CN108220276B - 一种头孢菌素c酰化酶突变体及其在7-氨基头孢烷酸生产中的应用 - Google Patents

一种头孢菌素c酰化酶突变体及其在7-氨基头孢烷酸生产中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种头孢菌素C酰化酶突变体及其在7‑氨基头孢烷酸生产中的应用，属于酶制备技术领域，包括如下步骤：通过引物A获取基因序列、重组表达蛋白、检测酶活和制备7‑氨基头孢烷酸。本发明通过定向进化得到酶活性增强的头孢菌素C酰化酶突变体，酶活性比野生性头孢菌素C酰化酶提高5倍以上，三小时底物转化率达95％‑98％，副产物D‑7ACA小于0.8％，优于行业内标准，通过使用本蛋白突变体，能有效地制造半合成头孢菌素类药物的重要中间体，工艺简单且得率高，技术可移植性强，只要一般的发酵车间即可投入生产，不需购置特殊设备，易于推广应用，本发明具有较强的实用性和推广价值。

Description

一种头孢菌素C酰化酶突变体及其在7-氨基头孢烷酸生产中 的应用
技术领域
本发明涉及一种头孢菌素C酰化酶突变体及其应用，特别是涉及一种头孢菌素C酰化酶突变体制备方法，属于酶制备技术领域。
背景技术
目前，7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是医药工业生产半合成头孢菌素类药物的重要中间体，国内外在工业上多采用化学法由头孢菌素C钠(锌)盐脱去其侧链来生产，但化学法存在工艺复杂、成本高等问题，而且还会严重污染环境；与化学法相比，酶法裂解可以使生产过程大大简化，例如：发酵得到的头孢菌素C不需结晶就可用于酶解，生产过程中没有用到有毒溶剂，可省掉加保护剂和去保护剂等步骤，产品能够达到高收率、高质量，同时降低成本和减少污染。因此近年来人们着力进行酶法生产7-ACA的研究。
目前，人们研究较多的是两步酶法制备7-ACA，首先，头孢菌素C在通氧气情况下被D-氨基酸氧化酶(DAAO)催化，产生具有酮基的中间体(keto-7-ACA)和H2O2，这个中间体较不稳定，很容易被同时产生的H2O2化学氧化脱羧，转变成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(GL-7-ACA)，然后GL-7-ACA在GL-7-ACA酰化酶的作用下脱去其侧链，生成7-ACA。
目前，国内7-ACA大部分的生产厂家已将7-ACA的生产线由化学法转换为酶法，7-ACA D-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA酰化酶国内也有厂家大批量生产。虽然，两步酶法制备7-ACA在生产成本和环境保护方面有优势，但是从头孢菌素C到7-ACA的转化率与化学法相比要低，而且DAAO催化反应难以控制，头孢菌素C酰基转移酶(CPC acylase)可以直接把头孢菌素C转变到7-ACA(不经过GL-7-ACA等中间产物，因此其转化率与化学法相当，而且能得到较高质量的7-ACA。
目前，利用CPC acylase生产7-ACA的一步酶法是全新的7-ACA酶法工程，既具有高转化率和纯度，也具有高经济性和环境保护的优势，具有生产工艺简单、设备要求低及生产成本低等优点。但是天然存在的头孢菌素C酰化酶对头孢菌素C的催化活性低，仅为GL-7-ACA酰化酶的2-4％，难以实现产业化，故亟需开发出高酶活的头孢菌素C酰化酶突变体用于产业化生产。
国内企业对于头孢菌素C酰化酶生产7-ACA工艺的提升上主要包括以下几个方面：通过定点突变以提高头孢菌素C酰化酶的活性；对大肠杆菌进行基因敲除，从而消除分解底物的蛋白表达，用以提高7-ACA的产率和纯度；头孢菌素C酰化酶的固定化研究，以缩减生产成本等。前述这些方法虽然使得酶活力在一定程度上有所提高，但是仍然无法满足工业需求，同时得到的突变型头孢菌素C酰化酶容易受7-ACA产物的抑制，使7-ACA的产率低，转化速率低，酶的活性受外界影响较大。
发明内容
本发明的主要目的是为了提供一种头孢菌素C酰化酶突变体及其在7-氨基头孢烷酸生产中的应用，通过定向进化得到酶活增强的头孢菌素C酰化酶突变体，提高酶活性，增强底物转化率，降低副产物生成率。
本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：
一种头孢菌素C酰化酶突变体，能够催化头孢菌素C生成7-氨基头孢烷酸，所述头孢菌素C酰化酶突变体与野生型头孢菌素C酰化酶相比表现出更高的催化活性，酶活提高约8.6倍。
进一步的，头孢菌素C酰化酶突变体选自序列SEQ ID NO.1。
进一步的，选自序列SEQ ID NO.1的头孢菌素C酰化酶突变体比野生型头孢菌素C酰化酶具有更高的底物催化活性。
进一步的，酶活的检测包括如下步骤：
步骤11：将酶活性定义为每分钟水解1μmolCPC-Na的酶活为一个单位U，检测酶活采用氢氧化钠滴定法；
步骤12：配制pH8.0的磷酸盐缓冲液；
步骤13：配制CPC-Na盐溶液；
步骤14：将三口烧瓶置于25℃的水浴中提前预热，吸取预热至25℃的2％CPC-Na盐溶液到三口烧瓶中，加入适量体积酶液，利用磁力搅拌使反应体系混匀，控制反应温度25℃，用0.1mol/L氢氧化钠滴定液滴定，保持反应溶液pH为8.0，同时记录反应约6～8min内氢氧化钠滴定液消耗的毫升数；
步骤15：酶活计算；
步骤16：HPLC分析。
一种多核苷酸，多核苷酸编码是由选自序列SEQ ID NO.1的头孢菌素C酰化酶突变体重组的多肽。
进一步的，所述多核苷酸选自序列SEQ ID NO.2。
一种7-氨基头孢烷酸的生产方法，通过选自序列SEQ ID NO.1的头孢菌素C酰化酶突变体生产7-氨基头孢烷酸。
进一步的，其生产方法包括如下步骤：
步骤21：配制pH8.0的磷酸盐缓冲液；
步骤22：配制CPC-Na盐溶液；
步骤23：将三口烧瓶置于25℃的水浴中提前预热，吸取预热至25℃的10％CPC-Na盐溶液到三口烧瓶中；
在加酶液前取样500μl，立即加入500μl终止液；
混匀后12000g高速离心10min后取上清进行保存；
加入适量体积酶液，利用磁力搅拌使反应体系混匀，控制反应温度25℃，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH，保持反应溶液pH为8.0。
步骤24：分别于加入酶液后100min、200min、250min、300min取样500μl，加入500μl终止液，混匀后12000g高速离心10min后，取上清进行HPLC检测。
进一步的，头孢菌素C酰化酶突变体生产7-氨基头孢烷酸过程中重组表达蛋白包括如下步骤：
步骤31：挑取含有SEQ ID NO.2序列的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中，30℃、250rpm过夜培养；
步骤32：次日取1L三角瓶，按1:100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中，于30℃中培养至菌体OD5-6；
步骤33：立刻将三角瓶置于25℃摇床中、250rpm培养1小时；
步骤34：加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃、250rpm继续培养16小时；
步骤35：培养结束后，将培养基于4℃、12000g下离心20min收集湿菌体；
步骤36：将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存；
步骤37：取少量菌体进行SDS-PAGE检测。
进一步的，所述步骤32中，每升所述培养基中包括以下成分：
胰蛋白胨：10g；
酵母提取物：5g；
磷酸氢二钠：3.55g；
磷酸二氢钾：3.4g；
氯化铵：2.68g；
硫酸钠：0.71g；
七水硫酸镁：0.493g；
六水氯化铁：0.027g；
甘油：5g；
葡萄糖：0.8g；
卡那霉素：50mg。
本发明的有益技术效果：按照本发明的头孢菌素C酰化酶突变体及其在7-氨基头孢烷酸生产中的应用，本发明提供的头孢菌素C酰化酶突变体及其在7-氨基头孢烷酸生产中的应用，通过定向进化得到酶活性增强的头孢菌素C酰化酶突变体，酶活性比野生性头孢菌素C酰化酶提高5倍以上，三小时底物转化率达95％-98％，副产物D-7ACA小于0.8％，优于行业内标准，通过使用本发明的蛋白突变体，能够有效地制造半合成头孢菌素类药物的重要中间体，工艺简单且得率高，技术可移植性强，只要一般的发酵车间即可投入生产，如氨基酸、维生素生产车间，不需购置特殊设备，易于推广应用，本发明具有较强的实用性和推广价值。
附图说明
图1为按照本发明的头孢菌素C酰化酶突变体蛋白上清、包涵体SDS-PAGE图谱；
图2为按照本发明的实施例中样品7-氨基头孢烷酸基因序列的HPLC图谱。
具体实施方式
为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本实施例提供的一种头孢菌素C酰化酶突变体，能够催化头孢菌素C生成7-氨基头孢烷酸，所述头孢菌素C酰化酶突变体与野生型头孢菌素C酰化酶相比表现出更高的催化活性，酶活提高约8.6倍。
进一步的，在本实施例中，头孢菌素C酰化酶突变体选自序列SEQ ID NO.1。
进一步的，在本实施例中，选自序列SEQ ID NO.1的头孢菌素C酰化酶突变体比野生型头孢菌素C酰化酶具有更高的底物催化活性。
进一步的，在本实施例中，酶活的检测包括如下步骤：
步骤11：将酶活性定义为每分钟水解1μmolCPC-Na的酶活为一个单位U，检测酶活采用氢氧化钠滴定法；
步骤12：配制pH8.0的磷酸盐缓冲液；
步骤13：配制CPC-Na盐溶液；
步骤14：将三口烧瓶置于25℃的水浴中提前预热，吸取预热至25℃的2％CPC-Na盐溶液到三口烧瓶中，加入适量体积酶液，利用磁力搅拌使反应体系混匀，控制反应温度25℃，用0.1mol/L氢氧化钠滴定液滴定，保持反应溶液pH为8.0，同时记录反应约6～8min内氢氧化钠滴定液消耗的毫升数；
步骤15：酶活计算；
步骤16：HPLC分析。
本实施例提供的一种多核苷酸，多核苷酸编码是由选自序列SEQ ID NO.1的头孢菌素C酰化酶突变体重组的多肽。
进一步的，在本实施例中，所述多核苷酸选自序列SEQ ID NO.2。
本实施例提供的一种7-氨基头孢烷酸的生产方法，通过选自序列SEQ ID NO.1的头孢菌素C酰化酶突变体生产7-氨基头孢烷酸。
进一步的，在本实施例中，其生产方法包括如下步骤：
步骤21：配制pH8.0的磷酸盐缓冲液；
步骤22：配制CPC-Na盐溶液；
步骤23：将三口烧瓶置于25℃的水浴中提前预热，吸取预热至25℃的10％CPC-Na盐溶液到三口烧瓶中；
在加酶液前取样500μl，立即加入500μl终止液；
混匀后12000g高速离心10min后取上清进行保存；
加入适量体积酶液，利用磁力搅拌使反应体系混匀，控制反应温度25℃，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH，保持反应溶液pH为8.0。
步骤24：分别于加入酶液后100min、200min、250min、300min取样500μl，加入500μl终止液，混匀后12000g高速离心10min后，取上清进行HPLC检测。
进一步的，在本实施例中，头孢菌素C酰化酶突变体生产7-氨基头孢烷酸过程中重组表达蛋白包括如下步骤：
步骤31：挑取含有SEQ ID NO.2序列的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中，30℃、250rpm过夜培养；
步骤32：次日取1L三角瓶，按1:100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中，于30℃中培养至菌体OD5-6；
步骤33：立刻将三角瓶置于25℃摇床中、250rpm培养1小时；
步骤34：加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃、250rpm继续培养16小时；
步骤35：培养结束后，将培养基于4℃、12000g下离心20min收集湿菌体；
步骤36：将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存；
步骤37：取少量菌体进行SDS-PAGE检测。
进一步的，在本实施例中，所述步骤32中，每升所述培养基中包括以下成分：
胰蛋白胨：10g；
酵母提取物：5g；
磷酸氢二钠：3.55g；
磷酸二氢钾：3.4g；
氯化铵：2.68g；
硫酸钠：0.71g；
七水硫酸镁：0.493g；
六水氯化铁：0.027g；
甘油：5g；
葡萄糖：0.8g；
卡那霉素：50mg。
进一步的，在本实施例中，图1为本实施例的头孢菌素C酰化酶突变体蛋白上清、包涵体SDS-PAGE图谱；图2为本实施例的实施例中样品7-氨基头孢烷酸基因序列的HPLC图谱。
本实施例提供的一种头孢菌素C酰化酶突变体及其应用，包括如下步骤：
步骤1：通过引物获取基因序列；
步骤2：重组表达蛋白；
步骤3：检测酶活；
步骤4：制备7-氨基头孢烷酸。
进一步的，在本实施例中，所述步骤1中，通过引物获取基因序列包括如下步骤：
利用Primer Premier(http://primer3.ut.ee/)进行引物设计，设计原则如下：保证Tm值差异控制在3℃以内；并需要减少重复序列生成以及消除潜在的发夹结构，使得二级结构更易转录；同时消除在宿主转录组中出现频率在10％以下密码子；并严格控制引物长度在50base以内，得到引物：
Figure BDA0001449318610000091
Figure BDA0001449318610000101
Figure BDA0001449318610000111
Figure BDA0001449318610000121
合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nM，首尾引物的终浓度为0.6μM。
每50μl的PCR反应体系中包括如下成分：
2mM dNTP mix：5μl；
10×Pfu buffer：5μl；
Pfu DNA polymerase(10U/μl)：0.5μl；
ddH2O：余量。
将配制好的PCR反应体系置于博日XP cycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃180s，35x。将PCR得到的DNA片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pET30a的NdeI/XhoI位点。挑取单克隆进行测序确认，获得正确的序列。
进一步的，在本实施例中，所述步骤2中，重组表达蛋白包括如下步骤：
挑取含有SEQ ID NO.2序列的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：
每升所述培养基中包括以下成分：
胰蛋白胨：10g；
酵母提取物：5g；
磷酸氢二钠：3.55g；
磷酸二氢钾：3.4g；
氯化铵：2.68g；
硫酸钠：0.71g；
七水硫酸镁：0.493g；
六水氯化铁：0.027g；
甘油：5g；
葡萄糖：0.8g；
卡那霉素：50mg；
30℃，250rpm过夜培养，次日取1L三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中；
于30℃中培养至菌体OD 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时；
加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃，250rpm继续培养16小时；
培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体；
将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存；
取少量菌体进行SDS-PAGE检测。
进一步的，在本实施例中，所述步骤3中，检测酶活包括如下步骤：
将酶活性定义为每分钟水解1μmolCPC-Na的酶活为一个单位(U)，检测酶活方法采用氢氧化钠滴定法；
配制pH8.0的磷酸盐缓冲液：称取KH2PO4 0.68g于250ml纯化水中得溶液1；称取K2HPO4·3H2O 2.28g于500ml纯化水中得溶液2；用溶液1调节溶液2使其pH值达到8.0；
配制CPC-Na盐溶液：称取CPC-Na盐2.0g，溶于约100ml上述磷盐缓冲液中，并用氢氧化钠调节溶液的pH至8.0；
将三口烧瓶置于25℃的水浴中提前预热，吸取预热至25℃的2％CPC-Na盐溶液到三口烧瓶中，加入适量体积酶液，利用磁力搅拌使反应体系混匀，控制反应温度25℃，用0.1mol/L氢氧化钠滴定液滴定，保持反应溶液pH为8.0，同时记录反应约6～8分钟内氢氧化钠滴定液消耗的毫升数；
酶活计算：取试验10分钟内的氢氧化钠滴定液消耗的毫升数，求每分钟的毫升数，用下列公式计算酶活性：
Figure BDA0001449318610000151
V1——测定时间内消耗氢氧化钠滴定液的体积，ml；
C——氢氧化钠滴定液的浓度，mol/L；
1000——折微摩尔浓度换算系数；
t——测定酶反应时间，min；
V2——酶液体积，mL；
取500ul反应液，加500μI终止液(20％冰醋酸和50mM NaOH按2:1混合)终止反应，进行HPLC分析(phenomenex C18柱，150X4.6mm；流动相:15％甲醇，7.5％乙腈，1％乙酸；254nm检测吸光度)，结果表明突变体能够产生7-氨基头孢烷酸。
进一步的，在本实施例中，所述步骤4中，制备7-氨基头孢烷酸包括如下步骤：
配制pH8.0的磷酸盐缓冲液：称取KH2PO4 0.68g于250ml纯化水中得溶液1；称取K2HPO4·3H2O 2.28g于500ml纯化水中得溶液2；用溶液1调节溶液2使其pH值达到8.0；
配制CPC-Na盐溶液：称取CPC-Na盐20.0g，溶于约200ml上述磷盐缓冲液中，并用氢氧化钠调节溶液的pH至8.0；
将三口烧瓶置于25℃的水浴中提前预热，吸取预热至25℃的10％CPC-Na盐溶液到三口烧瓶中，在加酶液前取样500μl，立即加入500μl终止液(20％冰醋酸和50mM NaOH按2:1混合)，混匀后12000g高速离心10分钟后取上清进行保存；加入适量体积酶液，利用磁力搅拌使反应体系混匀，控制反应温度25℃，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH，保持反应溶液pH为8.0；
分别于加入酶液后100min、200min、250min、300min取样500μl，加入500μl终止液(20％冰醋酸和50mM NaOH按2:1混合)，混匀后12000g高速离心10分钟后，取上清进行HPLC检测。
结果显示最终转化率为98.03％，D-7-氨基头孢烷酸约占0.76％。
结果显示，通过对CPC酰化酶进行定向进化，获得了比野生型酰化酶酶活提高8.6倍的CPC酰化酶突变体，酶活对比结果如表1所示。
表1酶活对比结果
种类 酶活
野生型酰化酶 10.46U/ml
Seq ID NO:1突变蛋白 90.0U/ml
通过使用本发明的蛋白突变体，能够有效地制造半合成头孢菌素类药物的重要中间体，工艺简单且得率高，技术可移植性强，只要一般的发酵车间(如氨基酸、维生素生产车间)即可投入生产，不需购置特殊设备，易于推广应用。
综上所述，在本实施例中，按照本实施例的头孢菌素C酰化酶突变体及其在7-氨基头孢烷酸生产中的应用，本实施例提供的头孢菌素C酰化酶突变体及其在7-氨基头孢烷酸生产中的应用，通过定向进化得到酶活性增强的头孢菌素C酰化酶突变体，酶活性比野生性头孢菌素C酰化酶提高5倍以上，三小时底物转化率达95％-98％，副产物D-7ACA小于0.8％，优于行业内标准，通过使用本发明的蛋白突变体，能够有效地制造半合成头孢菌素类药物的重要中间体，工艺简单且得率高，技术可移植性强，只要一般的发酵车间即可投入生产，如氨基酸、维生素生产车间，不需购置特殊设备，易于推广应用，本发明具有较强的实用性和推广价值。
以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京朗恩生物科技有限公司
<120> 一种头孢菌素C酰化酶突变体及其在7-氨基头孢烷酸生产中的应用
<130> 2017
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 765
<212> PRT
<213> 头孢菌素C酰化酶突变体(SEQ ID NO.1人工序列)
<400> 1
Met Thr Met Ala Ala Lys Thr Asp Arg Glu Ala Leu Gln Ala Ala Leu
1 5 10 15
Pro Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ala Pro Val
20 25 30
Arg Val Gln Arg Asp Gly Trp Gly Ile Pro His Ile Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Glu Ala Asp Ala Tyr Arg Ala Leu Gly Phe Val His Ala Arg Ser His
50 55 60
Leu Asp Gln Met Glu Leu Thr Arg Arg Lys Ala Leu Gly Arg Ala Ala
65 70 75 80
Glu Trp Leu Gly Ala Glu Ala Ala Glu Ala Asp Ile Leu Val Arg Arg
85 90 95
Leu Gly Met Glu Lys Val Cys Arg Arg Asp Phe Glu Ala Leu Gly Ala
100 105 110
Glu Ala Lys Asp Met Leu Arg Ala Tyr Val Ala Gly Val Asn Ala Phe
115 120 125
Leu Ala Ser Gly Ala Pro Leu Pro Ile Glu Tyr Gly Leu Ile Ser Pro
130 135 140
Glu Val Arg Gln Trp Glu Pro Trp His Ser Ile Ala Val Met Arg Arg
145 150 155 160
Leu Gly Leu Leu Met Gly Ser Val Trp Phe Lys Leu Trp Arg Met Leu
165 170 175
Ala Leu Pro Val Val Gly Ala Ala Asn Ala Leu Lys Leu Arg Tyr Asp
180 185 190
Asp Gly Gly Gln Asp Leu Leu Cys Ile Pro Pro Gly Val Glu Ala Glu
195 200 205
Arg Leu Glu Ala Asp Leu Ala Ala Leu Arg Pro Ala Val Asp Ala Leu
210 215 220
Leu Lys Ala Met Gly Gly Asp Ala Ser Asp Ala Ala Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
Asn Asn Trp Ala Val Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro Ile
245 250 255
Leu Ala Gly Asp Pro His Arg Val Phe Glu Ile Pro Gly Met Tyr Ala
260 265 270
Gln His His Leu Ala Cys Asp Arg Phe Glu Val Tyr Gly Leu Thr Val
275 280 285
Pro Gly Val Pro Gly Phe Ile Arg Val Ala Phe Asn Gln Lys Val Ala
290 295 300
Tyr Cys Val Thr His Ala Phe Met Asp Ile His Asp Leu Tyr Leu Glu
305 310 315 320
Gln Phe Ala Glu Asp Gly Arg Thr Ala Arg Phe Gly Asn Glu Phe Glu
325 330 335
Pro Phe Glu Arg Arg Gln Ala Ser Ile Ala Leu Arg Gly Gly Ala Asp
340 345 350
Arg Glu Phe Asp Ile Val Glu Thr Arg His Gly Pro Val Ile Ala Gly
355 360 365
Asp Pro Leu Glu Gly Ala Ala Leu Thr Leu Arg Ser Val Gln Phe Ala
370 375 380
Glu Thr Asp Met Leu Phe Gln Thr Phe Asp Met Met Pro Gly Ala Ser
385 390 395 400
Thr Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Thr Arg Gly Trp Gly Leu Ile Asp
405 410 415
His Asn Leu Val Ala Gly Asp Val Ala Gly Ser Ile Gly His Leu Val
420 425 430
Arg Ala Arg Val Pro Ser Arg Pro Arg Glu Asn Gly Trp Leu Pro Val
435 440 445
Pro Gly Trp Ser Gly Glu His Glu Trp Arg Gly Trp Ile Pro His Glu
450 455 460
Ala Met Pro Arg Val Ile Asp Pro Pro Gly Gly Leu Ile Val Thr Ala
465 470 475 480
Asn Asn Arg Val Val Ala Asp Asp His Pro Asp Tyr Leu Cys Thr Asp
485 490 495
Cys His Pro Pro Tyr Arg Ala Glu Arg Ile Met Glu Arg Leu Val Ala
500 505 510
Ser Pro Ala Phe Ala Val Asp Asp Ala Ala Ala Ile His Ala Asp Thr
515 520 525
Leu Ser Pro His Val Gly Leu Leu Arg Ala Arg Leu Glu Ala Leu Gly
530 535 540
Ile Gln Gly Ser Leu Pro Ala Glu Glu Leu Arg Gln Thr Leu Ile Ala
545 550 555 560
Trp Asp Gly Arg Met Asp Ala Gly Ser Gln Ala Ala Ser Ala Tyr Asn
565 570 575
Ala Phe Arg Arg Ala Leu Thr Arg Leu Val Thr Ala Arg Ser Gly Leu
580 585 590
Glu Gln Ala Ile Ala His Pro Phe Ala Ala Val Pro Pro Val Val Thr
595 600 605
Pro Tyr Gly Leu Arg Asp Pro Lys Ala Ala Val Asp Lys Leu Arg Ser
610 615 620
Trp Asp Glu Ala Leu Ser Glu Ala Leu Ser Val Ala Thr Gln Asn Leu
625 630 635 640
Thr Gly Arg Gly Trp Gly Glu Glu His Arg Pro Arg Phe Thr His Pro
645 650 655
Leu Ser Ala Gln Phe Pro Ala Trp Ala Ala Leu Leu Asn Pro Val Ser
660 665 670
Arg Pro Ile Gly Gly Asp Gly Asp Thr Val Leu Ala Asn Gly Leu Val
675 680 685
Pro Ser Ala Gly Pro Glu Ala Thr Tyr Gly Ala Leu Ser Arg Tyr Val
690 695 700
Phe Asp Val Gly Asn Trp Asp Asn Ser Arg Trp Val Val Phe His Gly
705 710 715 720
Ala Ser Gly His Pro Ala Ser Pro His Tyr Ala Asp Gln Asn Ala Pro
725 730 735
Trp Ser Asp Cys Ala Met Val Pro Met Leu Tyr Ser Trp Asp Arg Ile
740 745 750
Ala Ala Glu Ala Val Thr Ser Gln Glu Leu Val Pro Ala
755 760 765
<210> 2
<211> 2301
<212> DNA
<213> 多核苷酸(SEQ ID NO.2人工序列)
<400> 2
atgaccatgg cggcgaaaac cgatcgcgaa gcgctgcagg cggcgctgcc gccgctgtct 60
ggctctctgt ctattccggg cctgtctgcg ccggttcgtg ttcagcgcga cggctggggt 120
atcccgcaca tcaaagcgtc tggcgaagcg gacgcgtacc gtgcgctggg tttcgttcac 180
gcgcgctctc acctggatca gatggaactg acccgtcgta aagcgctggg ccgtgcggcg 240
gaatggctgg gcgcggaagc ggcggaagcg gatattctgg ttcgtcgcct gggcatggaa 300
aaagtttgtc gtcgtgactt cgaagcgctg ggcgcggaag cgaaagatat gctgcgcgcg 360
tacgttgcgg gcgttaacgc gttcctggcg tctggtgcgc cgctgccgat cgaatatggc 420
ctgatctctc cggaagttcg tcagtgggaa ccgtggcact ctatcgcggt tatgcgtcgt 480
ctgggcctgc tgatgggttc tgtttggttc aaactgtggc gcatgctggc gctgccggtt 540
gttggtgcgg cgaacgcgct gaaactgcgt tatgatgatg gtggccagga cctgctgtgc 600
atcccgccgg gtgttgaagc ggaacgcctg gaagcggatc tggcggcgct gcgtccggcg 660
gttgacgcgc tgctgaaagc gatgggtggc gatgcgtctg acgcggcggg cggtggttct 720
aacaactggg cggttgcgcc gggccgcacc gcgaccggcc gtccgattct ggcgggtgac 780
ccgcaccgcg ttttcgaaat cccgggcatg tatgcgcagc accacctggc gtgtgatcgt 840
ttcgaagttt acggcctgac cgttccgggc gttccgggtt tcattcgcgt tgcgttcaac 900
cagaaagttg cgtactgtgt tacccacgcg ttcatggaca tccacgatct gtatctggaa 960
cagttcgcgg aagacggtcg taccgcgcgt ttcggtaacg aattcgaacc gttcgaacgt 1020
cgtcaggcgt ctattgcgct gcgcggtggc gcggatcgtg aattcgatat tgttgaaacc 1080
cgtcacggtc cggttatcgc gggcgacccg ctggaaggcg cggcgctgac cctgcgctct 1140
gttcagttcg cggaaaccga catgctgttc cagaccttcg atatgatgcc gggcgcgtct 1200
accgttgcgc agctgtatga cgcgacccgt ggttggggtc tgatcgacca caacctggtt 1260
gcgggcgacg ttgcgggttc tatcggtcac ctggttcgtg cgcgtgttcc gtctcgcccg 1320
cgtgaaaacg gttggctgcc ggttccgggt tggtctggtg aacacgaatg gcgcggttgg 1380
atcccgcacg aagcgatgcc gcgcgttatt gatccgccgg gtggcctgat cgttaccgcg 1440
aacaaccgtg ttgttgcgga cgaccacccg gattacctgt gtaccgattg tcacccgccg 1500
tatcgtgcgg aacgtattat ggaacgtctg gttgcgtctc cggcgttcgc ggttgacgat 1560
gcggcggcga tccacgcgga caccctgtct ccgcacgttg gcctgctgcg tgcgcgcctg 1620
gaagcgctgg gtattcaggg ctctctgccg gcggaagaac tgcgccagac cctgattgcg 1680
tgggatggtc gtatggatgc gggctctcag gcggcgtctg cgtataacgc gttccgtcgt 1740
gcgctgaccc gcctggttac cgcgcgctct ggtctggaac aggcgattgc gcacccgttc 1800
gcggcggttc cgccggttgt taccccgtat ggtctgcgtg atccgaaagc ggcggttgac 1860
aaactgcgtt cttgggatga agcgctgtct gaagcgctgt ctgttgcgac ccagaacctg 1920
accggtcgtg gttggggcga agaacaccgt ccgcgcttca cccacccgct gtctgcgcag 1980
ttcccggcgt gggcggcgct gctgaacccg gtttctcgtc cgattggtgg tgatggcgat 2040
accgttctgg cgaacggcct ggttccgtct gcgggtccgg aagcgaccta tggcgcgctg 2100
tctcgttacg ttttcgatgt tggtaactgg gacaactctc gttgggttgt tttccacggt 2160
gcgtctggcc acccggcgtc tccgcactat gcggaccaga acgcgccgtg gtctgactgt 2220
gcgatggttc cgatgctgta ttcttgggac cgcattgcgg cggaagcggt tacctctcag 2280
gaactggttc cggcgtaata a 2301

Claims (7)

1.一种头孢菌素C酰化酶突变体，其特征在于，能够催化头孢菌素C生成7-氨基头孢烷酸，所述头孢菌素C酰化酶突变体序列如SEQ ID NO.1所示，与野生型头孢菌素C酰化酶相比表现出更高的催化活性，酶活提高约8.6倍。
2.一种多核苷酸，其特征在于，多核苷酸编码如序列SEQ ID NO.1所示的头孢菌素C酰化酶突变体。
3.根据权利要求2所述的一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
4.一种7-氨基头孢烷酸的生产方法，其特征在于，通过序列SEQ ID NO.1所示的头孢菌素C酰化酶突变体生产7-氨基头孢烷酸。
5.根据权利要求4所述的一种7-氨基头孢烷酸的生产方法，其特征在于，其生产方法包括如下步骤：
步骤21：配制pH8.0的磷酸盐缓冲液；
步骤22：配制CPC-Na盐溶液；
步骤23：将三口烧瓶置于25℃的水浴中提前预热，吸取预热至25℃的10%CPC-Na盐溶液到三口烧瓶中；
在加酶液前取样500μl，立即加入500μl终止液；
混匀后12000g高速离心10min后取上清进行保存；
加入适量体积酶液，利用磁力搅拌使反应体系混匀，控制反应温度25℃，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH，保持反应溶液pH为8.0；
步骤24：分别于加入酶液后 100min、200min、250min、300min取样500μl，加入500μl终止液，混匀后12000g高速离心10min后，取上清进行HPLC检测。
6.根据权利要求4所述的一种7-氨基头孢烷酸的生产方法，其特征在于，头孢菌素C酰化酶突变体生产7-氨基头孢烷酸过程中重组表达蛋白包括如下步骤：
步骤31：挑取含有SEQ ID NO.2序列的大肠杆菌单菌落接种于10ml 高压灭菌后的培养基中，30℃、250rpm过夜培养；
步骤32：次日取1L三角瓶，按1:100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中，于30℃中培养至菌体OD5-6；
步骤33：立刻将三角瓶置于25℃摇床中、250rpm培养1小时；
步骤34：加IPTG至终浓度0.1mM，并于25℃、250rpm继续培养16小时；
步骤35：培养结束后，将培养基于4℃、12000g下离心20min收集湿菌体；
步骤36：将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存；
步骤37：取少量菌体进行SDS-PAGE检测。
7.根据权利要求6所述的一种7-氨基头孢烷酸的生产方法，其特征在于，所述步骤32中，每升所述培养基中包括以下成分：
胰蛋白胨：10g；
酵母提取物：5g；
磷酸氢二钠：3.55g；
磷酸二氢钾：3.4g；
氯化铵：2.68g；
硫酸钠：0.71g；
七水硫酸镁：0.493g；
六水氯化铁：0.027g；
甘油：5g；
葡萄糖：0.8g；
卡那霉素：50mg。
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