JP4080542B2 - 突然変異ペニシリンgアシラーゼ - Google Patents
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Description
本発明は、タイプIIペニシリンGアシラーゼをコードする突然変異遺伝子、特性の改変をもたらすこれらの遺伝子によってコードされたペニシリンGアシラーゼ、およびこれらのペニシリンGアシラーゼを用いるβ−ラクタム抗生物質の合成法に関する。
背景技術
今日では、半合成β−ラクタム誘導体、たとえばアンピシリン、アモキシリン、セファレキシン、セファドロキシルおよびセフプロジル(cefprozil)は、工業規模で、化学的方法によって製造される。これらの抗生物質の、酵素で触媒される合成は、工業的重要性の可能性のある酵素反応の明らかな一例を構成する。酵素アプローチは、従来の化学的方法と比較して幾つかの利点を有し、すなわち、
(1)毒性試薬および溶媒の回避;(2)抗生物質核中のカルボキシル基の保護を不要にする酵素の特異性;(3)ラセミ化を含む副反応の回避が挙げられる。
この点について、ペニシリンGアシラーゼは優れた利点を付与する。ペニシリンGアシラーゼとは、ペニシリンGアミダーゼまたはベンジルペニシリン・アミドヒドロラーゼ[EC.3.5.1.11]とも称せられ、下記式IおよびIIのペニシリン類の6−アシル基またはセファロスポリン類の7−アシル基を加水分解して、それらの対応する遊離アミン体(式IIIの6−APAおよびその誘導体;および式IVの7−ACAおよびその誘導体)とすることができる、微生物、特に細菌由来のヒドロラーゼの群を指称する。
(式中、R1はフェニルアセチル、フェノキシアセチル、ヒドロキシフェニルグリシン、フェニルグリシンおよびその誘導体、アセチル、アジピルおよびその誘導体;
R2,R3はO、S、N原子の1つ以上を有するまたは有しない脂肪族または芳香族基;
R4はO、S、N原子の1つ以上を有するまたは有しない脂肪族または芳香族アルコール残基およびその誘導体である)
好ましいアシル基はフェニルアセチルであるが、他の芳香族および脂肪族(疎水性、または荷電/極性)のアシル基も、種々の程度(一般に小)に加水分解することができる。種々のアシル基の選択は、逆反応、すなわち該アシル基と6−APAおよび7−ACA(式IIIおよびIV)のアミド結合の形成を考えれば、必ずしも正確でない。たとえば、クロロアセチル基はほとんどの芳香族アシル基よりもはるかに速く7−ACAに付けることができる(特許JP08000284−A)。現在注目されている多くのβ−ラクタム抗生物質の場合、アシル基は疎水性の程度が異なる芳香族基である。野生(wild)型ペニシリンGアミダーゼは、これら抗生物質の半合成(アミド結合形成)を触媒することができるが、該抗生物質の産生を適当なもしくは経済的な条件下では、反応はめったに終了まで進まない。これらの反応の産生収率および効率の改善が多いに望まれる。
基質特異性の改変または触媒活性の変化を示す、改変したアミノ酸残基を含有するペニシリンGアシラーゼの文献に、多くの報告がなされている。プリエトらは-[I.プリエトらの「Appl.Microbiol.Biotechnol.」(33、553−559、1990年)]、K.シトロフィラ(citrophila)由来のペニシリンGアシラーゼのMet168をAla,Asp,Val,Asn,およびTyrに代えて、ペニシリンGおよびペニシリンVの動的パラメーターの修飾をもたらし;AsnのLys375へまたはTyrのHis481への置換はしなかった。マーチンらは[J.マーチンおよびI.プリエトの「Biochimica et Biophysica Acta」(1037、133−139、1990年)]、Met168をAlaに変えたときの、異なる基質特異性を持ちかつ熱的安定性の高いペニシリンGアシラーゼの変異体を記載している。Wang Minらは[Wang Minらの「Shiyan Shengwu Xuebao」(24、51−54、1991年)]、E.coliペニシリンGアシラーゼのSer177のGly,Thr,Leu,Argへの置換を報告し、これら変化の全ては不活性酵素をもたらした。Kyeong Sookらは[Kyeong Sookらの「Journal of Bacteriology」(174、6270−6276、1992年)]およびSladeらは[Sladeらの「Eur.J.Biochem.」(197、75−80、1991年)]、Ser290がE.coli由来のペニシリンGアシラーゼの必須アミノ酸残基であることを証明した。Ser290のCysへの置換は、酵素を完全に不活性にした。Niersbachらは[Niersbachらの「Biotechnology Letters」(17、1:19−24、1995年)]、E.coli由来のペニシリンGアシラーゼにおいて、Gly359をアスパラギンに置換した。突然変異酵素は、ペニシリンGを加水分解する能力を失うが、新たにフタリル−L−ロイシンやフタリル−グリシル−L−プロリンを加水分解する能力を示した。アルカリ性pHでの高い安定性は、Trp431をArgに変えたとき、E.coli由来のペニシリンGアシラーゼの部位−特異的(site-directed)突然変異体によって証明された[ガブリエル・デル・リオらの「Biotechnology and Bioengineering」(48、141−148、1995年)]。
本発明者らは、野生型酵素と比較して、酵素活性を改変した突然変異ペニシリンGアシラーゼを提供する。
発明の概要
本発明の1つの観点において、好ましくは原核生物の生体由来のタイプII野生型ペニシリンGアシラーゼのDNA配列(E.coli由来の酵素の構造を図1A〜1Dに示す)を改変して、突然変異ペニシリンGアシラーゼをコードする。タイプIIアシラーゼは全て、共通の分子構造を有する。タイプIIアシラーゼは、小さなサブユニット(アルファ:16−26キロダルトン(kDa))と大きなサブユニット(ベータ:54−66kDa)からなるヘテロダイマーである。本明細書で用いる語句“ペニシリンGアシラーゼ”とは、原核生物のタイプIIアシラーゼならびにそのプレ酵素およびプレプロ酵素体を意味する。E.coli由来の野生型ペニシリンGアシラーゼのアルファ・サブユニットのDNA配列(SEQ.ID.NO.:1)および対応するアミノ酸配列(SEQ.ID.NO.:2)を図1Aに示す。E.coli由来の野生型ペニシリンGアシラーゼのベータ・サブユニットのDNA配列(SEQ.ID.NO.:3)および対応するアミノ酸配列(SEQ.ID.NO.:4)を図1B〜1Dに示す。本発明に従って、選択した1種以上のアミノ酸残基を、天然アミノ酸群からの種々のアミノ酸残基に置換する。勿論、本発明の突然変異DNA配列において、所定のアミノ酸を所定の位置でコードするため、DNA配列の対応変化を行う。構造上の変化は、野生型ペニシリンGアシラーゼのX線結晶学的構造に基づいて決定する。本発明による各置換のDNAおよびアミノ酸配列変化を図2に示す。
本発明に従って、1以上の指定部位の以下に示す置換が提供される。
1.アルファ・サブユニット上:
DNA塩基対:A424−426(MetA142−Ala)
DNA塩基対:A436−438(PheA146−Ala)
2.ベータ・サブユニット上:
DNA塩基対:B70−72(PheB24−Ala,Leu,Val,Pro,Tyr,Met,Ser,Cys,Gly,Asp,Lys,Arg,Tyr,Thr,Ile,Glu,Gln,AsnまたはHis)
DNA塩基対:B166−168(ValB56−SerまたはThr)
DNA塩基対:B529−531(IleB177−Phe)
上記使用の用語において、“A”はアルファ・サブユニットを、“B”はベータ・サブユニットを表わし;番号をつけた位置は、アミノ酸配列の場合は従来のアミノ末端からカルボキシ末端、およびDNA配列の場合では5’から3’であり;アミノ酸位置番号の前のアミノ酸は野生型アミノ酸を、およびアミノ酸位置番号の後のアミノ酸は代用のアミノ酸を表わし、たとえば“ValB56−SerまたはThr”は、野生型ベータ・サブユニットの56位のアミノ酸がバリンで、セリンまたはトレオニンのいずれかで置換されて、本発明の突然変異アシラーゼを作成することを意味する。
本発明の改変アシラーゼは、対応する野生型ペニシリンGアシラーゼと比較して、改変した酵素活性を有する。
最も好ましい改変した(突然変異)ペニシリンGアシラーゼは、1つのアミノ酸改変(PheB24−Ala)を有し、野生型酵素よりもかなり高い収率および効率で、β−ラクタム抗生物質を合成することができる。
また本発明は、他の観点において、本発明の改変した核酸配列からなるベクター、および該ベクターで形質転換された微生物宿主細胞に指向する。また本発明は、本発明の宿主細胞を培養した後、好ましくはアシラーゼの単離を行なうことから成る、改変アシラーゼの産生法にも関係する。
さらに別の観点において、本発明は、β−ラクタム抗生物質(たとえばセファドロキシル、セフプロジル、アモキシリン)の半合成に、上記変異体ペニシリンGアシラーゼを使用する方法をも提供する。基質濃度、pH値および温度などの条件については、以下で説明する。突然変異ペニシリンGアシラーゼを用いる半合成反応の収率および効率は、野生型酵素と比較して、改善されていることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
図1Aは、E.coli野生型ペニシリンGアミダーゼ遺伝子のアルファ・サブユニットのヌクレオチド(DNA)配列および該ヌクレオチド配列によってコードされる対応アミノ酸配列;
図1Bは、E.coli野生型ペニシリンGアミダーゼ遺伝子のベータ・サブユニットのヌクレオチド(DNA)配列および該ヌクレオチド配列によってコードされる対応アミノ酸配列;
図1Cは図1Bの続き;
図1Dは図1Cの続き;
図2は、ペニシリンGアシラーゼの関連フラグメントの、本発明による突然変異の正確な部位を示すDNAおよびアミノ酸配列、ここで、DNAフラグメント1はSEQ.ID.NO.:5、アミノ酸フラグメント1はSEQ.ID.NO.:6、DNAフラグメント2はSEQ.ID.NO.:7、アミノ酸フラグメント2はSEQ.ID.NO.:8、DNAフラグメント3はSEQ.ID.NO.:9、アミノ酸フラグメント3はSEQ.ID.NO.:10、DNAフラグメンチ4はSEQ.ID.NO.:11、アミノ酸フラグメント4はSEQ.ID.NO.:12、およびDNAフラグメント5はSEQ.ID.NO.:13、アミノ酸フラグメント5はSEQ.ID.NO.:14;
図3は、ペニシリンGアシラーゼの変異DNA配列を含有する実施例1に関連する、PBMベクターのイラスト;
図4は、ペニシリンGアシラーゼ基質結合部位の構造のコンピューター・グラフィック像である。なお、図4において、明瞭のため、蛋白主鎖痕跡は図示せず。部位を構成する単離アミノ酸は、スティック構造の図形で示す。原子種は灰色の種々の陰影でコードし、すなわちポリペプチド主鎖炭素は白色;側鎖炭素は明灰色;窒素は暗灰色;酸素は黒色である。開裂した基質のフェニル酢酸については、部位の中心を矢印で示す。またフェニルアラニン側鎖B24も、矢印で標識する。図示で明らかなように、B24残基の芳香族側鎖環は、基質と接触し、かつ基質を溶媒から保護しながら、部位に対し中心の重要な位置を占める。像は、フェニル酢酸−ペニシリンGアシラーゼ複合体のX線結晶学的座標から作成した。
発明の詳細な説明
本発明の主題であるペニシリンGアシラーゼは、野生型酵素と比較して、改変した基質特異性および/または改変した特異的活性を有する。本発明の酵素は好ましくは、野生型酵素と比較して、高い収率および/または効率を示す。本発明の改変酵素の使用のため最適条件を決定するのに、日常の実験作業を要求しうることは可能である。本発明の改変酵素を製造するのに本発明で利用する野生型酵素は、エシェリキア・コリ(E.coli)(大腸菌)、クルイベラ・シトロフィラ(Kluyvera citrophila)、プロビデンシア・レットゲリ(Providencia rettgeri)、シュードモナス種、アルカリゲネス・ファエカリス(Alcaligenes faecalis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、アルトロバクター・ビスコスス(Arthrobacter viscosus)などの原核生物から得られる。アシラーゼは好ましくは以下の特性を有し、すなわち、(1)原核生物E.coli(たとえば、ATCC11105)から単離され、(2)単一ペプチド鎖前駆体として翻訳され、(3)翻訳後にプロセシングされて、小さなN−末端領域(domain)(アルファ・サブユニット)と大きなC−末端領域(ベータ・サブユニット)を有するヘテロダイマーを生成する。好ましいアルファ・サブユニットの分子量は約24000で、好ましいベータ・サブユニットの分子量は約62000である。好ましい酵素の活性体は典型例として、E.coliのペリプラズム(periplasmic)に見られる。
現在のLC−MSデータによれば、E.coliにおける翻訳後のプロセシング中に、アルファ・サブユニットはC−末端で、約10〜15のアミノ酸、最も可能性があるとしたら12または13のアミノ酸によって切断される(truncated)ことが示唆される。同様に、同データによって、翻訳後の処理中にアルファ・サブユニットはN−末端で、1または2のアミノ酸によって切断されることが示される。すなわち、本発明は、アルファ・サブユニットがN−末端で1または2のアミノ酸によって切断された、および/または該アルファ・サブユニットがC−末端で10〜15のアミノ酸、好ましくは12または13のアミノ酸によって切断された、突然変異ペニシリンGアシラーゼを包含する。
ペニシリンGアシラーゼの基質特異性の改変は、突然変異酵素が、ペニシリンGの自然側鎖であるフェニルアセチル以外の側鎖を有する、ペニシリンおよびセファロスポリン誘導体を開裂または合成することができるようにして達成される。現在、ペニシリンGアシラーゼによって重大なほどに影響されない側鎖の具体例は、ジカルボン酸であるコハク酸、グルタル酸、アジピン酸、アミノアジピン酸等から誘導されるアシル基である。
本発明の突然変異酵素は、キラル化合物のラセミ混合物を伴なう変換において、エナンチオマー過剰の改善をもたらすことができる、高い立体特異性を示しうる。このような特性は、アミノ基[たとえばアンピシリン、セファレキシン(cefalexin)、アモキシリン、セファドロキシル、セファクロールなどにおいて]またはヒドロキシル基(たとえばセファマンドールなどにおいて)の存在に基づき、キラルアルファ炭素を含有するフェニルアセチル側鎖または該フェニルアセチル側鎖の活性化誘導体(たとえばフェニルグリシン−アミドもしくはそのエステル、p−ヒドロキシフェニルグリシン−アミドもしくはそのエステル等)のラセミ混合物からの、鏡像異性的に純粋な半合成抗生物質の合成に極めて有用なアシラーゼを作るといえるだろう。
また本発明は、新しい残基の代わりに1つのアミノ酸残基を用いる当該分野で公知の組換えDNA法による、野生型酵素から誘導されるペニシリンG突然変異体の同定にも関係する。突然変異体の加水分解および合成活性の両方を分析した。ヒドロラーゼ活性に関してトランスフェラーゼ活性が改善されているペニシリンGアシラーゼ変種が好ましい。これは、合成変換においてより有用な酵素を作る。アモキシリン、セファドロキシル、セフプロジルおよびセファレキシンなどの抗生物質の酵素合成での性能を改善した突然変異体が好ましい。
遺伝子の決定部位における変異の導入は、合成オリゴヌクレオチドを用いるDNA配列の規定部位の修飾によって実施することができる。本発明におけるペニシリンGアシラーゼの突然変異体は、以下に示す方法によって製造することができる。すなわち、該方法は、
(1)標準ポリメラーゼ鎖反応部位−特異的変異誘発によって、ペニシリンGアシラーゼをコードする遺伝子の特異的部位に変異を導入し(ここで、これらの変異のための特異的オリゴデオキシヌクレオチドは、商業的出所によって合成した。オリゴヌクレオチドは、変異を決定する内部を除いて、変異化すべき配列に相同である。);
(2)該変異化遺伝子をクローニング・ベクターでクローン化し;
(3)宿主菌株を組換えベクターで形質転換し;
(4)該宿主菌株を適当な培地で培養し;
(5)このようにして得られる突然変異ペニシリンGアシラーゼを分離および固定し;
(6)該突然変異体の加水分解および合成活性を評価分析(アッセイ)することから成る。
かかる方法に係るペニシリンGアシラーゼの変異誘発は、新しい基質特異性および/または改変酵素活性をもたらす。点変異を導入するため、蛋白結晶学、分子モデル、分子生物学および蛋白化学技法に頼る合理的アプローチを採用する。本発明に従って、特異的アミノ酸位置を、酵素の触媒特性に関して重要な位置として同定した。これらの残基は、MetA142、PheA146、PheB24、ValB56およびIleB177を包含する。これらの残基の同定は、X線結晶学的構造に基づく。
本発明の酵素を野生型酵素と比較するため、突然変異体と野生型ペニシリンGアシラーゼは、粗細胞溶解産物または固定した固体の形状にあり、後者が好ましい。本発明の突然変異PheB24−Alaを有する酵素は、β−ラクタム抗生物質に対する合成活性の改善を証明することから好ましい。
また本発明は、宿主細胞においてその発現を指令することができるプロモーター配列に、本発明の核酸配列が作用可能に(operably)結合して成る発現ベクターをも包含する。好ましいベクターは、図3に示されるプラスミドPBMPGAなどのプラスミドである。本発明で用いる発現ベクターは典型例として、複製起点、DNA配列の前(すなわち、上流)に位置するプロモーターおよびこれに続く突然変異アシラーゼの全部または一部をコードするDNA配列を含有する。突然変異アシラーゼの全部または一部をコードするDNA配列の後に、転写終止配列および残りのベクターが続く。また発現ベクターは、当該分野で公知の他のDNA配列を包含することができ、たとえば発現産物の安定性を提供する安定性リーダー(leader)配列、発現産物の分泌を提供する分泌リーダー配列、調節すべき(たとえば、増殖培地における栄養分もしくは他の誘発因子の存在または非存在による)構造遺伝子の発現を可能ならしめる配列、形質転換した宿主細胞に表現型選択を付与しうるマーキング配列、および制限エンドヌクレアーゼにより開裂の部位を付与する配列が挙げられる。使用する実際の発現ベクターの特性は、使用すべき宿主細胞に適合しなければならない。たとえばE.coli細胞系においてクローン化するとき、発現ベクターはE.coli細胞のゲノムから単離したプロモーター(たとえばtac、lacおよびtrp)を含有すべきである。種々のE.coli宿主における適当な複製起点としては、たとえばColEIプラスミド複製起点が挙げられる。適当なプロモーターとしては、たとえばtac、lacおよびtrp、並びにE.coli由来のneo−r遺伝子プロモーターが挙げられる。適当な終止配列としては、たとえばペニシリンGアシラーゼ、T7ファージ遺伝子10、およびE.coli由来のneo−r遺伝子ターミネーターが挙げられる。また、発現ベクターは選択できるマーカーをコードする配列を包含することが好ましい。選択できるマーカーは、抗生物質耐性が好ましい。選択できるマーカーとして、アンピシリン耐性およびネオマイシン耐性が都合よく使用できる。これらの物質の全ては、当該分野で公知で、かつ商業上入手しうる。
所望のコードおよび調節配列を含有する適当な発現ベクターは、当該分野で公知の標準組換えDNA技法を用いて組み立ててよく、上記技法の多くは、サムブルックらの「A Laboratory Manual」(2版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、NY、1989年),“分子クローニング”に記載されている。
さらに本発明は、突然変異アシラーゼの全部または一部をコードするDNA配列からなる発現ベクターを含有する宿主細胞に関係する。宿主細胞は好ましくは、図2に示される、1以上の変異を有するDNA配列の全部または一部からなる発現ベクターを含有する。さらに好ましい宿主細胞は、突然変異アシラーゼの全部または一部の複製および/または発現を指令することができ、かつ突然変異アシラーゼの全部または一部をコードするDNA配列に作用的に(operatively)結合した1以上の調節DNA配列からなる発現ベクターを含有する。適当な宿主細胞としては、たとえばライフ・テクノロジィーズ・Inc.(MD20897、ガイサースブルグ、ピー・オー・ボックス6009)より入手可能なE.coli HB101(ATCC33694);ノバゲン・Inc.(WI53711、マジソン、サイエンス・ドライブ597)より入手可能なBL21等が挙げられる。
発現ベクターは、当該分野で公知の種々の方法によって、宿主細胞に導入することができる。たとえば、発現ベクターを持つ宿主細胞のトランスフェクションは、ポリエチレングリコール仲介プロトプラスト形質転換法によって行なうことができる。しかしながら、宿主細胞に発現ベクターを導入する他の方法、たとえば電気穿孔法、ビオリスティック・インジェクション(biolistic injection)、またはプロトプラスト融合法も使用することができる。
いったん発現ベクターを適当な宿主細胞に導入すれば、該宿主細胞を、所望の突然変異アシラーゼの発現を可能にする条件下で培養されてよい。
プラスミドPBMPGA((PBMF1PGA)+)を含有する宿主細胞のE.coliBL21を、ブタペスト条約の規定の下、1997年9月4日付で、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(メリーランド州20852、ロックビル)に寄託した(指定名ATCC98537)。
突然変異アシラーゼの全部または一部をコードするDNA配列を含有する発現ベクターを含有する宿主細胞は、以下に示す5つの一般的アプローチの1つ以上で同定されてよい。
(a)DNA−DNAハイブリダイゼーション;
(b)マーカー遺伝子機能の存在または非存在;
(c)宿主細胞中のペニシリンGアシラーゼmRNAトランスクリプト(transcript)の産生によって測定する、転写レベルの評価分析;
(d)遺伝子産物の免疫学的検出;および
(e)酵素アッセイ(比色検出等)。
本発明の発現ベクター、プラスミドまたはDNA分子のDNA配列は、当該分野で公知の種々の方法で測定されてよい。たとえば、サンガーらの「Proc.Natl.Acad.Sci.」(USA74、5463−5467、1977年)に記載のジデオキシ鎖末端法、あるいは「Proc.Natl.Acad.Sci.」(USA74、560−564、1977年)に記載のMaxam-Gilbert法を使用してもよい。
勿論、発現ベクターおよびDNA調節配列の全てが、本発明のDNA配列を発現するのに十分同等に機能するとは限らないことを理解すべきである。宿主細胞の全てはいずれも、同じ発現システムにおいて十分同等には機能しないであろう。しかしながら、当業者であれば、本発明によるガイダンスを用いて、必要以上の実験作業もなく、かつ本発明の技術的範囲から逸脱せずに、発現ベクター、DNA調節配列および宿主細胞の中で1つの選択を行なうことができる。
本発明で同定したアミノ酸残基の全ては、自然L−配置にある。標準ポリペプチドの命名法を一定に保持する上で、「J.Biol.Chem.」(243、3557−3559、1969年)の、アミノ酸残基の略語の一覧表を以下に示す。
本明細書で全てのアミノ酸配列は、左から右の位置が慣用のアミノ−末端からカルボキシ−末端への方向になっている式によって表わす。
本発明のポリペプチドは、当業者にとって公知の方法により、合成手段、すなわち成分アミノ酸からのポリペプチドの化学合成によって得ることができる。たとえば、ハクトンらの「Proc.Natl.Acad.Sci.」(82、5131−5135、1985年)に記載の固相操作が採用しうる。ポリペプチドは、変異体アシラーゼをコードするDNA配列を発現する原核生物の宿主細胞における産生によって、あるいは突然変異アシラーゼをコードするDNA配列でコードされたmRNAのインビトロ翻訳によって得るのが好ましい。たとえば、DNA配列は上述のPCRを用いて合成され、そして適当な発現ベクターに挿入され、順次、適当な宿主細胞を形質転換するのに使用されてよい。次いで、組換え宿主細胞を培養して、酵素を産生することができる。これらの手段によるポリペプチド産生の技法は、当該分野で公知であり、かつ本明細書に記載されている。
次に、このようにして産生したポリペプチドを単離し、種々の蛋白精製技法を用いて、ある程度に精製する。たとえば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび免疫親和力クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー操作が使用しうる。
本発明のポリペプチドは、決定DNAおよび演繹(deduced)アミノ酸のシークエンス(sequencing)によって規定した。遺伝暗号の縮重的性質(アミノ酸残基のほとんどおよび停止シグナルに対して1を超えるコドンが存在することによる)ゆえに、図1に示される同じアミノ酸配列をコードする他のDNA配列を、本発明のポリペプチドの産生に使用することができる。加えて、これらのDNAおよびアミノ酸配列のアレル変異は自然に存在するか、あるいは当該分野で公知の方法を用いて意図的に導入しうることが理解されよう。これらの変種は、全配列における1つ以上のアミノ酸の差異、または該配列における1以上のアミノ酸の削除、置換、挿入、逆位または付加によって証明することができる。かかるアミノ酸置換は、たとえば、必然的に伴なう残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および/または両親媒性の類似点に基づき行なうことができる。たとえば、陰荷電アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が;陽荷電アミノ酸としては、リシンおよびアルギニンが;類似の親水性価を有する非荷電極性ヘッド(head)基または非極性ヘッド基を持つアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシンが挙げられる。他の予期される変種としては、上記ポリペプチドの塩およびエステル、並びに上記ポリペプチドの前駆体、たとえばリーダー配列として用いるメチオニン、N−ホルミルメチオニンなどのN−末端置換基を有する前駆体が包含される。かかる変種の全ては、本発明の技術的範囲内に含まれる。
また本発明は、本発明の突然変異ペニシリンGアシラーゼの産生方法も意図するものであり、該方法は、本発明の突然変異アシラーゼの産生に好適な条件下で、本発明の宿主細胞を培養することから成る。細菌性宿主細胞の場合、典型的な培養条件は、適当な抗生物質および誘導物質を含有する液体培地である。培養物を、酵素の最適産生に好適な温度、たとえば約28〜29℃で振とうまたは撹拌する.適当な抗生物質の典型例としては、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン等が挙げられる。誘導物質の典型例としては、IPTG、ラクトース等が挙げられる。
また本発明は、半合成の6−アシル化ペニシラン酸、7−アシル化セファロスポラン酸またはこれらの塩もしくはエステルの産生方法も包含し、該方法は、アシル化が起る適当な条件下で、対応する6−アミノβ−ラクタムもしくは7−ACAまたはそれらの塩もしくはエステルのそれぞれとアシル化剤を、本発明の突然変異アシラーゼに接触させることから成る。アシル化剤の典型例としては、アモキシリン、セファドロキシル、セフプロジル等の側鎖のエステルまたはアミドが挙げられる。アシル化剤としては、これらに限定されるものではないが、たとえばフェニルグリシン、パラヒドロキシフェニルグリシン、フェニル酢酸、フェノキシ酢酸、これらのエステルまたはアミドが挙げられる。好ましい形状のアシル化剤は、上記酸のエステルである。かかるエステルのアルコール部分としては、これらの限定されるものではないが、メタノールおよびその長鎖類縁体並びにそれらの立体異性体、エチレングリコールおよびその長鎖類縁体並びにそれらの立体異性体が挙げられる。最も好ましいのは、エチレングリコールエステルである。典型的なアシル化条件は、一定の撹拌下で中性pHもしくはそれ以下の水性緩衝剤中である。典型的な温度は、約0〜35℃である。上記方法で用いる突然変異アシラーゼは、宿主細胞によって、現場で作るかあるいは予め作っておくことができる。無細胞突然変異アシラーゼを用いる場合、これを粗細胞溶解産物に入れ、部分的に精製するか、あるいは均質性になるまで精製することがてきる。突然変異アシラーゼを固定することが好ましい。本発明で用いる固定支持材としては、たとえばセライト(celite)、ジアカライト(diacalite)またはUOPビーズが挙げられる。
次に挙げる実施例は、本発明のより具体的な例である。これらの実施例は、本発明の技術的範囲を制限するものではなく、本発明の理解を高めるものである。
以下に示す実施例において、幾つかの試薬、制限酵素、およひ他の物質は商業的出所から入手し、供給元の指示に従って使用した。精製、特性決定およびDNAのクローニングで用いる操作は、当該分野で周知であり、かつ出版文献から順応させることができる。
実施例1
部位−特異的変異誘発
上記PCR部位−方向づけ方法を用いて、選択した位置でアミノ酸突然変異を行う。所定の突然変異を導入するのに用いるオリゴヌクレオチドは、商業的に入手した。特に、オリゴヌクレオチドは、以下に示す配列を有する。
(1)ペニシリンGアシラーゼの遺伝子を、突然変異遺伝子の合成の鋳型として用いるPBMプラスミド(図3)に挿入する。
(2)オリゴヌクレオチドは、突然変異を決定する内部を除いて変異化すべき配列に相補的なものにデザインする。
(3)標準PCR技法を用いて、合成オリゴヌクレオチドを鋳型にアニールし、鋳型を増幅する。二本鎖(double-stranded)突然変異体を産生する第二ラウンド(second round)のPCRに対して用いるため、メガプライマー(megaprimer)産物を精製する。次いで、突然変異DNAを分取アガロースゲルより精製する。
実施例2
突然変異ペニシリンGアシラーゼのクローニングおよび発現
tacプロモーターを含有し、ラクトースまたはIPTGで誘発されるプラスミドPBMに、突然変異ペニシリンGアシラーゼ遺伝子をクローン化する。組換えプラスミドを、E.coli群から選んだ宿主生体に導入することができる。次いでこれらの微生物を、適当な条件および選択コロニー下で培養する。
(1)PBMプラスミドおよび突然変異化酵素をコードするDNA配列の両方を、制限酵素HindIIIおよびBamHIで消化する。産物をゲル精製する。
(2)消化したDNA配列をライゲートし、ライゲーション反応のアリコートを用いて、コンピテントなE.coli細胞を形質転換する。次いで、カナマイシンおよびラクトースを含有するLBプレートにて、形質転換株を選択する。
(3)アッセイのため、個々のコロニーを選び、ラクトースおよびカナマイシンを含有するLB培地中、28℃で一夜増殖させる。
(4)突然変異を確かめるため、アンビオン・Inc.のキットを用いた。この方法は以下の事実に基づく。すなわち、一定のRNアーゼは、1つの組合せ間違いの塩基対を持つ位置で、二本鎖RNAを選択的に開裂することができ、これは突然変異が起こったことを示す。
実施例3
微生物の培養
形質転換したE.coliコロニーを用いて、種培養物を、30μg/mlのカナマイシンを補充した100mlのLuria Bertuni液体培地を含有する500mlのエルレンマイヤー(Erlenmeyer)フラスコに接種する。種フラスコを28℃で5時間培養する。50mlの培養物を用い、2リットルのタンクに接種する。基礎培地は、0.3% K2HPO4、0.2% KH2PO4、0.2% MgSO4、0.05%(NH4)2SO4、0.003% FeSO4、0.001% MnSO4、0.3%酵母エキス、および30μg/mlのカナマイシンである。pHは6.8〜7.2。タンクは、pH調節フィーディング・プロフィール(feeding profile)で運転する。タンクに、20%NZアミン、20%グルコース、およびカナマイシンを補充する。発酵体液体培地を、高度の酸素供給下30℃にて44時間培養する。
実施例4
E.coli由来のペニシリンGアシラーゼの単離および固定
液体培地全体をミクロ流動化して、連続気泡をこわす。10%セライトを加え、0.2〜0.25%のPEIを加えて、液体培地を透明にする。混合物を1時間攪拌し、濾過し、同量の水で洗い、透明な液体培地を得る。透明な液体培地を30000MWCO膜で限外濾過して、元の容量の5%とする。
(1)UOP−アルミニウムビーズに固定
限外濾過した液体培地をUOPビーズと共に10℃で一夜振とうする。ビーズを水洗し、4℃で貯蔵する。
(2)ジアカライトに固定
限外濾過した液体培地に4%トリトン(Triton)X−100、5%ビオクリル(Biocryl)および30%以下のイソプロパノールを加え、混合物を1時間攪拌し、濾過する。濾液に1%スピードプラス(Speedplus)を加え、50%PEGを加えて、15%の最終濃度とし、混合物を15分間攪拌し、50%グルタルアルデヒドを加えて、0.4%の最終濃度とする。室温で15分間固定を続ける。酵素を濾別し、洗液が無色になるまで水洗する。操作の間、pHを7.2〜7.6に維持する。
実施例5
ペニシリンGアシラーゼの加水分解活性のアッセイ
(1)市販の基質6−ニトロ−3−(フェニル−アセトアミド)安息香酸によるアッセイ
pH7.4の0.2Mリン酸カリウム緩衝剤中に0.1%の基質を含有する96−ウェル(well)ミクロタイタープレート(microtiterplate)のウェルに、細胞培養物の20μlサンプルを加える。分光光度405nmにて反応を行なう。
(2)p−ジメチル−アミノベンズアルデヒド(p−DAB)によるアッセイ
1ml細胞培養物サンプルを超音波破砕し、200mMリン酸カリウム緩衝剤(pH7.5)中の4.5%KペニシリンG 1mlを加える。振とうしながら37℃で15分間培養する。1mlの99.0%アセトニトリルおよび1.0%酢酸を加える。混合し、遠心分離する。1mlの上層液に、3mlのp−DAB試薬を加える。(P-DAB試薬の調製のため、1部の10mg/ml p−DABと6部の酢酸ナトリウム緩衝剤を混ぜる)。4分間培養し、415nmで読取る。100μg/mlの6APAの標準因子を用いて、IU/mlを計算する。
実施例6
ペニシリンGアシラーゼの合成活性のアッセイ
(1)セファドロキシル
p−ヒドロキシフェニルグリシンのヒドロキシエチル塩10.5gを、37.5mlの水に溶解する。水酸化アンモニウムでpHを8.0に調整する。4.8gの7−ADCAを加え、溶解する(pH7.5)。6N−HClでpHを7.0に調整する。容量を60mlにする。反応混合物をそれぞれ5mlの12等分に分ける。固定ペニシリンGアシラーゼを加えて、40IU/mlの最終濃度とする。HPLCアッセイのため、所定の時間でアリコートを取出す。
(2)セフプロキシル合成
4.5gのエステル塩を60mlの水に加え、pHを8.26に調整する。3.6gの7−PACAを加える。1.72mlの水酸化アンモニウムを加えて、pH8.26とする。4.5gのエステルを加え、pHを7.56に調整する。反応混合物を12等分に分ける。固定ペニシリンGアシラーゼを加えて、40IU/mlの最終濃度とする。HPLCアッセイのため、所定時間でアリコートを取出す。
(3)アモキシリン・アッセイ
3.5gのエステル塩を12.5mlの水に加える。水酸化アンモニウムでpHを8.0に調整する。1.6gの6−APAを加え、溶解し、pH7.0に調整する。容量を20mlにする。反応混合物をそれぞれ5mlの4等分に分ける。固定ペニシリンGアシラーゼを加えて、40IU/mlの最終濃度とする。HPLCアッセイのため、所定時間でアリコートを取出す。
(4)HPLCアッセイ
サンプルを以下の通りに処理する。
200μlのサンプルに、1mlの20mM−KP緩衝剤(pH7.4)を加え、高速回転させ、200μlの上層液をHPLCバイアルに取出す。800μlの緩衝剤を加え、アッセイ用の10μlを注入する。各反応のHPLCアッセイを、下記表1に示す。
ベータ・サブユニットのフェニルアラニン24をアラニン置換した、ペニシリンGアシラーゼの突然変異体を見つけ、β−ラクタム抗生物質の優れた合成が明らかに示され、加水分解活性は25%であった。この突然変異ペニシリンGアシラーゼを、F1と称す。これらの結果は、下記表2〜12で証明される。
25mlの培養物を、30μg/mlのカナマイシンを含有するLuria−Bertaini液体培地に接種し、28℃で一夜振とうする。培養物を800μmのIPTGと共に4時間誘発する。細胞を10倍に濃縮し、超音波破砕する。
ミクロタイタープレート・アッセイで加水分解を判定する。基質は、0〜0.2Mリン酸カリウム緩衝剤中の0.1%ニトロ−(フェニル−アセトアミド)安息香酸である。データは、野生型の%で表示する。
ヒドロキシエチルエステルおよび7ADCAとの4時間の培養後のセファドロキシルの形成によって、合成を判定する。アッセイはHPLCで行なう。活性は野生型の%で表示する。
Claims (15)
- ベータ・サブユニットの24位(B24)のPheがAlaまたはLeuに置換、またはベータ・サブユニットの56位(B56)のValがThrに置換された突然変異大腸菌タイプIIペニシリンGアシラーゼ。
- B24のPheがAlaまたはLeuに置換されている請求の範囲1に記載の突然変異アシラーゼ。
- B56のValがThrに置換されている請求の範囲1に記載の突然変異アシラーゼ。
- B24のPheがAlaに置換されている請求の範囲1に記載の突然変異アシラーゼ。
- 請求の範囲1に記載の突然変異アシラーゼをコードする核酸。
- 請求の範囲2に記載の突然変異アシラーゼをコードする請求の範囲5に記載の核酸。
- 請求の範囲3に記載の突然変異アシラーゼをコードする請求の範囲5に記載の核酸。
- 請求の範囲4に記載の突然変異アシラーゼをコードする請求の範囲5に記載の核酸。
- DNAである請求の範囲5に記載の核酸。
- 宿主細胞においてその発現を指令することができるプロモーターに、請求の範囲5に記載の核酸が作用可能に結合して成る発現ベクター。
- 請求の範囲10に記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
- 請求の範囲11に記載の宿主細胞を、突然変異アシラーゼの産生に適当な条件下で培養することから成る突然変異ペニシリンGアシラーゼの産生方法。
- 半合成の6−アシル化ペニシラン酸、7−アシル化セファロスポラン酸またはこれらの塩もしくはエステルの産生方法であって、アシル化が起こる適当な条件下で、対応する6−アミノβ−ラクタムもしくは7−ACAまたはそれらの塩もしくはエステルのそれぞれとアシル化剤を、請求の範囲1に記載の突然変異アシラーゼに接触させることから成る産生方法。
- 突然変異アシラーゼを固定する請求の範囲13に記載の産生方法。
- 突然変異アシラーゼが、B24_においてPheからAlaへのアミノ酸置換を有する請求の範囲14に記載の産生方法。
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