CN114410563B - 大肠杆菌的高密度培养及在催化生产槲皮素中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了大肠杆菌的高密度培养及在催化生产槲皮素中的应用，属于发酵工程及生物医药技术领域。本发明通过优化发酵培养基，使构建的重组菌株获得较高浓度的菌体密度，且具有较好的全细胞催化活性。将高密度发酵获得的重组大肠杆菌作为催化剂进行全细胞催化，可在4‑6h内催化40g/L的底物芦丁完全水解生成槲皮素。

Description

大肠杆菌的高密度培养及在催化生产槲皮素中的应用
技术领域
本发明涉及大肠杆菌的高密度培养及在催化生产槲皮素中的应用，属于发酵工程及生物医药技术领域。
背景技术
槲皮素是一种黄酮醇，存在于多种蔬菜和草药中，含有许多有利的生物活性，能帮助健康细胞增殖，提高心血管免疫。槲皮素具备抗氧化属性，能够清除自由基，帮助细胞调节，促进DNA完整性等。另外，槲皮素还能帮助身体在氧化应激中保持足够的谷胱甘肽水平，支持免疫调节。槲皮素在清除自由基方面具有显著的效果，是药用植物的活性成分之一，相关药理和临床实验证明槲皮素具有广泛的药用价值，现代药理研究表明槲皮素具有抗炎、抗氧化、抑制肿瘤细胞生长等药理活性。此外，槲皮素还可以治疗慢性支气管炎、冠心病及高血压等疾病。槲皮素是许多类黄酮的基础结构，如芦丁，异槲皮苷。同时，槲皮素环结构也是更大的类黄酮分子的一部分存在，比如金丝桃中的高糖，银杏中的黄酮糖苷等。槲皮素比较容易从芦丁中提取获得，常常被添加到保健品中。然而，槲皮素很少在自然中直接存在，且在小肠的吸收表面不易被主动吸收，它的吸收只能依靠更慢速、更低效的被动扩散过程进行。
目前，异槲皮素和槲皮素的制备方法有：1.从天然植物中分离提取，如“从生物类黄酮中回收异槲皮素”等方法，但这类方法要使用大量的有机溶剂，不利于清洁生产，并且产率低，成本高，很难实现产业化生产；2.用酶法水解芦丁制备异槲皮苷和槲皮素，比如“酶法水解制备异槲皮素和槲皮素的方法”，该方法需要使用昂贵的生物酶制剂，工艺设备也较复杂，生产成本较高。槲皮素的工业化生产一般采用强酸水解芦丁的工艺，对生产设备的防腐要求较高，且产生三废，不利于环境保护。微生物法比较经济而且操作方便安全。但是，全细胞催化生产需要足够的菌体量，如果培养大肠杆菌直接采用TB培养基，容易导致发酵成本太高。因此，为了在减少发酵成本的同时获得较高菌体量，亟待开发更加高效的发酵方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种高密度发酵方法，从而提高重组大肠杆菌发酵的菌体量。
本发明提供了一种能够利用芦丁生产槲皮素的重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达嗜热链球菌来源的L-鼠李糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶。
在一种实施方式中，所述L-鼠李糖苷酶DthRha具有如Genbank登录号WP_012548615.1所示的氨基酸序列；所述β-葡萄糖苷酶Dth3具有如Genbank登录号ACI19278.1所示的氨基酸序列。
在一种实施方式中，编码所述DthRha的基因序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述Dth3的基因序列SEQ ID NO.2所示。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以pET系列载体为中的pRSFduet-1为表达载体。
在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌以E.coli BL21(DE3)为宿主。
本发明还提供含所述重组大肠杆菌的细胞催化剂；所述细胞催化剂包括但不限于所述重组大肠杆菌的细胞培养液或固定化细胞。
本发明还提供了所述重组大肠杆菌的高密度发酵方法，是将所述重组大肠杆菌接种至发酵培养基中，使接种后的OD达0.08以上，于35～37℃发酵，发酵12h时后降温至30℃，并且开始补料，补料流速为20mL/h；发酵过程溶氧控制为40％，pH为7.0。
在一种实施方式中，所述发酵培养基包括但不限于TB培养基或高密度发酵培养基；所述高密度发酵培养基含有KH2PO4 6g/L、K2HPO43H2O 16.4g/L、(NH4)2SO4 5g/L、无水柠檬酸1g/L、MgSO47H2O 1g/L、酵母粉10g/L、甘油10-30g/L、麦芽糖糊精10g/L、维生素B10.1g/L和微量元素溶液1mL/L；所述微量元素溶液含有：柠檬酸铁(三价)100g/L,ZnCl318g/L,MnSO4·H2O 14.64g/L,CuSO4·5H2O 0.75g/L,Na2MoO4·2H2O 2g/L,CaCl2.2H2O 2g/L,H3BO3 3.0g/L,CoCl2.6H2O 2.5g/L,NiSO4.6H2O 2.5g/L和HCl 100mL。
在一种实施方式中，补料的成分包括：3g/L MgSO4.7H2O、10g/L酵母粉和500g/L甘油。
本发明还提供了一种生产槲皮素的方法，是以芦丁为底物，以所述重组大肠杆菌为细胞催化剂生产槲皮素。
在一种实施方式中，所述方法是将所述重组大肠杆菌细胞加入至含终浓度10～40g/L芦丁的反应体系中，于75～85℃反应至少4h。
在一种实施方式中，反应体系中，所述重组大肠杆菌细胞与芦丁的质量比为(2.5～10)：1。
本发明还提供所述重组大肠杆菌或所述方法在生产含槲皮素的食品、药品或保健品中的应用。
有益效果：本发明通过将DthRha、Dth3的基因序列连接至大肠杆菌表达载体pRSFduet-1上，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达，并采用优化后的培养基，在5L发酵罐上放大培养获得较高的菌体密度。发酵37h时OD600高达为96，同时，采用高密度发酵使DthRha和Dth3的酶活得到大大提高，DthRha总酶活达104905.08U/L，Dth3总酶活达12621.49U/L。向反应体系中添加终浓度为60g/L湿菌体，可在4～6h内完全催化水解浓度为40g/L的芦丁，生成槲皮素而不产生其他产物。
附图说明
图1为Dth3水解芦丁的HPLC图谱；
图2为DthRha水解芦丁的HPLC图谱；
图3为DthRha和Dth3水解芦丁的HPLC图谱。
具体实施方式
(一)培养基：
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L。加入20g/L琼脂条，以配制LB固体培养基。
TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，磷酸二氢钾2.31g/L，磷酸氢二钾12.54g/L，甘油4g/L。
优化培养基：KH2PO4 6g/L、K2HPO43H2O 16.4g/L、(NH4)2SO4 5g/L、无水柠檬酸1g/L、MgSO47H2O 1g/L、酵母粉10g/L、甘油10-30g/L、麦芽糖糊精10g/L、维生素B1 0.1g/L和微量元素溶液1mL/L；其中，微量元素溶液：柠檬酸铁(三价)100g/L,ZnCl3 18g/L,MnSO4·H2O14.64g/L,CuSO4·5H2O 0.75g/L,Na2MoO4·2H2O 2g/L,CaCl2.2H2O 2g/L,H3BO33.0g/L,CoCl2.6H2O 2.5g/L,NiSO4.6H2O 2.5g/L和HCl 100mL。
(二)糖苷酶活力测定方法：
(1)L-鼠李糖苷酶DthRha活力测定：将底物对硝基苯基鼠李糖苷(pNPR)溶于50mMpH 6.0的吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，至pNPR终浓度为10mM。吸取100μL底物溶液，向其中加入200μL酶液，充分混合均匀。按照每孔50μL吸取反应液至96孔酶标板，置于合适的温度进行酶促反应，以加入150μL 0.5M浓度的Na2CO3终止反应，并于405nm处测定吸光值。每组两个平行，0min、5min、7min终止一组反应并测定吸光度。
(2)β-葡萄糖苷酶Dth3活力测定：将底物对硝基苯基(pNP)-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)溶于50mM pH 6.0的吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，至pNPG终浓度为10mM。吸取100μL底物溶液，向其中加入200μL酶液，充分混合均匀。按照每孔50μL吸取反应液至96孔酶标板，置于合适的温度进行酶促反应，以加入150μL 0.5M浓度的Na2CO3终止反应，并于405nm处测定吸光值。每组两个平行，0min、5min、10min终止一组反应并测定吸光度。
酶活力定义为：在pH 5.5和90℃的反应条件下，每分钟生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量为1U。
(三)对硝基苯酚标曲制备：将对硝基苯酚溶于50mM pH 6.0的MES缓冲液，分别配制成终浓度为10μM，50μM，100μM，500μM，1mM，5mM以及10mM的贮液，按照每孔50μL吸取至酶标板，并向其中加入150μL 0.5M浓度的Na2CO3，于405nm处测定吸光值，制备对硝基苯酚标曲。
(四)芦丁、槲皮素及异槲皮素的HPLC测定：采用Shimadzu高效液相色谱进行测定。HPLC条件：色谱柱，Thermo Hypersil ODS-2column；流动相A：含有1‰三氟乙酸的超纯水；流动相B：含有1‰三氟乙酸的乙腈；流动相比例条件，0-10min，10-40％B，10-20min，40-60％B，20-22min，40-10％B，22-23min，10-10％B，23-25min，10-10％B；流速：1mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL；检测器：紫外检测器A370。
实施例1 DthRha和Dth3基因合成及重组表达糖苷酶大肠杆菌的构建
将DthRha和Dth3基因进行大肠杆菌密码子优化后，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因合成，DthRha基因序列如SEQ ID NO.1所示，Dth3基因序列如SEQ ID NO.2所示。
设计用于扩增DthRha序列的引物对F：ATGAAATCCAGCAACATCTACAGCCCG，R：TTAGATTTTTTCCATGTAGAAGTTGTAGC；对应的载体引物对F：GCTACAACTTCTACATGGAAAAAATCTAACGAACAGAAAGTAATCGTATTGTACACGG，R:CGGGCTGTAGATGTTGCTGGATTTCATCGAGCTCGAATTCGGATCCTGGC。而用于扩增Dth3序列的引物对F：ATGAAACTGGAATACAAAATCCCGTACCG，R:GAGATCTGCTTAAGAGTTAATTTCTTTCAGCAGGTTTTC；对应的pRSFduet-1载体引物对F：ACCTGCTGAAAGAAATTAACTCTTAAGCAGATCTCAATTGGATATCGGCC，R:GGTACGGGATTTTGTATTCCAGTTTCATTATATCTCCTTCTTATACTTAACTAATATAC。用上述引物对分别对基因片段和载体片段进行PCR扩增，选择高保真酶进行PCR，条件为预变性95℃，3min；扩增阶段28个循环，按照95℃，30s，58℃，30s，72℃，2min进行；延伸72℃，10min。将目的片段及载体片段的PCR产物进行产物纯化，用一步克隆的方法将纯化后片段进行重组，获得为载体pRSFduet-DthRha-Dth3，并转化大肠杆菌JM109。得到的载体送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)。
实施例2诱导重组大肠杆菌发酵产葡萄糖苷酶Dth3和α-L-鼠李糖苷酶DthRha
将实施例1构建完成的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pRSFduet-DthRha-Dth3划线于含有卡那霉素浓度为50μg/mL的LB平板，于37℃、220rpm培养12h。挑取单菌落转接入含有卡那霉素浓度为50μg/mL的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养10h。按照2-4％的接种量转接至50mL含有卡那霉素浓度为50μg/mL的TB培养基或者优化培养基，37℃ 220rpm振荡培养至OD600值为0.8-1.0，降温至30℃，220rpm继续振荡培养16h。
培养结束吸取1mL培养物，测定OD600值达14。将1mL培养物于4500×g离心10min收集菌体。用0.5M pH 5.5的PBS缓冲液重悬菌体，5000×g离心10min，洗涤菌体除去残余培养基。以0.5M pH 5.5的PBS缓冲液重悬菌体，将菌体进行适当稀释后测定DthRha与Dth3的酶活。采用TB培养基DthRha酶活为8687.1U/L，Dth3的酶活为1100.3U/L；采用优化培养基发酵获得的DthRha酶活为4144.56U/L，Dth3的酶活为372U/L。
实施例3重组葡萄糖苷酶Dth3水解芦丁
按照实施例1～2相同的策略制备表达重组糖苷酶Dth3的湿菌体，具体为：
将SEQ ID NO.2所示的Dth3基因与pRSFduet-1连接，构建重组质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得表达糖苷酶Dth3的重组大肠杆菌。按照实施例2的方法在TB培养基中培养重组大肠杆菌，收集湿菌体。
添加终浓度10g/L的芦丁及终浓度100g/L实施例2制备的湿菌体进行全细胞催化，于80℃条件下催化4-6h，然后将反应液于12000×g离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析(图1)，结果发现Dth3不能将芦丁转化成异槲皮素或槲皮素。
实施例4重组α-L-鼠李糖苷酶DthRha水解芦丁生成异槲皮素
按照实施例1～2相同的策略制备重组α-L-鼠李糖苷酶DthRha的湿菌体，具体为：
将SEQ ID NO.1所示的DthRha基因与pRSFduet-1连接，构建重组质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得表达α-L-鼠李糖苷酶的重组大肠杆菌。按照实施例2的方法在TB培养基中培养重组大肠杆菌，收集湿菌体。
向反应体系中添加终浓度10g/L的芦丁及100g/L实施例2制备的湿菌体进行全细胞催化，于80℃催化4-6h，反应结束后，加入适当的甲醇溶解产物异槲皮素，然后将反应液于12000×g离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析，结果见图2及表1，表达DthRha的重组大肠杆菌可以将芦丁转化成异槲皮素。
表1在含TB培养基的摇瓶中培养的表达DthRha的细胞全细胞催化反应4h的反应结果
*：底物以芦丁计：610.518；产物以槲皮素计：464.38。
实施例5重组葡萄糖苷酶Dth3和α-L-鼠李糖苷酶DthRha水解芦丁生成槲皮素
按照实施例2的方法制备重组葡萄糖苷酶Dth3和α-L-鼠李糖苷酶DthRha的湿菌体，以终浓度10g/L芦丁为底物，加入终浓度100g/L湿菌体进行全细胞催化，于80℃催化反应4-6h，反应结束后，加入适当的甲醇溶解产物槲皮素，然后将反应液于12000×g离心10min，经过0.22μm有机滤膜过滤，进行HPLC分析(见图3)，全细胞反应结束发现共表达DthRha和Dth3可以将芦丁转化成异槲皮素。在TB培养基中培养获得的细胞催化4h的转化率可以达到1.18(mol/mol)；优化培养基中培养的细胞催化4h的转化率可以达到1.17(mol/mol)，转化率基本相当。
表2在含TB培养基的摇瓶中培养的表达DthRha和Dth3的细胞全细胞反应4h的反应结果
*：底物以芦丁计：610.518；产物以槲皮素计：302.236。
表3在含优化培养基的摇瓶中培养的表达DthRha和Dth3的细胞全细胞反应4h的反应结果
*：底物以芦丁计：610.518；产物以槲皮素计：302.236。
实施例6重组菌株在5L发酵罐体系下生产槲皮素
根据实施例2～5的结果，虽然采用优化培养基表达的DthRha和Dth3的酶活没有采用TB培养的高，但是具有同样的全细胞催化能力。从成本的角度考虑，TB培养基的价格不适合扩大规模的工业化生产。为了进一步提高DthRha和Dth3的酶活及降低生产成本，选择采用优化培养基进行5L罐上的放大培养，希望获得较高菌体密度，同时细胞具有较高的酶活性。
发酵培养基成分为：6g/L KH2PO4、16.4g/L K2HPO43H2O、5g/L(NH4)2SO4、1g/L无水柠檬酸、1g/L MgSO47H2O、10g/L酵母粉、30g/L甘油、10g/L麦芽糖糊精、0.1g/L维生素B1和1mL/L微量元素。微量元素：Fe(III)citrate 100g/L,ZnCl3 18g/L,MnSO4·H2O 14.64g/L,CuSO4·5H2O 0.75g/L,Na2MoO4·2H2O 2g/L,CaCl2.2H2O 2g/L,H3BO3 3.0g/L,CoCl2.6H2O2.5g/L,NiSO4.6H2O 2.5g/L and HCl 100mL；补料成分包括3g/L MgSO4.7H2O、10g/L酵母粉和500g/L甘油。
将实施例1构建的重组菌株在LB培养基中，于37℃、220rpm培养10h左右(8～12h)，获得种子液，将发酵10h的种子液以按体积计4％的比例转接至发酵体系中，使接种后的OD达0.08，于37℃进行发酵，发酵12h后降温至30℃并开始补料，补料流速为20mL/h，发酵过程溶氧控制为40％，pH为7.0。
实验结果发现，采用高密度发酵37h时大肠杆菌OD600达到96，DthRha和Dth3的酶活得到较大的提高，DthRha酶活达104905.08U/L，Dth3的酶活12621.49U/L。离心收集细胞用于全细胞催化芦丁生产槲皮素，结果表明较高浓度的底物芦丁能够全部转化，槲皮素产量如表4。
综上，通过采用优化后的培养基表达重组酶DthRha和Dth3，可以在降低培养基成本(减少价格高昂的蛋白胨的使用，并减少酵母粉的用量)的同时，获得较高的菌体密度，以及较高DthRha和Dth3酶活。将终浓度为100g/L表达重组酶的细胞加入至反应体系中，在80℃反应，可在4-6h内将10～40g/L芦丁完全转化生成槲皮素，且不水解产生其他副产物。
表4 5L发酵罐采用优化培养基发酵表达DthRha和Dth3的细胞对芦丁转化成槲皮素的影响
*：底物以芦丁计：610.518；产物以槲皮素计：302.236。
发明人还尝试在发酵过程中不进行补料，结果显示，在不补料的情况下，细胞生长缓慢，无法达到全细胞催化所需的细胞量。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 大肠杆菌的高密度培养及在催化生产槲皮素中的应用
<130> BAA220034A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2766
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgaaatcca gcaacatcta cagcccgttc gatctgaaat gcgaattcac caccaacccg 60
ctgggtgtgg ataaaaagaa cccgatcttc tcttggaaac tgcgtcatct ggagaaaaac 120
gaaaaacaga ccgcatacca ggttatcgtt tctagctccc tggaaaccat caacgataac 180
atcggcgatg tttgggacac cggtaaagtg ctgagctccg aacaggtgat caaatatgaa 240
ggtaaagaac tggaaccgtg taaagtttat ttttggaaag tgcgttggtg ggactccaaa 300
gaccaggaaa gcccgttctc tgtggttaac acttttgaaa ccggcctgat gaacgaagaa 360
aattggaaag ctaaatggat taccaagaaa gaacacaaat acgaagtgta ctcgccggac 420
ggcgcaccgt tcggcctgaa ctacaccatc gcatacgctc cgatgttccg taaaagcttc 480
tccatcagca agaaaatcaa acgtgcacgt gtgtacattg caggcctggg cctgtatgaa 540
ctgtacatca acggcgaacg catcggcgat cgcgtactgg accctggcca gaccgattac 600
aaaaaacgtg tcttgtacac cgtgtacgac gtatctaaaa acatccgtga cggcaagaac 660
gctatcggcg tgattctggg taacggccgc tacgtaaaag agtacggcta cgacttcccg 720
aaactgatta tccaggttct ggttgaatac gaagatgact ccattgaatg gattgtgtct 780
gatgaatcct ggaaaaccac ctatggtcct attaccctga acagcctgta ccatggtgaa 840
atctacgatg gccgtaaaga aattaaaggc tggaatctgc cagacttcga tgactctacc 900
tgggaaaatg cgatccttgc ggagccgccg ggcggtaaac tgtattccga aatttatccg 960
ccgatccgta ttaccaaaac catcaaaccg atcaaaatgt ggtctccaga accgggcacc 1020
tacgtgtatg acttcggcca gaactatacc ggttggatta aaatcaaagt ccgtaccaac 1080
gaaagtggta aagaaattcg catccgccat gcagaattga cctacgaaga tggtaccctg 1140
aactactcca ccaaccgcac cgctctggcc actgacgttt acatcaccaa aggcgaaggc 1200
tatgaggaat atgaaccgcg tttcacctac cacggtttcc gctacgttga aatcctgggc 1260
tacccaggtg ttccgacact ggaagatatc gaaggcaaag ttgtgcacac ggcggtagaa 1320
tctaatggcg aatttatttg ctccaacgaa ctgatcaaca aaattcacca caacattatt 1380
tggggtcagc tgtctaacct gatgagcatc ccgaccgact gcccgcagcg tgatgaacgt 1440
atgggctgga tgggcgacgc acagctgagc gcggaagaag cgatcttcaa cttcgatatg 1500
attggttttt accgcaaata tctaaacgac atccgtgacg cgcagaaaga aaacggctcg 1560
ttatccgacg ttatcccgcc atattggagc atctatccgg gtgacccggc gtggtccacc 1620
gcgtacatca ctatcgcgtg gtatctgtac cagtattacg gcgacaaata tgtcctggaa 1680
gaacattatg aaggctttaa aaaatatgta gagtttctga aaaaactggc accggattat 1740
atcgtttcct tctataaata cggtgattgg tgccaaccgg gtaccgtgcg tccaaaagat 1800
aactctggtg aactgacctc gacgttttat ttctaccacg atgtaatcac cctgtctaag 1860
atcgcgaagc tgctgggcaa agaagcggat tacaagtact actctgaact ggccgataaa 1920
attaaatccg catttaacaa aaaattcctg aaagaaaaag cttacgcttc cattccgacc 1980
gaactgagtg aagaaaacgt taaagcgctg ctggaaaaat acccggaaga tattaaagat 2040
ttcctgcgtc agcagtttac catcctgtct agcctgggca tgttcacttc ccagacgctg 2100
aacaccctgc cgctgtacct gaatctggtg ccggaagata aagtccagga tgtactgaaa 2160
accctgctgg aggacattat catccgtcac gattaccacc tggacaccgg catcgtggcg 2220
acccgttaca tcttcgatgt tctgacctcc tacggctatg acgaagttgc gtacaaaatt 2280
gtgaaccaga aaacctaccc gtccttcggc tacatgatcg aagaaggcgc aaccaccctg 2340
tgggaacgct gggaaaaact gaccagcact ggtatgaata gccacaacca catcatgttc 2400
ggcagcgttg acgcatggtt ctaccgtgtg atcgctggcg tccgtgttgg cgaaccgggt 2460
tggaacaaaa tcattttcga accgcacccg gtgggtgatc tgaaatacgc gaaagcgcgc 2520
ctgaacacca ttaaaggcga agtggaaatc aactggcaga aaaccgaaaa catcttttct 2580
atgcgtatca gcgtgccggt taactctgaa ggcgaagttc atgttccgaa actgtttgaa 2640
cgtttcgtgg tgaaagaagg tgacaacatc atctacgaga aaaaaggtga cctggaagag 2700
aacgaaaaat acatcgtgat ccgtgtgggc agcggtagct acaacttcta catggaaaaa 2760
atctaa 2766
<210> 2
<211> 2349
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaaactgg aatacaaaat cccgtaccgt atcgaacgcg gcgaacagac caacttcagc 60
ccgctgttca tccgtatcat cagccagggc ggtaaacaga tggaaaaaga tatcaaaaaa 120
ctgatctcgc agatgactct ggaagaaaaa gcgagcctgt gctctggcct ggacttctgg 180
cacaccaaac caatcgaacg cctgggtatc ccgtccatcc gcatgtccga cggcccgcac 240
ggcctgcgta aagaagaaac catgttttcc aaaactgtgc cggcgacctg ctttccgacc 300
gcggtgacca tcgcagcgtc ctgggacaaa ctgctggcgg aaaaaatggg caaagccatc 360
ggcgaagaat gtcaggcgga aaacgttcag attctgctgg gtccgggcat caacatgaaa 420
cgctccccgc tgtgcggccg caacttcgaa tactacagcg aggacccgat cctggctggg 480
gaactggcgg cccacttcat taaaggtgtt cagagccagg gcgtaggcac ctctctgaaa 540
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ctgctgacta aagttctgcg tgaagaatgg ggcttcgagg gtttcgttgt gagcgactgg 780
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aactcttaa 2349

Claims (10)

1.一种能够利用芦丁生产槲皮素的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌表达嗜热链球菌来源的L-鼠李糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶；所述L-鼠李糖苷酶DthRha具有如Genbank登录号WP_012548615.1所示的氨基酸序列；所述β-葡萄糖苷酶Dth3具有如Genbank登录号ACI19278.1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，编码所述DthRha的基因序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述Dth3的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以pET系列载体表达所述L-鼠李糖苷酶和耐热β-葡萄糖苷酶。
4.根据权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以E.coli BL21(DE3)为宿主。
5.含权利要求1～4任一所述重组大肠杆菌的细胞催化剂，其特征在于，所述细胞催化剂包括但不限于所述重组大肠杆菌的细胞、细胞培养液或固定化细胞。
6.权利要求1～4任一所述重组大肠杆菌的高密度发酵方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌接种至发酵培养基中，于35～37℃发酵，发酵过程溶氧控制为40％，pH为7.0；并于发酵12h后降温至30℃开始补料，补料流速为20mL/h；
所述发酵培养基包括但不限于TB培养基或高密度发酵培养基；所述高密度发酵培养基含有KH2PO4 6g/L、K2HPO4·3H2O 16.4g/L、(NH4)2SO4 5g/L、无水柠檬酸1g/L、MgSO4·7H2O1g/L、酵母粉10g/L、甘油10-30g/L、麦芽糖糊精10g/L、维生素B1 0.1g/L和微量元素溶液1mL/L；所述微量元素溶液含有：柠檬酸铁100g/L,ZnCl3 18g/L,MnSO4·H2O 14.64g/L,CuSO4·5H2O 0.75g/L,Na2MoO4·2H2O 2g/L,CaCl2.2H2O 2g/L,H3BO3 3.0g/L,CoCl2·6H2O2.5g/L,NiSO4·6H2O 2.5g/L和HCl 100mL。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，补料的成分包括：3g/L MgSO4·7H2O、10g/L酵母粉和500g/L甘油。
8.一种生产槲皮素的方法，其特征在于，以芦丁为底物，以权利要求1～4任一所述的重组大肠杆菌为细胞催化剂生产槲皮素。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌细胞加入至含终浓度10～40g/L芦丁的反应体系中，于75～85℃反应至少4h。
10.权利要求1～4所述重组大肠杆菌，或权利要求5所述的细胞催化剂，或权利要求6～9任一所述方法在生产含槲皮素的食品、药品或保健品中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113350413A (zh) * 2021-06-30 2021-09-07 南京林业大学 一种用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法及应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113350413A (zh) * 2021-06-30 2021-09-07 南京林业大学 一种用于改善肠炎的杨树转化产物的制备方法及应用

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