JPH05501806A - 変異β―ラクタムアシラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 変異β−ラクタムアシラーゼ遺伝子 （関連分野） 本発明はアシラーゼをコードする遺伝子の変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）で、アシラ ーゼ酵素の基質特異性を変化させる変異に関する。これらの変異酵素のい（っか は、特にβ−ラクタム誘導体のデアシレージョン／アシレーションに適する触媒 活性を示す。これらの中では、セファロスポリン及びその誘導体の７−セファロ スポリン酸及びその誘導体へのワンステップ変換を目的として設計したものが好 ましい。

（関連技術） β−ラクタム型の基本的抗生物質は、原則的に醗酵で得られる。ペニシリウム（ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）及びセファリスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉ ｕｍ）（アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ））属の菌は、ペニシリンＧ、 ペニシリンＶおよびセファロスポリンＣなどのβ−ラクタム抗生物質の原料とし て使用し得る。ＰｅｎＧ、ＰｅｎＶ及びＣｅｆＣとも呼ばれるこれらの醗酵産物 は、現在市販されているほとんど全てのペニシリンやセファロスポリンの原料で ある。各々のこれらの側鎖であるフェニルアセチル、フェノキシアセチル及びア ミノアジピル基は、アミド結合の切断（デアシレージョン）により除去され、二 つのペニシリン分子の場合は６−アミノペニシラン酸（６−ＡＰＡ）及びセファ ロスポリンの場合は７〜アミノセフア０スポラン酸（７−ＡＣＡ）を生ずる。こ の変換を行う特定の酵素は、”アシラーグ又は”アミダーぜと呼ばれる。本明細 書で使用するこれらの名称は、同じ意味を持っている。

また、セファロスポリンＧの７−アミノ−３−デアセトキシセファ０スボラン酸 （７−ＡＤＣＡ）への変換も説明している。しかし、セファロスポリンＧ（Ｃｅ ｆＧ）は醗酵産物ではなく、通常ペニシリンＧから化学的に合成する。ここで述 べている種々のペニシリンおよびセファロスポリンの基本的構造を第１図に示す 。

種々のペニシリンおよびセファロスポリンの合成は基本的にそれぞれ６−ＡＰＡ 、７−ＡＣＡおよび７−ＡＤＣＡを原料とする。

ペニシリンＧおよびペニシリンＶの６−ＡＰＡへの変換は、化学的または酵素的 に行うことができる。古典的方法は化学的切断であったが、現在では酵素的方法 が好まれている（ロー（Ｌｏｗｅ）［１）のレヴユー参照）。酵素的方法のコス トおよび環境的配慮の利点が論じられている。

ＣｅｆＣの側鎖の切断による７−ＡＣＡへの変換は通常いわゆるイミノ−ハライ ド法を用いて行う。しかし、この方法は複雑で、とりわけ多くのステップ、極端 に低い温度および高価な試薬を必要とするという重大な欠点を持っている。

目的の半合成抗生物質へのβ−ラクタム中間体の変換も、化学的または酵素的に 行うことができる。適当な酵素が使用できるなら基本的に酵素法の方が好ましい 。多くの場合に使用される酵素は、ペニシリンアシラーゼである。酵素的変換は 、正しい条件が得られればどの酵素反応も可逆的であるという利点を持っている （アボット（Ａｂｂｏｔ）　Ｂ、　Ｊ、［２）　）。

醗酵によって得られるβ−ラクタム誘導体のデアシレージョンおよび、または選 択した半合成β−ラクタム抗生物質への６−ＡＰＡおよび７−ＡＣＡのアシレー ションに有用なアシラーゼ生産菌としては種々の微生物が提案されている。これ らのアシラーゼ生産菌には、大腸菌、クルイベラ　シトロフィラ（Ｋｕｙｖｅｒ ａ　ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ）、プロテウス　レトゲリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｒｅｔ ｔｇｅｒｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、アルカリゲネス 　フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）、バチルス　メガ テリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス　スフエリカ ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、およびアースロバクターヒス コサス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ）の特定の株がある。

参考文献にしたがって、分子構造および基質特異性に基づきいくつかのアシラー ゼを選んだ（Ｖａｎｄａｍｍｅ　Ｅ、Ｊ、［３））。

タイプＩアシラーセはペニシリンＶに特異的である。これらの酵素はそれぞれ３ ５ｋＤａの分子量を持つ４個の同じサブユニットからなっている。バチルススフ エリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ）からクローン化した遺伝 子の完全なヌクレオチド配列が報告された（オルソン（Ｏｆｌｓｏｎ）Ａ。

〔４〕）。

タイプ■アシラーゼは全て共通した分子構造を共有している。この酵素は小さい サブユニット（α；　２０−２５ｋＤａ）および大きいサブユニット（β、６Ｏ −６５ｋＤａ）からなるヘテロダイマーである。基質特異性に関して、タイプ■ アシラーセはさらに二つのグループに分けられる。

タイプＩＩＡアシラーセはペニシリンＧに非常に特異的である。一般に、これら はアミド基の窒素原子に隣接する部分（セフェム基、ペネム基、アミノ酸など） に対しては特異性を示さず、基質のアシル部分に特異性を示す。このアシル部分 は疎水性が高くなければならず、ベンジル基または（短い）アルキル基であるこ とが好ましい。タイプ■アシラーセによって加水分解しない基質には、ＣｅｆＣ の側鎖にアシル部分としてスクシニル、グルタリル、アジピルおよびアミノアジ ピル基のようなジカルボン酸を持つものがある。タイプＩｒＢアシラーセは、ア シル部分としてスクシニル、グルタリルおよびアジピル基をもつセファロスポリ ン（デスアセトキシ誘導体を含む）、またある場合には非常に限られた程度では あるがＣｅｆＣでさえも加水分解し得ることが報告されている（シブヤ（Ｓｈｉ ｂｕｙａ）Ｙ、［５）：マッダ（Ｍａｔｓｕｄａ）Ａ、［６））、これまで、こ れらのアシラーゼは、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種およびバチ ルス　メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）およびアース ロバフタ−ビスコサス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ）のある 株のみに見いだされている。

文献は主にペニシリンアシラーゼに関するものである。しかし、ペニシリンアシ ラーゼの合成能は、この酵素の特異性のために制限されている。また、最近セフ ァロスポリンＣアシラーゼに関する報告が出たが、報告された酵素の活性は比較 的低いものであった。適当な酵素の発見に相当の努力か払われたが、これまでの ところセファロスポリンＣの７−ＡＣＡへの変換を目的とした酵素法は商業的に 使われていない（ウオルトン（Ｗａ　Ｉ　ｔ　ｏｎ）　Ｒ，Ｂ、Ｃ７）　）。

それゆえ、目的の化学物質を生産するためのデアシレージョン／アシレーション に高い効率を有するアシラーゼ酵素の開発には実質的な興味が持たれる。β−ラ クタム特にＰｅｎＧ、ＰｅｎＶおよびＣｅｆＣおよびこれらの誘導体の６−ＡＰ Ａおよび７−ＡＣＡおよびこれらの誘導体への酵素的デアシレージョンおよび目 的の半合成ペニシリンおよびセファロスポリンを生産する後者化合物のアシレ− ジョンは、特に興味深い。この関係において、ＣｅｆＣ（および誘導体）の７− ＡＣＡ　（および誘導体）への変換を触媒しつる有効なアシラーゼ酵素は特に重 要である。

本発明は、このような有効な酵素を提供することを目的とする。

（関連先行技術） マハジャン（Ｍａｈａｊａｎ）［８）は、種々のペニシリンアミダーゼのレヴユ ーを提供し、また、ＰｅｎＧおよびＰｅｎＶ特異的７゛シラーセを区別した。

ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０２８３２１８は、アースロバフタ−ビスコサス （Ａｒｔｈｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｓｃｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ５３５９４株由来の酵 素を用いたＣｅｆＣおよびその誘導体の７−ＡＣＡおよびその誘導体への酵素的 ワンステップ変換を開示している。

プ変換法を公開している。

理的に処理することによってこれらの微生物から得られる物質を用いる同様の変 換法を公開している。

これまで述べてきたように、これらの酵素の低い活性が商業的に使用されなかっ た要因であった。

組み換えＤＮＡ技術の発展で商業的に使用できるアシラーゼの生産レベルの増加 が可能になり（メイヤー（Ｍａｙｅｒ）（９））、これらの酵素の処理に関する 知見も増えたくンユメイチャ＝（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ）Ｎ　Ｏ〕）。大腸菌の ベニンジンア／ラーセは、大きな前駆体蛋白質として生産され、これがさらに小 （α）および大（β）サブユニットからなる細胞周辺腔の成熟蛋白質にブロセグ でこの遺伝子と大腸菌アシラーゼ遺伝子との緊密なホモロジーが明らかになっｒ ｏｔｅｕｓ　ｒｅｔｔｇｅｒｉ）ペニシリンＧアンラーゼについても大小のサブ ユニットの存在が報告された（ドーミ−（Ｄａｕｍｙ）　［１２］　）。

ウィリアムス（Ｗ目１　ｉ　ａｍｓ）［３３）は、天然に存在する変異体である 大腸菌ＡＴＣＣ９６３７のＰｅｎＧアシラーゼの基質特異性の変化について報告 している。この方法は、野生型遺伝子中の天然変異体の遺伝子の等低領域による 置換的サブクローニングに基づいている。

フォーネイ（Ｆｏｒｎｅｙ）　［３４，３５］は、大腸菌のペニシリンアミダー ゼからの新しい基質特異性を持つアミダーセの選択、および高い変異効率を持つ 大腸菌株におけるこのような組み換えプラスミドの増殖によるこれらのペニシリ ンアミダーゼ（大腸菌ＡＴＣＣ１１１０５由来）の触媒効率の改善について報告 している。ペニシリンおよびセファレキシンの基質アナログとしてＤ−（−）− α−アミノフェニルアセチル−（Ｌ）−ロイシンを使用した。ペニシリンアミダ ーゼの基質特異性の改善および低ｐＨでのα−アミノフェニルアセチル部分を有 するアミドのより迅速な加水分解を行う酵素の発見が可能となった。

これらの刊行物は、本発明を開示あるいは示唆しているわけではない。

（本発明の概要） 本発明は、アシラーゼ遺伝子の突然変異に関しており、そのい（つかはアシラー ゼ酵素の基質特異性に変化を起こしているものに関する。突然変異は、アシラー ゼ遺伝子の特異的ヌクレオチドに生起されており、種々の態様において、この変 異酵素は生化学的性質に変化を示し、これに限られるわけではないが特定のβ− ラクタム抗生物質のデアシレージョンに関する特異性の増加が見られる。

好ましい対様において、Ｃｅｆ−Ｃおよびその誘導体を７−ＡＣＡおよびその誘 導体にワンステップ変換するのに適した新しい変異酵素が提供される。

別の好ま駿い態様においては、特に、目的のペニシリンおよびセファロスポリン 誘導体を生成する６−ＡＰＡおよび？−Ａ　（Ｄ）ＣＡのアシレージョンに特に 適した新しい変異酵素を提供する。

本発明の態様では、既知のタイプＩＩＡまたはタイプＩ［Ｂアシラーゼ、ｆｌＩ えば大腸菌、クルイベラ　シトロフィラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ　ｃｉｔｒｏｐｈｉ ｌａ）、アルカリゲネス　フェカリス（Ａ！ｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌ ｉｓ）またはその他のそのような酵素を生産する生物由来のＰｅｎＧアンラーセ をコードする遺伝子を変異させ、その基質特異性を変化させる。

これらの態様については、以後詳細に説明する。

図面の簡単な説明 第１図・特定のβ−ラクタム変換の反応図式。反応■は６−ＡＰＡおよびフェニ ル酢酸を生ずるＰｅｎＧのデアシレージョンである。反応２は６−ＡＰＡおよび フェニル酢酸を生ずるＰｅｎＶのデアシレージョンを示している。反応３は７− ＡＣＡおよび（α−）アミノアジピン酸へのＣｅｆＣのデアシレージョンを示し ている。反応４は７−ＡＤＣＡおよびフェニル酢酸へのＣｅ　ｆＧのデアシレー ジョンを示している。

第２図・プラスミドｐＵＮＮＩの制限地図。

第３図二大腸菌ＡＴＣＣｌ　ｌ　ｌ　Ｏ５ペニシリンアシラーゼ遺伝子を有する プラスミドｐＵＮＮＥＣの制限地図。

第４図ニブラスミドｐＡＦｌの６．４ｋｂ挿入物の制限地図。

第５図：アルカリゲネス　フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌ ｉｓ）のペニシリンアシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列および誘導されるアミ ノ酸配列。

第６図　シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＹ−７７グルタリルーＣ ｅｆアシラーゼ遺伝子を有するＩ）ＵＮＮＧＬ７の挿入物。

第７図：シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＹ−７７のグルタリル− Ｃｅｆアシラーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＵ０１８ニブラスミドｐＵＣＧＬ ７Ａの制限地図。

第８図：シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＥ−ＩＬ３　ＡｃｙＩＩ 遺伝子を有するプラスミドｐＴＺＩ８ＲニブラスミドｐＴＺＳＥ５−１の制限地 図。

第９図：ＴＡＣプロモーターのコントロール下のＮｄｅＩ挿入部位を有する突然 変異誘発発現プラスミドｐＭａ／ｃの誘導体ニブラスミドｐＭｃＴＮｄｅの地図 。

第１Ｏ図ニブラスミドｐＭｃＴＮｄｅのＮｄｅ１部位に挿入した５Ｙ−７７グル タリルーＣｅｆアシラーセ遺伝子（開始コドンを有する）を含むプラスミドｐＭ ｃＴＧＬ７ＡＮｄｅの地図。

第１１図：Ｎｄｅ１部位に挿入した５Ｅ−８３ＡｃｙｌＩ遺伝子を有するプラス ミドｐＮｃＴＮｄｅ　ニブラスミドｐＭｃＴＳＥ５Ｎｄｅの地図。

第１２図：Ｎｄｅ１部位に挿入したＡ、フェカリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）ペニシ リンアシラーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＭｃＴＮｄｅ　ニブラスミドｐＭｃ ＴＡＦＮｄｅの地図。

第１３図・完全なシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＹ−７７グルタ リルーＣｅｆアシラーセ遺伝子のヌクレオチド配列および誘導されるアミノ酸配 列。

第１４図　大腸菌（ｅ、ｃｏｌ）、クルイベラ　シトロフイラ（Ｋｌｕｙｖｅｒ ａ　ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ）（Ｋ、ｃｉｔ）、アルカリゲネス　フェカリス（Ａ ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）（ａ、ｆａｅ）、シュードモナス（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＥ−８３ＡｃｙＩＩ　（ＡｃｙＩＩ）およびシュー ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＹ−７７（ＳＹ−７７）由来のタイプ■ アシラーゼの配列。アステリスクはその配列が大腸菌アシラーゼの配列と同じア ミノ酸をその場所に含んでいることを示している。

第１５ａ図：アルカリゲネス　フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ″　ｆａｅ ｃａｌｉｓ）α−サブユニットにおける領域選択。

第１５ｂ図：アルカリゲネス　フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃ ａｌｉｓ）β−サブユニットにおける領域選択。

第１６ａ図：５Ｙ−７７α−サブユニットにおけるアミノ酸残基選択。

第１６ｂ図：　５Ｙ−７７β−サブユニットにおけるアミノ酸残基選択。

第１７図：グルタリルアシラーゼ５Ｙ−７７野生型および変異型Ｖ６２Ｌによる アジピルセリンの変換。酵素はグルタリル？−ＡＣＡに関して同じ活性が得られ るように添加した。

第１８図：グルタリルアシラーゼ５Ｙ−７７野生型および変異型Ｙｌ　７８Ｈお よびＶ１７９Ｇによるアジピルセリンの変換。酵素はグルタリル？−ＡＣＡに関 して同じ活性が得られるように添加した。

第１９図：グルタリルアシラーゼ５Ｙ−７７野生型および変異型Ｙ１７８Ｈおよ びＬ１７７ｒ＋Ｙ１７８Ｈによるアジピルセリンの変換。酵素はグルタリル７− ＡＣＡに関して同じ活性が得られるように添加した。

（発明の詳細な説明） 本発明は、基質特異性の変化したアシラーゼの開発に蛋白質工学を使用する。

本発明は、種々の（既知の）アシラーゼが特定の領域に有意なホモロジーを示す ことを見出したことに基づいている。比較分析によってアシラーゼの生化学的性 質は、特定の変異によって変化することが示された。以下に概説する方法によっ て多くの有力な変異部位が明らかになった。

相同的蛋白質における三次構造は進化の過程で一次構造よりも、またＤＮＡ配列 よりも保存されていることが分かってきた。このことは、例えばグロビン群によ って示されている（ディッカーソン（Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ　［１３：ｌ　）。グ ロビン構造は、非常に多くの異なるアミノ酸配列によってコードされており、あ るものでは８６％もの違いが見られる（１５０残基中１３０）。それにもかかわ らず、それらが非常に似た構造を取っていることは、それらが共通の祖先に由来 しているという仮説を支持している。

生物が、進化の過程で多様化するとき、それらの遺伝子は徐々に変異を蓄積し、 全く異なるアミノ酸配列の蛋白質を生成する。それらが多様化すればするほど、 配列のホモロジーは小さくなる。ホールディング、安定性または触媒活性に無関 係な部位における突然変異の頻度は高い。通常、これらの部位は、側鎖が表面に 出ているポリペプチド中の部位に存在する。折り返しのところにのみ、残基が短 い極性側鎖を有するか、もしくは、グリシンまたはプロリンである傾向を持つ。

これらの残基はほとんどこの部位に存在する。内部の残基は余り変化せず、その 側鎖の非極性は非常に良く保存される。進化の過程での突然変異はランダム過程 なので、機能性に影響する置換も存在する。これらの置換がその生物に害を起こ さないときのみ、それは保存される。通常、触媒活性に直接関係する残基は、非 常に良く保存されることが分かっている。二次構造ユニット間の表面ループでは 、内部を乱すことなく挿入および欠失が起きる傾向にある。通常、分岐した分子 における二次構造要素は同様の三次元的構造に配列している。

これらの分子の分子構造における類似性と同様に、タイプ■アシラーゼ間に見ら れる配列ホモロジーは、タイプＩＩＡおよびタイプＩ［Ｂアシラーゼが単一の祖 先遺伝子から進化してきたことを示している。また、典型的な成熟過程も共通起 源を指示している。共通の祖先から分岐してきた蛋白質の配列比較は、その酵素 の機能に直接関係する残基を明らかにし得る。

本発明の態様においては、既知のタイプｍＡまたはタイプＩ［Ｂアシラーゼをコ ードする遺伝子、例えば、大腸菌、クルイベラ　シトロフィラ（Ｋｌｕｙｖｅｒ ａ　ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ）、アルカリゲネス　フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅ ｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）またはその他の生物由来のＰｅｎＧアシラーセ、お よびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＥ−８３ＡｃｙＩＩ、シュー ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＹ−７７またはその他の生物に由来する グルタリル−Ｃｅｆアシラーセをコードする遺伝子をそれらの基質特異性が変化 するように変異させている。

ＰｅｎＧアシラーゼ（タイプＩ［Ａ）の基質特異性の修正は、変異酵素が天然の ペニシリンＧの側鎖であるフェニルアセチル基以外の側鎖を有するペニシリンお よびセファロスポリン誘導体を切断または合成し得るように行った。実際にＰｅ ｎＧアシラーゼによって影響を受けない側鎖には、ジカルボン酸であるコノ１り 酸、グルタル酸、アジピン酸およびアミノアジピン酸（後者はＣｅｆＣの天然の 側鎖である）由来のアシル基がある。

本発明の別の態様では、Ｃｅｆアシラーゼ（タイプｎＢ）の基質特異性を修正し 、グルタル酸以外の側鎖を有するペニシリンおよびセファロスポリン誘導体を切 断または合成する変異酵素を調製している。このような新しい変異酵素によって 切断または合成される適当な側鎖には、アジピン酸およびアミノアジピン酸由来 の部分（天然のセファロスポリンの側鎖である）、天然のペニシリンＧの側鎖で あるフェニル酢酸の部分のような疎水性側鎖、およびアルキル側鎖などＣｅｆア シラーセによって実質的に影響されないものである。

別の特徴に於いて、アシラーゼ（タイプＩ［ＡおよびＩ［Ｂ）の特異性および活 性の修正は該アシラーゼに関して既に存在する側鎖について行った。蛋白質工学 を用いることにより、基質に対するアフィニティーが修正することもあるしく例 えば増加、基質に対するより低いＫｍによって表される）、触媒的ターンオーバ ーが変化することもある（例えば増加、基質に対するより高いｋ　ｃ＊　ｌで表 される）。

酵素分子の修正を行うために、その酵素の３Ｄ構造を役立てることは非常に望ま しい。これまで、アシラーゼに関する高分解能の３Ｄ構造は報告されていない。

しかし、アシラーゼをコードする幾つかの遺伝子、例えば、大腸菌、クルイベラ （タイプＩｒＢ）由来の遺伝子がシーケンシングされ、このことは、これらの酵 素の生物学的処理に関する洞察を与えた。単離したサブユニットのアミノおよび カルボキシ末端のシーケンシングは、その遺伝子が、シグナル配列とそれに続く α−サブユニット、連結ペプチド（スペーサー）および最後のβ−サブユニット からなる前駆体蛋白質をコードしていることを示した。

本発明の態様に従い、アンラーゼの蛋白質工学は選択したアシラーゼの３Ｄ構造 の使用可能性に依存して、二つの戦術で行った。３Ｄ構造の測定操作はよく知ら れている。

３Ｄ構造が手に入らないときは、以下の戦術に従った第一に、幾つかの選択した アシラーゼ遺伝子を適当な発現宿主生物にクローン化する。好ましい微生物には 、大腸菌、バチルス（Ｂａｃ　ｉ　ｌ　１ｕｓ）　、シュードモナス（Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ）がある。次に、クローン化した各アシラーゼのＤＮＡ配列を決 定する。このＤＮＡ配列を対応するアミノ酸に翻訳し、それらのアミノ酸配列を 可能な限りホモロジーが高くなるように整列させる。配列の整列に関して、同一 性や類似性に基づくアミノ酸のタイプをパラメータとして用いると良い。例えば 、セリンはスレオニンと似ており、アスパラギン酸はグルタミン酸に似ている。

さらに、適当なパラメータには二次構造予測（いくつかの標準的操作、例えばチ ョウ　ファスマン（Ｃｈｏｕ　Ｆａｓｓｍａｎ））および配列中の荷電分布があ る。次のステップは変異領域の選択である。

ランダムに生じた変異体は、特異的基質を切断し得るもののみを増殖させること によって選択する。通常、これらの基質にはアシル部分として酸アシラーゼの特 異性としては好ましい側鎖およびアミド部分としては発現宿主の増殖には欠かせ ないし一アミノ酸を含むアミド誘導体が含まれる。それゆえ、望ましい基質特異 性を有するアシラーゼを発現する宿主のみが該アミド化合物を切断することがで き、それにより必須アミノ酸を放出することができる。たとえば、Ｄ−α−アミ ノアジピル　Ｌ−ロイシン（以後アミノアジピルロイシンと呼ぶ。この化合物は Ｄ型である）をアミド化合物として用いてロイシン栄養要求性発現生物を使用し たＣｅ　ｆＣアシラーセを選択できる。アミン部分のもう一つの例は、アンモニ アで発現宿主の唯一の窒素源として働きうる。

使用した選択操作に基づく目的とする基質特性を持つ“ポジティブ変異アシラー ゼを精製しテストする。突然変異誘発部位は変異アシラーゼ遺伝子のシーケンシ ングにより同定する。このような変異体には５Ｙ−７７アシラーセの変異体Ｖ６ ２Ｌ、Ｙ１７８Ｈ，Ｖ１７９Ｇがある。他の突然変異（アミノ酸置換、欠失およ び挿入を含む）を変異アシラーゼの活性を増加させるためにこれらの部位または その周辺に導入することもある。したがって、上述の変異のどの組み合わせも本 発明の範囲に入ることが理解されよう。このような組み合わせの例には、５Ｙ− ７７アシラーセの変異体５１７７Ｉ／Ｙ１７８Ｈがある。

アシラーゼの３Ｄ構造が使用可能なときは、上述の操作の第一ステップを行う必 要があるが、変異の選択は３Ｄ構造に基づいてできる。これには二つの方法が考 えられる： ａ）一つもしくは幾つかのアミノ酸を他のアミノ酸に変異させる合理的方法。

これは多量の変異体を生成しないので全ての変異体を精製や基質特異性のテスト について取り扱い得る。三次元構造から、活性部位の一つ以上のアミノ酸を変異 させるために選択し、その活性部位における側鎖を至適なものにする。たとえば 、ＣｅｆＣのアミノアジピル側鎖をＰｅｎＧアシラーゼに適応させるためには、 まず、結合ポケットを大きくしてより長いアルキル鎖がフィツトするようにし、 かつ、第二にアミノアジピル側鎖のアミ人および、またはカルボキシ基を結合す る正しい静電的環境を供給することが必要である。別の例では、ＣｅｆＣの側鎖 の正電荷のアミノ基を適応させるための適正な静電的環境の導入は、グルタリル −Ｃｅｆアシラーゼ（すでにアミノアジピルセファロスポリンに対する活性をい （らか示す）の特異性をＣｅｆＣアンラーゼへと変化させる。

ｂ）″ターゲラティドランダム突然変異誘発（ＴＲＭ）法”。３Ｄ構造が分がっ ていても予想は非常に難しい。もし、基質結合に幾っがのアミノ酸が関係してい ることが分かれば、ターゲラティドランダム突然変異誘発を行うことができ、続 いて先に述べた選択テストを行うことができる。この方法では、例えば三個の部 位をランダムに変異させたときは、８０００個の変異体が生成する（アミノ酸に 関しテハ、２０＊２０＊２０　；ＤＮＡレベルテハ、（４＊４＊４）’　＝２６ ２゜０００の変異体）。

（べき高いホモロジーを示すことが分がった。アルカリゲネス　フェカリス（Ａ ｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）由来のアシラーゼをコードする遺伝 子を単離し、シーケンスし、他の二つの種の遺伝子と比較した。その配列に共通 した特徴は、遺伝子力吠きいポリペプチド前駆体をコードしていることで、この 事は第１表で見ることができる。アルカリゲネス　フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇ ｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）に関するクエスジョンマークは、この配列の最後 か不明確で決定できなかったことを示している。

第１表 アシラーセペプチド当たりのアミノ酸数本発明のもう一つの特徴として、シュー ドモナス（Ｐｓｅｕｃｌｏｍｏｎａｓ）ＳＹ−７７由来のアシラーゼのα−およ びβ−サブユニットが、タイプｍＡアシラーゼおよびタイプＩＩＢＳＥ−８３Ａ ｃｙＩ　Ｉアシラーゼの両方に対して高いポモロシーを有する領域を含んでいる ことが示された。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＹ−７７のアシ ラーゼコート遺伝子を単離し、この遺伝子の完全な配列を決定した。両方のシュ ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）アシラーゼに関して、α−およびβ−サ ブユニットの間に連結ペプチドがあるという証拠はない。５Ｙ−７７酵素は、５ Ｅ−８３Ａｃｙ　Ｉ　ＩのＮ末端のシーケンシングによってその成熟α−サブユ ニットが開始メチオニンのすぐ後ろで始まっていることが示されているにもかが わらず、シグナルペプチドを有していると考えられている（マツダ（Ｍａｔｓｕ ｄａ）Ａ、［６］’Ｌタイプ■アンラーセの速度論は、アシル酵素中間体を介す る触媒プロセスと一致している（マハジャン（Ｍａｈａｊａｎ）　［８））。

このメカニズムの最初のステップでは、基質のＰｅｎＧが酵素に結合して非共有 結合的メカエリスーメンテン複合体ｅ：ＰｅｎＧを生成する。続くステップでは 、酵素とアシル部分の間で、第一の生成物６−ＡＰＡの放出を伴って共有結合中 間体が生成する（ｅ−ＰｈＡｃ−アンル化酵素；ＰｈＡｃ＝フェニル酢酸）。

デアシレージョンは水分子の助けを借りて進行し、第二生成物ＰｈＡｃの放出お よび酵素の再生が起こる。このメカニズムもＰｈＡｃが競合的インヒビターとし て働き、６−ＡＰＡが非競合的に働くという観察と一致いている。

セリンプロテアーゼに対して推論されているのと同様に、上記のメカニズムはフ ェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ、セリンプロテアーゼの強力 なインヒビター）がこの酵素を阻害するという知見とともに、これらの酵素もセ リン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸からなる触媒トリオを含むセリンプロテ ーゼであることを示している。このような触媒トリオはトリプシンおよびズブチ リシン群のセリンプロテアーゼばかりではなく、ヒト膵臓および菌類リゾムコー ル　ミニヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍ１ｅｈｅｉ）由来の構造的に異なる二 つのトリアシルグリセロールリパーセにも発見されている（ブロー（Ｂ　Ｉ　。

ｗ）Ｄ、［１４］　；ウィンクラ−（Ｗｉ　ｎｋ　ｌ　ｅ　ｒ）　Ｆ、　Ｋ、１ ：１５］　；ブラディ−（Ｂｒａｄｙ）Ｌ、〔ｌ　６））。配列整列化に基づき 、アルカリゲネス　フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ） の５ｅｔ７６５は、このアシラーゼの活性部位のセリンらしい。この知見に基づ きさらに活性を改善した変異体か、提供される。

本発明の別の特徴として、大腸菌、アルカリゲネス　フェカリス（Ａｌｃａｌｉ ｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓ　ｅｕｄｏｍｏｎａ　 ５）ＳＹ−７７およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＥ−８３Ａ ｃｙ■■由来のアシラーゼをコードする遺伝子を発現宿主生物大腸菌にクローン 化している。

大腸菌、クルイベラ　シトロフィラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ　ｃｉｔｒｏｐｈｉｌｉ ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＥ−８３ＡｃｙｒｌのＤＮＡ 配列およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＥ−７７の部分的ＤＮ Ａ配列は、文献から引用した。アルカリゲネス　フェカリス（ＡｌｃａｌｉｇＰ ｅｎＧアシラーセとグルタリル−Ｃｅｆアシラーゼ間のホモロジーは低かった（ ２５〜３５％）にもかかわらず、五つのアミノ酸配列の整列化は、ＰｅｎＧアシ ラーセ間の近接したホモロジー（〉４５％）を示す一方、グルタリル−Ｃｅｆア ノラーセ間のホモロジーも同じオーダーであることを示された。また、五つ全て の配列間で高いホモロジーを示す領域は、同様の３Ｄ構造に位置することぐ既に 、ヘテロニ量体構造により支持されている）が検出された。

変異に特に興味深い領域は、アシラーゼのα−およびβ−サブユニットである。

本明細書で用いられている全てのアミノ酸は、他言しないかぎり、Ｌ型である。

“アミノアジピル”という語句は、Ｄ−α−アミノアジピル部分を示している。

また、β−ラクタムアシラーゼ変異体をクローン化し、β−ラクタム生産微生物 中で発現し得る。このことは、デアシル化β−ラクタム中間体を醗酵培地から直 接回収し得るという利点を有している。セファロスポリウム（Ｃ６ｐｈａｌ。

ｓｐｏｒｉｕｍ）およびペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）株は、β−ラ クタムアンラーゼの応用に関する宿主として望ましい。

以下に示す例は、説明を目的とするもので制限を与えるものではない。

（材料と方法） アシラーゼ遺伝子のクローニングおよび欠失一般的なりローニング操作は、マニ アチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）［１７Ｌ　オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ　（１８） およびパーパル（Ｐｅ　ｒｂａ　ｌ　Ｃ１９）の方法に従った。これらのハンド ブックには、ｃＤＮＡ分子の構築および増殖操作、遺伝子ライブラリー構築操作 および部位特異的またはランダムなりＮＡの変異法等が詳細に述べられている。

ＤＮＡ操作に必要な酵素は市販されているものをその説明書にしたがって使用し た。プラスミドおよび大腸菌クローニング宿主は公的な培養物保管機関から入手 した。

プラスミドｐＵＮＮＩの構築 プラスミドｐＵＮＮｌは以下のようにして構築した。プラスミドｐＵＢ　１１０ （Ｓ、ａｕｒｅｕｓ）をＳｕａ　Ｂｌ及びＴａｇ　Ｉで切断し、ネオマイシン耐 性遺伝子をＳｍａ　Ｉ、ＡＣ（ｌ消化ｐＵｃ１９にクローン化し、ｐＰＮｅｏを 得た。ｐＰＮｅｏの旦且旦Ｒ１一旦旦且Ｉ小フラグメントをｐＵｃ１８の旦旦旦 Ｒン化した。ＫｐｕＩ、ＸｂｕＩ消化、ヌクレアーゼＳ１処理及び結合の後、プ ラスミドｐＵＮＮｌを回収した。このプラスミドは陽性選択ベクターとして使用 でき（Ｎｉｌｓｓｏｎ、前出）、一般のクローニングベクターに較べて、β−ラ クタム抗生物質を破壊し得るβ−ラクタマーゼ遺伝子を含んでいないという利点 をアシラーゼ活性は蛍光色素フルオレサミンによる一級アミノ基の検出に基づく 分光測定法によって検定した（Ｓ、アンダーフレンド（Ｕｎｄｅｒｆ　ｒｉ　ｅ ｎｄ）等［３２））。？−ＡＣＡの検出には、レイニス（Ｒｅｙｅｓ）等の方法 を採用した〔２１〕。

酵素活性を測定するために、酵素を基質と共に室温でインキュベートした。反応 液の組成は、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファｐＨ７，５，１，２ｍＭ基質、 １．０ｍＭβ−ラクタマーゼインヒビター６−プロモーペニシラン酸および酵素 である。反応は、０．５Ｎ　ＨＣＩを添加することによって停止した。遅い反応 は、塩酸による停止なしに直ちに検定した。反応液から１００μリツトル採取し 、８００μリツトルの０．２　Ｍ酢酸ナトリウムバッファＩ）Ｈ４，５およびＡ Ｒアセトンで調整した１００μリツトルのフルオレサミン（１ｍｇ／ｍｌ）を混 合した。基質が、７−ＡＣＡの代わりにアミノ酸を含む場合、酢酸ナトリウムバ ッファの代わりに０．２Ｍリン酸ナトリウムｐＨ７，５を使用する。１５分後、 Ｕｖｉｃｏｎ８６０分光光度計で３７８ｎｍの吸収を測定し、適当なブランクで 補正した。校正曲線によると３７８ｎｍでの吸収は基質の加水分解によって放出 された遊離したアミノ酸の数に関連していた。

アシラーゼ遺伝子の突然変異誘発 クローン化したＤＮＡフラグメントの部位特異的突然変異誘発は、プラスミドｐ Ｍａ／ｃシステムを用いスタンセンズ（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ）［２２）の方法で 行った。アシラーゼ遺伝子の適当なギャップ二本鎖分子を構築した。オリゴヌク レオチド部位指定突然変異で特異的ミスマツチを導入した。アシラーゼ遺伝子の 発現は、大腸菌ＷＫ６中、同種発現シグナル、または大腸菌１ａｃ、ｔａｃまた はｔｒｐプロモーターで始まった（デボア（Ｄｅ　Ｂｏｅｒ）［２３））ｏギャ ップ二本鎖分子を”スパイクト”オリゴヌクレオチドとアニールし、リーノヨン ターケッティドランダム突然変異誘発を行った（エルメス（Ｈｅ　ｒｍｅ　５） Ｃ２４’Ｊ）。これらの“スパイクト”オリゴヌクレオチドは、アプライドバイ オシステムダＤＮＡ合成機でオリゴヌクレオチドを合成する際に四種全てのヌク レオチドを含めておくことで調製した。それとは別に、ギャップドＤＮＡのラン ダム突然変異は、リーソバラ（Ｌｅｅｔｈｏｖａａｒａ）［２５）の方法の修正 法を用いて酵素的に行った。ギヤングを選択することで、酵素的に変異させる領 域を選んだ。

別のタイプの実験では、ターゲソティトランダム突然変異誘発を行った。これは 、オリゴヌクレオチドの合成の際に、特定のアミノ酸のコドンに四種全ての塩基 を含める事を含む。これを行うために、どのアミノ酸も他の全てのアミノ酸に変 異させうる変異性オリゴヌクレオチドを合成する。その様にして、単一のアミノ 酸部位または幾つかの部位の組み合わせを変異し得る。別に、ＰＣＲ法を用いた ランダム突然変異も使用し得る［３６）。

選択培地 フェニルアセチルロイシン（“ｆａｌ”）に関する選択培地は、ガルシア（Ｇａ ｒｃｉａ）［：２Ｕにより報告されているものを調製した。最小プレートは以下 のものを含んでいる。Ｍ６３最小寒天、２ｇ／Ｉグルコ〜ス、１ｍｇ／ｌチアミ ン、１０ｍｇ／ｌプロリンおよび適当な抗生物質（５０μｇ／ｍｌクロラムフェ ニコール（ｃ　ａ　ｐ）または２５μｇ／ｍｌアンピシリン（ａｍｐ））。アシ ラーゼの側鎖特異性（例えば、アジピルまたはアミノアジピル）に関する選択に は、１００μｇ／Ｉ！の対応するアシルロイシンを最小プレートに含めた。アシ ルロイシン存在下で排他的に増殖する大腸菌ＨＢＩＯＩ　（Ｌｅｕ　）のトラン スホーマントまたは変異体は、目的の特異性を有するアシラーゼ遺伝子を持つと 考えられる。ロイシンの代わりに、選択基質のアミノ酸部分を変化させてみた。

このような場合、選択には大腸菌の適当な栄養要求変異体を用いた。たとえば、 基質Ｎ−アジピルセリンに関する選択には、宿主として大腸菌ＰＣ２０５１株を 用いた（Ｐｈｕｂａｇｅｎ、ユトレヒト、オランダより入手）。フェニルアセチ ルロイシン、アミノアジピルロイシン、グルタリルロイシン、アジピルアラニン およびアジピルセリンはＬＧＳＳ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｂｕｒｅａｕ　Ｎｉ　ｊｍ ｅｇｅｎ。

オランダから購入した。

炭素源として０，２％のコハク酸塩、グリセロール、またはグルコース、および チアミン（ｌμｇ／ｍｌＬプロリン（１０μｇ／ｍｌ）および適当な抗生物質を 補った最小Ｍ６３培地に最終濃度が１５ｍＭとなるようにフェニルアセチルアミ ドを添加した。基礎培地中の全ての塩は、アミドに関する選択的増殖を保証する ために、Ｎａ＋またはＫ“イオンを含む対応する塩に置換した（ドーミー（Ｄａ ｕｍｙ）［１２））。目的の側鎖を有するアミドは市販のものを購入するか、も しくは、標準法にしたがって調製した。宿主として大腸菌ＪＭＩＯＩ、ＷＫ６． ＨＢＩＯ１，ＰＣ２０５１およびＰＣ１２４３株を用いて、選択的アミドに対す る特異性を持つ変異遺伝子を選択した。

野生型および変異型グルタリルアシラーゼの単離操作遠心により細胞を回収し、 １４０ｍＭ　ＮａＣ１を含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファｐＨ７，４に懸 濁した。この細胞を超音波処理で破壊した（６Ｘ２０秒、ｌ　ＯＯＷ、１００ｍ ｍｂａ　ｒ、ラブソニック１５１０．２０秒毎に細胞を氷で３０秒間冷却した。

）。続いて、このサスペンションを遠心した。超音波処理操作を懸濁したペレッ トに繰り返し、最後にこの細胞破壊物を遠心で除いた。上滑を集め、これに３０ ％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加した。三十分の攪拌後、沈殿物質を 遠心で除去した。この上清の硫酸アンモニウム濃度を６０％に増加し、３０分後 、沈殿を遠心で回収した。このペレットを２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファｐ Ｈ７，５に溶解し、同バッファに対して十分透析した。

（実施例１） 大腸菌ペニノリンアシラーセ遺伝子のクローニング大腸菌ＡＴＣＣｌ　１１０５ ペニシリンアンラーゼ遺伝子の公表されている制限地図および配列から（サン− ジン（Ｓａｎｇ−Ｊｉｎ）［２７］　）、２．９ｋｂのＨｉ　ｎ　ｄＩＩ［−Ｓ ｍａ　Ｉフラグメントがアシラーゼ遺伝子（“ｐａｃ″）を含んでいると結論し た。染色体ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩ［およびＳｍａ　Ｉで消化し、０．５％アガロ ースゲルで分画した。２乃至４ｋｂのフラクションをシーンクリーン（ＢＩｏ　 １０１、　ランヨラ、ＣＡ）で精製し、大腸菌ｐａｃの配列由来の下記のオリゴ ヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。

ＴＣＧＴＡＣＡ’ｒ’ｒＴＴＣＡＧ　ＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＴＡＧＴＧＣＴＴＡ ＴＣそれからポジティブなハイブリダイズフラクションをベクターｐＵＮＮｌに 連結し、大腸菌ＨＢＩＯＩにトランスホームした。２０００個のトランスホーマ ントの上記オリゴプローブによるフィルターハイブリダイゼーションによってプ ラスミドｐＵＮＮＥｃ１が同定された。その構造を第３図に示す。

ｐＵＮＮＥｃｌを有するコロニーをＨｌ−寒天プレート中３０°Ｃで２４時間増 殖させた。その後、このプレートにベニ／リンＧ（５ｍｇ／ｍｌ）を含む５ｍｌ の栄養培地トップアガーおよび０．５ｍｌのセラチア　マルセセンス（Ｓｅｒｒ ａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ２７１１７の一晩培養物を重層し、 もう２４時間インキュベートした。このトランスホーマントのペニシリンアシラ ーセ活性は、セラチア　マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎ Σ）の６−ＡＰＡに対する高い感受性に由来するコロニーの周辺の阻害ゾーンで 確認できる（ミーブーチソム（Ｍｅｅｖｏｏｔｉｓｏｍ）［２８））。

（実施例２） アルカリゲネス　フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）ペ ニンジンアンラーセ遺伝子のクローニングアルカリゲネス　フェカリス（Ａｌｃ ａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９０１８株（＝ＮＣＴＣ４１ ５）の染色体ＤＮＡを単離し、５ａｕ３Ａで部分分解した。４乃至７ｋｂの範囲 のフラクションを精製し、ＢａｍＨＩで消化したベクターｐＡＣＹ１８４にライ ゲーションした。このＤＮＡを大腸菌ＨＢｌｏｔにトランスホームし、ｆａｌ− プレートにブレーティングした（方法セクション参照）。二つのポジティブクロ ーン、ｐＡＦｌおよびｐＡＦ２、が同定された。これらのクローンもセラチア　 マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）重層法でポジティブ な結果を示した。ｐＡＦ　１プラスミドの６、４　ｋ　ｂ挿入物を第４図に示す 。

この遺伝子の位置は、Δ、フェカリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）ペニシリンアシラー セのβ−サブユニットのＮＨ２末端配列に関して設計したオリゴヌクレオチドを 用いて決定した。そのアミノ酸配列を以下に示す。

５−Ｎ−Ｌ−Ｗ−３−Ｔ／Ｒ−（Ｃ）−Ｐ−Ｅ−（Ｃ）−ＶｐＡＦ１挿入物に関 するハイブリダイゼーシヨンプローブとしては、以下のオリゴヌクレオチドを用 いた。

ＡＧＣＡＡＣＣＴに　ＴＧＧ　ＡＧＣＡ／ＣＣ／Ｇ　ＣＴＧＣＣＣＧ　ＧＡＧ　 ＴＧＣＧＴ制限地図上の７ゾブリダインングシグナルの位置から、Ａ、フェカリ ス（ｆａｅｃａ　Ｉ　ｉ　５）ｐａｃ遺伝子の方向を決定した（第４図）。６． ４ｋｂ挿入物の３．９ｋｂＳａｕ３Ａ−Ｎｄｅ　Ｉサブクローンは、ペニシリン アシラーセ活性を与えることを示したが、３．１ｋｂＳａｕ３Ａ−ｓｐｈ＋フラ グメントは、不活性であった（第４図）。３．９ｋｂ挿入物のＤＮＡ配列は、ｐ ＴＺ１８ＲおよびｐＴＺ１９Ｒ（ファルマシア）における適当なフラグメントの ダイデオキシシーケンシングで決定した。Δエフェカリス（ｆ　ａｅｃａ　１　 ｉ　ｓ）ペニシ１ルアシラーゼのコードＤＮＡ配列および誘導されるアミノ酸配 列を第５図に示す。

（実施例３） シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）グルタリル−セファロスポリンアシ ラーゼ遺伝子（Ａ）のクローニング シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＹ−７７は、グルタリルアミドセ ファロスポラン酸を７−ＡＣＡおよびグルタリン酸に加水分解しつる酵素を生産 する。この酵素をコードする遺伝子をクローニングした（マツダ（Ｍａｔｓｕｄ ａ）［２９））。シュードモナス５Ｙ−７７から抽出したＤＮＡを旦且見Ｉおよ びＳｍａ　Ｉで消化し、ＨＢＩＯＩ株中Ｓｍａ　Ｉで線状化したベクターｐＵＮ Ｎ１にクローン化し、そのＤＮＡ配列（マツダ（Ｍａ　ｔ　５ｕｄａ）、ｌ：２ ９）　、上述）に出来する以下のプローブとｌ＼イブリダイズさせた。

ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＡＧＡ　ＧＴＴ　ＣＴＧ　ＣＡＣＣＧＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　Ｔ ＣＣＧＣＣＴＴＧハイブリダイジングプラスミドｐＵＮＮＧＬ−７は、制限地図 によりシュードモナス（Ｐｓｅｕｃｌｏｍｏｎａｓ）ＳＹ−７７のアシラーゼコ ード化フラグメントを宿すことが示された（第６図）。このプラスミドを精製し 、ＢａｍＨＩおよ一ノヨンした。生成したプラスミドは、第７図に示したように 特徴付けられた。

コロニーをＬＢＣ培地で増殖させ、そのアシラーゼ活性を分析した（方法参照） 。

ブスミドｐＵＣＧＬ−７Ａが、５ユニット／ｇ−細胞ペレｙトを生成することが 、マシア）にクローン化し、プラスミドｐＴｚＩ　９ＧＬ−７Ａを生成した。そ の２．６ｋｂＢａｍＨＩ−３ａ　ｌ　Ｉフラグメントの全ＤＮＡ配列を決定しく 第１３図参照）、５Ｙ−７７アシラーセの完全なアミノ酸配列を誘導した。最初 の３１１残基（全部で８５０残基）は、５Ｙ−７７アンラーセの公表されている 部分的配列と同じであった（マツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）［２９）、上述）。

（実施例４） シュードモナスのグルタリル−セファロスボリンアシラーゼ遺伝子（Ｂ）のクロ セファロスポラン酸およびセファロスポリンＣを７−ＡＣＡおよびグルタル酸に 加水分解しつるアシラーゼを生産する。この酵素をコートする遺伝子をシュード モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＥ−８３（ＡｃｙＩＩ、７ツダ（Ｍａｔｓ ｕｄａ）　〔３０〕）の染色体ＤＮＡからクローニングした。これらのデータか ら、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＥ−８３の６．ＯｋｂＢｇｌ ＩＴフラグメントをＢｃＩＩ線状化ｐＵＮ１２１（−ルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ） （２０）　）にクローン化することを決定した。ＪＭＩＯＩのトランスホーマン トをＡｃｙＩＩのＤＮＡ配列由来のオリゴヌクレオチド・ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＡＴ ＧｃＴＣＣＩ’ＣＧＣＣＣＣＡ　ＧＣＣＧＣＧ　ＣＣＣＧＧＴ　ＣＡＧ　ＧｒＴ とハイブリダイズさせた。

ポジティブクローンｐＵＮＳＥ−５を単離した。このプラスミドの２．　３ｋｂ ＳａｃＩ−３ｍａＩフラグメントを生成し、ベクターｐＴＺ１８にサブクローン 化してｐＴ２１８３Ｅ５−１を得た（第８図）。

（実施例５） タイプ■アシラーゼのホモロノー比較 第１４図では、種々のアシラーゼの前駆体のアミノ酸配列を、大腸菌のアシラー ゼの配列を基準に整列させた。

大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ）、　クルイベラ　シトロフィラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ　ｃｉ ｔｒｏｐｈｉｌａ）（Ｋ、ｃｉｔ）およびアルカリゲネス　フェカリス（Δ１旦 ｓ　ａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）（Ａ、ｆａｅ）由来のアシラーゼは 、タイプＩＩＡアシラーゼ（ＰｅｎＧ　アシラーゼ）であるが、シュードモナス （ハｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（ＳＥ−８３および５Ｙ−７７）由来のアシラーゼは タイプＵＢアシラーゼ（グルタリル−Ｃｅｆ　アシラーゼ）である。

また、第１４図には、リーダー、α−サブユニット、連結ベフチドおよびβ−サ ブユニットが始まる位置が示されている。これらの位置は、第２表にまとめられ ているペプチドシーケンシングデータから誘導した。ペプチドシーケンシングデ ータが入手できない場合は、それらの位置を大腸菌の対応する位置から誘導した 。

第２表 タイプ■アシラーセのα−およびβ−サブユニットのペプチド配列データアミノ 酸配列間のホモロジーは、（推定上の）α−サブユニットおよびβ−サブユニッ トに関して計算した（各々第３表および第４表）。

第３表 タイプ■アシラーセのα−サブユニットのホモロジーマトリクス第４表 タイプ■アシラーゼのβ−サブユニットのホモロジーマトリクスカツコ内の値は 類似の残基に基づ（ホモロジーを示し、カッコの前の値は同一の残基を示す。

第３表および第４表からα−サブユニットに関しては４６−８３％、β−サブユ ニットに関しては４１−８６％のタイプｍＡアシラーゼ間の高いホモロジーが見 て取れる。このことは、残基間の類似性（例えば、Ｓ　ｅ　ｒ／Ｔｈ　ｒ、　Ａ 　ｓ　ｐ／Ｇｌｕ、Ａｒｇ／Ｌｙｓ等）を考慮しても、高いと言える。この高い ホモロジーは、三つのＰｅｎＧアシラーゼの３Ｄ構造が、たいへん似ていること を示している。

タイプＩＩＡおよびタイプ［３アシラ一セ間のホモロジーは、低かった（２２− ３０％）。アミノ酸間の類似性を考慮すると、これらの値はより高くなる（３５ −４５％）。それゆえ、タイプＩＩＢアシラーゼは、タイプＩＩＡアシラーセと 構造的に関連していると考えられる。このホモロジーはアミノ酸配列全体に渡っ て均等に分布しておらず、特定の領域に高いホモロジーが見られる。

アルカリゲネス　フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）お よびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＹ−７７アシラーゼの配列決 定で、直接触媒に関係する残基を同定できる。

タイプ■アシラーセが、ＰＭＳＦにより阻害されるという観察は、活性化セリン が触媒に関係することを強く指示している。活性化セリンは、セリンブロテアー セおよびリパーゼ中に見られる。それらは、常にヒスチジンおよびアスパラギン 酸と共に見いだされ、触媒性トリオを形成している。

第１４［Ｎの配列の整列は、三つの保存されているセリン：５ｅｒ１７４，５ｅ ｒ２６６および５ｅｒ７６５（Ａ、フェカリス（ｆａｅｃａｌｊｓ）の番号付け ）のみを示している。

５ｅｒ１７４は、タイプｆｆＢアシラーセ中には余り保存されていないが、タイ プＩＩＡアシラーセ内の良く保存されている領域中のα−サブユニットに存在す る（第１４図）。ＰＭＳＦ−感受性アミノ酸が、β−サブユニットに存在すると いう実験的観察を考慮すると（ドーミー（Ｄａｕｍｙ）［：ｌ　２））　、Ｓｅ ｒ　ｌ　７４は活性部位セリンではないようである。

５ｅｔ２６６は、β−サブユニットのＮ末端に存在し、この酵素の成熟に必須で あることから、非常に保存性がよい。それゆえ、これも活性部位セリンの候補で はないようだ。

５ｅｔ７６５は、β−サブユニットに存在しくＰＭＳＦ−感受性アミノ酸が、β −サブユニットに存在するという実験結果から確認された）、これが活性部位セ リンであるらしい。このセリンの回りのコンセンサス配列は、−−−−Ｇｌｙ− ＸＸＸ−５ｅｒ＝　・・である。

このセリンの前のグリシンは、全てのセリンヒドロラーセに共通している（ブｏ −（Ｂｌｏｗ）　［１ｔ））。

二つの異なるヒスチジンが、五つの配列（第１４図）に保存されている・Ｈｉｓ ４２およびＨｉｓ７７７゜これらは、すべての配列中の非常に保存性の高い領域 に存在する。しかし、Ｈｉｓ７７７は、部位７６５の推定される活性部位セリン に近いので、その候補ではないようだ。逆に、Ｈｉｓ４２は、α−サブユニット に存在する活性部位ヒスチジンであり、このことは、ヘテロダイマーのみがこの 酵素の活性型であるという実験観察とも一致している（すなわち、β−サブユニ ットのセリンおよびα−サブユニットのヒスチジン）。

提唱されている触媒性トリオの３残基に関して、β−サブユニットには３個の候 補：Ａｓｐ４４ｇ、Ａｓｐ５９０．Ａｓｐ７８０およびα−サブユニットには１ 個の候補：Ａｓｐ３６がある。後者は、提唱されている活性部位Ｈｉｓ４２に近 いが非常に保存性の高い領域の始めに含まれる。同様に、Ａｓｐ７８０は、非常 に保存性が高いが提唱されている活性部位５ｅｒ７６５に近いところに含まれて いる。Ａｓｐ４４８およびＡｓｐ５９０は、両方とも中程度の保存性の領域にあ り、それゆえ、活性部位アスパラギン酸の候補となりうる。

（実施例６） タイプｍＡアシラーゼに基づ（突然変異誘発のための残基の選択本実施例では、 生化学的性質を変えたアシラーゼを得るために変異させるアミノ酸残基を選択す る。これらの性質の変化は、特定のβ−ラクタム抗生物質のアシレージョンおよ び、またはデアシレージョンに関するタイプ■アシラーゼの基質特異性を変え得 る。

この選択に関する基準について概説すると同時に、全ての選択部位を含む第１５ ａ図および第１５ｂ図についても言及する。簡単にするために、示した残基はア ルカリゲネス　フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）のタ イプＩＩＡアシラーセのものである。他のアシラーゼの対応する残基は、第１４ 図の整列させた配列データから見つけることができる。

突然変異誘発のための領域の選択は、以下の規準に基づいて行った。

ｌ）タイプ■アンラーセの基質特異性を変えるために、変異は成熟α−およびβ −サブユニットに限定した。これは、残基２７−２３６　（α−サブユニット） および２６６−８１６（β−サブユニット）を意味し、各々全部で２１０および ５５１残基に関する。

２）ＰｅｎＧの疎水性側鎖を結合するＰｅｎＧ−アシラーゼ（タイプＩＩＡ）の アミノ酸は、タイプＩＩＡアシラーセ中に保存されており、基質特異性が異なる ために、おそらくタイプＪＩＢアシラーセではない。それゆえ、第１４図の配列 において、大腸菌、クルイベラ　シトロフィラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ　ｃｉｔｒｏ ｐｈ基をα−およびβ−サブユニットから選択することが望ましい。

その部位に存在するこの残基が、以下のグループに属する場合、その部位は、類 似するアミノ酸を含むということができる。

ａ）疎水性残基−このグループには、アミノ酸のイソロイシン、バリン、システ ィン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシ ンが含まれる。

ｂ）柔軟なセグメント中に存在する傾向にある、小さな残基−このグループには 、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、プロリン、バリンおよびシスティ ンが含まれる。

Ｃ）極性または荷電残基−このグループには、セリン、スレオニン、ヒスチジン 、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニンおよ びリジンが含まれる。α−サブユニットにおける突然変異誘発として考えられる 部位数は、選択規準により、１６９個（８０％）およびβ−サブユニットに関し ては、４１６（７５％）と限定される。第１５ａ図および第１５ｂ図には、これ らの選択された残基が項目１の欄にまとめられている。この番号は、第１４図に 示されているアルカリゲネス　フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃ ａｌｉｓ）アンラーゼの配列中の各アミノ酸の位置を示している。

３）ＰｅｎＧ−アシラーゼとＰｅｎＧの側鎖との相互作用は、性質から非常に疎 水的であると考えられるので、荷電を持たない保存的または類似するアミノ酸の みを選択すべきであるという仮定に基づいて選ぶことが望ましい。このことは、 グループＣについて先に定義した保存的または類似する組のなかの少なくとも一 個の荷電残基を含むあらゆる選択部位を除外することができる。さらに、この選 択規準は、好ましいアミノ酸部位をα−サブユニットでは１１９（５７％）、β −サブユニットでは３０４（５５％）に限定する。第１５ａ図および第１５ｂ図 では、これらの残基を項目２の欄にまとめである。

４）保存的グリシンおよびプロリンが、触媒的役割よりもむしろ蛋白質の構造的 役割を果たしているという観察に基づき、より好ましいグループを選択する。

選択したアミノ酸から保存的なＧＩＹおよびＰｒｏを除くことで、α−サブユニ ットでは１０２個のアミノ酸（４９％）、β−サブユニットでは２５８個のアミ ノ酸（４７％）からなるより好ましいグループができる。第１５ａ図および第１ ５ｂ図では、項目３の欄にこのグループをまとめである。このアミノ酸のグルー プは、荷電したアミノ酸、保存的グリシンおよびプロリンを除（保存的残基およ び類似的残基からなる。

５）より好ましいアミノ酸のグループは、グルタミン、アスパラギン、スレオニ ン、セリンおよびその他の極性アミノ酸が、疎水的基質の結合には関係しないら しいという仮定に基づいて得られる。さらにこの選択規準を用いて、α−サブユ ニット中の７４個のアミノ酸（３５％）およびβ−サブユニット中の１６２個の アミノ酸（２９％）のグループが得られる。第１５ａ図および第１５ｂ図では、 これらを項目４の欄にまとめである。このグループのアミノ酸は、パラグラフ２ のａ）で述べられているように、同一および類似する疎水性アミノ酸のみから成 り立っている。

６）さらに、変異すべき、または、変異し得るアミノ酸の選択は、タイプＩＩＡ アンラーゼの結合部位が、同一の疎水性アミノ酸からなるという仮定によって行 われる。この事はさらに選択されるアミノ酸の数を減らし、最終的にα−サブユ ニットでは４４個の保存的疎水性アミノ酸（α−サブユニット中の全アミノ酸の ２１％）また、β−サブユニットでは８１個の保存的疎水性アミノ酸（β−サブ ユニット中の全アミノ酸の１５％）からなるグループを作る。第１５ａ図および 第１５ｂ図の第５欄は、この用にして選択したアミノ酸グループを示している。

（実施例７） タイプｎＢアシラーセはアシル部分としてコハク酸、グルタル酸およびアジピン 酸等のジカルボン酸を含む基質に特異的である。このことは、その結合部位が、 、　タイプＩＩＡアシラーセに比べてより極性が高いことを示している。それは 、基質の側鎖のアノル部分のマイナス電荷を補償するプラス電荷を含むこともあ る。これらの特徴は、この基質特異性を示す酵素に保存されていることが期待さ れる。

それゆえ、タイプＩＩＡおよびタイプＩ［Ｂアシラーゼ配列を比較して、タイプ Ｉ［Ａおよびタイプ［ｒＢアンラーゼ配列の両方に保存されているが、マイナス 電荷のアシル部分によりよ（結合するために、極性が変化した領域を探した。

この選択規準を概説すると同時に、全ての選択部位を含む第１６ａ図および第１ ６ｂ図についても言及する。与えられた残基は、タイプＩＩＢアシラーセ５Ｙ− ７７に関するものである。他のアシラーゼの対応する残基は、第１４図の整列さ せた配列データから見ることができる。

タイプｎＢアンラーセに保存されている領域の同定は、タイプＩＩＡアシラーゼ について実施例６で述べた方法で行った。

１）突然変異は、成熟α−およびβ−サブユニットに限定した。これは、残基３ ０−１９８　（α−サブユニット）および１９９−７２０　（β−サブユニット ）に関するものである。

２）実施例６のグループ分けに従って、同一または類似したアミノ酸残基を含む タイプｎＢアシラーセ中のこれらの部位を選択する。選択した残基を第１６ａ図 および第１６ｂ図の項目ｌの欄にまとめた。

３）次の選択は、ＰｅｎＧ−アシラーゼ（タイプＩＩＡアシラーセ）とＰｅｎＧ の側鎖との相互作用が性質として非常に疎水的である一方、グルタリルアシラー ゼについてはプラスに帯電した残基を持ち得るより極性の高い結合部位が考えら れるという仮定に基づいて行われる。それゆえ、タイプＩＩＡおよびタイプＩＩ Ｂ両アシラーセにおいて荷電を示す第１４図の配列中の全ての部位は、省かれる 。タイプＨＡアシラーゼがＡｓｐまたはＧｌｕを示し、かつ、タイプＩｒＢが明 確にマイナスではない荷電残基を示す場合のみ、その部位か維持される。さらに 、この選択の適用は、好ましいアミノ酸部位の番号を限定する。第１６ａ図およ び第１６ｂ図は、項目２の欄にこれらの残基を示している。

４）実施例６で述べたように選択されたアミノ酸グループから、保存されている ＧｌｙおよびＰｒｏを除外することによって選択を行った。このアミノ酸グル、 −プのまとめは、第１５ａ図および第１５ｂ図の項目３に示した。

５）さらに、タイプｎＢグルタリルーＣｅｆアシラーセにおいて、疎水性アミノ 酸は、マイナス荷電のグルタリル側鎖の結合に関係しそうもないと考えて、選択 されるアミノ酸のグループを絞った。したがって、同一または同様の疎水性残基 を含むタイプｎＢアシラーセ内の部位は、ステップ４以後に残ったグループか１ 　ら除外した。第１６ａ図および第１６ｂ図の項目４にこの結果を示す。

６）残った残基グループには、主に極性または荷電残基が含まれる。また、タイ プｍＡおよびタイプｎＢ中の極性残基を含む部位は、表面の残基であり、必ずし も基質結合に関係しないと仮定することにより、変異すべきまたは変異し得るア ミノ酸の選択を行った。それゆえ、これらの残基は、第１６ａ図および第１６ｂ 図のステップ５からは除いた。

７）ステップ７において、タイプＩＩＡアシラーゼ中の対応する部位の残基とは 異なって、マイナスに荷電したグルタリル側鎖と静電的に適合する残基を含む部 位を選択した。特に、突然変異誘発には、タイプＩＩＡでは疎水性で、かつタイ プＩ［Ｂアシラーゼではプラスに荷電している部位を選択した。

（実施例８） アシラーゼ遺伝子のための発現／突然変異誘発ベクターの構築突然変異誘発のた め、プラスミドｐＴｚｌ　９ＧＬ−７Ａを業者の指示にしたがい一本鎖ＤＮＡと して増殖した。ＡＴＧ開始コドンにＮｄｅＩ部位（、ＣＡＴＡＴＧ）を導入する ために、以下のオリゴヌクレオチドを使用した。

ＣＡＧ　ＭＣＴＣＴ　ＣＡＧ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＴＴＴ　ＣＣＣＣＴＣＴＣＡ有 効に部位特異的および領域指定突然変異誘発を行うために、生成した変異体のＮ ｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをプラスミドｐＭｃの誘導体であるｐＭｃ ＴＮｄｅにサブクローン化した（スタンセンズ（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ）　［：２ ２））。

プラスミドｐＭｃＴＮｄｅは、ＲＢＳ部位およびＮｄｅｌクローニング部位の前 にＴＡＣプロモーターをコートするフラグメントを挿入することによりｐＭｃ５ −８　（ＥＰ−Ａ−０３５１０２９）から誘導した（第９図）。

同様に、プラスミドｐＴＺｓＥ５−１を以下のオリゴヌクレオチドで変異させ、 ＡＧＧ　ＴＣＣＡＧＡ　ＣＡＧ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＡＣＧ　ＡＴＧ　ＧＣＧドｐ ＭｃＴＮｄｅに移した。得られたプラスミドｐＭｃＴＧＬ７ＡＮｄｅ　（第１０ 図）およびｐＭｃＴＳＥ５Ｎｄｅ　（第１１図）は、強力な誘導可能なＴＡＣプ ロモーターのコントロール下、各々５Ｙ−７７および５Ｅ−８３グルタリル−Ｃ ｅｆアシラーゼを合成する（デボア（Ｄｅ　Ｂｏｅｒ　［２３］　）。

ＬＢＣ培地中の大腸菌ＷＫ６における発現レベルは、各々２．２および１２．３ ユニット／ｇ−細胞ペレットである。

プラスミドｐＭｃＴＧＬ？ＡＮｄｅの完全なアシラーゼコード領域の配列を決定 した。その結果を第１２図に示す。

（実施例９） ＳＹ−７７アシラーゼの突然変異誘発 プラスミドｐＭａＴＢｄｅＧＬ？ＡをＮｄｅｌおよびＮｃ旦Ｉで消化した。−重 鎖のｐＭｃＴＮｄｅＧＬ７Ａを用いてギヤノブ二本鎖を作り、先に述べた方法で （方法参照）一本鎖状のギャップに酵素的に突然変異を誘発した。この変異体ラ イブラリーを大腸菌ＷＫ６　ＭｕｔＳにトランスホームし、つづいて大腸菌ＨＢ ＩＯＩにトランスホームしてから、５０μｇ／ｍｌのｃａｐを補ったアミノアジ ピルロイシン含有最小プレートで選択した。これらのプレートでは増殖できるが 、最小プレートでは増殖できない（これらはロイシン復帰突然変異体（ｒｅｖｅ ｒｔａｎｔ）のため）コロニーを、セファロスポリンＣに関する酵素活性に関し てテストした。領域指定突然変異誘発のため、アシラーゼのα−サブユニットの 種々の部分をカバーするスパイクトオリゴマーを部位指定突然変異誘発と同じ方 法で取り込ませた（スタンセンズ（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ）［２２）　）。

合成の際に２％の混入を含ませた以下のオリゴヌクレオチドを使用した。各オリ ゴヌクレオチドは、制限酵素認識部位の生成または消失に基づく野生型および変 異型プラスミドの区別を可能にするサイレントな変異を有するよう設計する。

各オリゴヌクレオチドにカバーされる５Ｙ−７７アシラーゼの残基は、括弧内に 示した。

Ａ３２２３７（残基５０−８０） ＧＣＣＣＴＧＧＣＴ　ＧＣＧＣＧＣＣＴＧＧ　ＧＣＣＣＡＧＣＣＡＴ　ＡＧＣＣ ＧＴＡＧ品ＧＧＣＴＧＡＧＧＧＣＧＣＧＴＣＴＡＣＧＣＣＧＴＡＧＡＴＧＴＧ　 ＣＧＧＧＡＣＧＣＣＧ　ＴＡＧＣＣＧＴＣＣＣＡＣＡＧＡＢ２２３３（残基８ｌ −１０９） ＣＣＡ　ＧＡＣＧＧＴＣＧＴＣＴＧＴＴＣＧＴＡＡＴ　ＣＣＧＧＴＣＣＣＣＡ　 ＧＴＡ’Ｉ’ｒＣＧＧＣＣＣＣＣＴＴＧＣＣＣＣＧＣＧＣＴＴＣＴＣＣＡＴＡＣ ＡＧＧＣＧＣＡＧＧＡＴＡＴＴＧＴ　ＣＡＢ２２３４（残基１０９−１３６） Ａ３２２３７（残基１３７−１６４） Ｇ　ＧＣＧＣＣＧＧＡＡＡ　ＣＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＣＣＧＣＡＣＧ　ＴＣ ＧＧｃＣＧＡＧＡＴＧＴＣＧＴＣＧＧＧ　ＧＴＴＣＴＧＣＴＧＣＧＣＡＴＡＧＧ ＣＧＴ　ＴＧＡＴＧＣＣＣＧＣＴＧＣＡＢ２２３６（残基１６５−１９２） ＣＧＧＣＧ　ＧＧＴＣＧＣＣＣＴＣＧＣＣＣＡＧＧＧＴＧ　ＣＧＣＣＣＧＧにＣ Ｇ　ＡＣＧＣＧＡＣＡＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡにＧＣＧＧＴ　ＧＧＧ ＣＧＴＧＧＧＣＣＡＣＣＡＣＧＴＣ各オリゴヌクレオチドに対して、大腸菌ＷＫ ａ　ｍｕｔＳ中ｌＯ５個以上のコロニーの変異体ライブラリーを構築した。これ らのライブラリーをアジピルセリンに関する選択には大腸菌ＰＣ２０５１および アミノアジピルロイシンに関する選択には大腸菌ＨＢＩＯＩにトランスホームし た。３０°ＣＩＯ日で選択されたコロニーを原栄養性への復帰突然変異、および 増殖能力およびプラスミドの存在の関連について調べた。

アジピルセリンに関して良い増殖能を示す変異体を選択した。

これらの変異プラスミドを、α−サブユニットのスパイクトオリゴマーを用いた 次の回の突然変異誘発の原料として用い、続いてアミノアジピルロイシンに関す る選択を行った（大腸菌ＨＢＩＯＩにおけるライブラリーの構築）。

残基１７７．１７８および１７９は、５Ｙ−７７アシラーゼの基質特異性に関し て重要であることが分かつているので、タープ・ソテイトラじダム突然変異誘発 法を使用した。この目的のため、残基１７６．１７７．１７８，１７９および１ ８０に関するターゲノティドランダム突然変異誘発用の混合オリゴヌクレオチド を合成した。

ＮＮＮ　ＮＮＮ　ＧＴＴ　ＣＡＴ　ＣＡＧ　ＧＣＧ　ＧＴＧ　ＧＧＣＧＴＧ　Ｇ ＧＣ領域６０−６４についても次のオリゴヌクレオチドを用いた同様の方法を応 用した ＡＴＡ　ＧＣＣＧＴＡ　Ｇ晶ＧＧＣＴＧＡ　ＧＧＧ　ＮＮＮ　ＮＮＮ　ＮＮＮＮ ＮＮ　ＮＮＮ　ＧＡＴ　ＧＴＧ　ＣＧＧ　ＧＡＣＧＣＣＧＴＡ　ＧＣＣ１０６個 の変異体のライブラリーを、上記のオリゴヌクレオチドを用いて大腸菌ＨＢＩＯ Ｉに構築し、アミノアジピルロイシンプレート上で選択した。

また、同様のギャップ二本鎖分子についても下記のオリゴヌクレオチドを用いた ターゲラティドランダム突然変異誘発を行った：ＧＣＴ　ＧＣＧ　ＣＧＣＣＴＧ 　ＮＮ’Ｎ　ｒ　ＧＣＣＭキＧＣＣＮ’Ｎ’Ｎ　ＧＡＡ　ＮＮＮ　ＴＧＡ　ＧＧ Ｇ　ＣＧＣＧＴにれにより、５Ｙ−７７アシラーゼのアミノ酸部位６７．６９， ７１．７３および７４について、２０種金石のアミノ酸への置換が起きる。１０ ７個の変異体ライブラリーを構築し、アミノアジピルロイシンプレートで選択し た。

α−サブユニットについて先に述べた方法を５Ｙ−７７アシラーゼβ−サブユニ ットから選択した領域に応用した。先に述べた配列比較および選択規準に基づき 、以下の領域を下記のオリゴヌクレオチドを使用したスパイクトオリゴ突然変異 誘発用に選んだ・ ＡＢ２３９９（残基２５３−２７７） 入ＴＡＧＴＴＧＧＴＧ　ＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡ　ＴＧＣＣＧＴＴＡＡＣＧＧＴＡ ＴＴＧＧＴＧ　ＡＴＧＣＣＣＡＴＣＣＧＣＴＧＧＴＴＧＡＡ　ＧＧＣＧＡＡＧＣ ＧＧ　ＡＴＧＡＣＡＢ２４００（残基３７５−３９９） ＣＴＣＧＧＣＣＣＧＴＴＴＧＧＧＣＧＣＣＡＣＧＣＣＧＴ　ＴＧＡＡＧＣＴＧＴ Ａ　ＧＴＴＧＡＴＧＧＴＡＣＣＴＴＣＧＣＧＧＴ　ＣＧＧＣＧＴＡＧＡＣＧＡＴ ＧＴＴＧＡＡＡＢ２４０１（残基４１５−４４２） ＡＴＴＧＧ　ＭＴＴＣＴＧＣＡＣＧＭＧＣＣＧＣＣＣＧＧＣＧＧＡＴＴＧＧ　Ｔ ＧＡＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＡＴＣＧＴＣＣＡＧＣＧＧＧＴＧＴＧ　ＴＣＴＣＧＧ ＴＣＣＡ　ＣＡＧＧＴＡＡＣＧＡＢ２４０２（残基５０５−５２９） ＣＡＧＣＡＧ　ＧＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＴ　ＣＧＧＧＡＴＣＧ ＧＧ　ＡＴＣＧＡＴＣＡＧＧＧＣＧＧＣＣＧＧＧＡ　ＴＣＡＧＧＴＣＣＧＧ　Ｃ ＡＡＧＧＴＧＣＧＡＢ２４０３（残基６６１３−６９５）ＧＴＣＧ　ＧＣＧＣＧ ＣＧＡＣＡ　ＣＧＣＧＴＴＣＧＡＴ　ＣＴＧＡＴＣＧＣＴＧ　ＴＡＧＴＧＣＧＴ ＣＧＴＧＣＣＣＧＧＧＴＧ　ＧＣＧＡＧＡＧＴＴＧ　ＣＣＧＴＡＧＣＴＣＡ　Ｔ ＣＡＧＧＣＣＡＴＡこれらのオリゴヌクレオチドを用いて、β−サブユニットの 特異的領域に関する変異体ライブラリーを構築し、アンビルセリンまたはアミノ アジピルロイシンに関して選択を行った。

オリゴＡＢ２４０３は、触媒性セリン残基の候補として他のＡ、フェカリスＰｅ ｎ−アシラーゼおよび５Ｙ−７７アシラーゼとの配列比較に基づいて同定された ５ｅｒ６７４付近の領域を含んでいる。この領域付近の変異は、触媒部位に近く 、基質特異性を変化させる可能性が高い。

（実施例１０） アンビルセリンに対する特異性が増加した５Ｙ−７７アシラ一ゼ変異体変異体を セリン要求性の大腸菌にトランスホームし、唯一の炭素源としてアジピルセリン を含む最小培地で増殖し得る能力で選択した。野生型５Ｙ−７７グルタリルアシ ラーセを含む細胞は、このような培地では余りよ（増殖できない。

１４日間でも有意なコロニーは出現しなかった。１４日間で出現したコロニーを プレートから選択し、それらがプレートからアジピルセリンを除いた場合増殖し ないことを確認した。次に、選択したコロニーからプラスミドＤＮＡを単離し、 本来の大腸菌にトランスホームした。このトランスホーマント細胞は、アジピル セリンを含む選択培地で増殖することが確認された。以下に示す変異体が得られ た：Ｖ６２Ｌ、Ｙ１７８Ｈ，Ｖ１７９ＧおよびＬ１７７＋Ｙ１７８Ｈ。

基質としてグルタリル７−ＡＣＡ、グルタリルロイシンおよびアジピルセリンを 用いて、野生型５Ｙ−７７グルタリルアシラーゼおよび変異体５Ｙ−７７グルタ リルアシラーセを検定した。この基質の加水分解は、３７８ｎｍの蛍光で７−Ａ ＣＡ、ロイシンまたはセリンの放出を測定することにより追跡した。グルタリル セリンおよびアジピルセリンを用いた活性検定では、グルタリル７−ＡＣＡに関 するそれらの活性に応じて変異型および野生型酵素を添加した。第１７図−第１ ９図は、与えられた酵素によるアジピルセリンの加水分解速度を示している。

加水分解は、放出されたセリンとフルオレサミンとの反応による３７８ｎｍの吸 収の増加を経時的に測定することにより追跡した。この変異体は、野生型の５Ｙ −７７グルタリルアシラーセよりもアジピルセリンに関して３−５倍高い活性を 示した。アジピルセリンが唯一の炭素源であるとき、野生型は非常にゆっくりと 増殖するので、この５Ｙ＝７７アシラ一セ変異体は、この基質に関してより高い 特異性を示すと結論し得る。

グルタリルロイシンについてアジピルセリンと同様の操作を行い、変異型と野生 型の活性を比較した。グルタリルロイシンは、突然変異がアシル側鎖またはβ− ラクタム部分またはアミノ酸のような相補的側面に対する特異性に影響するかど うかをチェックするのに適した基質である。もし変異がアシル側鎖に対する特異 性に影響するなら、野生型および変異型グルタリルロシンーセの活性はグルタリ ル７−ＡＣＡおよびグルタリルロイシンのような基質に対して同様な傾向を示す であろう。この検定では、酵素がそのグルタリル？−ＡＣＡ活性に応じて添加さ れるために、このことは、グルタリルロイシンに関する活性が変異体と野生型で 非常に似ていることを意味している。事実、実験誤差範囲で、全ての変異体は野 生型と一致しており、この事はこの変異がアシル側鎖に対する特異性に影響して アジピル部分に対する特異性を特異的に増加させていることを示している。

（実施例１１） Ｎｄｅの領域指定およびターゲラティドランダム突然変異誘発を行った。５Ｅ− ８３のアミノ酸部位３０−５０をカバーする“スパイクト”オリゴマーを使用し た。

ＴＲＭ突然変異誘発は、以下のオリゴヌクレオチドを使用した・ＡＡＧ　ＧＣＧ 　ＧＴＣＩ　ＮＮＮ　ＮＮ’Ｎ　ＧＡＣＮＮ’Ｎ　ＧＣＣＮＮＮ　ＣＧＣＮＮＮ 　ＡＴＡ　ＮＮＮ　ＡＴＣαＸ：　ＣＴＣＣbＧ 別のＴＲＭ突然変異誘発は、５Ｙ−７７アシラーセの領域１７６−１８０と相同 的な領域に関して行った。以下に示すミックストオリゴヌクレオチドを使用した 。

ＣＣＡ　ＣＡＧ　ＣＴＴ　ＣＡＡ　ＣＣＡ　ＧＡＣＧＧＡ　ＮＮＮ　ＮＮＮ　Ｎ ＮＮ　ｔＪＮＮ　ＮＮ’Ｎ　ＣＡＧＣＣＧ　ＣＣＧ　ＣＡＴ　ＣＡＣＧＧＣＧＣ Ｃギヤツブは酵素ＮｏｔＩおよびＳｍａ　Ｉを用いて生成した。このギャップ二 本鎖を５Ｅ−８３のアミノ酸部位７３０−８４６をカバーするスパイクトオリゴ ヌクレオチドを用いて変異させた。ＴＲＭ突然変異誘発は、以下のオリゴヌクレ オチドを用いて行った。

ＣＡＣＣＡＴ　αＺ　ＧＣＡ　ＮＮＮ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＮＮＮ　ＮＮＮ　Ａ’ ＩＴ　ＣＴＧ　ＧＴＣＧＧＣ変異体は、アミノアジピルロイシンまたはアミノア ジピルアミド寒天プレートで選択した。

（実施例１２） 一ンにおいて、以下のオリゴヌクレオチドを用いてＡ、フェカリス遺伝子の開始 部位にＮｄｅＩ部位を構築した Ｇ　ＣＣＣＴＴＴ　ＣＴＧ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＴＧＴ　ＣＣＣＴＴＡ　ＴＴＴ　 ＴＴＡこの変異体のＮｄｅＩ消化後プラスミドｐＭａＡＦｎｄｅを構築した。Ｂ ａｍＨｌによる線状化後、−重鎖ｐＭｃＡＦＮｄｅを含むギャップ二本鎖を調製 した。

領域３７−４６をカバーするスパイクトオリゴマーを領域指定突然変異誘発に使 用し、大腸菌ＷＫ６　Ｍｕｔｓ続いて大腸菌ＨＢＩＯＩに転移後、１０　ｕ　ｇ ／ｍＩグルタリルロイシンおよび５０Ｂｇ／ｍＩ　ｃａｐを含む最小プレートで 変異体ライブラリーを選択した。これらのプレートで増殖する（最小プレートで は増殖しない）コロニーのグルタリルセファ０スポリンに関する活性をテストし た。

Ａ、フェカリスの領域５１−７２をカバーするオリゴマーを用いた同様の実験を 行った。

同様のギャップ二本鎖分子に関して以下のオリゴヌクし・オチドを用いたターゲ ラティドランダム突然変異誘発を行ったーＣＡＧ　ＡＣＧ　ＧＴＣＴＴＧ　ＮＮ Ｎ　ＮＮ’Ｎα；ＣＮＮＮ　ＡＣＣＮＮＮ　ＧＣＣＮＮＮ　ＡＴＡＮＮＮ　ＧＣ ＣＡＴＡ　ＧＴＧＧＣｒ このオリゴマーを使用すると、部位５１．５３，５５，５７．５９および６゜、 の２０種類全てのアミノ酸への置換が起こる。別のＴＲＭを５Ｙ−７７７シラー セの部位１７６−１８０に相同的な領域に関して、以下のミックストオリゴヌク レオチドを用いて行った ＴＩ’ＣＣＡＧ　ＡＴＴ　ＣＧＴ　ＧＴＣＧＧＡ　ＮＮＮ　Ｎ’ＮＮ　ＮＮＮ　 ＮＮＮ　ＮＮＮ　ＧＧＡ　ＧＣＣＣＡＣＣＣＡ　ＣＪｔＴ　bＡＴ １０’個の変異体からなる変異体ライブラリーが構築され、アミノアノビルロイ シンまたはグルタリルロインンプレートで選択した。

別の実験では、Ｎｒｕ　ＩおよびＭｌｕＩを用いたギャップ二本鎖を作成した。

このギャップ二本鎖をアミノ酸部位７６１−７９０をカバーする“スパイクト” オリゴヌクレオチドで変異させた。この変異体ライブラリーを各々グルタリルロ イシンおよびアミノアジピルロイシンで選択した。

（実施例１３） 大腸菌アシラーゼの突然変異誘発 プラスミドｐＵＮＮＥｃｌの挿入物を制限酵素部位旦工旦ｄＤＩおよびＳｍａ　 Ｉを用いてベクターｐＴＺ１８にサブクローン化した。以下の特異的オリゴヌク レ、オチドを用いて、開始コドンにＮｄｅＩ部位を作成したＴＣＴ　ＡＴＴ　Ｔ ＴＴ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＡＴＣＣＴＣＴＧＧ　ＣＡＧそれからアシラーゼ遺伝子 を制限酵素ＮｄｅＩおよびＳｍａ　Ｉを用いてプラスミドｐＭａＴＥＣＮｄｅに サブクローン化した。このプラスミドを大腸菌アシラーゼのアミノ酸５３−７４ をカバーする“スパイクト”オリゴヌクレオチドを用、いて変異させ、実施例９ に述べた方法で選択した。

大腸菌Ｐｅｎ−アシラーゼのＴＲＭは、５Ｙ−７７アシラーゼの部位１７６−１ ８０に相同的なミックストオリゴマーを用いて行った。使用したオリゴマーを以 下に示す ’ＩＴＣＧＣｒ　ＡＧｒ　ＧＣｒ　ＡＴＣＡＧＡ　ＮＮ’Ｎ　ＮＮＮ　ＮＮＮ　 ＮＮＮ　ＮＮＮ　ＧＧＴ　ＧＣＣＣＡＣＡＡＡ　ＴＡＴ　Ｃ`Ｔ 本明細書で述べている特許および特許出願を含む全ての刊行物は、当業者を対象 としている。本明細書で引用している全ての刊行物は、個々に参考として引用し ていることを記述しているのと同様に参考として引用している。

先に示した内容では、より良く理解されることを目的として図式および実施例を 用いて詳細に説明しているが、請求の範囲の精神および範囲を逸脱することなし に、本発明の変化および修正を行い得ることは当業者にとって明白である。

たとえば、選択した変異体は、上述のいずれかの方法およびいずれかのスパイク トオリゴマーを用いた連続的突然変異誘発に使用し得るっまた、単一の突然変異 誘発実験に二つ以上のスパイクトオリゴマーを用いることも、本発明の範囲に入 る。

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Ｅｃｏｎｏｍｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　５　（１９８０）　４６７−５ ５２．　Ａｃａｄ、Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗｏｒｋ ４、０１ｌｓｏｎ　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖ、　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ、　４９　（１９８５）　１ｏｓ４５、５ｈｉｂｕｙａ　Ｙ、　ａｔ　 ａｌ、、　Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈａｍ、　４５　（１９８１）　１５ ６１−１５６７６、　Ｍａｔｓｕｄａ　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔ ｅｒｉｏｌ、　１６９　（１９８７）　５８１．５−５８２０７、　Ｗａｌｔｏ ｎ　Ｒ，Ｂ、、　Ｄｅｖｅｌ、工ｎｄ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　ｊ　（１９６ ４）　３４９−３５３８−　Ｍａｈａうａｎ　Ｐ、Ｂ、、Ａｐｐｌ、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、ｌ　（１９８４）　５３７−５５：１９、　Ｍａ ｙｅｒ　ｅｔ　ｄ、＋　Ａｄｖ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　）　（１９Ｂ２） 　Ｂ５−８６１０、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ　ｅｔ　ａよ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、ユ４　（１９８６）　５７１３−５フ２７１１　Ｂａｒｂｅ ｒｏ　Ｊ、Ｌ、　ａｔ　Ｍｌ、、　Ｇｅｎｅ　４９　（１９８６）　６９−８゜ １２、　Ｄａｕｍｙ　Ｇ、Ｏ，ｅｔ　Ｑ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　ｍ （１９８５）　１２７９−１２８１１３、　Ｄｉｃｋａｒｓｏｎ　Ｒ，Ｅ、＆　 Ｇａ１ｓ　工、ｉｎ　”Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ”、Ｅｄ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ　ａ ｎｄＣｕｍｍｉｎｇｓ　（１９８３）、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ　ＣＡ、　ＵＳ Ａ１４、　Ｂｌｏｗ　Ｄ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３４３　（１９９０）　６９４− ６９５１５、　Ｗｉｎｋｌｅｒ　Ｆ、に、　ｅｊ−ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３ Ｑ　（１９９０）　７７１−７７４１６、　Ｂｒａｄｙ　Ｌ、　ａｔ　ａｌ、、 　Ｎａｔｕｒｅ　３４３　（１９９０）　７６７−７７０ｘ７．　Ｍａｎｉａセ ｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、″Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２／ １９８９１８、Ａｕ５ｕｂｅｌ　ｅｔ　Ｍ、、”Ｃｕｒｒｅｎセ　Ｐｒｏｔｏｃ ｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、工ｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　 １９８７１９、　Ｐｅｒｂａｌ　Ｂ、、”Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ 　Ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋１．　２ｎｄａｄ、、　Ｊｏｈ ｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、工ｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８ Ｂ２０、Ｎｉ１ｓｓｏｎ　ｅｔ　ａよ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、Ｊｌ　（１９８コ）　８０１９・２１．　Ｒｅｙｅｓ　Ｆ、　ａｔ　ａＪ、、 、　Ｊ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　４１　（１９８９）　１３６ −１３７２２、５ｔａｎｓｓｅｎｓ　ｅｔ　Ｂ１．、　ＮｕｃｌｅＩＣＡｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、　旦（１９８９）　４４４１２３、Ｄａ　ＢＯｅｒ　ｅｔ　ａよ、 、ＰｒｏＣ，Ｎａａｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　β１０　（１９８３ン　２ １−２５２４、　Ｈａｒｍｅｓ　絋ｊ１１．　Ｇｅｎｅ　８４　（１９８９）　 １４３（５１２５、Ｌａｅｔｈｏｖａａｒａ　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｔｅｉｎ 　Ｅｎｑ、　Ｋ　（１９８９）　１４３−１５１−４　２６．　Ｇａｒｃｉａ　 ｅｔ　Ａよ、、Ｊ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、３　（１９８６）　１８７−１９５２７、 　Ｓａｎｇ−Ｊｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　５６　（１９８７）　８７− ９７２Ｂ、Ｍｅｅｖｏｏセエｓｏｍ　ｅｔ　ａよ、、Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉ ｏｌ、Ｂｉｏｔａｃｈｎｏｌ、、２５　（１９８７）２９、Ｍａｔｓｕｄａ　Ａ 、ａｔ　５！１．、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６３　（１９８５）１２２２− １２２８３０、Ｍａｔｓｕｄａ　Ａ、ｅｔ　ｊａ、、Ｊ、Ｂａｃヒａｒｉｏ１． 　１６９　（１９８７）　５Ｂ２１−５８２６コＬ　Ｂｒｕｎｓ　Ｗ、ｅｔ　Ａ よ、、Ｊ、Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、Ｇｅｎ、３　（１９８５）　３６−４４３２、 Ｕｎｄｅｒｆｒｉｅｎｄ　Ｓ、ｅｔ　Ｂ１．．５ｃｉｅｎｃｅ　１７Ｂ　（１９ ７２）８７１−８７２コ３．　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｊ、Ａ、ｅｔ　Ｂ４．、Ｊ、 Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、９Ｂ／ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　（１９８５）ｐ、９ ９．ｎｏ、６５６ ３４、　Ｆｏｒｎｅｙ　Ｌ、、７．　ａｔ　ム、、Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５５　（１９８９）３５、　Ｆｏｒｎｅｙ　Ｌ、Ｊ、ｅｔ 　ａｌ、、Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５５　（１９８９ ）３６、Ｌｅｕｎｇ　Ｄ、Ｗ、ａｔ　ａｌ、、　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　１　（１ ９８９）　１１入　ＬＳＫＤＥＲＤ　工　Ｆ　ＲＧ　Ｙ　Ａ　Ｄ　Ｇ　Ｙ　ＩＩ 　Ａ　Ｙｒ工ＧＵＲＥ　５ ヨユ ｒ工ＧＵＲＥ　５　（ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ）シ１ Ｆ工ＯＲＥ　５　（Ｃｏ酊工■圧Ｄ） Ｆ工ＧＵＲＥ　５　（ＣＯＮＴＩＮＵＥＤ）ｒｉｇｕｒｅ　ｓ ｒ工ＧＵＲＥ　９ Ｆ工Ｇｔ７ＲＥ　１２ ＳＷＡＶＡＰ（ｉＫＴＡＮＧＮＡＬＬＬＱＮＰ１！　Ｌ　Ｓ　Ｗ　Ｔ　Ｔ　Ｄ　 ＹＦ　Ｔ　Ｙ　ＹＥ　Ａ　ＨＬ　Ｖ　Ｔ　Ｐ　ＤＦ　Ｅ　Ｘ　Ｙ　Ｇ　Ａ　Ｔ　 Ｑ　工（：　Ｌ　Ｐ　Ｖ　工ＲＦ　Ａ　Ｆ　Ｎ　ＱＰ、Ｍ　ＣＩ　Ｔ　ｌｉ　Ｔ 　Ｖ　Ｎ　ＣＭ　Ｖ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｎ　Ｙ　ＲＬ　Ｔｒ工Ｇ田ε　１３ コラ−９６１９７：　９８１　９９１　１ｃ０二ニー　−：ＡＳＦ−へＣ：：’ ニーＳＳ：ＴＡＴＣＴ’：τＡτＣＡＣＣＣＴＣＡＣσ丁ご；０００２３７７２ 口ＡＧＣＣＣ：Ｃｗ７−ＡＧb：： ＦＩＧＵＲＥ　１３　（ＣＯＮＴ工ＮＵＥＤ）ＦＩＧＵＲＥ　１３　（ＣＯＮＴ 工ＮＵＥＤ）タイプ−■アノラーゼの整列化 Ｆｉｇｕｒｅ　ユ４ Ｂ−サブユニット Ｆｉｇｕｒｅ　１４　（ｃｏｎｔｉｎｕａｄｌＦ’ｉｇｕｒｅ　１４　（ｃｏｎ ｔｉｎｕｅｄ）Ｔｉｍｅ　（ｈｏｕｒｓ） ｗｌｌｄ　ｔｙｐａ　”””’　Ｖａｌ　６２　ＬａｕＦ工ＧＵＲΣ　１５ ゜ヘ　フェカリスα−サブユニットに３けるアミノ酸残基の１択Ｆｉｇｕｒｅ　 １ｓａ Ｆｉｇｕｒｅ　１５ａ　（ｃｏｎｔｉｎｕａｄｌＡ　フェカリスβ−サブユニッ トにお１するアミノ酸残基の選択各行の番号の前にある１文字コードはアルカリ ゲネスフェカリスタイプ−ＴＩＡ７’ｚラーゼにおけるアミノ酸を表わしている 。

Ｆｉｇｕｒｅ　１５ｂ Ｆｉｇｕｒｅ　１５ｂ　（ｃｏｎｔｉｎｕａｄｌＦｉｇｕｒｅ　１５ｂ　（ｃｏ ｎｔｉｎｕａｄｌＦｉｇｕｒｅ　１５ｂ　（ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ）Ｔｉｍｅ　（ ｈｏｕｒｓ） ｗｌｌｄ　ｔｙｐａ　−”’　Ｔｙｒ　１７８　Ｈｉｓ　Ｖａｔ　１７９　Ｇｌ ｙｒ工ＧＵＲＥ　１６ ＳＹ−７７α−サブユニットにおけるアミノ酸残基の選択選　択　１　：　同一 および類似残基　１０８　（６４＆）（疎水性＋荷電性＋極性） 選　択　２　二　同一および類似残基　８７　（５１％）選　択　３　：　同一 および類似残基　７６　（４５４）（選択２　引くことの保存的ＧｌｙおよびＰ ｒｏ）選　択　４　：　同一および類似残基　２３　（１４ｔ）（選択３　引く ことの同一および類似疎水性残基）選　択　５　：　同一および類似残基　９　 （５ル）Ｆｉｇｕｒｅ　１６ａ Ｆｉｇｕｒｅ　ｉ６ａ　（ｃｏｎｔｉｎｕｅｄｌ旦ＬユＬ辷ヱ△ミヱ坦し旦虹１ 」鴫員り膵−一残基数 選　択　１　：　同一および類似残基　３２３　（６２１）（疎水性＋荷電性＋ 極性） 選　択　３　：　同一および類似残基　２２５　（４３１１（選択２　引くこと の保存的ＧＩＹおよびＰｒｏ）遺　択　４　：同一および類似残基　８０　（１ ５１１（選択３　引くことの同一および類億疎水性残基）Ｆｉｇｕｒ＠１６ｂ Ｆｉｇｕｒｅ　１６ｂ　（ｅｏｎｔｉｎｕｅｄ）Ｆｉｇｕｒｅ　１６ｂ　（ｃｏ ｎｔｉｎｕｅ４１Ｆｉｇｕｒｅ　１６ｂ　（ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ１３７８ｎｍに おける吸光度 Ｆｉｇｕｒｅ　１７ ７８ｎｍにおける吸光度 時間（ｈ） 一野生型　−−Ｔｙｒ　１７８　Ｈｉｓ　Ｖａｔ　１７９　ＧｌｙＦｉｇｕｒｅ 　１Ｂ 時間（ｈ） 一野生型　””・・’　Ｔｙｒ１７８ＨＩｓ　Ｌｅｕ１７７１１ａ　−Ｔｙｒ１ ７８Ｈ１ｓ’Ｉ’４　ｒｒｕｙｅｈ　１６ 基質特異性が変化した新しいβ−ラクタムアシラーゼ変異体が提供される。これ らのβ−ラクタムアシラーゼは、野生型β−ラクタムアシラーゼとは少なくとも 一つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する該β−ラクタムアシラーゼをコー ドする遺伝子を発現させることにより得られる。

ＯｒＴ／１ｌｌＱｌｎｎｎＣ’）

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．変異体β−ラクタムアシラーゼをコードする遺伝子の発現により得られ、か つ、野生型β−ラクタムアシラーゼとは少なくとも一つのアミノ酸が異なるアミ ノ酸配列を有する変異体β−ラクタムアシラーゼで、変化した基質特異性を示す ことを特徴とする変異体β−ラクタムアシラーゼ。
2. ２．前記野生型アシラーゼがタイプＩＩ酵素である請求項１記載の変異体β−ラ クタムアシラーゼ。
3. ３．前記野生型アシラーゼが、大腸菌、クルイベラシトロフィラ（Ｋｌｕｙｖｅ ｒａｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ）、アルカリゲネスフェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ ｅｓｆａｅｃａｌｉｓ）またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に由 来する請求項１または２記載の変異体β−ラクタムアシラーゼ。
4. ４．第１５ａ図または第１５ｂ図に示した一つ以上の部位に、少なくとも一つの 突然変異を含むことで野生型タイプＩＩＡ酵素とは異なる請求項１乃至３のいず れか１項記載の変異体β−ラクタムアシラーゼ。
5. ５．第１６ａ図または第１６ｂ図に示した一つ以上の部位に、少なくとも一つの 突然変異を含むことで野生型タイプＩＩＢ酵素とは異なる請求項１乃至３のいず れか１項記載の変異体β−ラクタムアシラーゼ。
6. ６．前記野生型アシラーゼが、アルカリゲネスフェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ ｅｓｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ１９０１８株に由来する請求項１乃至４のいず れか１項記載のβ−ラクタムアシラーゼ変異体。
7. ７．前記野生型アシラーゼが、シュートモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＥ −８３ＡｃｙＩＩまたはＳＹ−７７に由来する請求項１乃至３および５のいずれ か１項記載の変異体β−ラクタムアシラーゼ。
8. ８．シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＳＹ−７７における６２，１７ ７，１７８および１７９に対応する部位の一つ以上に少なくとも一つの変異を有 する先に示した請求項のいずれか１項記載の変異体β−ラクタムアシラーゼ。
9. ９．請求項１乃至８のいずれか１項記載の変異体アシラーゼをコードするＤＮＡ 配列。
10. １０．請求項９記載のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。
11. １１．請求項１０記載の発現ベクターでトランスホームした微生物宿主株。
12. １２．前記宿主株が原核生物である請求項１１記載のトランスホームした微生物 宿主株。
13. １３．前記宿主株がセファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）また はペニソリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）である請求項１１記載のトランスホ ームした微生物宿主株。
14. １４．変異体アシラーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターでトラ ンスホームした微生物宿主株を増殖させて前記変異体アシラーゼを生産し、該酵 素を回収することからなる請求項１乃至９のいずれか１項記載の変異体アシラー ゼ酵素の調製方法。
15. １５．タイプＩＩアシラーゼ酵素に変異を起こし、かつ、該変異に由来する該酵 素の活性の変化を検定することを含む方法。
16. １６．前記アシラーゼ酵素が、大腸菌、クルイベラシトロフィラ（Ｋｌｕｙｖｅ ｒａｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ）、アルカリゲネスフェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ ｅｓｆａｅｃａｌｉｓ）またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に由 来する請求項１５記載の方法。
17. １７．前記アルカリゲネスフェカリス株がＡＴＣＣ１９０１８株である請求項１ ６記載の方法。
18. １８．前記シュードモナスがＳＥ−８３ＡｃｙＩＩまたはＳＹ−７７である請求 項１６記載の方法。
19. １９．前記タイプＩＩＡアシラーゼ酵素中、第１５ａ図または第１５ｂ図に示し た一つ以上の部位に、少なくとも一つの突然変異を起す請求項１５乃至１８のい ずれか１項記載の方法。
20. ２０．前記タイプＩＩＢ酵素中、第１６ａ図または第１６ｂ図に示した一つ以上 の部位に、少なくとも一つの突然変異を起す請求項１５乃至１８のいずれか１項 記載の方法。
21. ２１．シュードモナスＳＹ−７７における６２，１７７，１７８および１７９に 対応する一つ以上の部位に、少なくとも一つの突然変異を起す請求項１５乃至２ ０のいずれか１項記載の方法。
22. ２２．望ましい活性変化を有する選択アシラーゼ変異体の製造及びその後の請求 項１５記載のその同定を含む方法。
23. ２３．アシレーションまたはデアシレーションに用いたとき、対応するタイプＩ Ｉの野生型アシラーゼと比べて少なくとも一つの望ましい活性変化を有する変異 体β−ラクタムアシラーゼを得る方法で、目的のアシラーゼをコードするクロー ン化した遺伝子またはそのフラグメントに突然変異を起し変異体アシラーゼ遺伝 子を得、該変異体アシラーゼ遺伝子を宿主株に導入し、トランスホームした宿主 株を得、 該トランスホーム宿主を増殖し、該変異体遺伝子を発現させて変異体アシラーゼ を生産させ、 アシレーションまたはデアシレーション反応について少なくとも一つの望ましい 活性変化を示す一つ以上の変異体アシラーゼを同定する各ステップを含む方法。
24. ２４．アシレーションまたはデアシレーション工程における、請求項１乃至２３ のいずれか１項記載の一つ以上の変異体β−ラクタムアシラーゼの使用。
25. ２５．β−ラクタム化合物の生産における請求項１乃至２３のいずれか１項記載 の一つ以上の変異体アシラーゼの使用。