CN105543201B - 一种头孢菌素c酰化酶突变体 - Google Patents

一种头孢菌素c酰化酶突变体 Download PDF

Info

Publication number
CN105543201B
CN105543201B CN201610097370.0A CN201610097370A CN105543201B CN 105543201 B CN105543201 B CN 105543201B CN 201610097370 A CN201610097370 A CN 201610097370A CN 105543201 B CN105543201 B CN 105543201B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
replaces
cephalosporin
mutant
cpc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610097370.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105543201A (zh
Inventor
王金刚
梁岩
陈舒明
任亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Banglin Biotechnology Co ltd
Original Assignee
SHANXI XINBAOYUAN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANXI XINBAOYUAN PHARMACEUTICAL CO Ltd filed Critical SHANXI XINBAOYUAN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority to CN201610097370.0A priority Critical patent/CN105543201B/zh
Publication of CN105543201A publication Critical patent/CN105543201A/zh
Priority to PCT/CN2017/074029 priority patent/WO2017143945A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105543201B publication Critical patent/CN105543201B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/165—Yeast isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C12N1/185—Saccharomyces isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C12P35/02—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin by desacylation of the substituent in the 7 position
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01093—Glutaryl-7-aminocephalosporanic-acid acylase (3.5.1.93)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/125—Bacillus subtilis ; Hay bacillus; Grass bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/84—Pichia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明通过点突变法构建了头孢菌素C酰化酶，相比Pseudomonas sp.GK16来源的野生型头孢菌素C酰化酶，本发明的头孢菌素C酰化酶的酶活力提高了20.5倍至150倍，可用于一步酶法生产7‑ACA。

Description

一种头孢菌素C酰化酶突变体
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及通过点突变法构建的用于一步酶法生产7-ACA(7-氨基头孢烷酸)的头孢菌素C酰化酶。
背景技术
头孢类抗生素是现在应用最广泛的β-内酰胺类抗生素，该类抗生素大部分是通过7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，简称为7-ACA)合成的7-ACA衍生物，这类抗生素占到了全球抗生素市场40％的份额。
7-ACA一般通过化学法或生物酶法裂解头孢菌素C(Cephalosporin C，简称为CPC)，脱去分子侧链而获得。因化学法工艺复杂、能耗高，污染严重，近几年来，工业生产7-ACA基本已替换为生物酶法制备。目前使用的生物酶法又分为两步酶法和一步酶法。两步酶法采用得较早，主要用到D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase，以下简称为DAAO)和戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(Glutaryl-7-Amidocephalospranic Acid，以下简称为GL-7-ACA)酰化酶，CPC在DAAO的作用下生成GL-7-ACA，然后再在GL-7-ACA酰化酶的作用下脱去侧链，生成7-ACA。虽然该方法因环保、低能耗、高收率等特点已经基本取代了化学法，但该方法中DAAO催化反应的副产物H2O2对CPC有降解作用，且为两步催化反应，步骤较为复杂。因此，人们开发出了一步酶法制备7-ACA的技术，即利用CPC酰化酶催化CPC脱去侧链，生成7-ACA。
自20世纪80年代以来，人们从自然界中发现了产CPC酰化酶(头孢菌素C酰化酶)的菌株，如Pseudomonas sp.SE83、Pseudomonas diminuta N176、Pseudomonas sp.P130、Pseudomonas sp.GK16等，但这些酶严格来说是GL-7-ACA酰化酶，它们的CPC酰化酶活力均比较低，只有GL-7-ACA酰化酶活力的2-4％。迄今为止，自然界尚未发现产高催化活力的CPC酰化酶野生菌。野生型的CPC酰化酶还不能满足工业化生产CPC的要求，因此一步酶法至今不能完全取代两步酶法来大规模生产7-ACA。现在对Pseudomonas sp.SE83来源的CPC酰化酶改造的研究相对比较多，通过改造筛选，CPC酰化酶活性较野生酶提高了几十倍，但该类型的CPC酰化酶都有很强的7-ACA产物抑制性。近年来，对Pseudomonas sp.GK16菌株来源的CPC酰化酶改造出现了较大的进展，将该来源的CPC酰化酶的β亚基的第45位由I替换成V、β亚基的第58位由F替换成V、β亚基的第153位由Y替换成T、β亚基的第177位由F替换成L、β亚基的第382位由V替换成L，获得的突变体的CPC酰化酶酶活提高了25.3倍，但该酶活仍然无法满足工业生产的要求。
发明内容
为了克服现有一步酶法生产7-ACA技术中的上述缺陷，得到酶活性更高、底物特异性更高的CPC酰化酶，本发明利用基因工程技术来对微生物来源的野生型CPC酰化酶进行改造和筛选，构建高酶活性的CPC酰化酶突变体，从而实现一步酶法生产7-ACA的工业化。
为此，本发明通过随机突变、半理性设计等技术对Pseudomonas sp.GK16来源的GL-7-ACA酰化酶(SEQ ID NO:1)进行改造，获得以CPC作为特异性底物的高酶活的CPC酰化酶突变体，以便高效地将CPC催化生成7-ACA。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种用于生产7-ACA的高酶活力的CPC酰化酶突变体。
本发明的第二个目的在于提供编码上述CPC酰化酶突变体的基因。
本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。
本发明的第四个目的在于提供转化了上述质粒的微生物。
本发明的第五个目的在于提供上述CPC酰化酶突变体或微生物在生产7-ACA中的用途。
为了达到上述目的，本发明提供如下头孢菌素C酰化酶：
一种头孢菌素C酰化酶(CPC酰化酶)，其氨基酸序列为：
SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:1第240位的V替换为F的突变体，其氨基酸序列为：
MEPTSTPQAPIAAYKPRSNEILWDGYGVPHIYGVDAPSAFYGYGWAQARSHGDNILRLYGEARGKGAEYWGPDYEQTTVWLLTNGVPERAQQWYAQQSPDFRANLDAFAAGINAYAQQNPDDISPEVRQVLPVSGADVVAHAHRLMNFLYVASPGRTLGEGDPPDLADQGSNSWAVAPGKTANGNALLLQNPHLSWTTDYFTYYEAHLVTPDFEIYGATQIGLPVIRFAFNQRMGITNTFNGMVGATNYRLTLQDGGYLYDGQVRPFERRQASYRLRQADGTTVDKPLEIRSSVHGPVFERADGTAVAVRVAGLDRPGMLEQYFDMITADSFDDYEAALARMQVPTFNIVYADREGTINYSFNGVAPKRAEGDIAFWQGLVPGDSSRYLWTETHPLDDLPRVTNPPGGFVQNSNDPPWTPTWPVTYTPKDFPSYLAPQTPHSLRAQQSVRLMSENDDLTLERFMALQLSHRAVMADRTLPDLIPAALIDPDPEVQAAARLLAAWDREFTSDSRAALLFEEWARLFAGQNFAGQAGFATPWSLDKPVSTPYGVRDPKAAVDQLRTAIANTKRKYGAIDRPFGDASRMILNDVNVPGAAGYGNLGSFRVFTWSDPDENGVRTPVHGETWVAMIEFSTPVRAYGLMSYGNSRQPGTTHYSDQIERVSRADFRELLLRREQVEAAVQERTPFNFKP；
SEQ ID NO:4，其为SEQ ID NO:1第306位的A替换为T的突变体，其氨基酸序列为：
MEPTSTPQAPIAAYKPRSNEILWDGYGVPHIYGVDAPSAFYGYGWAQARSHGDNILRLYGEARGKGAEYWGPDYEQTTVWLLTNGVPERAQQWYAQQSPDFRANLDAFAAGINAYAQQNPDDISPEVRQVLPVSGADVVAHAHRLMNFLYVASPGRTLGEGDPPDLADQGSNSWAVAPGKTANGNALLLQNPHLSWTTDYFTYYEAHLVTPDFEIYGATQIGLPVIRFAFNQRMGITNTVNGMVGATNYRLTLQDGGYLYDGQVRPFERRQASYRLRQADGTTVDKPLEIRSSVHGPVFERADGTTVAVRVAGLDRPGMLEQYFDMITADSFDDYEAALARMQVPTFNIVYADREGTINYSFNGVAPKRAEGDIAFWQGLVPGDSSRYLWTETHPLDDLPRVTNPPGGFVQNSNDPPWTPTWPVTYTPKDFPSYLAPQTPHSLRAQQSVRLMSENDDLTLERFMALQLSHRAVMADRTLPDLIPAALIDPDPEVQAAARLLAAWDREFTSDSRAALLFEEWARLFAGQNFAGQAGFATPWSLDKPVSTPYGVRDPKAAVDQLRTAIANTKRKYGAIDRPFGDASRMILNDVNVPGAAGYGNLGSFRVFTWSDPDENGVRTPVHGETWVAMIEFSTPVRAYGLMSYGNSRQPGTTHYSDQIERVSRADFRELLLRREQVEAAVQERTPFNFKP；
SEQ ID NO:5，其为SEQ ID NO:1第553位的R替换为L的突变体，其氨基酸序列为：
MEPTSTPQAPIAAYKPRSNEILWDGYGVPHIYGVDAPSAFYGYGWAQARSHGDNILRLYGEARGKGAEYWGPDYEQTTVWLLTNGVPERAQQWYAQQSPDFRANLDAFAAGINAYAQQNPDDISPEVRQVLPVSGADVVAHAHRLMNFLYVASPGRTLGEGDPPDLADQGSNSWAVAPGKTANGNALLLQNPHLSWTTDYFTYYEAHLVTPDFEIYGATQIGLPVIRFAFNQRMGITNTVNGMVGATNYRLTLQDGGYLYDGQVRPFERRQASYRLRQADGTTVDKPLEIRSSVHGPVFERADGTAVAVRVAGLDRPGMLEQYFDMITADSFDDYEAALARMQVPTFNIVYADREGTINYSFNGVAPKRAEGDIAFWQGLVPGDSSRYLWTETHPLDDLPRVTNPPGGFVQNSNDPPWTPTWPVTYTPKDFPSYLAPQTPHSLRAQQSVRLMSENDDLTLERFMALQLSHRAVMADRTLPDLIPAALIDPDPEVQAAARLLAAWDREFTSDSRAALLFEEWARLFAGQNFAGQAGFATPWSLDKPVSTPYGVLDPKAAVDQLRTAIANTKRKYGAIDRPFGDASRMILNDVNVPGAAGYGNLGSFRVFTWSDPDENGVRTPVHGETWVAMIEFSTPVRAYGLMSYGNSRQPGTTHYSDQIERVSRADFRELLLRREQVEAAVQERTPFNFKP；
SEQ ID NO:6，其为SEQ ID NO:1第623位的H替换为N的突变体，其氨基酸序列为：
MEPTSTPQAPIAAYKPRSNEILWDGYGVPHIYGVDAPSAFYGYGWAQARSHGDNILRLYGEARGKGAEYWGPDYEQTTVWLLTNGVPERAQQWYAQQSPDFRANLDAFAAGINAYAQQNPDDISPEVRQVLPVSGADVVAHAHRLMNFLYVASPGRTLGEGDPPDLADQGSNSWAVAPGKTANGNALLLQNPHLSWTTDYFTYYEAHLVTPDFEIYGATQIGLPVIRFAFNQRMGITNTVNGMVGATNYRLTLQDGGYLYDGQVRPFERRQASYRLRQADGTTVDKPLEIRSSVHGPVFERADGTAVAVRVAGLDRPGMLEQYFDMITADSFDDYEAALARMQVPTFNIVYADREGTINYSFNGVAPKRAEGDIAFWQGLVPGDSSRYLWTETHPLDDLPRVTNPPGGFVQNSNDPPWTPTWPVTYTPKDFPSYLAPQTPHSLRAQQSVRLMSENDDLTLERFMALQLSHRAVMADRTLPDLIPAALIDPDPEVQAAARLLAAWDREFTSDSRAALLFEEWARLFAGQNFAGQAGFATPWSLDKPVSTPYGVRDPKAAVDQLRTAIANTKRKYGAIDRPFGDASRMILNDVNVPGAAGYGNLGSFRVFTWSDPDENGVRTPVNGETWVAMIEFSTPVRAYGLMSYGNSRQPGTTHYSDQIERVSRADFRELLLRREQVEAAVQERTPFNFKP；
SEQ ID NO:7，其为SEQ ID NO:1第240位的V替换为F、第306位的A替换为T、第623位的H替换为T的突变体，其氨基酸序列为：
MEPTSTPQAPIAAYKPRSNEILWDGYGVPHIYGVDAPSAFYGYGWAQARSHGDNILRLYGEARGKGAEYWGPDYEQTTVWLLTNGVPERAQQWYAQQSPDFRANLDAFAAGINAYAQQNPDDISPEVRQVLPVSGADVVAHAHRLMNFLYVASPGRTLGEGDPPDLADQGSNSWAVAPGKTANGNALLLQNPHLSWTTDYFTYYEAHLVTPDFEIYGATQIGLPVIRFAFNQRMGITNTFNGMVGATNYRLTLQDGGYLYDGQVRPFERRQASYRLRQADGTTVDKPLEIRSSVHGPVFERADGTTVAVRVAGLDRPGMLEQYFDMITADSFDDYEAALARMQVPTFNIVYADREGTINYSFNGVAPKRAEGDIAFWQGLVPGDSSRYLWTETHPLDDLPRVTNPPGGFVQNSNDPPWTPTWPVTYTPKDFPSYLAPQTPHSLRAQQSVRLMSENDDLTLERFMALQLSHRAVMADRTLPDLIPAALIDPDPEVQAAARLLAAWDREFTSDSRAALLFEEWARLFAGQNFAGQAGFATPWSLDKPVSTPYGVRDPKAAVDQLRTAIANTKRKYGAIDRPFGDASRMILNDVNVPGAAGYGNLGSFRVFTWSDPDENGVRTPVTGETWVAMIEFSTPVRAYGLMSYGNSRQPGTTHYSDQIERVSRADFRELLLRREQVEAAVQERTPFNFKP；
SEQ ID NO:8，其为SEQ ID NO:1第240位的V替换为F、第306位的A替换为T、第553位的R替换为L的突变体、第623位的H替换为T的突变体，其氨基酸序列为：
MEPTSTPQAPIAAYKPRSNEILWDGYGVPHIYGVDAPSAFYGYGWAQARSHGDNILRLYGEARGKGAEYWGPDYEQTTVWLLTNGVPERAQQWYAQQSPDFRANLDAFAAGINAYAQQNPDDISPEVRQVLPVSGADVVAHAHRLMNFLYVASPGRTLGEGDPPDLADQGSNSWAVAPGKTANGNALLLQNPHLSWTTDYFTYYEAHLVTPDFEIYGATQIGLPVIRFAFNQRMGITNTFNGMVGATNYRLTLQDGGYLYDGQVRPFERRQASYRLRQADGTTVDKPLEIRSSVHGPVFERADGTTVAVRVAGLDRPGMLEQYFDMITADSFDDYEAALARMQVPTFNIVYADREGTINYSFNGVAPKRAEGDIAFWQGLVPGDSSRYLWTETHPLDDLPRVTNPPGGFVQNSNDPPWTPTWPVTYTPKDFPSYLAPQTPHSLRAQQSVRLMSENDDLTLERFMALQLSHRAVMADRTLPDLIPAALIDPDPEVQAAARLLAAWDREFTSDSRAALLFEEWARLFAGQNFAGQAGFATPWSLDKPVSTPYGVLDPKAAVDQLRTAIANTKRKYGAIDRPFGDASRMILNDVNVPGAAGYGNLGSFRVFTWSDPDENGVRTPVTGETWVAMIEFSTPVRAYGLMSYGNSRQPGTTHYSDQIERVSRADFRELLLRREQVEAAVQERTPFNFKP；
SEQ ID NO:9，其为SEQ ID NO:1第215位的I替换为V、第228位的F替换为V、第240位的V替换为F、第306位的A替换为T、第323位的Y替换为T、第347位的F替换为L、第552位的V替换为L的突变体、第553位的R替换为L的突变体、第623位的H替换为T的突变体，其氨基酸序列为：
MEPTSTPQAPIAAYKPRSNEILWDGYGVPHIYGVDAPSAFYGYGWAQARSHGDNILRLYGEARGKGAEYWGPDYEQTTVWLLTNGVPERAQQWYAQQSPDFRANLDAFAAGINAYAQQNPDDISPEVRQVLPVSGADVVAHAHRLMNFLYVASPGRTLGEGDPPDLADQGSNSWAVAPGKTANGNALLLQNPHLSWTTDYFTYYEAHLVTPDFEVYGATQIGLPVIRVAFNQRMGITNTFNGMVGATNYRLTLQDGGYLYDGQVRPFERRQASYRLRQADGTTVDKPLEIRSSVHGPVFERADGTTVAVRVAGLDRPGMLEQTFDMITADSFDDYEAALARMQVPTLNIVYADREGTINYSFNGVAPKRAEGDIAFWQGLVPGDSSRYLWTETHPLDDLPRVTNPPGGFVQNSNDPPWTPTWPVTYTPKDFPSYLAPQTPHSLRAQQSVRLMSENDDLTLERFMALQLSHRAVMADRTLPDLIPAALIDPDPEVQAAARLLAAWDREFTSDSRAALLFEEWARLFAGQNFAGQAGFATPWSLDKPVSTPYGLLDPKAAVDQLRTAIANTKRKYGAIDRPFGDASRMILNDVNVPGAAGYGNLGSFRVFTWSDPDENGVRTPVTGETWVAMIEFSTPVRAYGLMSYGNSRQPGTTHYSDQIERVSRADFRELLLRREQVEAAVQERTPFNFKP。
优选上述头孢菌素C酰化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:9。
一种编码上述头孢菌素C酰化酶的基因。
优选地，编码上述头孢菌素C酰化酶SEQ ID NO:9的基因具有下述碱基序列：
atggaaccgacctccaccccgcaggctccgatcgctgcttacaaaccgcgttccaacgaaatcctgtgggacggttacggtgttccgcacatctacggtgttgacgctccgtccgctttctacggttacggttgggctcaggctcgttcccacggtgacaacatcctgcgtctgtacggtgaagctcgtggtaaaggtgctgaatactggggtccggactacgaacagaccaccgtttggctgctgaccaacggtgttccggaacgtgctcagcagtggtacgctcagcagtccccggacttccgtgctaacctggacgctttcgctgctggtatcaacgcttacgctcagcagaacccggacgacatctccccggaagttcgtcaggttctgccggtttccggtgctgacgttgttgctcacgctcaccgtctgatgaacttcctgtacgttgcttccccgggtcgtaccctgggtgaaggtgacccgccggacctggctgaccagggttccaactcctgggctgttgctccgggtaaaaccgctaacggtaacgctctgctgctgcagaacccgcacctgtcctggaccaccgactacttcacctactacgaagctcacctggttaccccggacttcgaagtttacggtgctacccagatcggtctgccggttatccgtgttgctttcaaccagcgtatgggtatcaccaacaccttcaacggtatggttggtgctaccaactaccgtctgaccctgcaggacggtggttacctgtacgacggtcaggttcgtccgttcgaacgtcgtcaggcttcctaccgtctgcgtcaggctgacggtaccaccgttgacaaaccgctggaaatccgttcctccgttcacggtccggttttcgaacgtgctgacggtaccaccgttgctgttcgtgttgctggtctggaccgtccgggtatgctggaacagaccttcgacatgatcaccgctgactccttcgacgactacgaagctgctctggctcgtatgcaggttccgaccctgaacatcgtttacgctgaccgtgaaggtaccatcaactactccttcaacggtgttgctccgaaacgtgctgaaggtgacatcgctttctggcagggtctggttccgggtgactcctcccgttacctgtggaccgaaacccacccgctggacgacctgccgcgtgttaccaacccgccgggtggtttcgttcagaactccaacgacccgccgtggaccccgacctggccggttacctacaccccgaaagacttcccgtcctacctggctccgcagaccccgcactccctgcgtgctcagcagtccgttcgtctgatgtccgaaaacgacgacctgaccctggaacgtttcatggctctgcagctgtcccaccgtgctgttatggctgaccgtaccctgccggacctgatcccggctgctctgatcgacccggacccggaagttcaggctgctgctcgtctgctggctgcttgggaccgtgaattcacctccgactcccgtgctgctctgctgttcgaagaatgggctcgtctgttcgctggtcagaacttcgctggtcaggctggtttcgctaccccgtggtccctggacaaaccggtttccaccccgtacggtctgctggacccgaaagctgctgttgaccagctgcgtaccgctatcgctaacaccaaacgtaaatacggtgctatcgaccgtccgttcggtgacgcttcccgtatgatcctgaacgacgttaacgttccgggtgctgctggttacggtaacctgggttccttccgtgttttcacctggtccgacccggacgaaaacggtgttcgtaccccggttaccggtgaaacctgggttgctatgatcgaattctccaccccggttcgtgcttacggtctgatgtcctacggtaactcccgtcagccgggtaccacccactactccgaccagatcgaacgtgtttcccgtgctgacttccgtgaactgctgctgcgtcgtgaacaggttgaagctgctgttcaggaacgtaccccgttcaacttcaaaccg(SEQ ID NO:10)。
一种包含上述基因的质粒。该质粒包含用于表达上述基因的载体，优选载体是PET系列，比如载体是pET24a(+)，但并不受限于此。
一种转化了上述质粒的微生物，该微生物可作为宿主用于表达上述头孢菌素C酰化酶。
优选地，上述微生物选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
上述头孢菌素C酰化酶或者微生物可以用于生产7-ACA、尤其是一步酶法生产7-ACA。
在生产7-ACA中，以头孢菌素C为底物原料，用上述头孢菌素C酰化酶或者微生物作为催化剂来催化反应。
生产7-ACA可采用常规的工艺条件，比如，头孢菌素C(CPC)的浓度可选择1～3wt％，优选2.5wt％；反应温度选择10～37℃，优选15℃。
本发明的CPC酰化酶突变体水解CPC产生7-ACA的活性相较野生酶提高了20.5倍至150倍，底物特异性更高，产物抑制性更低，当应用于一步法生产7-ACA时，7-ACA生成率超过98％，极具工业化前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
为简要起见，本文中的氨基酸缩写既可以使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员熟知的，这些缩写列于下表中：
表1氨基酸中英文对照及缩写
作为构建头孢菌素C酰化酶突变体的基础模板，Pseudomonas sp.GK16来源的野生型GL-7-ACA酰化酶的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID NO:1。其编码基因是序列表中的SEQID NO:2。
为了获得酶活性更高的CPC酰化酶突变体，本发明对野生型CPC酰化酶SEQ ID NO:1的基因序列SEQ ID NO:2进行点突变。通过易错PCR技术获得一个或多个氨基酸位点取代的突变体氨基酸序列，筛选出多个可提高CPC酰化酶的酶活的位点，包括240位缬氨酸(β肽第70位)、306位丙氨酸(β肽第136位)、553位精氨酸(β肽第383位)和623位组氨酸(β肽第453位)。然后以定点突变技术对上述位点进行随机组合突变，获得本发明中具有氨基酸序列SEQ ID NO:7-8的突变体。最后再在SEQ ID NO:8的基础上进行定点突变，获得本发明中具有氨基酸序列SEQ ID NO:9的突变体。
其中，SEQ ID NO:1是这些氨基酸序列SEQ ID NO:3-9的共同序列，这些氨基酸序列都是在SEQ ID NO:1的基础上进行1个、或2个、最多9个氨基酸的替换而获得的突变体，这些突变体氨基酸序列保持了98％以上的同源性。
在本发明中，术语“CPC酰化酶突变体”、“突变体CPC酰化酶”、“突变CPC酰化酶”和“突变酶”表示相同的意义，都是指头孢菌素C酰化酶的突变体。
在本发明中，术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指野生型的GL-7-ACA酰化酶或称CPC酰化酶(SEQ ID NO:1)。
本发明的CPC酰化酶突变体的氨基酸数量只有692个，且结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。
这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
上述转化体宿主可以使任何适合表达CPC酰化酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
当作为生物催化剂用于生产7-ACA时，本发明的CPC酰化酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。
本发明的CPC酰化酶分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。
实施例
本文中的全基因合成、引物合成及测序委托苏州金唯智公司完成。
实施例1野生型CPC酰化酶基因重组大肠杆菌的构建
对于Pseudomonas sp.GK16来源的CPC酰化酶，以其已经公布的基因序列SEQ IDNO:2为基础(Matsuda et.al.,J.Bacteriol.163:1222-1228,1985)，全基因合成基因序列，并在基因两端设计限制性内切酶位点NdeI和XhoI，亚克隆到载体pET24a(Novagen)的相应位点，获得重组质粒pET24a-wt-CPC，转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到野生型CPC酰化酶的重组大肠杆菌。
实施例2易错PCR法构建随机突变点库及筛选
2.1易错PCR法构建随机突变点库
以CPC酰化酶野生型基因SEQ ID NO:2为模板，应用易错PCR技术构建随机突变体库。正向引物CPC-Nde-F为5’-CATATGGAGCCGACCTCGAC-3’，反向引物CPC-Xho-R为5’-CTCGAGTGGCTTGAAGTTGAAG-3’
50μL易错PCR反应体系包括：50ng质粒模板pET24a-wt-CPC，30pmol一对引物CPC-Nde-F和CPC-Xho-R，1X Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mMMgCl2，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl2，2.5个单位的Taq酶(fermentas)。PCR反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 2min/kbp；30个循环；72℃ 10min。胶回收2.0kb随机突变片段作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃ 5min，；98℃ 10s，60℃ 30s，68℃2min/kbp，25个循环；68℃ 10min。DpnI消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过104个克隆的随机突变库。
2.2突变体库的高通量筛选
选取突变体库中的转化子接种到含700μL LB培养基的96孔深孔培养板中，培养基中含100μg/mL卡那霉素和0.1mM IPTG，37℃培养6h后，降温至25℃，培养过夜。5000rpm离心10min，弃上清，置于-70℃冷冻1h，室温融化30min。加入200μL含1mg/mL溶菌酶的0.1M磷酸钾盐缓冲液(pH8.0)，重悬菌体，37℃孵育1h，4℃，5000rpm离心20min，取20μL上清，用于CPC活力测定。
2.3高通量CPC酰化酶活力测定
底物反应液：含2wt％CPC钠盐的0.1M磷酸钾盐缓冲液(pH8.0)，
终止反应液：0.05M NaOH，20v/v％冰醋酸，
显色剂：含0.5wt％的PDAB(p-二甲氨基苯甲醛，p-Dimethyl Aminobenzaldehyde)甲醇溶液。
酶活力定义：每分钟催化CPC产生1微摩尔(μmol)7-ACA所需要的酶量定义为1个单位(U)。
将上述步骤2.2中的上清20μL加入20μL底物反应液，在37℃的条件下反应过夜，加入200μL终止反应液，然后5000rpm离心10min。取200μL离心上清，加入40μL显色液，室温反应10min后，检测415nm下的吸光度。
在随机突变库，通过对约30000个突变体克隆筛选，结果显示V240F、A306T、R553L、H623N这4个突变点能提高CPC酰化酶的酶活。
表2随机突变菌在37℃下的发酵液相对比活结果
菌种编号 突变位点 氨基酸序列号 发酵液相对比活
wtCPC —— 1 1.0
EP 1 V240F 3 2.8
EP 2 A306T 4 2.2
EP 3 R553L 5 4.0
EP 4 H623N 6 3.1
*wtCPC是指野生型头孢菌素C酰化酶的表达菌株。
实施例3通过定点突变技术进行定向进化
根据实例2中筛选出的V240F、A306T、R553L、H623N这4个位点，设计简并引物，以pET24a-wtCPC质粒为模板，构建定点组合突变库。然后通过定点突变技术，以组合突变库中筛选出的高活力菌株质粒为模板，加入I215V、F228V、Y323T、F347L、V552L即β亚基的I45βV、F58βV、Y153βT、F177βL、V382βL五个突变点。构建过程中所用的引物见表3。
表3定向进化引物列表
*其中：N＝A/G/C/T。
3.1通过定点突变技术构建定向进化突变库
以pET24a-wtCPC质粒为模板，以240-F1和306-R1、306-F2和553-R2、553-F3和623-R3三组引物对分别进行PCR扩增，通过over-lapping PCR扩增出大片段，然后以大片段为引物进行MegaPrimer PCR，构建定点组合突变库。
50μL PCR反应体系包括：10ng质粒模板，10pmol的引物对，1xKOD plus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO4，5个单位的KOD-plus DNA聚合酶。
PCR反应条件为：95℃ 1min；98℃ 10s，57℃ 30s，68℃ 1min/kbp；30个循环；68℃10min。胶回收三个片段P1、P2、P3。
以P1、P2、P3为模板，以240-F1和623-R3为引物进行第二轮PCR，获得片段P，切胶回收。
PCR反应条件为：95℃ 3min；98℃ 10s，60℃ 30s，68℃ 1min/kbp；25个循环；68℃10min。
以片段P作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃ 5min，；98℃ 10s，60℃ 30s，68℃ 2min/kbp，25个循环；68℃ 10min。DpnI消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过3×104个克隆的随机突变库。
3.2突变体库的高通量筛选
方法同实施例2的步骤2.2。经筛选获得活力相对较高的ED2菌株，经测序确定该菌株含有V240F,A306T,R553L,H623T四个位点的突变。
3.3定点突变
以ED2菌株提取的质粒为模板，以45/58-F和45/58-R、153-F和153-R、177-F和177-R、382-F和382-R为引物，获得的最终产物经Dpn I消化后转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
50μL PCR反应体系包括：10ng质粒模板，10pmol的引物对，1xKOD plus buffer，0.2mM dNTP，1.5mM MgSO4，5个单位的KOD-plus DNA聚合酶。
PCR反应条件为：95℃ 1min；98℃ 10s，57℃ 30s，68℃ 1min/kbp；20个循环；68℃10min。
3.4高通量CPC酰化酶活力测定
底物反应液：含2wt％CPC钠盐的0.1M磷酸钾盐缓冲液(pH8.0)，
终止反应液：0.05M NaOH，20v/v％冰醋酸，
显色剂：含0.5wt％的PDAB(p-二甲氨基苯甲醛，p-Dimethyl Aminobenzaldehyde)甲醇溶液。
酶活力定义：每分钟催化CPC产生1微摩尔(μmol)7-ACA所需要的酶量定义为1个单位(U)。
将上述步骤2.2中的上清20μL加入20μL底物反应液，在37℃的条件下反应10min后，加入200μL终止反应液，然后5000rpm离心10min。取200μL离心上清，加入40μL显色液，室温反应10min后，检测415nm下的吸光度，与7-ACA定量标准曲线进行比较定量。
3.5摇瓶发酵
挑取单菌落，接种至5mL含50μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，250rpm培养过夜。取2mL过夜培养物接种至200mL TB培养基中，37℃，250rpm培养2-3h，至OD6000.6-0.8时，加入0.1mM IPTG，28℃，200rpm培养过夜。4℃，10000rpm，离心10min，收集菌体。
3.6酶的提取
菌体用50mL平衡缓冲液(50mM磷酸钾盐缓冲液，200mM NaCl，pH8.0)重悬，然后超声破碎，破碎后的菌体4℃，12000rpm，离心20min，收集上清。上清以1mL/min的速率加入含10mL Ni-NAT基质的亲和层析柱中，然后用含有30mM咪唑的平衡缓冲液冲洗柱料，洗脱杂质。最后用含有500mM咪唑的平衡缓冲液冲洗脱目的蛋白，收集峰值洗脱液。
洗脱液经截留分子量为10kDa的超滤管进行脱盐处理，得纯酶。
3.7纯酶比活力测定
该步骤所用溶液与实施例2中步骤2.3所用试剂相同。
将步骤3.6中的脱盐溶液20μL加入20μL底物反应液，在37℃的条件下反应5min后，加入200μL终止反应液，然后5000rpm离心10min。取200μL离心上清，加入40μL显色液，室温反应10min后，检测415nm下的吸光度，与7-ACA定量标准曲线进行比较定量。
同时采用Thermo Scientific公司的BCA Protein Assay Kit试剂盒测定纯酶的蛋白浓度，从而获得纯酶的比活力。
表4定向进化的纯酶在37℃下的酶活力对比结果
*wtCPC是指野生型头孢菌素C酰化酶的表达菌株。
由表4可以看出，相比野生型头孢菌素C酰化酶SEQ ID NO:1，本发明的头孢菌素C酰化酶突变体SEQ ID NO:7-9的酶活力提高了20.5倍至150倍，其中突变体SEQ ID NO:9的酶活力最高。
实施例4 7-ACA的生产
称取2.5g CPC钠盐，加水溶解，降温至15℃，调整pH至8.2，加入实施例3中步骤3.5制备的500U的突变体SEQ ID NO:9纯酶，搅拌反应。反应过程中控制温度15±0.5℃，pH8.0±0.2，反应40min，检测反应样品。
精确量取100μL反应40min后的样品，用水定容至10mL，进行HPLC分析，分析条件：C18200mm×4.6柱，波长262nm，流动相为0.02M醋酸钠PH5.5:乙腈(93:7)，温度25℃。结果显示，反应中CPC钠盐的转化率超过98％。
综上所述，本发明构建了CPC酰化酶突变体，将野生型CPC酰化酶的比活提高了20.5-150倍，用突变体纯酶进行一步酶法生产7-ACA，反应40min，使CPC的转化率超过98％，具有广阔的工业化前景。

Claims (10)

1.一种头孢菌素C酰化酶，其氨基酸序列为：
SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:1第240位的V替换为F的突变体；
SEQ ID NO:7，其为SEQ ID NO:1第240位的V替换为F、第306位的A替换为T、第623位的H替换为T的突变体；
SEQ ID NO:8，其为SEQ ID NO:1第240位的V替换为F、第306位的A替换为T、第553位的R替换为L、第623位的H替换为T的突变体；或者
SEQ ID NO:9，其为SEQ ID NO:1第215位的I替换为V、第228位的F替换为V、第240位的V替换为F、第306位的A替换为T、第323位的Y替换为T、第347位的F替换为L、第552位的V替换为L、第553位的R替换为L、第623位的H替换为T的突变体。
2.如权利要求1所述头孢菌素C酰化酶，其特征在于，所述氨基酸序列为SEQ ID NO:9。
3.编码如权利要求1或2所述头孢菌素C酰化酶的基因。
4.编码如权利要求2所述头孢菌素C酰化酶的基因，其序列为SEQ ID NO:10。
5.包含如权利要求3或4所述基因的质粒。
6.转化了如权利要求5所述质粒的微生物。
7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，所述微生物选自枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌。
8.如权利要求7所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。
9.如权利要求1所述头孢菌素C酰化酶或者如权利要求7所述微生物在生产7-ACA中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，以头孢菌素C为底物、用权利要求1所述头孢菌素C酰化酶或者如权利要求7所述微生物催化生产7-ACA。
CN201610097370.0A 2016-02-23 2016-02-23 一种头孢菌素c酰化酶突变体 Active CN105543201B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610097370.0A CN105543201B (zh) 2016-02-23 2016-02-23 一种头孢菌素c酰化酶突变体
PCT/CN2017/074029 WO2017143945A1 (zh) 2016-02-23 2017-02-19 一种头孢菌素c酰化酶突变体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610097370.0A CN105543201B (zh) 2016-02-23 2016-02-23 一种头孢菌素c酰化酶突变体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105543201A CN105543201A (zh) 2016-05-04
CN105543201B true CN105543201B (zh) 2018-11-20

Family

ID=55822759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610097370.0A Active CN105543201B (zh) 2016-02-23 2016-02-23 一种头孢菌素c酰化酶突变体

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN105543201B (zh)
WO (1) WO2017143945A1 (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543201B (zh) * 2016-02-23 2018-11-20 山西新宝源制药有限公司 一种头孢菌素c酰化酶突变体
KR101808192B1 (ko) * 2016-08-26 2018-01-18 아미코젠주식회사 7-아미노세팔로스포란산의 고농도 생산 재조합 아크레모니움 크리소제눔 균주의 제조방법 및 이 방법으로 제조된 균주
WO2018165881A1 (zh) * 2017-03-15 2018-09-20 上海星维生物技术有限公司 一种头孢菌素c酰化酶突变体及其应用
CN108220276B (zh) * 2017-10-30 2021-05-14 南京朗恩生物科技有限公司 一种头孢菌素c酰化酶突变体及其在7-氨基头孢烷酸生产中的应用
CN109913436B (zh) * 2017-12-12 2023-05-23 石药集团圣雪葡萄糖有限责任公司 含有一个或几个点突变的头孢菌素c酰化酶突变体及其制备方法
CN108267521A (zh) * 2017-12-28 2018-07-10 伊犁川宁生物技术有限公司 一种头孢菌渣中头孢菌素c残留效价的测定方法
CN111172142B (zh) * 2020-02-14 2021-09-28 上海陶宇晟生物技术有限责任公司 一种热稳定性高的头孢菌素c酰化酶突变体
CN112662655B (zh) * 2020-12-29 2022-05-03 山东金城柯瑞化学有限公司 头孢菌素c酰化酶突变体及其制备方法和应用
KR102405289B1 (ko) * 2021-12-24 2022-06-07 아미코젠주식회사 세팔로스포린 c 아실라제 활성을 가지는 폴리펩타이드 및 이의 용도
CN116286763B (zh) * 2023-02-28 2024-06-25 西北工业大学 一种热稳定性提高的胱硫醚β-合成酶突变体及应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103060298B (zh) * 2012-12-31 2014-07-02 安徽丰原基因工程技术有限公司 一种头孢菌素c酰化酶突变体及其编码基因与应用
KR101728906B1 (ko) * 2013-01-21 2017-04-20 아미코젠주식회사 세파계 항생제 원료물질(7-aca)을 생산하기 위한 변이효소
CN105543201B (zh) * 2016-02-23 2018-11-20 山西新宝源制药有限公司 一种头孢菌素c酰化酶突变体

Also Published As

Publication number Publication date
CN105543201A (zh) 2016-05-04
WO2017143945A1 (zh) 2017-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105543201B (zh) 一种头孢菌素c酰化酶突变体
CN108026130A (zh) 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法2
CN108026535B (zh) 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法
CN107922952B (zh) 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法
CN108251392B (zh) 提高比活和热稳定性的葡萄糖氧化酶突变体及其编码基因和应用
CN107889504A (zh) 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法
CN107889505A (zh) 一种制备烟酰胺单核苷酸的方法
CN111718915A (zh) 一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体、包含该突变体的重组表达载体和重组菌及应用
WO2017143944A1 (zh) 一种青霉素g酰化酶突变体
US7399624B2 (en) Cephalosporin C acylases
CN109072215A (zh) 一种头孢菌素c酰化酶突变体及其应用
CN114395541B (zh) 一种热稳定性和比活提高的葡萄糖氧化酶突变体GOx1-MUT、其编码基因和应用
CN111172142B (zh) 一种热稳定性高的头孢菌素c酰化酶突变体
WO2005105991A1 (ja) 放線菌由来のａｍｐデアミナーゼ、及びその使用
CN110129305B (zh) 一种用于制备7-aca的头孢菌素c酰化酶突变体
CN115029327B (zh) 葡萄糖氧化酶突变体GOx-MUT7~11及其编码基因和应用
US20120149071A1 (en) D-aminoacylase
CN105950595B (zh) (-)-γ-内酰胺酶、基因、突变体、载体及其制备与应用
US9404139B2 (en) Mutated cephalosporin hydroxylase and its application in deacetylcephalosporanic acid synthesis
JP4405324B2 (ja) 改変型ザルコシンオキシダーゼ、改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子及び改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法
Wani Lako et al. Cloning, expression and characterization of thermostable YdaP from Bacillus licheniformis 9A
CN110699345A (zh) 一种卤醇脱卤酶突变体及其应用
CN109280651B (zh) 一种乳酸脱氢酶突变体基因LbLDH1及其在大肠杆菌中高效表达的发酵方法
CN110951717B (zh) 一种l-阿拉伯糖异构酶异构体及其应用
CN115851687B (zh) 具有头孢菌素c酰基转移酶活性的多肽及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20181010

Address after: 037002 Garden Industrial Park, Xinrong District, Datong, Shanxi

Applicant after: SHANXI XINBAOYUAN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Address before: 201202 1 Chuang Hong Road 9, 1, Pudong New Area, Shanghai.

Applicant before: SHANGHAI XINGWEI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Applicant before: Shanxi Xinbaoyuan Pharmaceutical Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information

Address after: 037010 Datong Pharmaceutical Industrial Park, Shanxi

Applicant after: SHANXI XINBAOYUAN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

Address before: 037002 Garden Industrial Park, Xinrong District, Datong, Shanxi

Applicant before: Shanxi Xinbaoyuan Pharmaceutical Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 037010 Datong Pharmaceutical Industrial Park, Shanxi

Patentee after: Shanxi Shuangyan Pharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: 037010 Datong Pharmaceutical Industrial Park, Shanxi

Patentee before: SHANXI XINBAOYUAN PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20221202

Address after: 201403 3rd floor, building 11, 6055 Jinhai Road, Fengxian District, Shanghai

Patentee after: Shanghai Banglin Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 037010 Datong Pharmaceutical Industrial Park, Shanxi

Patentee before: Shanxi Shuangyan Pharmaceutical Co.,Ltd.