダーゼ遺伝子
の発現はバチルス・メガテリウム及びバチルス・サチリ
スで得られた。適当なプロモーターの使用により該遺伝
子の発現はバシラス属のいかなる種に於ても得ることが
できることが予想され従って本発明は多くのバシラス属
を包含する宿主に於ける該遺伝子の発現方法に関する。

適当なプロモーター配列の使用及び該プロモーター配列
に本発明のセファロスポリンＣアミダーゼ遺伝子を融合
させた構築体物を含む適当なベクターの構築により真核
及び他の原核宿主例えば特にストレプトマイセス、サツ
カロミセス、アスペルギルス、セラチア、セファロスポ
リウム及びニジエリチアの様々な種に於て遺伝子の発現
を得ることが可能であることも予想される。

７−アミツセフ７０スボランＭ　（７−ＡＣＡ）を与え
るセファロスポリンＣの酵素的脱アシル化を示すために
以下に例示される一般操作を続けた。

琶聚與製 コロニーをクロラムフェニコールヲ含むＬＢ’１天培地
から分離した。

クロラムフェニコールを含む液体ＬＢ培地に接種し、３
７°Ｃで１８時間培養後、産生培地に接種し、３０℃で
６０〜９６時間培養する。

細胞浮遊液を収集し遠心分離して細胞を除去する。（Ｎ
Ｈａ）　ｚｓＯ４を用いて５５〜７５％飽和で分画し、
活性を濃縮及び部分精製する。

活性の検定：酵素１８０μｌを２０μｌの２０■／ｄセ
フアロスポリンＣと温度する。

３７°Ｃで３時間後ＨＰＬＣ検定により７−ＡＣＡを定
量する。

本発明の酵素を分離精製した方法の更に詳しい説明はす
ぐ下に示される。

琶塞豊製 バチルス・メガテリウムの培養菌は記載した通り増殖さ
せた。細胞を遠心分離によってブイヨンから除去した。

ブイヨンを５５％硫酸アンモニウム飽和とし、沈降物を
遠心分離によって除去した。

次いで上清を７５％硫酸アンモニウム飽和とし、セファ
ロスポリンＣアミダーゼを含む沈降物を遠心分離によっ
て沈殿させた。この沈降物を原培養量のｌ／１０の１５
％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸ナトリ
ウム、５％（ｗ／ｖ）グリセロールｐＨ７，５に再浮遊
させた。

１０倍濃縮酵素を飽和硫酸アンモニウムの添加により１
５〜１８％−／Ｖ硫酸アンモニウムとし、０．４μフイ
ルターで濾過した。この４−を予め１８％（ｗ／ｖ）硫
酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７，０で
平衡にしたジンクロームシンクロパック（Ｓｙｎｃｈｒ
ｏｍｅ　５ｙｎｃｈｒｏｐａｋ　）プロピルカラム（２
５Ｃ１ｌ　Ｘ　４．１　ｍＭ）に注入した。流速はｌｄ
／分とした。

注入後１０分間移動相組成は未変化のままであった。１
０〜４０分の移動相は直線的に０％硫酸アンモニウム、
５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７に変化した。４０〜５
０分の移動相組成は未変化のままであった。１分当り２
百分を集め、セファロスポリンＣアミダーゼ活性を検定
した。活性は２２〜２５分に溶出した。

最も活性を有する５両分をプールしセントリコン３０（
アミコン）の限外濾過で約５０ｕ１．に濃縮した。この
濃縮酵素をゾルボックス（Ｚｏｒｂｏｘ　）ＣＦ２５０
　（デュポン）カラム（２５０＋＋＋ＭＸ９．４ｗ＋Ｍ
）に注入した。カラムは前もって平衡化してあり１０％
（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウム、５０＋ｗＭリン酸カリウ
ムρＩ（７，０で１ｍ／分で展開した。５画分／分を集
めた。注入後約９分で全セファロスポリンＣアミダーゼ
活性が２画分に回収された。

これらの活性画分の硫酸ドデシルナトリウムゲル電気泳
動はセファロスポリンＣアミダーゼが約９９％の全クー
マシー染色タンパク質に相当することを示した。

以下で更に詳細に例示される通り上述の一般操作は実験
に使用している具体例に従った。

尖隻撚土 バチルス・メガテリウムの培養からのセファロスポリン
Ｃアミダーゼ活性の調製及び検定隻髪粂佳 １、菌株を次の組成を有するＬＢ寒天プレート（クロラ
ムフェニコール１０μｇ／−添加）で保存した。

成分　　ｇ／ｌ トリプトン　　　　１０ 酵母エキス　　　　５ ＮａＣＩ！　　　　　　　５ 寒天　　　　　　１５ ２、再分離したコロニーはＬＢ＋クロラムフェニコール
プレートにストリークして得、次に３７°Ｃで一晩イン
キユベートした。分離したコロニーを使用して寒天成分
が欠けていることを除いては上で挙げた培地と同じＬＢ
＋クロラムフェニコール液体培地５−に接種した。これ
らの培養を３７°Ｃで一晩インキユーベートした。

５−の−夜培養液を使用してクロラムフェニコール１０
μｇ／ｄを添加した発酵培地（ＦＭ）４０Ｍ１の培養液
に接種した。ＦＭは次の組成を有する。

３゜ 成分　　　ｇ／ｌ 牛肉エキス　　　　　４．５ カシトン　　　　　９．０ 大豆ξ−ル　　　　１５．０ デキストロース　　　５．０ 可溶性デンプン　　３０ ４、ＦＭ中の培養菌を培養液のｐＨが８．０以上になる
まで３０°に於て回転振盪器（２２０ｒｐｎ＋）で３〜
４日間インキュベートした。

舅」１１区 １、細胞を培養液から１０．００Ｏｒｐｍで１０分間遠
心分離して除去した。

２、　この遠心分離した上清２．５１１！！に飽和硫酸
アンモニウム７、５１ｄを加え、次に氷上で１０分互い
た後、１０．００Ｏｒｐｍ＋で１０分間遠心分離した。

基質としてセファロスポリンＣを用いて検定するために
、沈降物を高塩緩衝液（）ＩＳＢ）０．５ｄに再浮遊し
た。Ｈ３Ｂは次の組成を有した。

Ｈ３Ｂ ５０＋Ｍ　ＫＨＰＯａ、　　ｐＨ７，５５％　グリセロ
ール １５％　ＮＨ，ＳＯ４ 聾案捻足 】、基質原液はセファロスポリンＣ２０■を水１艷に溶
解して調製した。

２、　セファロスポリンＣ原液（２０μｌ）を回収酵素
（１８０μｌ）に加え、この混合液を３７°Ｃで３時間
インキュベートした。７−ＡＣＡの生成をＨＰＬＣでモ
ニターした。次のＨＰＬＣ条件を使用した。

移動相　　　５０ｍＭに１ｌｔＰＯ４ 流速　２．０ｄ／分 温　度　　　室温 検出器　　　２５４ｎｍ 試料サイズ　２０μ１ 機　器　　　ウォーターズ社 ７−ＡＣＡの保持時間はこれらの条件下で約５．０分で
あった。

蛮辻挟定級果 １、上述のプロセスにより、酵素調製試料は、セファロ
スポリンＣ２■／Ｉ１１の存在下７−ＡＣＡ　１５７μ
ｇ／反応混合液ｄ／３時間温置を生成した。

失旗拠主 セファロスポリンＣの７−アミノセファロスポラン酸へ
の一工程酵素変換：切断生成 生坐皇援璽り 本発明によるセファロスポリンＣの７−アミノセファロ
スポラン酸（７−ＡＣＡ）への変換が実際に単独酵素（
セファロスポリンＣアミダーゼ）によって達成される一
工程プロセスであることを更に立証するために、実施例
１で上述した通り切断を行なわせるが、実施例１で記載
したＨＰＬＣにより７−ＡＣＡの生成を測定するほかに
他の切断生成物アミノアジピン酸の出現を更に測定する
。

これはベックマン６３００ハイパーフオーマンスアナラ
イザーを用いた行なわれる。酵素はセファロスポリンＣ
（最終濃度２■／ｌ１１）と３７℃で２．８時間インキ
ュベートする。分離生成物がモル比１：１であることが
アくダーゼ酵素によるセファロスポリンＣの７−ＡＣＡ
への一工程変換の良い証拠である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、セファロスポリンＣ及び誘導体を、一次翻訳産物で
   ある次のアミノ酸配列、 【遺伝子配列があります。】 又はその翻訳後修飾物、又は一工程セファロスポリンＣ
   アミダーゼとしての酵素活性を有するサブユニットを含
   むセファロスポリンＣアミダーゼで処理することを特徴
   とする、セファロスポリンＣ及びその誘導体を対応する
   ７−アミノセファロスポラン酸及び誘導体に一工程変換
   する方法。 ２、式 I の化合物を式IIの化合物に一工程で変換する
   ことができる酵素、セファロスポリンＣアミダーゼで式
   I の化合物を処理し、該酵素が請求項１で示したもの
   であることを特徴とし、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ．） ｛式中 Ｒ＾１は▲数式、化学式、表等があります▼である。 Ｒ＾２は−Ｈである。 Ｒ＾３は−Ｈ又は▲数式、化学式、表等があります▼又
   はＣＨ＿２Ｒ＾４（Ｒ＾４は−Ｈ、−ＯＨ又は▲数式、
   化学式、表等があります▼である）である。 Ｍは−Ｈ、アルカリ金属又は他の医薬的に使用し得る塩
   、医薬的に使用し得るエステル又は容易に除去し得るカ
   ルボキシル保護基である。｝ で表わされるセファロスポリンＣ及びその誘導体を式 ▲数式、化学式、表等があります▼（II．） で表わされる７−アミノセファロスポラン酸に一工程変
   換する方法。 ３、式 I の化合物がセファロスポリンＣであり、式II
   の化合物が７−アミノセファロスポラン酸である請求項
   ２記載の方法。 ４、一次翻訳産物である次のアミノ酸配列又はその翻訳
   後修飾物又は一工程セファロスポリンＣアミダーゼとし
   ての酵素活性を有するサブユニットを包含する酵素セフ
   ァロスポリンＣアミダーゼ。 【遺伝子配列があります。】 ５、次の物理的及び化学的特性を有する酵素、セファロ
   スポリンＣアミダーゼ Ａ、構造 １、ゲル濾過による見掛けのＭＷ：１２６，０００２、
   サブユニットＭＷ（ＳＤＳ　ＰＡＧＥによる）α（大）
   ：４５ｋｄ、β（小）：３７ｋｄ ３、化学量論：α（２）β（２）オリゴマー（ＭＷ約１
   ６５ｋｄ） ４、比活性：１〜３μモル７−ＡＣＡ／ｍｇ酵素／時間
   （酵素を希釈すると増加する） Ｂ、速度論 １、至適温度：３７〜４０℃ ２、至適ｐＨ：７〜８ ３、安定なｐＨ範囲：５．０〜８．０ ４、活性は１０〜１５％（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウムで
   促進される ５、Ｋｍ：１．３ｍＭセファロスポリンＣアミダーゼ〔
   グルタリル−４−アミノベンゾエート（ＧＡＢ）による
   ＫｍはほぼＭであるが回転数は２０倍高い〕 ６、基質特異性 ＤＡＣ＞ＣｅｐｈＣ＞ＤＡＯＣ １２．５％＞９．１％＞２．３％（３時間に於ける７−
   ＡＣＡ産生％） 〔ＤＡＣ＝デスアセチルセファロスポリンＣ、ＤＡＯＣ
   ＝デスアセトキシセファロスポリンＣ〕 Ｃ、阻害剤 １、ＰｅｎＧ又は６−ＡＰＡにより阻害されない ２、強力阻害剤（１０ｍＭに於ける＞９０％阻害）グリ
   シン、Ｌ−アラニングルタメート、Ｄ−アラニングルタ
   ミン又は一工程セファロスポリンＣアミダーゼとしての
   酵素活性を有するそのサブユニット。 ６、酵素、セファロスポリンＣアミダーゼをコードし、
   該酵素を発現することができ、実質的に次のヌクレオチ
   ド塩基配列からなる精製され分離されたＤＮＡ配列。 【遺伝子配列があります。】 又は一工程セファロスポリンＣアミダーゼとしての酵素
   活性を有する酵素を生産できるそのいずれかのサブユニ
   ット。 ７、一工程セファロスポリンＣアミダーゼ酵素をコード
   する請求項６で示したヌクレオチド塩基配列を有する部
   分と、バチルス原核宿主種に於ける該アミダーゼの発現
   に適したプロモーター配列の双方を包含している組換え
   体ＤＮＡ分子。 ８、一工程セファロスポリンＣアミダーゼ酵素をコード
   する請求項６で示したヌクレオチド塩基配列を有する部
   分と、真核又は原核宿主に於ける該アミダーゼの発現に
   適したプロモータ配列の双方を包含している組換え体Ｄ
   ＮＡ分子。 ９、本質的に酵素セファロスポリンＣアミダーゼをバチ
   ルス属の原核宿主の少くとも１種に於て発現することか
   らなり、該宿主は該酵素をコードし請求項６で示したヌ
   クレオチド塩基配列を有する遺伝子にプロモーター配列
   を融合させてできる構築物を含むベクターで形質転換さ
   れている、セファロスポリンＣを７−ＡＣＡに一工程変
   換することができる酵素、セファロスポリンアミダーゼ
   の製造方法。 １０、本質的に酵素、セファロスポリンＣアミダーゼを
   真核又は原核宿主に於て発現することからなり、該宿主
   は該酵素をコードし請求項６で示したヌクレオチド塩基
   配列を有する遺伝子にプロモーター配列を融合させてで
   きる構築物を含むベクターで形質転換されている、セフ
   ァロスポリンＣを７−ＡＣＡに一工程変換することがで
   きる酵素セファロスポリンアミダーゼの製造方法。