CN103667418B - 高活性β-内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种β-内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，它按以下步骤进行：在酶标板的板孔中加入合成液，然后加入待测酶样品，在微孔板振荡反应器中，10-30℃，反应0.1-3小时，反应过程中每隔1-30分钟取出酶标板加入PDAB显色液显色，酶标测定其在415nm处的吸光值大小；根据吸光值变化趋势及吸光值的最低值，筛选出活性高、合成能力好的酶；所述合成液是将β-内酰胺抗生素的母核与侧链溶解于KPB溶液中制成；所述待测酶样品为β-内酰胺抗生素合成酶。本发明可以用于用于内酰胺类抗生素如阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛、头孢羟氨苄、氨苄西林等酶法合成用酶的筛选。具有操作简单、成本低廉、检测准确等特点，适合大规模高通量筛选合成用酶。
Description
技术领域
本发明涉及高通量筛选技术，具体的说是高活性β-内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法。
技术背景
目前内酰胺类抗生素合成用酶主要集中在7-ACA、6-APA、阿莫西林、氨苄西林等的工业生产中，其中应用最广的为青霉素酰化酶（EC 3.5.1.11），其最早用于6-APA母核的生产。近几年随着生物技术的发展，酶分子改造技术的突破，各种用于内酰胺类抗生素酶法合成的酶分子相继出现，DSM公司已经实现了阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛等抗生素的产业化；国内联邦制药也实现了阿莫西林的酶法合成。
新型酶的发现可以通过自然突变的方法筛选得到，但这种方法因其效率低、目的性差，目前已不多用，人们现在更主要倾向于通过分子改造的手段获得新型的合成酶。使用分子改造的方法对现有的合成酶进行突变时，通常会形成数量巨大的文库，从而高通量的筛选方法成为筛选适合的合成酶的关键。目前人们普遍使用的筛选方法是高压液相色谱（HPLC），但该方法的准确性虽然比较高，但也存在检测成本高的问题，并且HPLC法检测时间长，从筛选效率上受到限制，不能提高筛选效率。专利CN102264904A公开一种利用检测合成产物浓度的方法，用于高通量的筛选，该方法原理是利用头孢氨苄在碱性条件下在490nm具有最大吸收峰的原理进行的检测，因其只是针对于头孢氨苄的筛选，不能用于头孢克洛、阿莫西林等其它抗生素的筛选，不具有普遍适用性。
发明内容
本发明的目的是提供一种高活性内酰胺类抗生素合成用酶的高通量筛选方法，以解决现有方法检测效率低、适用范围窄的问题。
本发明的目的是这样实现的：
一种高活性β-内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，它按以下步骤进行：
在酶标板的板孔中加入合成液，然后加入待测酶样品，放入微孔板振荡反应器中，10-30℃，反应0.1-3小时，反应过程中每隔1-30分钟取出酶标板加入PDAB显色液显色，酶标测定其在415nm处的吸光值大小；根据吸光值变化趋势及吸光值的最低值，筛选出吸光值较早到达最低值且吸光值最低值较低的酶，即为活性高、合成能力好的β-内酰胺抗生素合成酶；
所述合成液是：将母核与侧链溶解于KPB溶液中制成合成液，备用；所述的母核为6-APA、7-ADCA、7-ACCA、7-ACA和7-AVCA中的任意一种，所述的侧链为HPGME·HCL或PGME·HCL；
所述待测酶样品为β-内酰胺抗生素合成酶。
本发明所述高活性β-内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，所述的合成液是每毫升所述KPB溶液中加入母核3~10mg、侧链4~12mg。
本发明所述高活性β-内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，所述β-内酰胺抗生素合成用酶为催化合成阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛、头孢羟氨苄或氨苄西林的合成酶。
所述从高活性β-内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法的一个更好的实现方案是，在进行筛选的过程中，加入对照组，即按以下步骤进行：
在酶标板的板孔中加入合成液，然后将板孔分为实验组和对照组，在实验组板孔中加入待测酶样品，在对照组板孔中加入与所述待测酶样品等量的KPB溶液；然后放入微孔板振荡反应器中，10-30℃，反应0.1-3小时，反应过程中每隔1-30分钟取出酶标板加入PDAB显色液显色，分别酶标测定实验组和对照组在415nm处的吸光值；根据实验组与对照组吸光值差值的变化趋势及实验组与对照组吸光值差值的大小，筛选出吸光值差值较早到达最最大值且吸光值差值较大的酶，即为活性高、合成能力好的β-内酰胺抗生素合成酶。
本发明所述的PDAB显色液是：称取0.4g-1.8g PDAB，加入20mL甲醇和44mL纯水制成溶液Ⅰ；在16mL冰醋酸中加入60mL纯水，再加入0.08gNaOH溶解制成溶液Ⅱ；将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ混合均匀即得PDAB显色液，避光4℃保存备用。
本发明的筛选过程的具体条件是：在96孔酶标板的板孔中按10-200μL/孔加入合成液，然后将板孔分为实验组和对照组，所述实验组中按10-200μL/孔加入待测酶样品，所述对照组中按10-200μL/孔加入KPB溶液；然后放入微孔板振荡反应器中，10-30℃，反应0.1-3小时，反应过程中每隔1-30分钟取出酶标板加入10-50μL的PDAB显色液，然后分别酶标测定实验组和对照组在415nm处的吸收值。
本发明建立了一种高通量筛选方法，其是通过显色液与母核反应显色，检测反应液中母核浓度，利用检测母核浓度的方法，反应出其转化率大小。酶标检测的吸光值大小反映出反应体系中母核的浓度大小，因而通过吸光值的大小变化以及根据实验组与对照组吸光值的差值大小，判断出酶对于相应母核的转化能力大小。本发明方法适用范围广可以用于6-APA、7-ACA、7-ADCA、7-ACCA、7-AVCA等类似母核的检测，用于内酰胺类抗生素如阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛、头孢羟氨苄、氨苄西林等酶法合成用酶的筛选。具有操作简单、成本低廉、检测准确等特点，适合大规模高通量筛选合成用酶。
附图说明
图1是酶标检测6-APA吸光值变化趋势。
图2是HPLC检测6-APA浓度变化趋势。
图3是酶标检测7-ADCA吸光值变化趋势。
图4是PLC检测7-ADCA浓度变化趋势。
图5是酶标检测7-ACCA吸光值变化趋势。
图6是HPLC检测7-ACCA浓度变化趋势。
图7是阿莫西林用合成酶筛选结果。
具体实施方式
以下实施例出现的英文缩写说明为：PDAB：对二甲氨基苯甲醛；6-APA：6-氨基青霉烷酸；7-ACA：7-氨基头孢烷酸；7-ADCA：7-氨基去乙氧基头孢烷酸；7-ACCA：7-氨基-3-氯-3-头孢环-4-羧酸；7-AVCA：7-氨基-3-乙烯基-3-头孢环-4-羧酸；HPGME·HCL：D-对羟基苯甘氨甲酯酸盐酸盐；PGME·HCL：D-苯甘氨酸甲酯盐酸盐。
以下实施例用到的仪器为：酶标仪、控温微孔板振荡培养器、控温摇床、冷冻离心机、多道移液器（排枪）。
以大肠杆菌青霉素酰化酶（EC：3.5.1.11， GeneBank：YP_002295891.1）为出发基因，根据《精编分子生物学实验指南第四版》第8章方法和《分子克隆试验指南第三版》第15章方案2方法构建得到大肠杆菌文库（Clone1~12、C1~8），所构建的文库菌落在大肠杆菌青霉素酰化酶原始蛋白序列的基础上有如下突变：
Clone1在第35位异亮氨酸突变为苯丙氨酸，Clone2在第95位异亮氨酸突变为丙氨酸，Clone3在第246位脯氨酸突变为精氨酸，Clone4在第478位甘氨酸缺失；Clone5在第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸，Clone6在第478位甘氨酸突变为酪氨酸，Clone7在第801位丙氨酸突变为赖氨酸，Clone8在第838位丝氨酸突变为天冬氨酸；Clone9在第51位色氨酸缺失，Clone10在第159位天冬氨酸突变为异亮氨酸，Clone11在第300位丙氨酸突变为精氨酸，Clone12在第819位天冬氨酸缺失；
C1：第51位色氨酸缺失＋第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸，C2：第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸＋第159位天冬氨酸突变为异亮氨酸，C3：第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸＋第300位丙氨酸突变为精氨酸，C4：第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸＋第819位天冬氨酸缺失，C5：第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸＋第478位甘氨酸突变为酪氨酸，C6：第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸＋第801位丙氨酸突变为赖氨酸，C7：第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸＋第838位丝氨酸突变为天冬氨酸，C8：第313位苯丙氨酸突变为丙氨酸＋第478位甘氨酸缺失。
实施例1
本实施例中用到的试剂配制方法如下：
①LB培养基：1％ Trptone; 0.5% Yeast Etract ; 1% NaCl；
②Lysis Buffer裂解缓冲液：10mM-50mM Tris-Hcl (pH 7.2); 1-5% Glycerol; 10mM-50mM NaCl；
③KPB溶液：配置0.02-0.2M KH2PO4 和0.02-0.2M K2HPO4 ，调节pH值5.0-7.0；
④PDAB显色液：称取0.4g-1.8g PDAB，加入20mL甲醇和44mL纯水置成溶液I；16mL冰醋酸加入60mL纯水，加入0.08gNaOH溶解制备溶液II；混合溶液I和溶液II，避光4℃保存；
⑤合成液：分别称取30-100mg 6-APA、7-ADCA或7-ACCAβ-内酰胺抗生素母核和40-120mg HPGME·HCL或PGME·HCL等合成侧链溶解在10mL KPB溶液中。
本实施例将文库中的Clone1~12按如下分组进行筛选：
筛选方法如下：
（1）酶液制备：
1.1）挑取文库菌落到96孔细胞培养板（LB+卡那霉素），37℃，220rpm，培养过夜（8~12h）后，以体积比1∶10转接到96孔深孔板中（LB+卡那霉素），37℃，220rpm，培养4h，得菌液；
1.2）加入IPTG（终浓度为0.5mM），23℃、220rpm条件下诱导4h，然后3000rpm离心，去上清，-70℃放置过夜（8~12h）后取出，融化，加入浓度为0.5mg/ml的溶菌酶（使用Lysis Buffer配置，并加入终浓度4U/mL DnaseI酶）37℃保温1h，然后3000rpm离心15min，取上清液备用，该上清液即为所制备得到的酶液。
（2）合成用酶的筛选：
2.1）取96孔酶标板，使用排枪在板孔中加入合成液200μL，然后加入步骤1.2）制备的酶液100μL（实验组）或KPB溶液100μL（对照组），放入微孔板振荡反应器中，10-30℃条件下反应0.1-3h得反应液；
2.2）每隔30min取出酶标板加入50μL的PDAB显色液，然后使用酶标仪测定415nm吸光值。
根据实验组不同时间点的吸光值大小，其吸光值越早到达最低点者所对应的酶活性越高；根据实验组与对照组吸光值差值大小，两者差值反映出溶液中合成母核的浓度，吸收值越小合成能力越强，吸光值差值最大的的对应为合成能力最强者。
实施例2
实施例1在进行酶标测定的同时，取步骤2.1）得到的反应液，采用HPLC法检测反应液中母核的浓度，不同母核的检测条件如下：
（1）6-APA 浓度HPLC检测方法：
色谱条件：高效液相色谱仪Agelent LC 1200，SB-C18柱，150*4.6*5，加SB-C18预柱。柱温35℃。流动相A:30%乙腈，流动相B：50Mm NaH2PO4，PH=5，0-2min，A:B=2:98；2-10min，A:B=10:90.流速为1mL/min，检测波长：210nm。进样：20μL。
样品制备：取500μL反应液，加水稀释至25mL容量瓶中，再取500μL于25mL容量瓶中，加流动相B稀释至刻度，0.45μm滤膜过滤，取滤液进样，检测6-APA的浓度。
（2）7-ADCA 浓度HPLC检测方法：
色谱条件：高效液相色谱仪Agelent LC 1200，SB-C18柱，150*4.6*5，加SB-C18预柱。柱温35℃。流动相A:甲醇，流动相B：50Mm NaH2PO4，PH=5，0-2min，A:B=5:95;2-20min，A:B=25:75；20-30minA:B＝2：98流速为1mL/min，检测波长：225nm。进样：20μL。
样品制备：取200μL反应液加水稀释至25mL容量瓶中，再取1250μL于25mL容量瓶中，加流动相B稀释至刻度，0.45μm滤膜过滤，取滤液进样，检测7-ADCA的浓度。
（3）7-ACCA浓度 HPLC检测方法：
色谱条件：高效液相色谱仪Agelent LC 1200，SB-C18柱，150*4.6*5，加SB-C18预柱。柱温35℃。流动相A:甲醇，流动相B：50Mm NaH2PO4，PH=5，0-2min，A:B=5:95;2-30min，A:B=25:75，30-35min=5:95，流速为1mL/min，检测波长：225nm。进样：20μL。
样品制备：取500μL反应液加水稀释至25mL容量瓶中，再取500μL于25mL容量瓶中，加流动相B稀释至刻度，0.45μm滤膜过滤，取滤液进样，检测7-ACCA的浓度。
实施例3：
（1）实施例1、实施例2以6-APA为反应母核所得吸光值数据及浓度数据对比：
实施例1筛选以6-APA为反应母核合成用酶结果（6-APA吸光值变化）见表1及图1：
表1：6-APA吸光值变化
实施例2同时以HPLC法测定得到的6-APA浓度（μg/ml），结果见表2及图2：
表2：6-APA浓度变化
| Clone1 | Clone2 | Clone3 | Clone4 | CK | |
| 30min | 11.28 | 10.10 | 19.70 | 18.47 | 20.54 |
| 60min | 11.12 | 9.95 | 19.30 | 12.12 | 20.37 |
| 120min | 12.64 | 11.78 | 19.49 | 16.23 | 20.42 |
由图1和图2变化趋势可以看出，酶标检测6-APA的吸光值变化趋势同HPLC检测出的浓度变化相一致，从而表明本发明方法可以很好的检测出反应液中的6-APA浓度变化，从而体现了酶对于阿莫西林、氨苄西林等以6-APA为反应母核的抗生素合成的能力大小，6-APA浓度越低证明该酶催化合成阿莫西林、氨苄西林等以6-APA为反应母核的抗生素的能力越强。
（2）实施例1、实施例2以7-ADCA为反应母核所得吸光值数据及浓度数据对比：
实施例1筛选以7-ADCA为反应母核合成用酶结果（7-ADCA吸光值变化），见表3及图3：
表3：7-ADCA吸光值变化
| Clone5 | Clone6 | Clone7 | Clone8 | CK | |
| 30min | 2.037 | 2.486 | 2.366 | 2.192 | 3.019 |
| 60min | 1.727 | 2.472 | 2.283 | 2.012 | 3.096 |
| 90min | 1.530 | 2.466 | 2.137 | 1.714 | 3.090 |
实施例2同时以HPLC法测定不同时间段7-ADCA浓度变化（μg/ml），结果见表4及图4：
表4：7-ADCA浓度变化
| Clone5 | Clone6 | Clone7 | Clone8 | CK | |
| 30min | 3.10 | 4.22 | 4.09 | 3.81 | 4.96 |
| 60min | 2.81 | 4.14 | 3.75 | 3.00 | 5.04 |
| 90min | 2.4 | 4.13 | 3.53 | 2.45 | 5.05 |
由图3和图4变化趋势可以看出，吸光值变化趋势同HPLC检测出的浓度变化相一致，使用本发明方法可以很好的检测出反应溶液中的7-ADCA浓度变化，从而体现了酶对于头孢氨苄、头孢羟氨苄等以7－ADCA为合成母核的抗生素合成的能力大小，7-ADCA浓度越低证明该酶的合成头孢氨苄（头孢羟氨苄等以7－ADCA为合成母核的抗生素）的能力越强。
（3）实施例1、实施例2以7-ACCA为反应母核所得吸光值数据及浓度数据对比：
实施例1筛选以7-ACCA为反应母核合成用酶结果（7-ACCA吸光值变化），见表5及图5：
表5：7-ACCA吸光值变化
| Clone9 | Clone10 | Clone11 | Clone12 | CK | |
| 30min | 2.777 | 2.823 | 2.672 | 2.450 | 3.026 |
| 60min | 2.664 | 2.754 | 2.568 | 2.365 | 3.015 |
| 90min | 2.647 | 2.623 | 2.221 | 2.528 | 3.056 |
实施例2同时以HPLC法测定不同时间段7-ACCA浓度变化（μg/ml），结果见表6及图6：
表6： 7-ACCA浓度变化（μg/ml）
| Clone9 | Clone10 | Clone11 | Clone12 | CK | |
| 30min | 4.86 | 4.90 | 4.43 | 3.66 | 5.06 |
| 60min | 4.46 | 4.77 | 4.27 | 3.58 | 5.03 |
| 90min | 4.68 | 4.60 | 3.49 | 3.74 | 5.11 |
由图5和图6变化趋势可以看出，吸光值变化趋势同HPLC检测出的浓度变化相一致，使用本发明方法可以很好的检测出反应溶液中的7-ACCA浓度变化，从而体现了酶对于头孢克洛等以7－ADCA为合成母核的抗生素合成的能力大小，7-ACCA浓度越低证明该酶的合成头孢克洛等以7－ADCA为合成母核的抗生素的能力越强。
通过实施例1和实施例2数据对比分析可以得出，本发明方法用于筛选内酰胺类抗生素合成酶的结果与采用现有HPLC法筛选内酰胺类抗生素合成酶的检测结果一致，从而本发明的方法可以用于内酰胺类抗生素如：阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛、头孢羟氨苄、氨苄西林等酶法合成用酶的筛选。
实施例4：
以实施例1所述方法步骤进行文库筛选，合成液以6-APA为反应母核，以HPGME为反应侧链，进行阿莫西林合成用酶的筛选，测定的吸光值变化见表7及图7：
表7：阿莫西林用合成酶筛选结果
| C1 | C2 | C3 | C4 | C5 | C6 | C7 | C8 | |
| 15min | 1.140 | 1.370 | 1.235 | 1.470 | 1.273 | 1.389 | 1.367 | 1.380 |
| 30min | 1.123 | 1.305 | 1.043 | 1.444 | 1.174 | 1.326 | 1.279 | 1.357 |
| 45min | 1.018 | 1.280 | 1.019 | 1.558 | 1.304 | 1.263 | 1.392 | 1.364 |
| 60min | 0.957 | 1.128 | 0.992 | 1.091 | 1.416 | 1.024 | 1.124 | 1.310 |
| 75min | 0.981 | 1.137 | 0.917 | 1.419 | 1.465 | 1.148 | 1.140 | 1.290 |
| 90min | 0.923 | 1.109 | 0.884 | 1.571 | 1.569 | 1.257 | 1.246 | 1.281 |
| 105min | 0.972 | 1.006 | 0.835 | 1.605 | 1.625 | 1.295 | 1.325 | 1.260 |
| 120min | 1.010 | 1.104 | 0.905 | 1.620 | 1.624 | 1.346 | 1.478 | 1.321 |
由图7结果可以分析出：酶C1、C3合成阿莫西林能力较强，其吸光值最低值最小，而且C3合成能力最强，其最低值最小。C1、C3吸光值变化趋势来看，C1的合成酶活要高于C3，因其较快达到最低值。因此，通过吸光值变化趋势，可以判断出酶的合成能力大小，以及合成酶活大小。
通过上述结果可以得出下列结论：本发明的方法可以用于内酰胺类抗生素如：阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛、头孢羟氨苄、氨苄西林等酶法合成用酶的筛选。通过吸光值变化，反映出反应体系中母核的浓度变化，从而筛选出合成能力较高的酶；通过吸光值变化趋势，可以反应出合成酶活的大小，越早到达最低点，其合成酶活越高。通过这些数值的变化，综合筛选出适合合成的酶。本发明的方法具有操作简单、成本低廉、检测准确等特点，适合大规模高通量筛选合成用酶。
Claims (3)
1.一种高活性β-内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，其特征在于它按以下步骤进行：
在酶标板的板孔中加入合成液，然后加入待测酶样品，放入微孔板振荡反应器中，10-30℃，反应0.1-3小时，反应过程中每隔1-30分钟取出酶标板加入PDAB显色液显色，酶标测定其在415nm处的吸光值大小；根据吸光值变化趋势及吸光值的最低值，筛选出吸光值较早到达最低值且吸光值最低值较低的酶，即为活性高、合成能力好的酶；
所述合成液是：将母核与侧链溶解于KPB溶液中制成合成液，备用；所述的母核为6-APA、7-ADCA、7-ACCA、7-ACA和7-AVCA中的任意一种，所述的侧链为HPGME·HCL或PGME·HCL；
所述待测酶样品为β-内酰胺抗生素合成酶。
2.根据权利要求1所述高活性β-内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，其特征是，所述的合成液是每毫升所述KPB溶液中加入母核3~10mg、侧链4~12mg。
3.根据权利要求1或2所述高活性β-内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，其特征是，所述β-内酰胺抗生素合成用酶为催化合成阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛、头孢羟氨苄或氨苄西林的合成酶。
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| CN102264904A (zh) * | 2008-12-23 | 2011-11-30 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 突变体青霉素g酰基转移酶 |
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2013
- 2013-12-18 CN CN201310696643.XA patent/CN103667418B/zh active Active
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