CN103074320B - 含有一个或几个点突变的青霉素g酰化酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新的青霉素G酰化酶突变体，编码所述突变体的核酸，相关表达载体和宿主细胞以及所述突变体合成阿莫西林的用途。

Description

含有一个或几个点突变的青霉素G酰化酶

技术领域

本发明涉及药物生产领域，具体涉及β-内酰胺类抗生素生产及其生产用酶，更具体涉及青霉素G酰化酶及其在β-内酰胺类抗生素生产中的应用。

背景技术

β-内酰胺类抗生素是临床应用中最重要的一大类抗生素（包括青霉素和头孢菌素等），其分子中所含的青霉烷或头孢烯能够破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用。天然存在的β-内酰胺类抗生素具有抗菌谱窄、不耐酸、容易产生抗药性和容易引起过敏反应等缺点，这些缺点促使了半合成青霉素和半合成头孢菌素的研发。

青霉素G酰化酶(penicillin G acylase，PGA，EC 3.5.1.11）)可以水解青霉素G(penicillinG，PenG)获得β-内酰胺抗生素工业中的重要中间体6-氨基青霉烷酸(6-amino-penicillanic acid，6-APA)，同时又可以6-APA为原料合成其他多种合成或半合成β-内酰胺类抗生素。因此，PGA是β-内酰胺类抗生素工业中一种具有重要意义的生物催化剂。

由于PGA的开发具有诱人前景，许多科研院所及制药企业投入大量的研究，并有大量研究文献与专利相继报道。目前已经从许多细菌中克隆并表达出编码PGA的基因，如大肠杆菌(Escherichia coli，Ec)、嗜柠檬酸克吕沃尔氏菌(Kluyvera citrophila，Kc)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri，Pr)、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis，Af)、无色杆菌木糖氧化属(Achromobacter xylosoxidans，Ax)、假单胞菌属(Pseudomonas sp，Ps)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，Bm)与粘节杆菌(Arthrobacterviscosus，Av)等。

周政（Acta Biochemica et Biophysica，35（6）：573-579）、程天凡（2005，浙江大学硕士学位论文）等利用PGA基因家族重排技术对PGA基因进行改造，分别获得了合成活性提高的重组体和合成/水解比率提高的重组体；Alkema等（Alkema WBL，2002， Eur. J.Biochem ，269：2093-2100）将αF146和βF24氨基酸残基分别突变为亮氨酸（Leu）和丙氨酸（Ala）后，氨苄青霉素和头孢氨苄的合成性能得到提高。

此外，国际专利申请WO96/05318通过突变底物结合位点的一个或多个氨基酸来改变PGA的特异性及合成/水解比率；WO98/20210报道了EcPGA的α142和α146位氨基酸的突变和β24、β56或β177位氨基酸的突变，特别是突变体βF 24A突变体合成青霉素和头孢菌素的产量具有显著提高；而在WO03/055998中，突变体αR145L、αR145C、αR145K虽然具有较高的合成/水解比率，但合成活性却大大降低，中国专利CN101177688所报道的BmPGA的突变体也显示了相似的结果。

虽然研究人员已经分离纯化并克隆表达出许多天然存在的PGA并进行改造，但这些PGA仍有很多方面不尽如人意，如成熟为活性酶的效率不高、合成活性低或合成/水解（S/H）比率低、生成的副产物多等不足。因此本领域存在对具有合成/水解比率高、合成活性高和副产物少的青霉素G酰化酶的需要。

发明内容

本发明涉及新的青霉素G酰化酶突变体，编码所述突变体的核酸，相关表达载体和宿主细胞以及所述突变体合成阿莫西林的用途。本发明的青霉素G酰化酶突变体的合成活性和合成/水解比率相比野生型有了较大的提高，副产物降低，原料利用率有了很大提升，降低了成本，减少了能耗和环境污染。

本发明还构建了青霉素G酰化酶突变体的四倍体表达盒重组菌，使产酶量显著提高，成本大大降低，节约了发酵产酶环节的原料、人员及时间成本。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含选自αN110Q、αD154E、αN176Q、αQ204N、βE85D、βK95R、βQ233N、βD334E中的任意一至八个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αN110Q氨基酸突变，以及选自αD154E、αN176Q、αQ204N、βE85D、βK95R、βQ233N、βD334E中的任意一至七个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αD154E氨基酸突变，以及选自αN110Q、αN176Q、αQ204N、βE85D、βK95R、βQ233N、βD334E中的任意一至七个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αN176Q氨基酸突变，以及选自αN110Q、αD154E、αQ204N、βE85D、βK95R、βQ233N、βD334E中的任意一至七个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αQ204N氨基酸突变，以及选自αN110Q、αD154E、αN176Q、βE85D、βK95R、βQ233N、βD334E中的任意一至七个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含βE85D氨基酸突变，以及选自αN110Q、αD154E、αN176Q、αQ204N、βK95R、βQ233N、βD334E中的任意一至七个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含βK95R氨基酸突变，以及选自αN110Q、αD154E、αN176Q、αQ204N、βE85D、βQ233N、βD334E中的任意一至七个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含βQ233N氨基酸突变，以及选自αN110Q、αD154E、αN176Q、αQ204N、βE85D、βK95R、βD334E中的任意一至七个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含βD334E氨基酸突变，以及选自αN110Q、αD154E、αN176Q、αQ204N、βE85D、βK95R、βQ233N中的任意一至七个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αQ204N、βE85D氨基酸突变，以及选自αN110Q、αD154E、αN176Q、βK95R、βQ233N、βD334E中的任意一至六个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αQ204N、βK95R氨基酸突变，以及选自αN110Q、αD154E、αN176Q、βE85D、βQ233N、βD334E中的任意一至六个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αN110Q、αQ204N、βE85D氨基酸突变，以及选自αD154E、αN176Q、βK95R、βQ233N、βD334E中的任意一至五个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αD154E、αQ204N、βE85D氨基酸突变，以及选自αN110Q、αN176Q、βK95R、βQ233N、βD334E中的任意一至五个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αQ204N、βE85D、βQ233N氨基酸突变，以及选自αN110Q、αD154E、αN176Q、βK95R、βD334E中的任意一至五个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αQ204N、βE85D、βD334E氨基酸突变，以及选自αN110Q、αD154E、αN176Q、βK95R、βQ233N中的任意一至五个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αN110Q、αQ204N、βK95R氨基酸突变，以及选自αD154E、αN176Q、βE85D、βQ233N、βD334E中的任意一至五个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αQ204N、βK95R、βQ233N氨基酸突变，以及选自αN110Q、αD154E、αN176Q、βE85D、βD334E中的任意一至五个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αD154E、αQ204N、βE85D、βQ233N氨基酸突变，以及选自αN110Q、αN176Q、βK95R、βD334E中的任意一至四个氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αN110Q、αQ204N和βK95R氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αD154E、αQ204N和βQ233N氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αN176Q、αQ204N和βD334E氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αN110Q、αQ204N、βK95R和βQ233N氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αN110Q、αQ204N、βE85D和βD334E氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αD154E、αQ204N、βE85D和βQ233N氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αN110Q、αQ204N、βE85D、βK95R和βD334E氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上包含αD154E、αQ204N、βE85D、βQ233N和βD334E氨基酸突变。

在一个实施方案中，本发明提供了编码本文所述的青霉素G酰化酶突变体的核酸，且所述核酸包括根据简并性编码本文所述的青霉素G酰化酶突变体的核酸。编码SEQ IDNO.1所述的青霉素G酰化酶野生型的一种形式的核苷酸序列如SEQ ID NO.2中所述。

在一个实施方案中，本发明提供了编码本文所述的青霉素G酰化酶突变体的核酸的表达载体。可以采用的表达载体包括所有含有必须表达元件的载体，如Novagen公司的原核表达pET系列的卡那霉素抗性载体及Invitrogen公司的酵母表达载体pAO815、pPIC3.5等。本发明所要保护的突变PGA基因的可采用载体不仅限于举例载体。

在一个实施方案中，本发明提供了编码本文所述的青霉素G酰化酶突变体的核酸的表达载体，其中所述表达载体具有多于一个拷贝的表达盒，例如具有二、三或四个拷贝的表达盒，优选具有四个拷贝的表达盒。多拷贝表达盒的使用可在一定程度上提高酶活。

在一个实施方案中，本发明提供了宿主细胞，其包含编码本文所述的青霉素G酰化酶突变体的核酸的表达载体。宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞。原核细胞优选选自细菌、放线菌等，更优选大肠杆菌（Escherichia coli），更进一步优选大肠杆菌BL21(DE3)。真核细胞优选选自酵母细胞，更优选巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，更进一步优选巴斯德毕赤酵母GS115。所述表达载体可通过转化、转染或侵染等本领域公知方式导入宿主细胞。

在一个实施方案中，本发明提供了本文所述的青霉素G酰化酶突变体用于催化6-APA和对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐（HPGM·HCl）反应合成阿莫西林的用途。

在一个实施方案中，本发明提供了合成阿莫西林的方法，其采用本文所述的青霉素G酰化酶突变体催化6-APA和HPGM·HCl反应合成阿莫西林。

除非本文另有定义，本发明使用的相关科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。而且，除非上下文有其它规定，单数形式的术语应当包括复数，而复数形式的术语应当包括单数。通常，与本文所述的分子生物学、酶学及细胞生物学相关使用的命名以及技术，是本领域众所周知且普遍使用的那些。除非另有说明，下面的术语应当理解为具有下述含义：

如本文所用，“青霉素G酰化酶野生型” 指埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC11105的青霉素G酰化酶野生型，其α、β链定义如下：从N端起始依次为：信号肽：26个氨基酸；α链：209个氨基酸；连接肽：54个氨基酸；β链：557个氨基酸。信号肽及连接肽在翻译后切除，由α链和β链组成有活性的青霉素G酰化酶。青霉素G酰化酶野生型的氨基酸序列如SEQID NO.1中所述，其一种形式的核苷酸序列如SEQ ID NO.2中所述，且包括根据简并性编码SEQ ID NO.1所述的青霉素G酰化酶野生型的核苷酸序列。

如本文所用，“青霉素G酰化酶突变体”包含野生型多肽内的一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的缺失和/或添加，和/或野生型多肽中的一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的置换。本文所用的“野生型”氨基酸序列包含自然出现的氨基酸序列。本文所用的“青霉素G酰化酶突变体”的具体突变的含义如下：αN110Q为α链上第110位氨基酸N突变为Q、αD154E为α链上第154位氨基酸D突变为E、αN176Q为α链上第176位氨基酸N突变为Q、αQ204N为α链上第204位氨基酸Q突变为N、βE85D为β链上第85位氨基酸E突变为D、βK95R为β链上第95位氨基酸K突变为R、βQ233N为β链上第233位氨基酸Q突变为N、βD334E为β链上第334位氨基酸D突变为E （氨基酸名称和缩写见表1）。

表1：氨基酸名称和缩写

中文名称	英文名称	三字母缩写	单字母缩写
				甘氨酸	Glycine	Gly	G
丙氨酸	Alanine	Ala	A
				缬氨酸	Valine	Val	V
亮氨酸	Leucine	Leu	L
				异亮氨酸	Isoleucine	Ile	I
脯氨酸	Proline	Pro	P
				苯丙氨酸	Phenylalanine	Phe	F
酪氨酸	Tyrosine	Tyr	Y
				色氨酸	Tryptophan	Trp	W
丝氨酸	Serine	Ser	S
				苏氨酸	Threonine	Thr	T
半胱氨酸	Cysteine	Cys	C
				蛋氨酸	Methionine	Met	M
天冬酰胺	Asparagine	Asn	N
				谷氨酰胺	Glutamine	Gln	Q
天冬氨酸	Aspartic acid	Asp	D
				谷氨酸	Glutamic acid	Glu	E
赖氨酸	Lysine	Lys	K
				精氨酸	Arginine	Arg	R
组氨酸	Histidine	His	H

如本文所用，“宿主细胞”是指包含本发明的核酸的表达载体的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如细菌、放线菌，或者真核细胞如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是细菌或酵母，包括酶生产领域常用的细菌和酵母；更优选大肠杆菌（Escherichia coli）和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；特别优选大肠杆菌BL21(DE3)和巴斯德毕赤酵母GS115。

如本文所用，“表达”是指源于本发明的核酸分子（通常为DNA分子）经转录为mRNA而翻译成多肽的过程。

如本文所用，“ATCC”指美国典型培养物保藏中心，是位于Virginia，USA的微生物保藏中心。

如本文所用，“转化率”指原料转化成产物的摩尔百分比。具体地，如本文所用，“6-APA的转化率”计算如下：[生成的阿莫西林摩尔数/（未反应的6-APA摩尔数+生成的阿莫西林摩尔数）]×100%；该值反映了青霉素G酰化酶的合成活性。

如本文所用，“包含”在本发明的说明书和权利要求中指“包括但不限于”。

本发明的青霉素G酰化酶突变体可以高效快速催化6-APA和HPGM·HCl反应合成阿莫西林，具有较高的S/H比，能在短时间内达到98%以上的转化率，而本发明之前的研究的转化率低于90%。

本发明使在相同条件下的转化率有了很大提高，副产物大大降低，原料利用率有了很大提升，降低了成本，减少了能耗和环境污染。尤其是四倍体表达盒重组菌的构建使产酶成本大大降低，单拷贝发酵一批获得的酶活约4000U/L，四拷贝的构建使发酵一批获得的酶活约15000U/L，四拷贝表达盒的构建使发酵产酶环节的原料、人员及时间成本至少降低四分之三。

附图说明

图1为PGA的PCR产物图。图中M为核酸标记物（Trans 2K Marker），从上到下分别为5000、3000、2000、1000、750、500、250、100bp；1为PGA的PCR扩增条带，与预测大小一致。

图2为pAO815-PGA酶切鉴定图。图中M为核酸标记物（Trans 1K Marker），从上到下分别为10000、8000、6000、5000、4000、3000、2000、1000bp；1为pAO815-PGA用EcoRI酶切产物，从上到下分子量大小分别为7700和2500，与预测大小一致，载体构建成功。

图3为pAO815-2PGA酶切鉴定图。图中M为核酸标记物（Trans 1K Marker），从上到下分别为15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500bp；1为pAO815-2PGA用BamHI和BglII双酶切产物，从上到下分别为7400、4000、2400bp，与预测大小一致，载体构建成功。

图4为pAO815-4PGA酶切鉴定图。图中M为核酸标记物（Trans 15K Marker），从上到下分别为15000、10000、7500、5000、3000、1500、1000、500bp；1为pAO815-4PGA用BamHI和BglII双酶切产物，从上到下分别为15000、4000、2400bp，与预测大小一致，载体构建成功。

图5为不同拷贝表达盒重组巴斯德毕赤酵母发酵罐酶活情况。由图可见，四个以内的PGA表达盒的拷贝数与单位发酵体积酶活成正比，基本与拷贝数成倍数关系。

图6为PGA催化阿莫西林合成HPLC图，具体为PGA重组巴斯德毕赤酵母发酵粗酶液催化阿莫西林合成HPLC图，其中6-APA的转化率可达98%以上。

序列说明

SEQ ID NO.1

埃希氏大肠杆菌ATCC11105

青霉素G酰化酶氨基酸序列

MKNRNRMIVNCVTASLMYYWSLPALAEQSSSEIKIVRDEYGMPHIYANDTWHLFYGYGYVVAQDRLFQMEMARRSTQGTVAEVLGKDFVKFDKDIRRNYWPDAIRAQIAALSPEDMSILQGYADGMNAWTDKVNTNPETLLPKQFNTFGFTPKRWEPFDVAMIFVGTMANRFSDSTSEIDNLALLTALKDKYGVSQGMAVFNQLKWLVNPSAPTTIAVQESNYPLKFNQQNSQTAALLPRYDLPAPMLDRPAKGADGALLALTAGKNRETIAAQFAQGGANGLAGYPTTSNMWVIGKSKAQDAKAIMVNGPQFGWYAPAYTYGIGLHGAGYDVTGNTPFAYPGLVFGHNGVISWGSTAGFGDDVDIFAERLSAEKPGYYLHNGKWVKMLSREETITVKNGQAETFTVWRTVHGNILQTDQTTQTAYAKSRAWDGKEVASLLAWTHQMKAKNWQEWTQQAAKQALTINWYYADVNGNIGYVHTGAYPDRQSGHDPRLPVPGTGKWDWKGLLPFEMNPKVYNPQSGYIANWNNSPQKDYPASDLFAFLWGGADRVTEIDRLLEQKPRLTADQAWDVIRQTSRQDLNLRLFLPTLQAATSGLTQSDPRRQLVETLTRWDGINLLNDDGKTWQQPPSAILNVWLTSMLKRTVVAAVPMPFDKWYSASGYETTQDGPTGSLNISVGAKILYEAVQGDKSPIPQAVDLFAGKPQQEVVLAALEDTWETLSKRYGNNVSNWKTPAMALTFRANNFFGVPQAAAEETRHQAEYQNRGTENDMIVFSPTTSDRPVLAWDVVAPGQSGFIAPDGTVDKHYEDQLKMYENFGRKSLWLTKQDVEAHKESQEVLHVQR

SEQ ID NO.2

埃希氏大肠杆菌ATCC11105

青霉素G酰化酶核苷酸序列

ATGAAAAATAGAAATCGTATGATCGTGAACTGTGTTACTGCTTCCCTGATGTATTATTGGAGCTTACCTGCACTGGCTGAGCAGTCGTCAAGTGAGATAAAGATTGTTCGCGATGAATACGGCATGCCGCATATTTATGCCAATGATACATGGCACCTATTTTATGGCTATGGCTATGTAGTAGCACAAGATCGCCTTTTTCAGATGGAAATGGCACGTCGCAGTACTCAAGGGACTGTCGCGGAAGTGCTTGGCAAAGATTTTGTGAAATTTGATAAAGATATCCGTCGTAACTACTGGCCGGATGCTATCCGGGCGCAAATTGCTGCCCTTTCCCCAGAGGATATGTCCATTCTGCAAGGCTACGCTGATGGAATGAATGCCTGGACTGATAAGGTAAATACCAATCCAGAGACGCTCTTACCAAAACAGTTTAATACATTTGGCTTTACTCCTAAGCGCTGGGAACCGTTTGATGTCGCGATGATATTTGTGGGCACCATGGCAAACCGCTTCTCTGATAGCACTAGCGAAATTGATAATCTGGCACTGCTAACGGCTTTAAAAGATAAATATGGTGTATCACAAGGCATGGCGGTATTTAATCAGTTGAAATGGCTGGTAAACCCATCAGCGCCAACCACTATTGCCGTACAAGAGAGTAACTACCCACTTAAATTTAATCAGCAAAACTCGCAAACAGCAGCTCTGTTGCCACGCTACGATTTACCTGCACCAATGCTTGACCGACCAGCAAAAGGGGCGGATGGCGCACTGCTGGCGTTAACAGCAGGGAAGAACCGGGAAACTATTGCTGCACAATTTGCACAGGGTGGTGCCAATGGTCTGGCGGGGTATCCAACGACCAGCAATATGTGGGTGATCGGCAAAAGCAAAGCCCAGGATGCGAAAGCAATCATGGTAAATGGTCCGCAGTTTGGCTGGTATGCGCCTGCGTATACTTATGGTATTGGTCTGCACGGTGCTGGTTATGATGTCACTGGCAATACACCATTTGCCTATCCTGGGCTGGTTTTTGGTCATAATGGTGTGATTTCCTGGGGATCAACGGCAGGTTTCGGCGATGATGTCGATATTTTTGCTGAACGGCTGTCGGCAGAGAAACCAGGCTACTACTTGCATAATGGTAAGTGGGTGAAAATGTTAAGCCGTGAGGAAACCATTACGGTGAAAAATGGTCAGGCAGAGACCTTTACTGTCTGGCGTACGGTGCATGGCAACATTCTCCAAACTGACCAGACGACACAAACGGCTTACGCTAAATCCCGCGCATGGGATGGTAAAGAGGTGGCGTCTTTGCTGGCCTGGACTCATCAGATGAAGGCCAAAAATTGGCAGGAGTGGACACAGCAGGCAGCGAAACAAGCACTGACCATCAACTGGTACTATGCTGATGTAAACGGCAATATTGGTTATGTTCATACTGGTGCTTATCCAGATCGTCAATCAGGCCATGATCCGCGATTACCCGTTCCTGGTACGGGAAAATGGGACTGGAAAGGGCTATTGCCTTTTGAAATGAACCCTAAGGTGTATAACCCCCAGTCGGGATATATTGCTAACTGGAACAATTCTCCCCAAAAAGATTATCCCGCTTCAGATCTGTTTGCCTTTTTGTGGGGTGGTGCAGATCGCGTTACGGAGATCGACCGACTGCTTGAGCAAAAGCCACGCTTAACTGCTGATCAGGCATGGGATGTTATTCGCCAAACCAGTCGTCAGGATCTTAACCTGAGGCTTTTTTTACCTACTCTGCAAGCAGCGACATCTGGTTTGACACAGAGCGATCCGCGTCGTCAGTTGGTAGAAACATTAACACGTTGGGATGGCATCAATTTGCTTAATGATGATGGTAAAACCTGGCAGCAGCCACCGTCTGCCATCCTGAACGTTTGGCTGACCAGTATGTTGAAGCGTACCGTAGTGGCTGCCGTACCTATGCCATTTGATAAGTGGTACAGCGCCAGTGGCTACGAAACAACCCAGGACGGCCCAACTGGTTCGCTGAATATAAGTGTTGGAGCAAAAATTTTGTATGAGGCGGTGCAGGGAGACAAATCACCAATCCCACAGGCGGTTGATCTGTTTGCTGGGAAACCACAGCAGGAGGTTGTGTTGGCTGCGCTGGAAGATACCTGGGAGACTCTTTCCAAACGCTATGGCAATAATGTGAGTAACTGGAAAACACCTGCAATGGCCTTAACGTTCCGGGCAAATAATTTCTTTGGTGTACCGCAGGCCGCAGCGGAAGAAACGCGTCATCAGGCGGAGTATCAAAACCGTGGAACAGAAAACGATATGATTGTTTTCTCACCAACGACAAGCGATCGTCCTGTGCTTGCCTGGGATGTGGTCGCACCCGGTCAGAGTGGGTTTATTGCTCCCGATGGAACAGTTGATAAGCACTATGAAGATCAGCTGAAAATGTACGAAAATTTTGGCCGTAAGTCGCTCTGGTTAACGAAGCAGGATGTGGAGGCGCATAAGGAGTCGCAGGAAGTGTTGCACGTTCAGAGATAA

实施例

在以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例示出了实施本发明的简要方法，但不限定其所有可能变型。

缩写含义如下：“min”表示分钟，“s”表示秒，“U”表示酶活单位，“mM”表示毫摩尔每升，“M”表示摩尔每升，“rpm”表示转每分钟，“mol”表示摩尔，“µg”表示微克，“mg”表示毫克，“g”表示克，“µl”表示微升，“ml”表示毫升，“bp”表示碱基对。

实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》（J. 萨姆布鲁克，D. W. 拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译. 第3版，北京：科学出版社，2002）及毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒（Invitrogen）中所述的方法进行。

下述实施例利用基因工程技术，从含有青霉素G酰化酶活性的E.coli ATCC11105的基因组中，扩增出青霉素G酰化酶野生型基因序列，通过定点突变技术对该基因进行改造，并将该青霉素G酰化酶突变体基因克隆到表达载体，并将相应的表达质粒转化到相应的宿主菌。在大肠杆菌宿主表达系统，小试反应筛选出在相同条件下具有高转化率的PGA突变体，然后在巴斯德毕赤酵母GS115表达系统构建四倍体表达盒，以提高酶产量及酶活，同时使用优选PGA突变体大规模生产阿莫西林，结果显示，所述青霉素G酰化酶突变体在催化6-APA和HPGM·HCl合成阿莫西林的反应中具有很高的S/H比，能在短时间内达到98%以上的转化率。

实施例1 青霉素G酰化酶突变体编码基因的构建、原核表达及功能鉴定

1.引物设计

将GeneBank上E.coli ATCC11105来源的青霉素G酰化酶为基因序列，全基因合成该序列，并设计引物。

用于在原核表达载体pET-24a克隆的引物序列为：

引物P1：5’-ACCGCATATGGAGCAGCTTAGTTCAGAAATC-3’（带下划线的碱基为NdeI识别位点）；

引物P2：5’-ACCGAAGCTTATCTCTGGACGTGAAGGAC -3’（带下划线的碱基为HindIII识别位点）；该对引物扩增出的青霉素G酰化酶基因序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的青霉素G酰化酶蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

用于在酵母胞内表达载体pAO815克隆的引物序列为：

引物P3：5’-ACCGGAATTCGAGCAGCTTAGTTCAGAAATC-3’（带下划线的碱基为EcoRI识别位点）；

引物P4：5’-ACCGGAATTCTTATCTCTGGACGTGAAGGAC-3’（带下划线的碱基为EcoRI识别位点）；

定点突变引物

αN110Q-1：5’-TCGACAAAGTTAACACCCAACCGGAAACGCTGCTGCC-3’

αN110Q-2：5’-GGCAGCAGCGTTTCCGGTTGGGTGTTAACTTTGTCGA-3’

αD154E-1：5’-ATAGCACTAGCGAAATTGAAAATCTGGCACTGCTAACG-3’

αD154E-2：5’-CGTTAGCAGTGCCAGATTTTCAATTTCGCTAGTGCTAT-3’

αN176Q-1：5’-CACAAGGCATGGCGGTATTTCAACAGTTGAAATGGCTGGT-3’

αN176Q-2：5’-ACCAGCCATTTCAACTGTTGAAATACCGCCATGCCTTGTG-3’

αQ204N-1：5’-CCGCTGAAATTCAACCAGAATAATAGCCAGACCGCAGCT-3’

αQ204N-2：5’-AGCTGCGGTCTGGCTATTATTCTGGTTGAATTTCAGCGG-3’

βE85D-1：5’-ACGTCTGTCGGCCGATAAACCGGGCTATTAC-3’

βE85D-2：5’-GTAATAGCCCGGTTTATCGGCCGACAGACGT-3’

βK95R-1：5’-AAACCGGGCTATTACCTGCATAATGGTCGCTGGGTGAAAATGCTGAG-3’

βK95R-2：5’-CTCAGCATTTTCACCCAGCGACCATTATGCAGGTAATAGCCCGGTTT-3’

βQ233N-1：5’-CCCTAAGGTGTATAACCCCAACTCGGGATATATTGCTAACT-3’

βQ233N-2：5’-AGTTAGCAATATATCCCGAGTTGGGGTTATACACCTTAGGG-3’

βD334E-1：5’-GTATTAACCTGCTGAATGAAGACGGCAAAACCTGG-3’

βD334E-2：5’-CCAGGTTTTGCCGTCTTCATTCAGCAGGTTAATAC-3’

引物由南京金斯瑞公司合成，然后用无菌水溶解。

2. 野生型青霉素G酰化酶(PGA)基因原核表达

将E.coli ATCC11105菌株的单菌落挑到LB液体培养基中，37℃震荡培养，收集菌体，提取基因组DNA，以其为模板，用P1和P2引物PCR扩增青霉素G酰化酶基因。其中PCR所用聚合酶及相应扩增缓冲液、dNTP溶液均由TaKaRa公司购得。

PCR反应体系为：

10×Buffer（Mg²⁺） 5μL

dNTP 4μL

引物P1 2μL

引物P2 2μL

模板 2μL

ddH₂O 34.5μL

Pyrobest 0.5μL

总体积 50μL

PCR反应条件为：先95℃ 4 min；然后95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2.5 min，共20个循环；再72℃ 10 min。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，扩增到一条2500 bp左右的条带，大小与预测结果一致。回收该PCR产物片段，利用限制性内切酶NdeI和HindIII将PCR扩增产物连接入大肠杆菌表达载体pET-24a（购自Novagen公司）中相应的位点，得到重组表达质粒pET24a-PGA，将重组表达质粒转化到感受态E.coli Top10（购自全式金公司）中，然后在含卡那霉素抗性（50μg/mL）LB平板培养基上筛选阳性克隆，在相应引物的引导下，用菌落PCR的方法验证筛选的阳性克隆（转化子），将阳性克隆送Invitrogen公司测序。将测序正确的阳性转化子转入E.coli BL21(DE3)（购自全式金公司）中。将E.coliBL21(DE3)（pET24a-PGA）置于LB液体培养基中37℃、160转震荡培养，至菌密度OD600为0.8左右时，加入1mM的 IPTG于20℃ 诱导12小时，表达青霉素G酰化酶。

3. 青霉素G酰化酶定点突变

基因定点突变试剂盒是利用含有需要突变的位点的引物，通过Pfu高保真酶对从常规大肠杆菌中提取的甲基化质粒作为模板进行环扩增形成带缺刻的开环质粒，之后用DpnI消化甲基化模板质粒，将扩增的带缺刻的开环质粒转入大肠杆菌，即可形成带有突变的闭环质粒。

利用Stratagene公司的基因定点突变试剂盒（QuikChange XL Site-directedMutagenesis kit）对青霉素G酰化酶基因进行αN110Q定点突变。

PCR反应体系为：

10×Buffer 2.5μL

Quick solution 1.5μL

dNTP 2μL

模板 1μL

αN110Q-1 1μL

αN110Q-2 1μL

ddH₂O 15.5μL

Pfu Tubo 0.5μL

总体积 25μL

PCR反应条件为：先95℃ 1 min；然后95℃ 50 s，60℃ 50s，68℃ 8 min，共20个循环；再68℃ 10 min。PCR产物加入0.5μL DpnI消化1h后转化大肠杆菌，菌落PCR检测并送Invitrogen公司测序。

依上述方法改变引物后进行αD154E、αN176Q、αQ204N、βE85D、βK95R、βQ233N、βD334E单点突变，分别以获得的单点突变的青霉素G酰化酶基因为模板，按照上述方法，进行二次突变，获得任意两点突变的青霉素G酰化酶突变体基因，并以此方法进行三点突变、四点突变、五点突变，获得的突变体如下表2。

分别进行菌体培养和诱导表达青霉素G酰化酶突变体。

表2：青霉素G酰化酶突变体及对应突变位点

名称	突变位点
		突变体1-8	单点突变，依次为αN110Q、αD154E、αN176Q、αQ204N、βE85D、βK95R、βQ233N、βD334E
突变体9	αN110Q-αQ204N
		突变体10	αD154E-αQ204N
突变体11	αN176Q-αQ204N
		突变体12	αQ204N-βE85D
突变体13	αQ204N-βK95R
		突变体14	αQ204N-βQ233N
突变体15	αQ204N-βD334E
		突变体16	αN110Q-αQ204N-βE85D
突变体17	αN110Q-αQ204N-βK95R
		突变体18	αD154E-αQ204N-βQ233N
突变体19	αN176Q-αQ204N-βD334E
		突变体20	αN110Q-αQ204N-βK95R-βQ233N
突变体21	αN110Q-αQ204N-βE85D-βD334E
		突变体22	αD154E-αQ204N-βE85D-βQ233N
突变体23	αN110Q-αQ204N-βE85D-βK95R-βD334E
		突变体24	αD154E-αQ204N-βE85D-βQ233N-βD334E

4. 大肠杆菌中青霉素G酰化酶突变体的粗酶粉的制备

将经过IPTG诱导的菌液离心去上清，湿细胞重悬于磷酸盐缓冲液中，并用超声细胞破碎仪以200W的功率超声20分钟，超声后，加入PI（聚乙醇胺）沉淀核酸，将样品在10000rpm离心20分钟，离心上清作为粗酶液，将上清液冻干得青霉素G酰化酶的粗酶粉。

5. 青霉素G酰化酶功能鉴定及筛选

转化率：反应生成的阿莫西林的摩尔数占未反应的底物6-APA摩尔数和反应生成的阿莫西林的摩尔数之和的百分比。

实施例中底物6-APA（6-氨基青霉烷酸）的终浓度为2mg/ml，6-APA与HPGM·HCl（对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐）的mol比为1:1.3～1.6。将适量粗酶液加入总体积3ml的反应体系，反应1h后HPLC测定，计算反应转化率。

如表3所示，青霉素G酰化酶突变体的催化活性均高于野生型青霉素G酰化酶，尤其是突变体20、21、22、24。

表3：野生型青霉素G酰化酶及其突变体原核表达的转化率

名称	转化率（%）	名称	转化率（%）
				野生型PGA	17.2	突变体13	19.3
突变体1	18.5	突变体14	19.9
				突变体2	19.2	突变体15	20.5
突变体3	18.8	突变体16	20.8
				突变体4	23.3	突变体17	28.9
突变体5	20.1	突变体18	30.3
				突变体6	19.9	突变体19	26.6
突变体7	20.8	突变体20	34.2
				突变体8	22.7	突变体21	33.8
突变体9	18.1	突变体22	35.1
				突变体10	25.2	突变体23	28.4
突变体11	19.4	突变体24	32.5
				突变体12	20.9

实施例2 青霉素G酰化酶突变体真核表达及功能鉴定

分别构建突变体20、21、22、24的四拷贝酵母表达载体并转化巴斯德毕赤酵母细胞，以下以突变体20进行阐述，其它突变体的构建方法相同。

1. 青霉素G酰化酶突变体真核表达

将突变体20的PGA基因利用引物P3和P4所带的EcoRI酶切位点引入酵母表达载体pAO815（invitrogen公司），转化到E.coli TOP10中，将E.coli TOP10(pAO815-PGA)置于LB液体培养基中37℃、160转震荡培养过夜，中提重组质粒。利用SalI线性化重组质粒pAO815-PGA。

将线性化的重组质粒pAO815-PGA转化酵母细胞。

巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞（invitrogen公司）的制备：将Pichia GS115单菌落挑入YPD培养基中活化，活化的Pichia GS115按0.5%的接种量接入50 ml YPD培养基中培养至对数期，离心获得的菌体用20ml无菌水洗2次，再用20ml无菌1 M山梨醇洗2次，加入1ml山梨醇重悬菌体获得巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞。将线性化pAO815-PGA加入80 μl 巴斯德毕赤酵母GS115感受态细胞中冰浴5分钟，电转化后加入800 μl山梨醇将细胞洗至EP管中，25℃温育2h后，离心，涂MD平板培养至长出菌落后，划线分离出单菌落。将单菌落挑入无菌水中加入适量Lyticase后37℃温育1h消化细胞壁，取部分消化产物加入PCR体系检测阳性克隆。

将阳性克隆编号挑入YPD液体培养基活化后转接入BMGY液体培养基中培养至OD为1.0时接入1%甲醇诱导，诱导72h，每24h补加一次甲醇用于表达青霉素G酰化酶。

2. 青霉素G酰化酶突变体多拷贝表达盒的构建

利用pAO815载体上BglII和BamHI同位酶的特性构建多拷贝表达盒，将pAO815-PGA（突变体20）用BglII和BamHI双酶切，结果如图2，回收带有青霉素G酰化酶突变体基因的表达盒部分的片段BglII-PGA-BamHI作为DNA片段，将pAO815-PGA用BamHI酶切并用磷酸酶去磷酸化，产物BamHI-pAO815-PGA-BamHI作为载体片段，将得到的两个片段用T4连接酶连接后转化E.coli TOP10，提质粒酶切鉴定如图3，获得含有2个拷贝青霉素G酰化酶突变体基因的表达质粒pAO815-2PGA。

同样的方法可以获得DNA片段BglII-PGA-BamHI/BglII-PGA-BamHI 和载体片段BamHI-pAO815-2PGA-BamHI，连接后可以获得含有4个拷贝青霉素G酰化酶突变体基因的表达质粒pAO815-4PGA，酶切鉴定结果如图4。

将线性化的pAO815-2PGA和pAO815-4PGA电转化毕赤酵母获得青霉素G酰化酶突变体多拷贝重组巴斯德毕赤酵母。

按上述方法获得突变体21、22、24的二、四拷贝重组巴斯德毕赤酵母。

3. 毕赤酵母中青霉素G酰化酶突变体的粗酶粉的制备

将经过甲醇诱导的菌液离心收集菌体，菌体用pH为6.5，0.05 mol/L的磷酸钠缓冲液重悬，加入适量的酸洗玻璃珠震荡破碎20min后，离心上清作为粗酶液，将上清液冻干得青霉素G酰化酶突变体的粗酶粉。

青霉素G酰化酶活性测定方法：在28℃，pH 8.0的0.05mol/L磷酸缓冲液中，每分钟水解青霉素G生成1μmol 的6-APA所需要的酶量定义为1个单位。此处测定的为青霉素G酰化酶的水解活性，以方便发酵过程测定，同样反映其合成活性。

取粗酶粉测定不同拷贝表达盒重组巴斯德毕赤酵母中突变体的酶活情况。如图5所示，在本实施例中的不同拷贝青霉素G酰化酶重组巴斯德毕赤酵母酶活测定结果显示，四拷贝和二拷贝的酶活与一拷贝基本呈倍数关系，使发酵产酶环节的原料、人员及时间成本约降低四分之三。

4. 青霉素G酰化酶突变体催化阿莫西林合成

将HPGM·HCl（对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐）溶于pH 6.5的50mM磷酸盐缓冲液中，终浓度为51.84mg/ml；待其完全溶解后，加入6-APA（6-氨基青霉烷酸），其终浓度为43.2mg/ml，利用NaOH调节其pH，使其稳定在pH6.2，平行进行四次试验，分别加入突变体20、21、22、24四个拷贝的粗酶液催化阿莫西林合成反应，反应5h，取反应液，HPLC检测阿莫西林生成。使用突变体20催化阿莫西林合成的HPLC图谱参见图6，使用突变体21、22和24催化阿莫西林合成得到相似的图谱（未附图），四个突变体反应的6-APA的转化率均可达98%以上，同样反应条件下以野生型PGA四拷贝催化合成阿莫西林的反应，其6APA的转化率达不到90%，结果未显示。

表4：四拷贝酵母表达的青霉素G酰化酶突变体的转化率

名称	转化率
		突变体20	98.5%
突变体21	98.9%
		突变体22	99.0%
突变体24	98.1%

序列表

<110> 石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司

<120> 含有一个或几个点突变的青霉素G酰化酶

<130> CPCH1261198N

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 846

<212> PRT

<213> 埃希氏大肠杆菌ATCC11105

<400> 1

Met Lys Asn Arg Asn Arg Met Ile Val Asn Cys Val Thr Ala Ser Leu

1 5 10 15

Met Tyr Tyr Trp Ser Leu Pro Ala Leu Ala Glu Gln Ser Ser Ser Glu

20 25 30

Ile Lys Ile Val Arg Asp Glu Tyr Gly Met Pro His Ile Tyr Ala Asn

35 40 45

Asp Thr Trp His Leu Phe Tyr Gly Tyr Gly Tyr Val Val Ala Gln Asp

50 55 60

Arg Leu Phe Gln Met Glu Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Thr Val

65 70 75 80

Ala Glu Val Leu Gly Lys Asp Phe Val Lys Phe Asp Lys Asp Ile Arg

85 90 95

Arg Asn Tyr Trp Pro Asp Ala Ile Arg Ala Gln Ile Ala Ala Leu Ser

100 105 110

Pro Glu Asp Met Ser Ile Leu Gln Gly Tyr Ala Asp Gly Met Asn Ala

115 120 125

Trp Thr Asp Lys Val Asn Thr Asn Pro Glu Thr Leu Leu Pro Lys Gln

130 135 140

Phe Asn Thr Phe Gly Phe Thr Pro Lys Arg Trp Glu Pro Phe Asp Val

145 150 155 160

Ala Met Ile Phe Val Gly Thr Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Ser Thr

165 170 175

Ser Glu Ile Asp Asn Leu Ala Leu Leu Thr Ala Leu Lys Asp Lys Tyr

180 185 190

Gly Val Ser Gln Gly Met Ala Val Phe Asn Gln Leu Lys Trp Leu Val

195 200 205

Asn Pro Ser Ala Pro Thr Thr Ile Ala Val Gln Glu Ser Asn Tyr Pro

210 215 220

Leu Lys Phe Asn Gln Gln Asn Ser Gln Thr Ala Ala Leu Leu Pro Arg

225 230 235 240

Tyr Asp Leu Pro Ala Pro Met Leu Asp Arg Pro Ala Lys Gly Ala Asp

245 250 255

Gly Ala Leu Leu Ala Leu Thr Ala Gly Lys Asn Arg Glu Thr Ile Ala

260 265 270

Ala Gln Phe Ala Gln Gly Gly Ala Asn Gly Leu Ala Gly Tyr Pro Thr

275 280 285

Thr Ser Asn Met Trp Val Ile Gly Lys Ser Lys Ala Gln Asp Ala Lys

290 295 300

Ala Ile Met Val Asn Gly Pro Gln Phe Gly Trp Tyr Ala Pro Ala Tyr

305 310 315 320

Thr Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly Ala Gly Tyr Asp Val Thr Gly Asn

325 330 335

Thr Pro Phe Ala Tyr Pro Gly Leu Val Phe Gly His Asn Gly Val Ile

340 345 350

Ser Trp Gly Ser Thr Ala Gly Phe Gly Asp Asp Val Asp Ile Phe Ala

355 360 365

Glu Arg Leu Ser Ala Glu Lys Pro Gly Tyr Tyr Leu His Asn Gly Lys

370 375 380

Trp Val Lys Met Leu Ser Arg Glu Glu Thr Ile Thr Val Lys Asn Gly

385 390 395 400

Gln Ala Glu Thr Phe Thr Val Trp Arg Thr Val His Gly Asn Ile Leu

405 410 415

Gln Thr Asp Gln Thr Thr Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Ser Arg Ala Trp

420 425 430

Asp Gly Lys Glu Val Ala Ser Leu Leu Ala Trp Thr His Gln Met Lys

435 440 445

Ala Lys Asn Trp Gln Glu Trp Thr Gln Gln Ala Ala Lys Gln Ala Leu

450 455 460

Thr Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp Val Asn Gly Asn Ile Gly Tyr Val

465 470 475 480

His Thr Gly Ala Tyr Pro Asp Arg Gln Ser Gly His Asp Pro Arg Leu

485 490 495

Pro Val Pro Gly Thr Gly Lys Trp Asp Trp Lys Gly Leu Leu Pro Phe

500 505 510

Glu Met Asn Pro Lys Val Tyr Asn Pro Gln Ser Gly Tyr Ile Ala Asn

515 520 525

Trp Asn Asn Ser Pro Gln Lys Asp Tyr Pro Ala Ser Asp Leu Phe Ala

530 535 540

Phe Leu Trp Gly Gly Ala Asp Arg Val Thr Glu Ile Asp Arg Leu Leu

545 550 555 560

Glu Gln Lys Pro Arg Leu Thr Ala Asp Gln Ala Trp Asp Val Ile Arg

565 570 575

Gln Thr Ser Arg Gln Asp Leu Asn Leu Arg Leu Phe Leu Pro Thr Leu

580 585 590

Gln Ala Ala Thr Ser Gly Leu Thr Gln Ser Asp Pro Arg Arg Gln Leu

595 600 605

Val Glu Thr Leu Thr Arg Trp Asp Gly Ile Asn Leu Leu Asn Asp Asp

610 615 620

Gly Lys Thr Trp Gln Gln Pro Pro Ser Ala Ile Leu Asn Val Trp Leu

625 630 635 640

Thr Ser Met Leu Lys Arg Thr Val Val Ala Ala Val Pro Met Pro Phe

645 650 655

Asp Lys Trp Tyr Ser Ala Ser Gly Tyr Glu Thr Thr Gln Asp Gly Pro

660 665 670

Thr Gly Ser Leu Asn Ile Ser Val Gly Ala Lys Ile Leu Tyr Glu Ala

675 680 685

Val Gln Gly Asp Lys Ser Pro Ile Pro Gln Ala Val Asp Leu Phe Ala

690 695 700

Gly Lys Pro Gln Gln Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Glu Asp Thr Trp

705 710 715 720

Glu Thr Leu Ser Lys Arg Tyr Gly Asn Asn Val Ser Asn Trp Lys Thr

725 730 735

Pro Ala Met Ala Leu Thr Phe Arg Ala Asn Asn Phe Phe Gly Val Pro

740 745 750

Gln Ala Ala Ala Glu Glu Thr Arg His Gln Ala Glu Tyr Gln Asn Arg

755 760 765

Gly Thr Glu Asn Asp Met Ile Val Phe Ser Pro Thr Thr Ser Asp Arg

770 775 780

Pro Val Leu Ala Trp Asp Val Val Ala Pro Gly Gln Ser Gly Phe Ile

785 790 795 800

Ala Pro Asp Gly Thr Val Asp Lys His Tyr Glu Asp Gln Leu Lys Met

805 810 815

Tyr Glu Asn Phe Gly Arg Lys Ser Leu Trp Leu Thr Lys Gln Asp Val

820 825 830

Glu Ala His Lys Glu Ser Gln Glu Val Leu His Val Gln Arg

835 840 845

<210> 2

<211> 2541

<212> DNA

<213> 埃希氏大肠杆菌ATCC11105

<400> 2

atgaaaaata gaaatcgtat gatcgtgaac tgtgttactg cttccctgat gtattattgg 60

agcttacctg cactggctga gcagtcgtca agtgagataa agattgttcg cgatgaatac 120

ggcatgccgc atatttatgc caatgataca tggcacctat tttatggcta tggctatgta 180

gtagcacaag atcgcctttt tcagatggaa atggcacgtc gcagtactca agggactgtc 240

gcggaagtgc ttggcaaaga ttttgtgaaa tttgataaag atatccgtcg taactactgg 300

ccggatgcta tccgggcgca aattgctgcc ctttccccag aggatatgtc cattctgcaa 360

ggctacgctg atggaatgaa tgcctggact gataaggtaa ataccaatcc agagacgctc 420

ttaccaaaac agtttaatac atttggcttt actcctaagc gctgggaacc gtttgatgtc 480

gcgatgatat ttgtgggcac catggcaaac cgcttctctg atagcactag cgaaattgat 540

aatctggcac tgctaacggc tttaaaagat aaatatggtg tatcacaagg catggcggta 600

tttaatcagt tgaaatggct ggtaaaccca tcagcgccaa ccactattgc cgtacaagag 660

agtaactacc cacttaaatt taatcagcaa aactcgcaaa cagcagctct gttgccacgc 720

tacgatttac ctgcaccaat gcttgaccga ccagcaaaag gggcggatgg cgcactgctg 780

gcgttaacag cagggaagaa ccgggaaact attgctgcac aatttgcaca gggtggtgcc 840

aatggtctgg cggggtatcc aacgaccagc aatatgtggg tgatcggcaa aagcaaagcc 900

caggatgcga aagcaatcat ggtaaatggt ccgcagtttg gctggtatgc gcctgcgtat 960

acttatggta ttggtctgca cggtgctggt tatgatgtca ctggcaatac accatttgcc 1020

tatcctgggc tggtttttgg tcataatggt gtgatttcct ggggatcaac ggcaggtttc 1080

ggcgatgatg tcgatatttt tgctgaacgg ctgtcggcag agaaaccagg ctactacttg 1140

cataatggta agtgggtgaa aatgttaagc cgtgaggaaa ccattacggt gaaaaatggt 1200

caggcagaga cctttactgt ctggcgtacg gtgcatggca acattctcca aactgaccag 1260

acgacacaaa cggcttacgc taaatcccgc gcatgggatg gtaaagaggt ggcgtctttg 1320

ctggcctgga ctcatcagat gaaggccaaa aattggcagg agtggacaca gcaggcagcg 1380

aaacaagcac tgaccatcaa ctggtactat gctgatgtaa acggcaatat tggttatgtt 1440

catactggtg cttatccaga tcgtcaatca ggccatgatc cgcgattacc cgttcctggt 1500

acgggaaaat gggactggaa agggctattg ccttttgaaa tgaaccctaa ggtgtataac 1560

ccccagtcgg gatatattgc taactggaac aattctcccc aaaaagatta tcccgcttca 1620

gatctgtttg cctttttgtg gggtggtgca gatcgcgtta cggagatcga ccgactgctt 1680

gagcaaaagc cacgcttaac tgctgatcag gcatgggatg ttattcgcca aaccagtcgt 1740

caggatctta acctgaggct ttttttacct actctgcaag cagcgacatc tggtttgaca 1800

cagagcgatc cgcgtcgtca gttggtagaa acattaacac gttgggatgg catcaatttg 1860

cttaatgatg atggtaaaac ctggcagcag ccaccgtctg ccatcctgaa cgtttggctg 1920

accagtatgt tgaagcgtac cgtagtggct gccgtaccta tgccatttga taagtggtac 1980

agcgccagtg gctacgaaac aacccaggac ggcccaactg gttcgctgaa tataagtgtt 2040

ggagcaaaaa ttttgtatga ggcggtgcag ggagacaaat caccaatccc acaggcggtt 2100

gatctgtttg ctgggaaacc acagcaggag gttgtgttgg ctgcgctgga agatacctgg 2160

gagactcttt ccaaacgcta tggcaataat gtgagtaact ggaaaacacc tgcaatggcc 2220

ttaacgttcc gggcaaataa tttctttggt gtaccgcagg ccgcagcgga agaaacgcgt 2280

catcaggcgg agtatcaaaa ccgtggaaca gaaaacgata tgattgtttt ctcaccaacg 2340

acaagcgatc gtcctgtgct tgcctgggat gtggtcgcac ccggtcagag tgggtttatt 2400

gctcccgatg gaacagttga taagcactat gaagatcagc tgaaaatgta cgaaaatttt 2460

ggccgtaagt cgctctggtt aacgaagcag gatgtggagg cgcataagga gtcgcaggaa 2520

gtgttgcacg ttcagagata a 2541

Claims (24)

1.一种青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述突变体与SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列相比，位点α204上的Gln被Asn替代，同时在以下位点的任意0-7个中发生以下氨基酸突变：位点α110上的Asn被Gln替代，或位点α154上的Asp被Glu替代，或位点α176上的Asn被Gln替代，或位点β85上的Glu被Asp替代，或位点β95上的Lys被Arg替代，或位点β233上的Gln被Asn替代，或位点β334上的Asp被Glu替代，其他位置氨基酸序列相同，且其中所述青霉素G酰化酶突变体与野生型相比，合成活性提高。

2.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变为αQ204N、βE85D氨基酸突变，以及选自αN110Q、αD154E、αN176Q、βK95R、βQ233N、βD334E中的任意一至六个氨基酸突变。

3.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变为αQ204N、βK95R氨基酸突变，以及选自αN110Q、αD154E、αN176Q、βE85D、βQ233N、βD334E中的任意一至六个氨基酸突变。

4.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变为αN110Q、αQ204N、βE85D氨基酸突变，以及选自αD154E、αN176Q、βK95R、βQ233N、βD334E中的任意一至五个氨基酸突变。

5.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变为αD154E、αQ204N、βE85D氨基酸突变，以及选自αN110Q、αN176Q、βK95R、βQ233N、βD334E中的任意一至五个氨基酸突变。

6.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变为αQ204N、βE85D、βQ233N氨基酸突变，以及选自αN110Q、αD154E、αN176Q、βK95R、βD334E中的任意一至五个氨基酸突变。

7.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变为αQ204N、βE85D、βD334E氨基酸突变，以及选自αN110Q、αD154E、αN176Q、βK95R、βQ233N中的任意一至五个氨基酸突变。

8.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变为αN110Q、αQ204N、βK95R氨基酸突变，以及选自αD154E、αN176Q、βE85D、βQ233N、βD334E中的任意一至五个氨基酸突变。

9.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变为αQ204N、βK95R、βQ233N氨基酸突变，以及选自αN110Q、αD154E、αN176Q、βE85D、βD334E中的任意一至五个氨基酸突变。

10.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变为αD154E、αQ204N、βE85D、βQ233N氨基酸突变，以及选自αN110Q、αN176Q、βK95R、βD334E中的任意一至四个氨基酸突变。

11.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变为αN110Q、αQ204N和βK95R氨基酸突变。

12.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变为αD154E、αQ204N和βQ233N氨基酸突变。

13.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变为αN176Q、αQ204N和βD334E氨基酸突变。

14.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变为αN110Q、αQ204N、βK95R和βQ233N的氨基酸突变。

15.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变为αN110Q、αQ204N、βE85D和βD334E的氨基酸突变。

16.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变为αD154E、αQ204N、βE85D和βQ233N的氨基酸突变。

17.根据权利要求1的青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，所述氨基酸突变为αD154E、αQ204N、βE85D、βQ233N和βD334E的氨基酸突变。

18.一种编码权利要求1-17中任一项青霉素G酰化酶突变体的核酸。

19.一种包含权利要求18的核酸的表达载体。

20.根据权利要求19的表达载体，其特征在于，所述表达载体具有多于一个拷贝的表达盒。

21.根据权利要求19的表达载体，其特征在于，所述表达载体具有四个拷贝的表达盒。

22.一种包含权利要求19的表达载体的宿主细胞。

23.权利要求1-17中任一项的青霉素G酰化酶突变体用于催化6-APA和HPGM·HCl反应合成阿莫西林的用途。

24.一种合成阿莫西林的方法，其特征在于，采用权利要求1-17中任一项的青霉素G酰化酶突变体催化6-APA和HPGM·HCl反应合成阿莫西林。