CN101177688B - 突变青霉素g酰化酶、其重组表达质粒及转化的工程菌株 - Google Patents

突变青霉素g酰化酶、其重组表达质粒及转化的工程菌株 Download PDF

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Abstract

本发明通过基因定点突变的方法获得的青霉素G酰化酶合成性能提高的基因、突变质粒、工程菌，并可在将工程菌发酵纯化后，获得青霉素G酰化酶合成性能提高的突变酶。本发明先用Kpn I和Pst I双酶切pUC18，然后用T4polymerase补平，自连得到pZ01；用EcoR I酶切pZ01，再和同样用EcoR I酶切的pEES102连接，获得重组质粒pY020；再以pY020为模板质粒，利用TaKaRa MuTanBEST Kit对B.megaterium PGA进行定点突变，从而获得青霉素G酰化酶合成性能提高的突变质粒。将该突变质粒转化枯草杆菌获得需要的工程菌。将该工程菌放大发酵，纯化后可获得合成产物/水解产物的比值及7-ADCA最大转化率提高的突变酶。

Description

突变青霉素G酰化酶、其重组表达质粒及转化的工程菌株 
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及通过基因定点突变方法获得合成性能提高的青霉素G酰化酶的基因、突变质粒、工程菌以及突变酶。 
背景技术
青霉素G酰化酶(Penicillin G Acylase，E.C.3.5.1.11，简称PGA)是一种异二聚体N-端亲核丝氨酸水解酶(Duggleby et al.，Nature，373(6511)，264-268，1995)。青霉素G酰化酶是半合成β-内酰胺类抗生素工业的重要用酶，该酶主要用途在于分别水解青霉素G和头孢菌素G，生成相应的化合物母核，6-氨基青霉烷酸(6-AminoPenicillinic acid，6-APA)和7-氨基头孢烷酸(7-Amino-deacetoxy-cephalosporanic-acid，7-ADCA)(Abian et al.，Biotechnol Prog，2003，19(6)，1639-42，2003)。青霉素G酰化酶的新用途是催化母核6-APA或7-ADCA与各种D-氨基酸发生侧链反应，生成新的半合成β-内酰胺抗生素，如半合成青霉素和半合成头孢霉素等(Gabor，De Vries，and Janssen，Enzyme And MicrobialTechnology，2005，36(2-3)，182-190)。 
酶法合成β-内酰胺抗生素研究开始于上世纪60年代。相对于化学法(Wegman et al.，Advanced Synthesis&Catalysis，343(6-7)，559-576，2001)，由于其具有不用有机溶剂、反应条件温和以及环保等优点，酶法合成β-内酰胺抗生素逐渐成为了β-内酰胺抗生素工业研究中的一个热点(Giordano，Ribeiro，and Giordano，Biotechnology Advances，24(1)，27-41，2006)。理论上，β-内酰胺类抗生素的酶法合成可通过两种方法(Kasche.Enzyme andMicrobial Technology，8(1)，4-16，1986)，即1)热力学控制，即逆转水解反应，和2)动力学控制，即酰基转移，实现。动力学控制的催化机制，涉及酶和酰基供体反应，形成酰基酶中间体，当中间体遇到β-内酰胺母核即可发生耦合，形成半合成β-内酰胺抗生素；而水作为竞争性亲核性试剂，引起反应物和产物的水解，当产物合成速率与产物水解速率相当时，该合成产物量达到最大值。 
近年来，利用酶法催化动力学控制母核6-APA或者7-ADCA的酰基化的研究已有所报道(Bruggink，Roos，and de Vroom.Organic Process Research&Development，2(2)，128-133，1998)。与传统的化学合成法比较，β-内酰胺抗生素的酶法合成面临的主要问题，是在合成抗生素的同时又发生两个副反应，即1)水解活化的酰基供体；2)水解生成的抗生素； 从而导致酰基供体和生成的抗生素的减少，进而造成了母核转化率偏低，即合成产物/水解产物(S/H)的比值偏低。虽然可以通过改善该酶促反应的反应条件，例如pH值优化(Nam，Ryu，and Ryu.Journal Of Microbiology And Biotechnology，11(2)，329-332，2001)，采用过饱和的底物和改变各种反应底物的投料比(Youshko et al.，Biotechnol Bioeng，85(3)，323-9，2004)，以及媒介工程改造(Fernandez-Lafuente，Rosell，and Guisan.，Biotechnol ApplBiochem，24(Pt2)，139-43，1996)等，来改善上述问题，但是酶自身的特性对S/H值的影响依然是最重要的(Alkema et al.，Eur.J.Biochem，270(18)，3675-83，2003)。 
利用蛋白质工程改造的方法改善青霉素G酰化酶的合成性能已有报道(Alkema et al，Protein Eng.，13(12)，857-63，2000)。在大肠杆菌来源的青霉素G酰化酶中，α Y145，α F146和β F24这三种氨基酸位于酰化酶与青霉素G结合的口袋位置。当酰化酶与青霉素G结合时，α Y145和α F146的构象会发生很大的变化，远离活性中心：α Y145通过两个水分子，利用氢键与青霉素G的羧酸基团相互作用，增加其亲核能力；α F146通过范德华力与底物的β内酰胺环相互作用。而，β F24则在E.coli PGA中与底物的苯环结构发生疏水相互作用，从而有利于酰化酶与底物的结合，当把α F146和β F24氨基酸残基分别突变为Leu和Ala后，氨苄青霉素和头孢氨苄的合成性能得到提高(Alkema et al.，ProteinEngineering Design&Selection，17(5)，473-480，2004)。利用有利设计和定向进化结合的方法，青霉素G酰化酶PAS2把αR160，α F161和β F24这三个氨基酸筛选到在氨苄青霉素和头孢氨苄合成时性能大大提高的工程菌中(Gabor，E.M.and D.B.Janssen，Protein Eng DesSel，2004，17(7)，571-9)。 
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种运用定点突变的方法获得的选择性突变的青霉素G酰化酶的DNA序列。 
本发明的第二个目的在于提供一种含有上述选择性突变的青霉素G酰化酶的DNA序列的重组表达质粒。 
本发明的第三个目的在于提供一种转化有上述重组表达质粒的青霉素G酰化酶生产菌株。 
本发明的第四个目的在于提供一种利用上述青霉素G酰化酶生产菌株生产的青霉素G酰化酶的突变酶。 
为达到上述目的，本发明采用以下手段：
首先以大肠杆菌和Providencia rettgeri来源的青霉素G酰化酶结构作为模板，利用Swiss-Model模建巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源的青霉素G酰化酶(BmPGA)；然后利用E.coli PGA与青霉素G(PG)的复合物的结构，通过叠加BmPGA和青霉素G获得了BmPGA-PG的复合物的结构，最后用GROMOS96对复合物的结构进行了能量优化，选择到合适的突变位点。 
并根据巨大芽孢杆菌来源的PGA基因序列，设计出了合成突变引物；再以包含巨大芽孢杆菌来源的PGA基因的重组质粒为模板质粒，以上述的合成突变引物为引物，利用TaKaRa公司的TaKaRa MuTanBEST Kit对B.megaterium PGA进行定点突变，从而获得合成性能提高了的青霉素G酰化酶的突变质粒，同时对突变质粒的DNA序列进行测定，经验证，确定该突变质粒的DNA序列为我们设计的选择性突变的青霉素G酰化酶的DNA序列。 
本发明再将突变后的质粒，通过自身环化后，转化枯草杆菌感受态细胞，从而获得合成性能提高了的青霉素G酰化酶的工程菌。 
本发明挑选该工程菌的单菌落进行培养，并放大发酵，纯化，从而获得了青霉素G酰化酶突变酶。 
本发明还对获得的突变酶的性能进行了测定，包括水解酶活力、合成活力、S/H值和7-ADCA最大转化率等的测定。 
测定结果显示，我们获得的突变酶的合成性能、合成产物/水解产物值(S/H值)及7-ADCA最大转化率均得到了提高。 
附图说明
图1是巨大芽孢杆菌来源的青霉素G酰化酶与头孢氨苄复合物及大肠杆菌来源的青霉素G酰化酶复合物电子模拟示意图。 
图2是各工程菌发酵液上清电泳图，其中，1代表在β24位点上的缬氨酸和在α144位点上的酪氨酸同时分别被突变为苯丙氨酸和精氨酸而获得的突变BmPGA(BmPGAβ24F+α144R)，2代表在β24位点上的缬氨酸被突变为苯丙氨酸而获得的突变BmPGA(BmPGA β24F)，3代表在α145位点上的苯丙氨酸被突变为酪氨酸而获得的突变BmPGA(BmPGA α145Y)，4代表α145位点上的苯丙氨酸被突变为亮氨酸而获得的突变BmPGA(BmPGA α145L)，5代表α145位点上的苯丙氨酸被突变为丙氨酸而获得的突变BmPGA(BmPGA α145A)，6代表α144位点上的酪氨酸被突变为精氨酸而获得的突变BmPGA(BmPGA α144R)，7代表野生型BmPGA，8代表蛋白质分子量Marker。
图3是各工程菌的头孢氨苄的动态控制合成示意图，其中，A代表是野生型BmPGA，B代表BmPGA α145Y，C代表BmPGA α144R，D代表BmPGA β24F，E代表BmPGA β24F+α144R。 
图4是BmPGA发酵培养的细菌生长量及水解酶的酶活力与时间的关系示意图。 
图5是野生型BmPGA，BmPGA α145Y，BmPGA α144R，BmPGA β24F和BmPGAβ24F+α144R的合成产物/水解产物比率示意图。 
图6是野生型BmPGA和BmPGA β24F+α144R的头孢氨苄的最大生成率示意图，其中A代表野生型BmPGA，B代表BmPGA β24F+α144R。 
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。 
本发明以大肠杆菌和普雷斯登菌来源的青霉素G酰化酶结构作为模板，利用Swiss-Model模建巨大芽孢杆菌来源的PGA；然后利用E.coli PGA与青霉素G的复合物的结构，通过叠加BmPGA和青霉素G(PG)获得了BmPGA-PG的复合物的结构，最后用GROMOS96对复合物的结构进行了能量优化，选择合适的位点，并根据巨大芽孢杆菌来源的PGA基因序列，设计出了合成突变引物；再以包含巨大芽孢杆菌来源的PGA基因的重组质粒为模板质粒，以上述的合成突变引物为引物，利用TaKaRa公司的TaKaRaMuTanBEST Kit对B.megaterium PGA进行定点突变。再将突变后的质粒在自身环化后转化枯草杆菌感受态细胞。并挑选单菌落培养，放大发酵，纯化，获得了青霉素G酰化酶突变酶，最后还对获得的突变酶的性能进行了测定，包括水解酶活力、合成活力、S/H值和7-ADCA最大转化率等的测定。 
本发明使用的菌株和质粒为：包含巨大芽孢杆菌来源的PGA基因的质粒pEES102(CGMCC No.0398)，枯草芽孢杆菌WB600(Wu，XC，Lee，W，Tran，L，Wong，SL(1991).JBacteriol173：4952-4958)，质粒pUC18购自Promega公司，大肠杆菌DH5α购自TaKaRa公司。 
本发明使用的酶和试剂为：限制性内切酶(EcoR I、Kpn I、ClaI、ApaI和Pst I)，Pyrobest DNA聚合酶，T4连接酶，TaKaRa基因定点突变试剂盒，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)购自TaKaRa公司，PCR纯化试剂盒和DNA胶回收试剂盒购自华舜生物制品有限公司，7-ADCA由哈尔滨制药集团赠送，D—苯甘酰胺(D-PGA)购自上海实业化工有限公司，7-ADCA标准品，头孢氨苄(CEX)标准品，D-PGA标准品购自 Sigma-Aldrich(St.Louis，USA)，6—硝基—3—苯乙酰氨基苯甲酸(NIPAB)购自东风试剂有限公司，琼脂购自西巴斯生物技术有限公司，其它常规试剂均为国产或进口分装。 
本实施例中酶的检测项目的测定方法： 
1)水解酶活力的测定方法(NIPAB法)： 
按Yang S et al.(Yang S，et al.，Protein Expression And Purification，2001，21(1)，60-64)描述的方法，用NIPAB测定PGA的活力。其具体操作步骤如下： 
取10μl酶液，加入490μl pH7.5的50mmol/L的磷酸盐缓冲液中，置于37℃水浴恒温器中保温10分钟；然后再向该溶液中加入1ml已于37℃预热的、0.09％(w/v)的6-硝基-3-苯乙酰氨基苯甲酸(NIPAB)溶液，混匀，反应4min后，向反应液中加入1ml无水乙醇，以终止反应，取1ml终止反应液；以不加酶的反应液作为空白对照，测定该终止反应液的OD405数值。 
酶活力＝7×OD405(U) 
酶活力单位(U)定义为：37℃，pH7.5条件下，每分钟水解1μmol的NIPAB所需的PGA的量为1U。 
2)酶合成活力测定方法： 
按照周政(Zhou Z，et al.，Acta Biochimica Et Biophysica Sinica，2003，35(5)，416-422)建立的测定方法，测定酶合成活力。其具体操作步骤如下： 
取1.2ml含有200mM的7-ADCA和400mM的D-PGA的底物反应液(即pH7.0的0.05M的磷酸钠溶液)，用盐酸将该底物反应液的pH值调至7.0±0.02，然后再加入0.5mg纯化酶，于30℃反应；分别在开始反应后的第15，30和45分钟取样，每次取样量为30μl，并将样品在用50mM的磷酸二氢钠溶液稀释40倍，灭活后，用HPLC测定产物生成量。 
酶合成活力单位定义为：30℃，pH7.0条件下，每分钟生成1μmol的头孢氨苄所需的固定化PGA的量为1SU。 
3)S/H值测定方法： 
取1.2ml含200mM的7-ADCA和400mM的D-PGA的底物反应液(即pH7.0的0.05M的磷酸钠溶液)，将其pH调至7.0±0.02。向该反应体系中加入纯化后的酶，使反应体系中的酶的合成活力控制为0.2SU/ml。于30℃，pH7.0条件下，反应120分钟；并 于反应过程中，每隔15分钟取样一次，每次取样的量为30μl反应液；在每次取样后，迅速将样品用50mM的磷酸二氢钾溶液稀释40倍，以终止反应，然后取终止反应后的反应液5μl，HPLC测定样品中的产物头孢氨苄和苯甘氨酸的生成摩尔量以及底物7-ADCA的剩余摩尔量，并计算样品的S/H值。 
S/H值为：样品中的7—ADCA消耗达10％时，样品中所含的产品头孢氨苄的摩尔数与副产品苯甘氨酸的摩尔数的比值。 
4)7-ADCA最大转化率的测定方法： 
取1.2ml含有200mM的7-ADCA和400mM的D-PGA的底物反应液(即pH7.0的0.05M的磷酸钠溶液)，将其pH调至7.0±0.02。向该反应体系中加入纯化后的酶，使反应体系中的酶的合成活力控制为1SU/ml。于30℃，pH7.0条件下，反应120分钟；并于反应过程中，每隔15分钟取样一次，每次取样的量为30μl反应液；在每次取样后，迅速将样品用50mM的磷酸二氢钾溶液稀释40倍，以终止反应，然后取终止反应后的反应液5μl，用HPLC测定样品中的产物头孢氨苄生成的摩尔量，并计算样品的7-ADCA最大转化率。 
7-ADCA最大转化率为：当头孢氨苄的浓度开始下降时，此时测定的样品中的产物头孢氨苄的生成量与头孢氨苄的理论最大生成量的比值。 
实施例1、确定定点突变基因序列 
1.1、BmPGA—配体复合物的结构模建 
以大肠杆菌(E.coli)和普雷斯登菌(Providencia rettgeri)来源的青霉素G酰化酶的结构为模板，利用Swiss-Model模型(Kaplan and Littlejohn，Swiss-PDB Viewer，2001，http://www.expasy.org/spdbv/)，模建巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)来源的PGA(BmPGA)；然后利用模建的E.coli PGA和青霉素G的复合物结构，通过叠加BmPGA和青霉素G(PG)获得BmPGA-PG的复合物结构。 
1.2、突变位点的选择 
运用分子动力学软件GROMOS96(van Gunsteren WF，Billeter SR，EA，Hünenberger PH，Krüger R，Mark AE，S，1996，http://www.igc.ethz.ch/gromos/manual.html)对BmPGA-PG复合物的结构进行能量优化，以选择适合的突变位点和突变方向。 
模建并优化后的结果如图1所示，根据图1的结果，确定定点突变的位点为：α144，α145和β24，突变方向为：位点α144上的酪氨酸被精氨酸替代，位点α145上的苯丙氨酸被丙氨酸、亮氨酸或酪氨酸替代，位点β24上的缬氨酸被苯丙氨酸替代。
实施例2、突变质粒的构建 
2.1、引物设计 
根据巨大芽孢杆菌来源的PGA的基因序列(SEQ ID NO：1)，以及选定的突变位点α144、α145、β24，设计下列7个突变引物： 
α144R：5`—G AGA TTT ATG GAT AAT CAC CAG GAG TTA—3`； 
α145Y：5`—GTAT TAT ATG GAT AAT CAC CAG GAG TTA—3`； 
α145A：5`—G TAT GCT ATG GATAAT CAC CAG GAG TTA—3`； 
α145L：5`—G TAT CTT ATG GATAAT CAC CAG GAG TTA—3`； 
β24F2：5`—AA TTTGGT TTT GTT GCT CCT GGATTT—3`； 
α145U：5`—GT CATCGATAC CATATAAAC ACG GAC A—3`； 
               (Cla I) 
β24F1：5`—G GGG CCC ACT GAA TAA TAAAGC ATT T—3`； 
                (Apa I) 
其中，引物中的下划线表示为引入的突变序列。引物α145U和β24F1为同义突变，用于鉴定突变是否成功。 
2.2、重组质粒pY020的构建 
先用内切酶Kpn I和内切酶Pst I对质粒pUC18(具有氨苄霉素抗性，和Kpn I酶和PstI酶的酶切位点)进行双酶切，电泳回收2.6kb的DNA大片断，然后用T4聚合酶将该片段的酶切缺口补平，并自连，得到pZ01； 
再用内切酶EcoR I酶切质粒pZ01，并和同样预先经内切酶EcoR I酶切后的pEES102(CGMCC No.0398)连接，获得重组质粒pY020。 
2.3、BmPGA的定点突变 
以重组质粒pY020为模板质粒，参照TaKaRa生物产品及操作手册，利用TaKaRaMuTanBEST突变试剂盒，利用设计的相应突变引物对，PCR扩增出BmPGA的定点突变序列，具体操作步骤如下： 
(1)反应体系(200μl)： 
10×Pfu聚合酶缓冲液              10μl 
10mmol/L dNTP溶液                2μl 
上游引物                         40pmoles
下游引物                             40pmoles 
Pfu DNA聚合酶                        5U 
质粒DNA模板                          200-400pg 
加水至200μl 
(2)PCR条件：94℃3min，94℃30s，55℃30s，72℃300s，30个循环，72℃10min。 
以α144R/α145U作为定点突变的上/下游引物，PCR获得BmPGAα144R(α144上的酪氨酸被精氨酸替代)。 
以α145Y/α145U作为定点突变的上/下游引物，PCR获得BmPGAα145Y(α145上的苯丙氨酸被丙氨酸替代)；以α145A/α145U或α145L/α145U作为定点突变的上/下游引物，则PCR获得BmPGAα145A或BmPGAα145L(α145上的苯丙氨酸被亮氨酸或酪氨酸替代)。 
以β24F2/β24F1作为定点突变的上/下游引物，PCR获得BmPGA β24F(β24上的缬氨酸被苯丙氨酸替代)。 
参考TAKARA公司操作手册，对PCR获得的DNA片断的5’末端进行磷酸化，然后将磷酸化的突变引物进行自身环化，接着转化DH5α感受态细胞，并涂布于加入氨苄抗生素的LB选择性平板上，37℃倒置培养约20h。能在加入氨苄抗生素的LB平板上长出来的就是转化有重组质粒的转化子。最后对转化子进一步培养以对重组质粒进行扩增，并抽提扩增的重组质粒。 
在获得定点突变的BmPGAα144R的基础上，进一步以BmPGAα144R质粒作为定点突变的模板，并以β24F2/β24F1作为上/下游引物，PCR获得BmPGAα144R+β24F(α144上的酪氨酸被精氨酸替代+β24上的缬氨酸被苯丙氨酸替代)，PCR方法同上，并按照上述同样的方法获得扩增的重组质粒。 
突变位点验证： 
1)用Cla I酶进行酶切，琼脂糖凝胶电泳，如大小约为9.1kb的片段为线性化质粒，则表明在α144和α145位点发生了突变。 
2)再用Apa I进行酶切，琼脂糖凝胶电泳，如大小约为9.1kb的片段为线性化质粒，则表明在β24位发生了突变。 
突变序列鉴定： 
分别对筛选到的突变质粒进行测序，确定所获得的质粒在目的突变位点发生了突变而在非目的突变位点没有发生突变，其中，位点α144突变的突变质粒BmPGAα144R的 DNA序列如SEQ ID NO.2所示(突变位点为508-510)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示(突变位点为170，酪氨酸被精氨酸替代)；位点β24F突变的突变质粒BmPGAβ24F的DNA序列如SEQ ID NO.4所示(突变位点为865-867)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示(突变位点为289，缬氨酸被苯丙氨酸替代)；位点α144R+β24F突变的突变质粒BmPGAα144R+β24F的DNA序列如SEQ ID NO.6所示(突变位点分别为508-510、865-867位点)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示(突变位点分别为170、289位点，酪氨酸被精氨酸替代，缬氨酸被苯丙氨酸替代)。 
虽然本申请为在确定的位点α144，α145和β24进行的定点突变，但是该3个位点的定点突变与其他位点的同义突变的组合，获得的产物具有与本申请所要求保护的产物具有同样的功能，这对本领域的人员来说是显而易见的。 
实施例3、工程菌的获得 
参照TAKARA公司的操作手册，分别将突变后的4种质粒(BmPGAα144R、BmPGAα145Y、BmPGAβ24F、BmPGAα144R+β24F)用EcoR I酶切，酚氯仿抽提，乙醇沉淀，然后用T4连接酶e自身环化，再转化枯草杆菌感受态细胞WB600，获得基因工程菌株BmPGAα144R/WB600、BmPGAα145Y/WB600、BmPGAβ24F/WB600和BmPGAα144R+β24F/WB600，具体如下： 
3.1、突变质粒环化 
1)在37℃条件下，在100μl EcoR I酶的酶切体系(30μl获得突变质粒，1/10体积的TaKaRa公司的H缓冲液，EcoR I酶(终浓度为0.05U/μl)，补双蒸水到100μl)中，酶切突变质粒，2小时后，跑琼脂糖凝胶电泳，参照操作手册，用华瞬公司的胶回收试剂盒回收6.3kb大小的片断。 
2)取8μl以上1)获得的DNA片段，在16℃条件下，在10μlT4连接酶的连接体系(1/10体积的TaKaRa公司的T4连接酶缓冲液，T4连接酶(终浓度为0.1U/μl)，补双蒸水到10μl)中反应6小时，获得环化的带突变酶基因的重组质粒BmPGAα144R、BmPGAα145Y、BmPGAβ24F和BmPGAα144R+β24F。 
测序鉴定获得的重组质粒的序列为正确。 
3.2、转化工程菌 
参照Harwood，CR，Cutting，SM(1990)Molecular biological methods for Bacillus.Sussex： Wiley中所介绍的方法，将重组质粒转化枯草杆菌感受态细胞WB600，分别获得基因工程菌株BmPGAα144R/WB600、BmPGAα145Y/WB600、BmPGAβ24F/WB600和BmPGAα144R+β24F/WB600。最后将获得的工程菌株分别涂布于加入氨苄抗生素的LB选择性平板上，37℃倒置培养约20h，能在加入氨苄抗生素的LB平板上长出来的就是转化有重组质粒的转化子。 
实施例4、工程菌发酵培养 
从LB选择性培养平板上挑单菌落，接种至3ml LB液体培养基中，加入卡那霉素，至其终浓度为100μg/ml，于37℃，250r/min，培养过夜； 
取2ml培养过夜的培养液，接种至200ml的LB液体培养基中，于37℃，250r/min，培养12h，获得种子菌液； 
取200ml种子菌液，接种至(已预先加入了1ml泡敌，并在121℃下，湿热灭菌20min的)3L淀粉培养基中，发酵培养(发酵条件为37℃，1.33vvm，300r/min)；每隔1h，取3ml发酵液，测定发酵液中的细菌生长量及水解酶的酶活力。 
水解酶的酶活力与时间的关系如图4所示。 
根据图4所示，待发酵至水解酶的酶活力达到最大，即大约在44小时后，即可停止发酵。 
细菌生长量测定： 
取1ml发酵液，根据菌浓度不同，用双蒸水稀释相应不同倍数(1-100倍)，以使测定的OD600的数值在0.2到0.6之间。发酵结束时，OD600数值在30到40之间，可认为发酵正常。 
水解酶的酶活力测定：参见上文提到的“水解酶活力的测定方法(NIPAB法)”，其中，用发酵液替换“酶液”。 
实施例5、酶的纯化 
参照Yang S et al(Yang，S，et al.，Protein Expression And Purification，2001，21(1)，60-64)中描述的BmPGAs的纯化方法进行酶的纯化。 
在纯化过程中，检测总蛋白浓度、酶活，并计算总酶活和酶的比活，从而确定回收率和纯化程度。 
总蛋白浓度测定：以小牛血清为标准品，根据Bradford检测法计算。 
野生型酶(BmPGA)和四种突变酶BmPGAα145Y，BmPGAα144R，BmPGAβ24F和BmPGAβ24F+α144R分别在枯草杆菌中分泌表达，五种酶(BmPGA，BmPGAα145Y，BmPGAα144R，BmPGAβ24F和BmPGAβ24F+α144R)用两步法纯化后水解比活分别浓缩了2.4倍，5.5倍，3.5倍，3.3倍和3.3倍，纯化结果见表1。 
表1：四种BmPGA的纯化结果 
Figure DEST_PATH_GA20168585200610118042001D00041
a：总蛋白含量通过Brandford法测定，小牛血清为标准品；b：总酶活通过NIPAB测定 
实施例6、纯化后酶的性质的测定 
参照前述方法，测定水解酶活、合成活力、S/H值和7-ADCA最大转化率。 
6.1、水解酶酶活测定 
水解酶酶活的测定的方法，见上文提到的“水解酶活力的测定方法(NIPAB法)”。各酶的水解酶酶活结果见表1。 
如表1所示，与野生型酶BmPGA相比较，BmPGAβ24F+α144R的比活下降很大， BmPGAα145Y和BmPGAβ24F比活下降比较大，BmPGAα144R的比活稍有下降。 
6.2、酶合成活力测定 
酶合成活力的测定的方法，见上文提到的“酶合成活力测定”。 
根据测定的野生型BmPGA，BmPGAα145Y，BmPGAα144R，BmPGAβ24F以及BmPGAβ24F+α144R的液体酶催化头孢氨苄合成计算出了他们的合成活力，其合成活力的结果见表2。 
表2：五种BmPGAs的合成活力 
Figure DEST_PATH_GA20168585200610118042001D00051
6.3、S/H值测定 
S/H值测定的方法，见上文提到的“S/H值测定”，测定结果见图5。 
如图5所示，五种青霉素G酰化酶BmPGA，BmPGAα145Y，BmPGAα144R，BmPGAβ24F和BmPGAβ24F+α144R的S/H值分别是：BmPGA的S/H值为2.3，BmPGAα145Y的S/H值为0.40，BmPGAα144R的S/H值为2.9，BmPGAβ24F的S/H值为5.5，BmPGAβ24F+α144R的S/H值为6.8。 
根据图示结果，突变酶BmPGAα145Y的S/H值相对于野生型BmPGA下降了，突变酶BmPGAα144R的S/H值比野生型BmPGA提高了约26％，BmPGAβ24F的S/H值比野生型BmPGA提高了约140％，而双突变酶BmPGAβ24F+α144R的S/H值大约是野生型BmPGA的三倍。 
6.4、7-ADCA最大转化率测定 
7-ADCA最大转化率测定的方法：见上文所提到的“7-ADCA最大转化率测定”。测定结果见图6。 
如图6所示，野生型BmPGA的最大转化率为31.1％(图6-A)，双突变酶 BmPGAβ24F+α144R的最大转化率为59.0％(图6-B)，其转化率大约是野生型BmPGA的转化率的两倍。 
综上所述，通过以上步骤获得的突变酶的合成性能、合成产物/水解产物值(S/H值)及7-ADCA最大转化率均得到了提高。 
序列表 
<110>中国科学院上海生命科学研究院 
<120>定点突变提高青霉素G酰化酶合成性能的工程菌 
<130>061825N 
<160>11 
<170>PatentIn version 3.1 
<210>1 
<211>2409 
<212>DNA 
<213>巨大芽孢杆菌 
<400>1 
atgaagatga agtggctaat atcagtcata atcctatttg ttttcatttt tcctcaaaat    60 
ctagtttttg ctggggagga taagaatgaa ggggtcgaag tagtacgtga taattttgga   120 
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gcaaaggatc gactatttca gttggaaatg ttccgtcgcg gaaatgaggg gaccgtttca   240 
<211>28 
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gcagagatac ttgcaaagct agaacatgaa tatgggacag aagtttcccg gaaaatgttc   600 
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gatatctttg aggaaaaatt gaatgcgaag aactcttccc agtatttata caaagggaag  1080 
tggagagaca tggaaaagag gaaggaatct ttcacagtca aaggagacaa tggagaaaag  1140 
aaaacagtag aaaagattta ttatcggaca gtacatggtc ctgtaattag tagagatgaa  1200 
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gaatatacga tgtctttgaa ttggtattat gcggataaga agggtgatat agcgtattat  1380 
catgtaggaa gatatccagt aagaaacagc aaaattgatg aaagaatccc tacaccagga  1440 
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ccgaagaatg gctatgtagt taattggaac aataagcctt ctaaagagtg ggtaaatggt  1560 
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agtaagtag                                                          2409 
<210>2 
<211>2409 
<212>DNA 
<213>巨大芽孢杆菌 
<400>2 
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<210>3 
<211>802 
<212>PRT 
<213>巨大芽孢杆菌 
<400>3 
Met Lys Met Lys Trp Leu Ile Ser Val Ile Ile Leu Phe Val Phe Ile 
1               5                   10                  15 
Phe Pro Gln Asn Leu Val Phe Ala Gly Glu Asp Lys Asn Glu Gly Val 
            20                  25                  30 
Glu Val Val Arg Asp Asn Phe Gly Val Pro His Leu Tyr Ala Lys Asn 
        35                  40                  45 
Lys Lys Asp Leu Tyr Glu Ala Tyr Gly Tyr Val Met Ala Lys Asp Arg 
    50                  55                  60 
Leu Phe Gln Leu Glu Met Phe Arg Arg Gly Asn Glu Gly Thr Val Ser 
65                  70                  75                  80 
Glu Ile Phe Gly Glu Asp Tyr Leu Ser Lys Asp Glu Gln Ser Arg Arg 
                85                  90                  95 
Asp Gly Tyr Ser Asn Lys Glu Ile Lys Lys Met Ile Asp Gly Leu Asp 
            100                 105                 110 
Arg Gln Pro Lys Glu Leu Ile Ala Lys Phe Ala Glu Gly Ile Ser Arg 
        115                 120                 125 
Tyr Val Asn Glu Ala Leu Lys Asp Pro Asp Asp Lys Leu Ser Lys Glu 
    130                 135                 140 
Phe His Glu Tyr Gln Phe Leu Pro Gln Lys Trp Thr Ser Thr Asp Val 
145                 150                 155                 160 
Val Arg Val Tyr Met Val Ser Met Thr Arg Phe Met Asp Asn His Gln 
                165                 170                 175 
Glu Leu Lys Asn Ala Glu Ile Leu Ala Lys Leu Glu His Glu Tyr Gly 
            180                 185                 190 
Thr Glu Val Ser Arg Lys Met Phe Asp Asp Leu Val Trp Lys Asn Asp 
        195                 200                 205 
Pro Ser Ala Pro Thr Ser Ile Val Ser Glu Gly Lys Pro Lys Arg Asp 
    210                 215                 220 
Ser Ser Ser Gln Ser Leu Gln Ile Leu Ser Ser Ala Val Ile Lys Ala 
225                 230                 235                 240 
Ser Glu Lys Val Gly Lys Glu Arg Glu Asn Phe Val Gln Thr Ser Glu 
                245                 250                 255 
Glu Leu Gly Leu Pro Leu Lys Ile Gly Ser Asn Ala Ala Ile Val Gly 
            260                 265                 270 
Ser Glu Lys Ser Ala Thr Gly Asn Ala Leu Leu Phe Ser Gly Pro Gln 
        275                 280                 285 
Val Gly Phe Val Ala Pro Gly Phe Leu Tyr Glu Val Gly Leu His Ala 
    290                 295                 300 
Pro Gly Phe Asp Met Glu Gly Ser Gly Phe Ile Gly Tyr Pro Phe Ile 
305                 310                 315                 320 
Met Phe Gly Ala Asn Asn His Phe Ala Leu Ser Ala Thr Ala Gly Tyr 
                325                 330                 335 
Gly Asn Val Thr Asp Ile Phe Glu Glu Lys Leu Asn Ala Lys Asn Ser 
            340                 345                 350 
Ser Gln Tyr Leu Tyr Lys Gly Lys Trp Arg Asp Met Glu Lys Arg Lys 
        355                 360                 365 
Glu Ser Phe Thr Val Lys Gly Asp Asn Gly Glu Lys Lys Thr Val Glu 
    370                 375                 380 
Lys Ile Tyr Tyr Arg Thr Val His Gly Pro Val Ile Ser Arg Asp Glu 
385                 390                 395                 400 
Thr Asn Lys Val Ala Tyr Ser Lys Ser Trp Ser Phe Arg Gly Thr Glu 
                405                 410                 415 
Ala Gln Ser Met Ser Ala Tyr Met Lys Ala Asn Trp Ala Lys Asn Leu 
            420                 425                 430 
Lys Glu Phe Glu Asn Ala Ala Ser Glu Tyr Thr Met Ser Leu Asn Trp 
        435                 440                 445 
Tyr Tyr Ala Asp Lys Lys Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr His Val Gly Arg 
    450                 455                 460 
Tyr Pro Val Arg Asn Ser Lys Ile Asp Glu Arg Ile Pro Thr Pro Gly 
465                 470                 475                 480 
Thr Gly Glu Tyr Glu Trp Lys Gly Phe Ile Pro Phe Lys Glu Asn Pro 
                485                 490                 495 
His Val Ile Asn Pro Lys Asn Gly Tyr Val Val Asn Trp Asn Asn Lys 
            500                 505                 510 
Pro Ser Lys Glu Trp Val Asn Gly Glu Tyr Ser Phe Tyr Trp Gly Glu 
        515                 520                 525 
Asp Asn Arg Val Gln Gln Tyr Ile Asn Gly Met Glu Ala Arg Gly Lys 
    530                 535                 540 
Val Thr Leu Glu Asp Ile Asn Glu Ile Asn Tyr Thr Ala Ser Phe Ala 
545                 550                 555                 560 
Gln Leu Arg Ala Asn Leu Phe Lys Gln Leu Leu Ile Asp Val Leu Asp 
                565                 570                 575 
Lys Asn Lys Ser Thr Asn Gly Asn Tyr Ile Tyr Leu Ile Glu Lys Leu 
            580                 585                 590 
Glu Glu Trp Asn Asn Leu Lys Glu Asp Glu Asn Lys Asp Gly Tyr Tyr 
        595                 600                 605 
Asp Ala Gly Ile Ala Ala Phe Phe Asp Glu Trp Trp Asn Asn Leu His 
    610                 615                 620 
Asp Lys Leu Phe Met Asp Glu Leu Gly Asp Phe Tyr Gly Ile Thr Lys 
625                 630                 635                 640 
Glu Ile Thr Asp His Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Ala Tyr Lys Ile Leu 
                645                 650                 655 
Asn Lys Glu Ser Thr Asn Tyr Lys Trp Val Asn Val Asp Gln Glu Lys 
            660                 665                 670 
Ile Ile Met Glu Ser Thr Asn Glu Val Leu Ala Lys Leu Gln Ser Glu 
        675                 680                 685 
Lys Gly Leu Lys Ala Glu Lys Trp Arg Met Pro Ile Lys Thr Met Thr 
    690                 695                 700 
Phe Gly Glu Lys Ser Leu Ile Gly Ile Pro His Gly Tyr Gly Ser Met 
705                 710                 715                 720 
Thr Pro Ile Ile Glu Met Asn Arg Gly Ser Glu Asn His Tyr Ile Glu 
                725                 730                 735 
Met Thr Pro Thr Gly Pro Ser Gly Phe Asn Ile Thr Pro Pro Gly Gln 
            740                 745                 750 
Ile Gly Phe Val Lys Lys Asp Gly Thr Ile Ser Asp His Tyr Asp Asp 
        755                 760                 765 
Gln Leu Val Met Phe Ala Glu Trp Lys Phe Lys Pro Tyr Leu Phe Asn 
    770                 775                 780 
Lys Lys Asp Ile Asn Lys Ala Ala Lys Asn Val Ser Ala Leu Asn Met 
785                 790                 795                 800 
Ser Lys 
<210>4 
<211>2409 
<212>DNA 
<213>巨大芽孢杆菌 
<400>4 
atgaagatga agtggctaat atcagtcata atcctatttg ttttcatttt tcctcaaaat    60 
ctagtttttg ctggggagga taagaatgaa ggggtcgaag tagtacgtga taattttgga   120 
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gcaaaggatc gactatttca gttggaaatg ttccgtcgcg gaaatgaggg gaccgtttca   240 
gaaatttttg gagaagatta tctttcaaaa gatgagcaat ccagaagaga tggatatagt   300 
aataaagaaa ttaaaaaaat gattgacggt ctggatcgtc agccaaaaga attaatagca   360 
aaatttgctg aaggtatttc acgttatgta aatgaagctt taaaagatcc agatgataag   420 
ctttcgaagg gatttcatga atatcagttt ttaccgcaaa aatggacttc aacagatgtt   480 
gtccgtgttt atatggtatc catgacctat tttatggata atcaccagga gttaaaaaac   540 
gcagagatac ttgcaaagct agaacatgaa tatgggacag aagtttcccg gaaaatgttc   600 
gatgatttag tgtggaaaaa tgatcctagc gctcctacaa gcattgtaag cgaggggaaa   660 
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tctgaaaaag tcggaaagga aagggagaat tttgtccaaa catctgaaga acttggatta   780 
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gatatctttg aggaaaaatt gaatgcgaag aactcttccc agtatttata caaagggaag  1080 
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ccgaagaatg gctatgtagt taattggaac aataagcctt ctaaagagtg ggtaaatggt  1560 
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gacgaaaata aagatggata ttatgacgca gggattgcgg cattctttga tgaatggtgg  1860 
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gaaattaccg atcatcgcta tggggcttca ttagcatata aaatattaaa caaggaatct  1980 
acaaactata aatgggtgaa cgtagatcag gaaaaaataa taatggaaag cacaaatgaa  2040 
gtacttgcta aattgcaatc agaaaaaggg ttgaaagcag aaaaatggcg tatgcctata  2100 
aaaacgatga cttttggtga aaaatcattg attggtattc cccacgggta tggctcaatg  2160 
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agtaagtag                                                          2409 
<210>5 
<211>802 
<212>PRT 
<213>巨大芽孢杆菌 
<400>5 
Met Lys Met Lys Trp Leu Ile Ser Val Ile Ile Leu Phe Val Phe Ile 
1               5                   10                  15 
Phe Pro Gln Asn Leu Val Phe Ala Gly Glu Asp Lys Asn Glu Gly Val 
            20                  25                  30 
Glu Val Val Arg Asp Asn Phe Gly Val Pro His Leu Tyr Ala Lys Asn 
        35                  40                  45 
Lys Lys Asp Leu Tyr Glu Ala Tyr Gly Tyr Val Met Ala Lys Asp Arg 
    50                  55                  60 
Leu Phe Gln Leu Glu Met Phe Arg Arg Gly Asn Glu Gly Thr Val Ser 
65                  70                  75                  80 
Glu Ile Phe Gly Glu Asp Tyr Leu Ser Lys Asp Glu Gln Ser Arg Arg 
                85                  90                  95 
Asp Gly Tyr Ser Asn Lys Glu Ile Lys Lys Met Ile Asp Gly Leu Asp 
            100                 105                 110 
Arg Gln Pro Lys Glu Leu Ile Ala Lys Phe Ala Glu Gly Ile Ser Arg 
        115                 120                 125 
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    130                 135                 140 
Phe His Glu Tyr Gln Phe Leu Pro Gln Lys Trp Thr Ser Thr Asp Val 
145                 150                 155                 160 
Val Arg Val Tyr Met Val Ser Met Thr Arg Phe Met Asp Asn His Gln 
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Glu Leu Lys Asn Ala Glu Ile Leu Ala Lys Leu Glu His Glu Tyr Gly 
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Thr Glu Val Ser Arg Lys Met Phe Asp Asp Leu Val Trp Lys Asn Asp 
        195                 200                 205 
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    210                 215                 220 
Ser Ser Ser Gln Ser Leu Gln Ile Leu Ser Ser Ala Val Ile Lys Ala 
225                 230                 235                 240 
Ser Glu Lys Val Gly Lys Glu Arg Glu Asn Phe Val Gln Thr Ser Glu 
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Glu Leu Gly Leu Pro Leu Lys Ile Gly Ser Asn Ala Ala Ile Val Gly 
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Ser Glu Lys Ser Ala Thr Gly Asn Ala Leu Leu Phe Ser Gly Pro Gln 
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Pro Gly Phe Asp Met Glu Gly Ser Gly Phe Ile Gly Tyr Pro Phe Ile 
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Met Phe Gly Ala Asn Asn His Phe Ala Leu Ser Ala Thr Ala Gly Tyr 
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Gly Asn Val Thr Asp Ile Phe Glu Glu Lys Leu Asn Ala Lys Asn Ser 
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Ser Gln Tyr Leu Tyr Lys Gly Lys Trp Arg Asp Met Glu Lys Arg Lys 
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Asp Asn Arg Val Gln Gln Tyr Ile Asn Gly Met Glu Ala Arg Gly Lys 
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785                 790                 795                 800 
Ser Lys 
<210>6 
<211>2409 
<212>DNA 
<213>巨大芽孢杆菌 
<400>6 
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<210>7 
<211>802 
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<400>7 
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            340                 345                 350 
Ser Gln Tyr Leu Tyr Lys Gly Lys Trp Arg Asp Met Glu Lys Arg Lys 
        355                 360                 365 
Glu Ser Phe Thr Val Lys Gly Asp Asn Gly Glu Lys Lys Thr Val Glu 
    370                 375                 380 
Lys Ile Tyr Tyr Arg Thr Val His Gly Pro Val Ile Ser Arg Asp Glu 
385                 390                 395                 400 
Thr Asn Lys Val Ala Tyr Ser Lys Ser Trp Ser Phe Arg Gly Thr Glu 
                405                 410                 415 
Ala Gln Ser Met Ser Ala Tyr Met Lys Ala Asn Trp Ala Lys Asn Leu 
            420                 425                 430 
Lys Glu Phe Glu Asn Ala Ala Ser Glu Tyr Thr Met Ser Leu Asn Trp 
        435                 440                 445 
Tyr Tyr Ala Asp Lys Lys Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr His Val Gly Arg 
    450                 455                 460 
Tyr Pro Val Arg Asn Ser Lys Ile Asp Glu Arg Ile Pro Thr Pro Gly 
465                 470                 475                 480 
Thr Gly Glu Tyr Glu Trp Lys Gly Phe Ile Pro Phe Lys Glu Asn Pro 
                485                 490                 495 
His Val Ile Asn Pro Lys Asn Gly Tyr Val Val Asn Trp Asn Asn Lys 
            500                 505                 510 
Pro Ser Lys Glu Trp Val Asn Gly Glu Tyr Ser Phe Tyr Trp Gly Glu 
        515                 520                 525 
Asp Asn Arg Val Gln Gln Tyr Ile Asn Gly Met Glu Ala Arg Gly Lys 
    530                 535                 540 
Val Thr Leu Glu Asp Ile Asn Glu Ile Asn Tyr Thr Ala Ser Phe Ala 
545                 550                 555                 560 
Gln Leu Arg Ala Asn Leu Phe Lys Gln Leu Leu Ile Asp Val Leu Asp 
                565                 570                 575 
Lys Asn Lys Ser Thr Asn Gly Asn Tyr Ile Tyr Leu Ile Glu Lys Leu 
            580                 585                 590 
Glu Glu Trp Asn Asn Leu Lys Glu Asp Glu Asn Lys Asp Gly Tyr Tyr 
      595                 600                 605 
Asp Ala Gly Ile Ala Ala Phe Phe Asp Glu Trp Trp Asn Asn Leu His 
    610                 615                 620 
Asp Lys Leu Phe Met Asp Glu Leu Gly Asp Phe Tyr Gly Ile Thr Lys 
625                 630                 635                 640 
Glu Ile Thr Asp His Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Ala Tyr Lys Ile Leu 
                645                 650                 655 
Asn Lys Glu Ser Thr Asn Tyr Lys Trp Val Asn Val Asp Gln Glu Lys 
            660                 665                 670 
Ile Ile Met Glu Ser Thr Asn Glu Val Leu Ala Lys Leu Gln Ser Glu 
        675                 680                 685 
Lys Gly Leu Lys Ala Glu Lys Trp Arg Met Pro Ile Lys Thr Met Thr 
    690                 695                 700 
Phe Gly Glu Lys Ser Leu Ile Gly Ile Pro His Gly Tyr Gly Ser Met 
705                 710                 715                 720 
Thr Pro Ile Ile Glu Met Asn Arg Gly Ser Glu Asn His Tyr Ile Glu 
                725                 730                 735 
Met Thr Pro Thr Gly Pro Ser Gly Phe Asn Ile Thr Pro Pro Gly Gln 
            740                 745                 750 
Ile Gly Phe Val Lys Lys Asp Gly Thr Ile Ser Asp His Tyr Asp Asp 
        755                 760                 765 
Gln Leu Val Met Phe Ala Glu Trp Lys Phe Lys Pro Tyr Leu Phe Asn 
    770                 775                 780 
Lys Lys Asp Ile Asn Lys Ala Ala Lys Asn Val Ser Ala Leu Asn Met 
785                 790                 795                 800 
Ser Lys 
<210>8 
<211>28 
<212>DNA 
<213>引物 
<400>8 
gagatttatg gataatcacc aggagtta                               28 
<210>9 
<211>26 
<212>DNA 
<213>引物 
<400>9 
aatttggttt tgttgctcct ggattt                                 26 
<210>10 
<211>27 
<212>DNA 
<213>引物 
<400>10 
gtcatcgata ccatataaac acggaca                                         27 
<210>11 
<211>26 
<212>DNA 
<213>引物 
<400>11 
ggggcccact gaataataaa gcattt                                          26 

Claims (10)

1.一种青霉素G酰化酶的突变基因，其特征在于，其表达蛋白的氨基酸序列与巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的氨基酸序列相比，在位点α144上的酪氨酸被精氨酸替代，或位点β24上的缬氨酸被苯丙氨酸替代或以上这些突变位点的组合，以及这些突变位点与其它同义突变的组合，其中，所述巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的DNA序列如SEQ IDNo.1所示。
2.如权利要求1所述的突变基因，其特征在于，其表达蛋白的氨基酸序列与巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的氨基酸序列相比，在位点α144上的酪氨酸被精氨酸替代，同时在位点β24上的缬氨酸被苯丙氨酸替代，其中，所述巨大芽孢杆菌青霉素G酰化酶的DNA序列如SEQ ID No.1所示。
3.如权利要求1或2所述的突变基因，其特征在于，该突变基因的DNA序列是通过对巨大芽孢杆菌来源的PGA的DNA序列进行定点突变而获得的。
4.一种突变质粒，其特征在于，该突变质粒含有如权利要求1-3中任一项所述的突变基因的DNA序列。
5.如权利要求4所述的突变质粒，其特征在于，该突变质粒还含有氨苄霉素抗性基因。
6.一种具有青霉素G酰化酶合成性能的工程菌，其特征在于，该工程菌转化有权利要求4或5所述的突变质粒。
7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，该工程菌为枯草杆菌。
8.如权利要求7所述的工程菌，其特征在于，该工程菌为枯草杆菌WB600。
9.一种权利要求1-3中任一项所述的突变基因的DNA序列所表达的青霉素G酰化酶突变酶。
10.如权利要求9所述的突变酶，其特征在于，该酶由权利要求6-8任一项所述的工程菌经发酵而获得。
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