KR20220125300A

KR20220125300A - 오르리스타트 중간체 제조를 위한 생물학적 효소의 용도 및 제조 방법

Info

Publication number: KR20220125300A
Application number: KR1020227027087A
Authority: KR
Inventors: 티앤슈애이 쉬; 다용 공; 유메이 샤오; 장홍 왕; 지추안 후앙; 샨 후앙; 레이 장; 신 가오; 준웨이 쉔
Original assignee: 제인 바이오테크놀로지 씨오., 엘티디.
Priority date: 2020-01-07
Filing date: 2021-01-06
Publication date: 2022-09-14
Also published as: EP4086343A1; JP2023511025A; BR112022013466A2; CN111154736A; WO2021139689A1; US20240158819A1; CN111154736B

Abstract

(R)-β-하이드록시테트라데카노에이트 화합물의 생합성 방법이 제공된다. 상기 방법은 β-카보닐테트라데카노에이트를 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소 또는 이의 융합 효소, 글루코스, NADP+ 및 완충액에서 반응시켜 (R)-β-하이드록시테트라데카노에이트 화합물을 수득하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 효소 촉매 생합성 방법으로 간단한 조작, 기존 장비, 및 환경 친화적 공정을 갖고 있으며 제조된 제품은 순도가 높고 수율이 높으며 ee 값이 높다.

Description

오르리스타트 중간체 제조를 위한 생물학적 효소의 용도 및 제조 방법

본 발명은 바이오의약품 및 바이오화학 산업의 기술 분야, 특히 (R)-β-하이드록시테트라데카노에이트 화합물의 생합성 방법에 관한 것이다.

비만 치료제는 크게 두 가지 카테고리, 즉, 중추 신경계 작용성 체중 감량 약물과 비중추 신경계 작용성 체중 감량 약물로 분류된다. 중추 신경계 작용성 체중 감량 약물의 체중 감량 효과는 명백하지만 부작용이 상대적으로 크고 임상 적용이 크게 제한된다. 이들 중, 펜플루라민은 폐고혈압과 비대성 심장판막 질환을 야기할 수 있기 때문에 1997년 시장에서 철수했다. 시부트라민은 심각한 심혈관 위험을 증가시킬 가능성이 있기 때문에 중국 식품의약청에서 2010년에 생산, 판매 및 사용을 중단했다. 로카세린(상품명 Belviq)은 2012년 6월에 FDA 승인을 받았지만, 여전히 심장판막 질환과 심혈관 이상반응 증가 위험이 있어 임상 적용의 안전성을 추가로 검증할 필요가 있다.

오르리스타트는 최초의 비중추 신경 작용성 체중 감량 약물이며, 현재 세계에서 유일한 OTC 체중 감량 약물이다. 1998년 출시된 이후 확실한 효능과 높은 안전성으로 인해 체중 감량 치료를 위해 선택되는 약물이 되고 있다. 오르리스타트는 위장관의 리파아제에 직접 작용하며 지방 흡수 억제에 상당한 효과가 있다. 그 표적은 매우 특이적이고 다른 위장 효소에 영향을 미치지 않으며 약물 효과를 발휘하기 위해 전신 흡수가 필요하지 않다. 생체 내 이의 전신 약물 노출이 매우 낮고 주요 부작용은 위장 반응이며 안전성이 탁월하다. 오르리스타트는 20년 초과 동안 전 세계적으로 판매되어 왔으며 145개 초과의 국가에서 마케팅 승인을 받았다. 그 탁월한 효능과 안전성은 다수의 임상 적용에 의해 검증되었다.

오르리스타트의 시장 수요는 많고, 오르리스타트 및 이의 중간체의 효율적인 합성 방법을 찾는 것이 매우 중요하다. (R)-β-하이드록시테트라데카노에이트는 약물 오르리스타트의 합성에서 중요한 중간체이며, 이 중간체의 광학적 순도는 매우 중요하다. 광학적으로 순수한 (R)-β-하이드록시테트라데카노에이트를 효율적으로 얻을 수 있는 방법은?

예를 들어, 중국 특허 CN101538285B는 비대칭 수소화를 촉매하기 위해 제조된 (R)-금속 촉매 [(R)-Ru(MeOBIPHEP)Cl2]2ㆍEt3을 보고했지만 이 화학 촉매 반응은 강산 및 60 bar 고압 조건 하에 수행해야만 ee 값 > 98.5%의 생성물을 수득할 수 있다. 그러한 방법의 단점은 다음과 같다: 1) 고가의 (R)-리간드 및 귀금속 촉매가 필요하고; 2) 즉각적인 사용을 위해 촉매를 제조해야 하고 공정 안정성을 보장하기 어렵고; 3) 고압 수소화 장치가 필요하고; 4) 내산성 장비가 필요하고; 5) 불량한 반응 제어는 ee 값에 영향을 미칠 것이다.

요약

상기 언급된 종래 기술의 단점을 고려할 때, 본 발명의 발명자들은 오르리스타트의 핵심 중간체의 대규모 생산을 달성하기 위해 생물학적 효소 방법을 사용하여 체계적인 개선을 수행하였다.

이러한 관점을 고려하여, 본 발명의 제1 목적은 오르리스타트 중간체의 제조에서 생물학적 효소의 새로운 용도를 제공하는 것이다. 생물학적 효소는 기질 β-카보닐테트라데카노에이트에 효과적으로 작용하여 고순도의 오르리스타트 중간체를 제조할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 기술적 해결책은:

오르리스타트 중간체(최종 생성물)의 제조에서 생물학적 효소의 사용이며, 여기서, 생물학적 효소에 대한 기질은 β-카보닐테트라데카노에이트(원료)이고, 구조식은 I로 나타낸 바와 같고; 오르리스타트 중간체는 (R)-β-하이드록시테트라데카노에이트이고, 구조식은 II로 나타낸 바와 같고; 구조식 I에서 R은 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 포화 알킬 기를 지칭하고, 구조식 II에서 R은 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 포화 알킬 기를 지칭한다:

[화학식 I]

[화학식 II]

생물학적 효소는 케토환원효소이고, 생물학적 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 나타낸 바와 같고 아미노산 서열과 90% 초과의 상동성을 갖고 싱굴리스파에라 애시디필라(Singulisphaera acidiphila)로부터 유도되고 NCBI 데이터베이스에서 WP_015245403.1로 코딩되고 단쇄 탈수소효소 계열에 속하고/하거나; 서열 번호 2로 나타낸 바와 같고 아미노산 서열과 90% 초과의 상동성을 갖고 스핑고모나스 에키노이데스(Sphingomonas echinoides)로부터 유도되고 NCBI 데이터베이스에서 WP_010403640.1로 코딩되고 단쇄 탈수소효소 계열에 속하고/하거나; 서열 번호 4로 나타낸 바와 같고 아미노산 서열과 80% 초과의 상동성을 갖고 로도토룰라 토룰로이데스(Rhodotorula toruloides)로부터 유도되고 NCBI 데이터베이스에서 EGU12837.1로 코딩된 단백질의 절단된 단백질이고 단쇄 탈수소효소 계열에 속한다. 또는 생물학적 효소는 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소이고, 융합 효소의 아미노산 서열은 서열번호 8로 나타낸 바와 같고/같거나 서열번호 9로 나타낸 바와 같다. 본 발명의 발명자들은 놀랍게도 천연 또는 유전적/단백질-조작된 생물학적 효소가 기질에 대한 우수한 촉매 효과를 가지며, 광학적 순도가 높은 최종 생성물이 얻어진다는 것을 발견하였다.

또한, 서열 번호 1 및/또는 서열 번호 2와 90% 이상의 동일성/상동성, 서열 번호 4 및 서열 번호 8 및/또는 서열 번호 9와 80% 이상의 동일성/상동성을 갖는 생물학적 효소를 사용하여 오르리스타트 중간체를 제조할 수도 있다.

또한, 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소에서, 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소는 링커에 의해 연결되고;

또한, 링커의 아미노산 서열은 서열 번호 5로 나타낸 바와 같다.

또한, 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소는 케토환원효소-링커-글루코스 탈수소효소 또는 글루코스 탈수소효소-링커-케토환원효소이고; 임의로, 글루코스 탈수소효소의 아미노산 서열은 서열 번호 3으로 나타낸 바와 같다.

또한, 상기 언급된 생물학적 효소 중 어느 하나는 효소 분말 및/또는 효소 용액 및/또는 고정화 효소이다.

또한, 구조식 I에서 R은 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필 중 어느 하나이고, 구조식 II에서 R은 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필 중 어느 하나이다.

본 발명의 제2 목적은 융합 효소를 제공하는 것이고, 융합 효소는 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소이고, 융합 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 8 및/또는 서열 번호 9로 나타낸 바와 같다.

또한, 융합 효소에서 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소는 링커에 의해 연결되고; 임의로, 링커의 아미노산 서열은 서열 번호 5로 나타낸 바와 같다.

또한, 융합 효소는 케토환원효소-링커-글루코스 탈수소효소 또는 글루코스 탈수소효소-링커-케토환원효소이고;

임의로, 케토환원효소의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 2로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 4로 나타낸 바와 같고, 아미노산 서열과 80%과 동일성/상동성을 갖고;

임의로, 글루코스 탈수소효소의 아미노산 서열은 서열 번호 3으로 나타낸 바와 같다.

본 발명의 제3 목적은 상기 언급된 임의의 융합 효소의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 방법 및 이의 작제 방법을 제공하는 것이다.

융합 효소의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 6 또는 서열 번호 7로 나타낸 바와 같다.

또한, 뉴클레오티드 서열의 작제 방법은 서열 번호 3에 나타낸 글루코스 탈수소효소의 유전자 단편의 3' 말단에 서열 번호 5에 나타낸 링커 서열을 삽입하는 단계에 이어서, 서열 번호 4에 나타낸 케토환원효소의 유전자 단편을 연결하여 서열 번호 6에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 플라스미드를 형성하는 단계를 포함한다.

또한, 융합 효소 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열은 양 말단에서 제한 효소 부위 NdeI 및 XhoI를 통해 캐리어 pET28a와 연결되어 이중 효소 융합 발현 플라스미드 pET28a-G3790을 형성하고, 이는 이어서 스크리닝, 접종 및 배양을 위해 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)로 옮겨 세균 세포를 얻고; 세균 세포를 파쇄하고 원심분리하여 조 효소 용액을 얻고, 조 효소 용액을 동결건조시켜 효소 분말을 얻는다.

또한, 뉴클레오티드 서열의 작제 방법은 서열번호 4에 나타낸 케토환원효소의 유전자 단편의 3' 말단에 서열 번호 5로 나타낸 링커 서열을 삽입하는 단계에 이어서, 서열 번호 3에 나타낸 글루코스 탈수소효소의 유전자 단편을 연결하여 서열 번호 7에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 형성하는 단계를 포함한다.

또한, 융합 효소 서열 번호 7의 뉴클레오티드 서열은 양 말단에서 제한 부위 NdeI 및 XhoI를 통해 캐리어 pET28a와 연결되어 이중효소 융합 발현 플라스미드 pET28a-G3790을 형성하고, 이는 이어서 스크리닝, 접종 및 배양을 위해 에스케리키아 콜리로 옮겨 세균 세포를 얻고; 세균 세포를 파쇄하고 원심분리하여 조 효소 용액을 수득하고, 조 효소 용액을 동결건조시켜 효소 분말을 수득한다.

본 발명의 제4 목적은 두 가지가 효소와 기질 사이에 상승적 관계를 형성할 수 있고, 구조식 II로 나타낸 생성물을 수득할 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 기술적 해결책은 다음과 같다:

상기 기재된 임의의 생물학적 효소 및 기질을 포함하는 조성물로서, 기질은 β-카르보닐테트라데카노에이트이다. β-카보닐테트라데카노에이트의 구조식은 화학식 I로 나타낸 바와 같고; 생물학적 효소는 케토환원효소 또는 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소이고, 케토환원효소의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 2로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 4로 나타낸 바와 같고, 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성/상동성을 가지고; 융합 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 8에 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 9에 나타낸 바와 같다.

화학식 I

구조식 I에서 R은 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 포화 알킬 기를 지칭한다.

또한, 융합 효소는 케토환원효소-링커-글루코스 탈수소효소 또는 글루코스 탈수소효소-링커-케토환원효소이다.

또한, 글루코스 탈수소효소의 아미노산 서열은 서열 번호 3으로 나타낸 바와 같다.

또한, 생물학적 효소는 효소 분말 및/또는 효소 용액 및/또는 고정화 효소이다.

또한, 조성물에서, 생물학적 효소 대 기질의 중량비는 1:1.1 내지 150이다.

바람직하게는, 조성물에서, 생물학적 효소 대 기질의 중량비는 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:110, 1:120, 1:130, 1:140 및/또는 1:150이다.

본 발명의 제5 목적은 (R)-β-하이드록시테트라데카노에이트를 제조하기 위한 반응 시스템을 제공하는 것이다. (R)-β-하이드록시테트라데카노에이트는 고온 및 고압의 가혹한 조건에 의존하지 않고 이 반응 시스템을 통해 얻을 수 있다.

상기 반응 시스템은 I에 나타낸 기질, 생물학적 효소, 글루코스, 글루코스 탈수소효소, NADP⁺ 및 완충 용액으로 구성되고; 본원에 기재된 상기 생물학적 효소는 케토환원효소이고, 상기 케토환원효소의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 2로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 4로 나타낸 바와 같고, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성/상동성을 갖거나; 상기 반응 시스템은 I에 나타낸 기질, 생물학적 효소, 글루코스, NADP⁺ 및 완충 용액으로 구성되고; 여기서, 상기 생물학적 효소는 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소이고, 상기 케토환원효소의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 2로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 4로 나타낸 바와 같고, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성/상동성을 가지고; 상기 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 8로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 9로 나타낸 바와 같다:

화학식 I

또한, 글루코스 탈수소효소의 아미노산 서열은 서열 번호 3으로 나타낸 바와 같다. 또한, 융합 효소에서 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소는 링커에 의해 연결되고; 임의로, 링커의 아미노산 서열은 서열 번호 5로 나타낸 바와 같다.

또한, 반응 시스템의 pH 값은 6.0 내지 8.0이다.

또한, 반응 시스템에서 완충 용액은 PBS 완충액 또는 Tris-HCl 완충액이다.

또한, 반응 시스템에서 기질의 농도는 20 g/L 내지 150 g/L이다.

또한, 반응 시스템에서, NADP⁺의 농도는 0.1 내지 0.5 g/L이다.

또한, 반응 시스템에서, 구조식 I로 표시된 화합물 대 글루코스의 몰비는 1:(1.2 내지 4)이다.

또한, 반응 시스템에서, 완충 용액의 농도는 0.01 내지 0.5 mol/L이다.

또한, 반응 시스템의 반응 시간은 반응 용액을 수득하기 위해 15시간 이하이다.

본 발명의 제6 목적은 산업화된 대규모 생산에 적합한 오르리스타트 중간체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

(R)-β-하이드록시테트라데카노에이트의 생합성 방법, 반응식은 다음과 같다:

화합물 I 및 화합물 II에서 R은 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 포화 알킬 기, 바람직하게는, 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필을 지칭하고;

상기 생합성 방법은 케토환원효소, 글루코스, 글루코스 탈수소효소 및 NADP⁺에서, 또는 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소, 글루코스 및 NADP⁺의 융합 효소에서 화합물 I을 반응시켜 화합물 II를 수득하는 단계를 포함한다.

본 발명의 구현예에서, 생합성 방법은 하기 단계를 포함한다: 화합물 I을 취하여 이를 완충 용액에 넣은 다음, 케토환원효소 또는 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소, 글루코스, 글루코스 탈수소효소의 융합 효소(케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소가 첨가되면 글루코스 탈수소효소는 첨가할 필요가 없음) 및 NADP⁺를 첨가형 혼합 용액을 수득하는 단계, 상기 혼합 용액을 20 내지 40℃에서 교반 및 반응시키며 이 과정 동안 NaOH 수용액에 의해 pH가 조정되는 단계, 전환율이 99% 초과인 경우 반응이 완료될 때까지 액체 크로마토그래피에 의해 반응의 전환율을 모니터링한 다음, 추출용 추출용매를 가하는 단계, 유기 상을 합하여 감압 하에 농축하는 단계, 결정화를 위해 냉각시키는 단계, 생성물을 분리하여 백색 고체, 즉 화합물 II를 수득하는 단계, 임의로, n-헥산으로 추가 재결정화하여 더 높은 순도를 가진 생성물을 수득하는 단계.

본 발명의 일부 구현예에서, NaOH 수용액의 농도는 2 M일 수 있다.

본 발명의 일부 구현예에서, 완충 용액은 6.0 내지 8.0의 pH 값을 가지며; 바람직하게는, 완충 용액은 PBS(즉, 포스페이트) 완충액 또는 Tris-HCl 완충액이고; 보다 바람직하게는, 완충 용액의 농도 0.01 내지 0.5 mol/L PBS 포스페이트 완충액 또는 0.01 내지 0.5 mol/L Tris-HCl 완충액이다.

본 발명의 구현예에서, pH 범위는 반응 과정 동안 7.0 내지 7.5로 조절된다.

본 발명의 구현예에서, 케토환원효소의 아미노산 서열은 본 출원의 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 4로 나타낸 바와 같고; 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 8로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 9로 나타낸 바와 같고; 케토환원효소 또는 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소의 형태는 효소 분말, 효소 용액, 또는 고정화 효소일 수 있고; 글루코스 탈수소효소의 아미노산 서열은 본 출원의 서열 번호 3으로 나타낸 바와 같고, 글루코스 탈수소효소의 형태는 효소 분말, 효소 용액, 또는 고정화 효소일 수 있다.

본 발명의 구현예에서, NADP⁺는 니코틴아미드 아데닌디뉴클레오티드 포스페이트, 즉, 환원된 코엔자임 II(NADPH)의 산화된 형태를 지칭하고; 혼합 용액에서 NADP⁺의 농도는 0.1 내지 0.5 g/L이다.

본 발명의 구현예에서, 혼합 용액에서 화합물 I의 농도는 20 g/L 내지 150 g/L이다.

본 발명의 구현예에서, 혼합 용액에서 화합물 I 대 글루코스의 몰비는 1:(1.2 내지 4)이다.

본 발명의 일부 구현예에서, 바람직하게는, 반응 온도는 35℃에서 유지된다.

본 발명의 일부 구현예에서, 추출 용매는 추출에 2회 사용된다; 추출 용매는 무수 에탄올 또는 에틸 아세테이트이다.

상기 내용에 대한 기술적 해결책은 구체적으로 다음과 같이 요약된다:

반응 시스템에 기반하여 오르리스타트 중간체를 제조하는 방법으로, 여기서, 반응 시스템은 교반하면서 20 내지 40℃에서 반응시켜 오르리스타트 중간체의 반응 용액을 수득한다. 오르리스타트 중간체의 중간체는 (R)-β-하이드록시테트라데카노에이트이고, 구조식은 II로 나타낸 바와 같다.

또한, 상기 방법에서, NaOH 수용액은 pH 조절제로서 사용된다.

또한, 상기 방법에서, 반응 시간은 15시간을 초과하지 않는다.

또한, 상기 방법에서, 오르리스타트 중간체는 수득된 반응 용액으로부터 용매로 추출된다.

또한, 상기 방법에서, 용매는 무수 에탄올 또는 에틸 아세테이트이다.

또한, 상기 방법에서, 수득된 추출물을 감압 하에 농축하고, 결정화를 위해 냉각시켜 백색 결정질 고체인 화합물 II를 수득한다.

오르리스타트 중간체로부터 제조된 오르리스타트

본 발명의 유익한 효과는 다음과 같다:

본 발명에서 사용된 생물학적 효소는 150 g/L 이하의 기질 농도를 견딜 수 있고, 효소 활성은 기질 또는 생성물에 의해 저해되지 않는다.

본 발명의 오르리스타트 중간체의 제조방법은 생물학적 효소 방법이며, 상기 방법은 온화한 조건, 간단한 장비 요구 사항 및 간단한 조작을 가지고, 상기 방법은 폐수, 폐잔류물 및 폐가스가 적게 발생하고 중금속 오염이 없고 환경 친화적이며 산업 생산에 도움이 된다.

본 발명에서 효소 촉매 과정의 전환율은 99% 이상으로 높고, 키랄 ee 값은 99% 초과에 도달할 수 있다. 15시간 이내에 반응을 완료할 수 있고, 생성물 농도가 높으며, 기질이 거의 완전히 전환되어 반응 용액의 후처리 단계를 단순화할 수 있다. 간단한 추출 및 결정화 단계를 거쳐야만 고순도의 생성물을 수득할 수 있어서 생산 원가를 크게 절감할 수 있다.

도 1은 실시예 5에서 측정된 전환율의 HPLC 크로마토그램이다.
도 2는 실시예 5의 생성물 순도의 HPLC 스펙트럼이다.
도 3은 실시예 5에서 생성물 키랄 순도의 HPLC 크로마토그램이다.
도 4는 융합 효소 G3790 발현 플라스미드의 플라스미드 맵이다.
도 5는 융합 효소 3790G 발현 플라스미드의 플라스미드 맵이다.
도 6은 G3790 융합 효소 단백질 밴드이다.
도 7은 3790G 융합 효소 단백질 밴드이다.

구현예는 본 발명을 보다 잘 설명하기 위해 제공되는 것이지만, 본 발명의 내용은 주어진 구현예로 제한되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 상기 언급된 내용에 따라 당업자에 의해 행해진 구현예에 대한 비필수적 개선 및 조정은 여전히 본 발명의 보호 범위에 속한다.

본 발명은 생물학적 효소의 촉매작용 하에 β-카보닐테트라데카노에이트를 (R)-β-하이드록시테트라데카노에이트로 환원시키는 것에 관한 것이다. 반응식은 다음과 같다.

기질로서 β-카보닐테트라데카노에이트는 NADP⁺ 조효소, 글루코스 및 글루코스 탈수소효소를 함유하는 환경에서 특정 효소에 의해 촉매화되어 극히 높은 키랄 순도를 갖는 (R)-β-하이드록시테트라데카노에이트를 수득하고; 여기서, 촉매 효소는 일반적으로 본 발명의 구현예에서 상이한 유형의 케토환원효소와 같은 단쇄 탈수소효소 계열에 속하고; 이는 또한 본 발명의 일부 구현예에서 환원효소 및 글루코스 탈수소효소의 융합 효소와 같은 상이한 효소의 융합 효소일 수 있고; 여기서, 글루코스는 글루코스 탈수소효소의 작용 하에 탈수소되어 H⁺를 얻고, 이어서 NADP⁺ 조효소는 H⁺를 운반하고 β-카보닐테트라데카노에이트의 환원 반응에 참여하여 β-하이드록시테트라데카노에이트를 수득한다.

본 발명의 케토환원효소 JR3789는 싱굴리스파에라 애시디필라로부터 유래되고 단쇄 탈수소효소 계열에 속하는 NCBI 데이터베이스에서 WP_015245403.1로 코딩된다. 케토환원효소의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 나타낸 바와 같고, 크기는 249개 아미노산이다.

아미노산 서열, 서열 번호 1:

"MGKLDNKVAVITGGNSGMGLATAQRFVSEGAYVFITGRRQAELDKAVDLIGKNVTGVQGDVSNLADLDRLYATVKEQKGRVDVLFANAGVGELAPLGSITEEQFDKVFNINVRGLLFTVQKALPLFQDGGSIILNASIASIKGMPAFSVYSASKAAVRSFARSWTVDLKGRKIRINTLSPGPIDTPILSGLASTEEELKQVKADLAAQVPLGRMGTSDEIANVALFLASDDSSYVTGIELFVDGGMAQI".

본 발명의 케토환원효소 JR37150은 스핑고모나스 에키노이데스로부터 유래되고 단쇄 탈수소효소 계열에 속하는 NCBI 데이터베이스에서 WP_010403640.1로 코딩된다. 케토환원효소의 아미노산 서열은 서열번호 2로 나타낸 바와 같고, 크기는 259개 아미노산이다.

아미노산 서열, 서열 번호 2:

"MARLAGKVALVTGGASVPGLGSATAIRFAQEGATVYLTDRDLAGAQAVAAQITAAGGRATALEHDVTSEADWDRVLAAIDAAEGRLDILVNNAGIAVLGPLEDVTAADFLRQNDVNLNSVFHGSKRALVMMRRPGDGGTARGGSIINISSVAGLIGVPGCGSYAASKGGVRLFSKVVALEGAADGVRCNSVHPGMIATNIQGVALEDNAANFDAVMALIPMVRMGEPEDIANMNLFLASDESRYITGAEFVVDGGMTAR".

본 발명의 글루코스 탈수소효소 GDH는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) QB928로부터 유래되고 단쇄 탈수소효소 계열에 속하는 NCBI 데이터베이스에서 코딩된 AFQ56330.1이다. 탈수소효소의 아미노산 서열은 서열 번호 3으로 나타낸 바와 같고, 크기는 263개 아미노산이다.

아미노산 서열, 서열 번호 3:

"MYMYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAVVVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHEVIPWPLFVHYAASKGGIKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTQYPSFQAGRG".

본 발명의 케토환원효소 JR3790은 로도토룰라 토룰로이데스로부터 유래되고

단쇄 탈수소효소 계열에 속하는 NCBI 데이터베이스에서 EGU12837.1로 코딩된 단백질의 절단된 단백질(위치 70-317)이다. 케토환원효소의 아미노산 서열은 서열 번호 4로 나타낸 바와 같고, 크기는 248개 아미노산이다.

아미노산 서열, 서열 번호 4:

"MSSPAPTVYVISGASRGIGFAITSILAQHDNVLIFAGARDLKSAQLNELAQKSSGKVIPVKLESTSVEDAAALAKVVEEKAGKVDYVLAVAGISQSTDPIAQVSLDDVRRHFEVNTIGPLVLFQALLPLTTKSTAPHFIVVSTIAGSIASMPQVTFPVSAYAISKTAVNSAVGRIAIEHPDLDAFVCHPGFVSSDMVKQFAEKTGAPLSDFESFGMITPEESAASLVKLFDEAKKETHSGKFFNVDGT".

링커 서열, 서열 번호 5:

"EFEEEEKKKQQEEEAERLRRIQEEMEKERKRREEDEERRRKEEEERRMKLEMEAKRKQEEEERKKREDDEKRKKKKL".

HPLC 검출 조건: OD-H 크로마토그래피 컬럼; 이동상은 n-헥산: 이소프로판올 = 98:2; 유속 1.0 mL/분. 검출 기기의 사양은 DAD1C, Sig = 210, 4 Ref = 360,100이다.

생물학적 효소(서열 번호 1, 서열 번호 2) 및 글루코스 탈수소효소(서열 번호 3)는 Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd.에 의해 합성되고 상업화된다.

실시예 1

1 g의 메틸 β-카보닐테트라데카노에이트 및 1.5 g의 글루코스를 칭량하고 100 mL 3구 플라스크에 넣은 다음, 50 mM의 농도 및 7.0의 pH 값을 갖는 50 mL의 PBS 완충액을 첨가하였다. 3구 플라스크를 교반 속도를 800 rpm으로 조정하고 온도를 35℃로 조정한 항온 수조에 넣은 다음, 10 mg NADP⁺, 25 mg 글루코스 탈수소효소 GDH 효소 분말(서열 번호 3으로 나타냄), 및 100 mg 케토환원효소 JR3789 효소 분말(서열 번호 1로 나타냄)를 각각 첨가하여 혼합 반응 용액을 수득하였다. 2 M NaOH 용액을 사용하여 pH를 조정하고 7.0 내지 7.5로 유지하고, 온도를 35℃로 유지하고, 반응 진행을 HPLC로 모니터링하였다. 반응은 9시간 내에 완료되었으며 전환율은 >99%로 측정되었다.

반응이 완료된 후, 수득된 용액을 60℃의 온도까지 가열하여 15분 동안 유지한 다음, 20 내지 25℃로 냉각시키고, 20분 동안 교반하면서 추출을 위해 80 mL의 에틸 아세테이트를 가하고 여과하였다. 여액이 층을 이룬 후 유기상을 취하였다. 수성상을 50 mL의 에틸 아세테이트로 1회 더 추출하고, 층을 분리하고, 유기상을 취하였다. 유기상을 합하고, 감압 하에 농축한 다음, 천천히 냉각시켜 생성물을 분리하였다. 순도가 98.10%이고 광학적 순도가 98.45%인 조 생성물(crude product)을 수득하였다. 조 생성물에 2배 부피의 n-헥산을 첨가하고, 가열하고, 용해시키고, 결정화를 위해 냉각시켰다. 결정을 수집하고 실온에서 공기 건조시켜, 측정된 순도가 99.99%이고 ee 값이 99.91%이고 총수율이 89%인 0.89 g의 백색 결정질 생성물을 수득하였다.

실시예 2

1 g의 에틸 β-카보닐테트라데카노에이트 및 1.5 g의 글루코스를 칭량하고 100 mL 3구 플라스크에 넣은 다음, 50 mM의 농도 및 7.0의 pH 값을 갖는 50 mL의 PBS 완충액을 첨가하였다. 3구 플라스크를 교반 속도를 900 rpm으로 조정하고 온도를 35℃로 조정한 항온 수조에 넣은 다음, 10 mg NADP⁺, 35 mg 글루코스 탈수소효소 GDH 효소 분말(서열 번호 3으로 나타냄), 및 150 mg 케토환원효소 JR3789 효소 분말(서열 번호 1로 나타냄)를 각각 첨가하여 혼합 반응 용액을 수득하였다. 2 M NaOH 용액을 사용하여 pH를 조정하고 7.0 내지 7.5로 유지하고, 온도를 35℃로 유지하고, 반응 진행을 HPLC로 모니터링하였다. 반응은 10시간 내에 완료되었으며 전환율은 >99%로 측정되었다.

반응이 완료된 후, 수득된 용액을 60℃의 온도까지 가열하여 15분 동안 유지한 다음, 20 내지 25℃로 냉각시키고, 20분 동안 교반하면서 추출을 위해 80 mL의 에틸 아세테이트를 가하고 여과하였다. 여액이 층을 이룬 후 유기상을 취하였다. 수성상을 50 mL의 에틸 아세테이트로 1회 더 추출하고, 층을 분리하고, 유기상을 취하였다. 유기상을 합하고, 감압 하에 농축한 다음, 천천히 냉각시켜 생성물을 분리하였다. 순도가 98.42%이고 ee 값이 98.15%이고 총수율이 84%인 0.84 g의 백색 분말을 수득하였다.

실시예 3

5 g의 메틸 β-카보닐테트라데카노에이트 및 7.5 g의 글루코스를 칭량하고 100 mL 3구 플라스크에 넣은 다음, 50 mM의 농도 및 7.0의 pH 값을 갖는 50 mL의 PBS 완충액을 첨가하였다. 3구 플라스크를 교반 속도를 800 rpm으로 조정하고 온도를 35℃로 조정한 항온 수조에 넣은 다음, 50 mg NADP⁺, 125 mg 글루코스 탈수소효소 GDH 효소 분말(서열 번호 3으로 나타냄), 및 500 mg 케토환원효소 JR3789 효소 분말(서열 번호 1로 나타냄)를 각각 첨가하여 혼합 반응 용액을 수득하였다. 2 M NaOH 용액을 사용하여 pH를 조정하고 7.0 내지 7.5로 유지하고, 온도를 35℃로 유지하였다. 반응 진행을 HPLC로 모니터링하였다. 반응은 13시간 내에 완료되었으며 전환율은 >99%로 측정되었다.

반응이 완료된 후, 수득된 용액을 60℃의 온도까지 가열하여 15분 동안 유지한 다음, 20 내지 25℃로 냉각시키고, 20분 동안 교반하면서 추출을 위해 80 mL의 에틸 아세테이트를 가하고 여과하였다. 여액이 층을 이룬 후 유기상을 취하였다. 수성상을 50 mL의 에틸 아세테이트로 1회 더 추출하고, 층을 분리하고, 유기상을 취하였다. 유기상을 합하고, 감압 하에 농축한 다음, 천천히 냉각시켜 생성물을 분리하였다. 순도가 98.12%이고 ee 값이 98.45%이고 총수율이 93%인 4.65 g의 백색 분말을 수득하였다.

실시예 4

5 g의 메틸 β-카보닐테트라데카노에이트 및 7.5 g의 글루코스를 칭량하고 100 mL 3구 플라스크에 넣은 다음, 50 mM의 농도 및 7.0의 pH 값을 갖는 50 mL의 PBS 완충액을 첨가하였다. 3구 플라스크를 교반 속도를 800 rpm으로 조정하고 온도를 35℃로 조정한 항온 수조에 넣은 다음, 50 mg NADP⁺, 300 mg 글루코스 탈수소효소 GDH 효소 분말(서열 번호 3으로 나타냄), 및 800 mg 케토환원효소 JR37150 효소 분말(서열 번호 2로 나타냄)를 각각 첨가하여 혼합 반응 용액을 수득하였다. 2 M NaOH 용액을 사용하여 pH를 조정하고 7.0 내지 7.5로 유지하고, 온도를 35℃로 유지하였다. 반응 진행을 HPLC로 모니터링하였다. 반응은 35시간 내에 완료되었으며 전환율은 >99%로 측정되었다.

반응이 완료된 후, 수득된 용액을 60℃의 온도까지 가열하여 15분 동안 유지한 다음, 20 내지 25℃로 냉각시키고, 20분 동안 교반하면서 추출을 위해 100 mL의 에틸 아세테이트를 가하고 여과하였다. 여액이 층을 이룬 후 유기상을 취하였다. 수성상을 60 mL의 에틸 아세테이트로 1회 더 추출하고, 층을 분리하고, 유기상을 취하였다. 유기상을 합하고, 감압 하에 농축한 다음, 천천히 냉각시켜 생성물을 분리하였다. 순도가 98.62%이고 광학적 순도가 99.66%이고 총수율이 91%인 4.55 g의 백색 분말을 수득하였다.

실시예 5

7.5 g의 메틸 β-카보닐테트라데카노에이트 및 11.25 g의 글루코스를 칭량하고 100 mL 3구 플라스크에 넣은 다음, 50 mM의 농도 및 7.0의 pH 값을 갖는 50 mL의 PBS 완충액을 첨가하였다. 3구 플라스크를 교반 속도를 800 rpm으로 조정하고 온도를 35℃로 조정한 항온 수조에 넣은 다음, 150 mg NADP⁺, 200 mg 글루코스 탈수소효소 GDH 효소 분말(서열 번호 3으로 나타냄), 및 750 mg 케토환원효소 JR3789 효소 분말(서열 번호 1로 나타냄)를 각각 첨가하여 혼합 반응 용액을 수득하였다. 2 M NaOH 용액을 사용하여 pH를 조정하고 7.0 내지 7.5로 유지하고, 온도를 35℃로 유지하였다. 반응 진행을 HPLC로 모니터링하였다. 반응은 15시간 내에 완료되었으며 전환율은 >99%로 측정되었다. 시험 결과를 하기 표 1에 나타내고, HPLC 크로마토그램을 도 1에 나타낸다

반응이 완료된 후, 수득된 용액을 60℃의 온도까지 가열하여 15분 동안 유지한 다음, 20 내지 25℃로 냉각시키고, 20분 동안 교반하면서 추출을 위해 100 mL의 에틸 아세테이트를 가하고 여과하였다. 여액이 층을 이룬 후 유기상을 취하였다. 수성상을 80 mL의 에틸 아세테이트로 1회 더 추출하고, 층을 분리하고, 유기상을 취하였다. 유기상을 합하고, 감압 하에 농축한 다음, 천천히 냉각시켜 생성물을 분리하였다. 순도가 99.60%이고 ee 값이 98.68%인 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물에 2배 부피의 n-헥산을 첨가하고, 가열하고, 용해시키고, 결정화를 위해 냉각시키고, 여과하고, 실온에서 공기 건조시켜, 측정된 순도가 99.99%이고 ee 값이 99.86%이고 총수율이 87%인 6.53g의 백색 결정 생성물을 수득하였다. 시험된 생성물의 순도 데이터는 표 2에 나타내고, HPLC 크로마토그램은 도 2에 나타내고, 생성물의 키랄 순도 데이터는 표 3에 나타내고, HPLC 크로마토그램은 도 3에 나타낸다.

[표 1] 측정된 전환율의 데이터 시트

[표 2] 생성물의 측정된 순도의 데이터 시트

[표 3] 생성물의 측정된 키랄 순도의 데이터 시트

실시예 6

(1) 융합 효소 G3790 발현 플라스미드의 작제

링커의 유전자 서열(서열 번호 5)은 글루코스 데하이드로게하이드로게 GDH의 유전자 단편(서열번호 3)의 3' 말단에 삽입되었고, 케토환원효소 JR3790의 유전자 단편(서열 번호 4)을 연결하여 융합 효소 G3790 서열(서열 번호 6) (Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd.에 의해 합성됨)을 구성하고, 이를 양 말단의 제한 부위 NdeI 및 XhoI를 통해 캐리어 pET28a에 추가로 연결하여 이중 효소 융합 발현 플라스미드 pET28a-G3790을 구성하였다. 재조합 플라스미드의 플라스미드 맵은 도 4에 나타낸 바와 같다.

(2) 융합 효소 3790G 발현 플라스미드의 작제

링커의 유전자 서열(서열 번호 5)은 케토환원효소 JR3790의 유전자 단편(서열 번호 4)의 3' 말단에 삽입되었고, 글루코스 탈수소효소 GDH의 유전자 단편(서열 번호 3)을 연결하여 융합 효소 서열(서열 번호 7) (Nanjing GenScript Biotechnology Co., Ltd.에 의해 합성됨)을 구성하고, 이를 양 말단의 제한 부위 NdeI 및 XhoI를 통해 캐리어 pET28a에 추가로 연결하여 이중 효소 융합 발현 플라스미드 pET28a-3790G를 구성하였다. 재조합 플라스미드의 플라스미드 맵은 도 5에 나타낸 바와 같다.

(3) 융합 효소 G3790 및 융합 효소 3790G의 제조

작제된 융합 효소 발현 플라스미드 pET28a-G3790 및 pET28a-3790G를 에스케리키아 콜라이 적격 이. 콜라이 BL21(DE3) 균주로 옮겼다. 스크리닝에 의해 양성 클론 형질전환체를 얻었다. 재조합 플라스미드를 포함하는 단일 클론을 선택하고 5 ml LB 배지(100 μg/ml 카나마이신)를 포함하는 시험관에 접종하였다. 37℃ 및 200 rpm에서 밤새 인큐베이션한 후, 세균 용액을 2%의 접종량으로 1 L의 LB 배지를 함유하는 원추형 플라스크로 옮기고, OD600이 약 0.6에 도달할 때까지 37℃ 및 200 rpm에서 인큐베이션하였다. 세균 용액에 이소프로필-β-D-티오갈락토사이드(IPTG) 유도제(최종 농도 0.3 mM)를 첨가하고, 25℃에서 12시간 동안 연속 배양하였다. 세균 세포를 원심 분리에 의해 수집하였다. 세균 세포를 PBS(pH=7.0)로 희석하고, 재현탁하고 파쇄를 위해 초음파 처리하고, 원심분리하여 상청액, 즉 조 효소 용액을 수득하였다.

발현에 의해 수득된 조 효소 용액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 적용하여 단백질 밴드를 확인하였다. 도 6은 G3790 융합 효소의 단백질 전기영동을 나타내고, 여기서, 레인 M은 단백질 마커(GenScript)이고, 레인 1은 전체 세포 파괴 후의 총 단백질이고, 레인 2는 전체 세포 파괴의 원심분리 상청액이고, 여기서, 융합 효소의 이론 분자량은 67 kDa이어야 하고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 8로 나타낸 바와 같다. 도 7은 3790G 융합 효소의 단백질 전기영동을 나타내고, 여기서, 레인 M은 단백질 마커(GenScript)이고, 레인 1은 전체 세포 파괴 후의 총 단백질이고, 레인 2는 전체 세포 파괴의 원심분리 상청액이다. 두 융합 효소의 이론적인 분자량은 둘 모두 67 kDa이고, 아미노산 서열은 서열번호 9로 나타낸다. 두 융합 효소 모두 가용성 단백질이며 이들의 분자량은 해당 이론 분자량에 가깝다.

조 효소 용액을 밤새 사전 동결하고 24시간 내지 36시간 동안 동결 건조시켜 융합 효소 G3790 효소 분말 및 융합 효소 3790G 효소 분말을 수득하였다.

(4) 오르리스타트 중간체의 제조

7.5 kg의 메틸 β-카보닐테트라데카노에이트 및 9.375 kg의 글루코스를 칭량하고 100 mL 유리 반응기에 넣은 다음, 50 mM의 농도 및 7.0의 pH 값을 갖는 25 L의 PBS 완충액을 첨가하였다. 고온 및 저온 사이클 통합 기계는 반응기 온도를 35℃로 유지하였고, 기계적 교반 속도는 180 rpm으로 조정하였다. 18 g NADP⁺ 및 800 g 3790G 효소 분말을 각각 첨가하여 혼합 반응 용액을 수득하였다. 2 M NaOH 용액을 사용하여 pH를 조정하고 7.0 내지 7.5로 유지하였다. 반응 진행을 HPLC로 모니터링하였다. 반응은 13시간 내에 완료되었으며 전환율은 >99%로 측정되었다.

반응이 완료된 후, 수득된 용액을 60℃의 온도까지 가열하여 15 동안 유지한 다음, 20 내지 25℃로 냉각시키고, 흡입에 의해 여과하여 필터 케이크를 수집하였다. 필터 케이크에 15 L의 에틸 아세테이트를 첨가하였다. 혼합물을 추출하고 20분 동안 교반하고, 흡인 여과하여 유기상을 수집하였다. 유기상을 합하고, 감압 하에 농축한 다음, 천천히 냉각하여 생성물을 분리하였다. 순도가 98.5%이고 ee 값이 98.6%인 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물에 2배 부피의 n-헥산을 첨가하고, 가열하고, 용해시키고, 결정화를 위해 냉각시키고, 여과하고, 실온에서 공기 건조시켜, 측정된 순도가 99.70%이고 ee 값이 99.88%이고 총수율이 86%인 6.45 kg의 백색 결정 생성물을 수득하였다.

마지막으로, 상기 구현예는 본 발명의 기술적 해결책을 예시하기 위해 사용된 것일 뿐, 이를 제한하기 위한 것이 아님에 주목해야 한다. 본 발명을 바람직한 구현예를 참조하여 상세히 설명하였지만, 당업자는 본 발명의 기술적 해결책이 본 발명의 청구항의 범위에 포함되어야 하는 본 발명의 기술적 해결책의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 변형되거나 동등하게 대체될 수 있음을 이해해야 한다.

<110> ZEIN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD <120> USE OF BIOLOGICAL ENZYME FOR PREPARING ORLISTAT INTERMEDIATE, AND PREPARATION METHOD <130> OP0022-00-0530 <150> CN 202010015510.1 <151> 2020-01-07 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the ketoreductase <400> 1 Met Gly Lys Leu Asp Asn Lys Val Ala Val Ile Thr Gly Gly Asn Ser 1 5 10 15 Gly Met Gly Leu Ala Thr Ala Gln Arg Phe Val Ser Glu Gly Ala Tyr 20 25 30 Val Phe Ile Thr Gly Arg Arg Gln Ala Glu Leu Asp Lys Ala Val Asp 35 40 45 Leu Ile Gly Lys Asn Val Thr Gly Val Gln Gly Asp Val Ser Asn Leu 50 55 60 Ala Asp Leu Asp Arg Leu Tyr Ala Thr Val Lys Glu Gln Lys Gly Arg 65 70 75 80 Val Asp Val Leu Phe Ala Asn Ala Gly Val Gly Glu Leu Ala Pro Leu 85 90 95 Gly Ser Ile Thr Glu Glu Gln Phe Asp Lys Val Phe Asn Ile Asn Val 100 105 110 Arg Gly Leu Leu Phe Thr Val Gln Lys Ala Leu Pro Leu Phe Gln Asp 115 120 125 Gly Gly Ser Ile Ile Leu Asn Ala Ser Ile Ala Ser Ile Lys Gly Met 130 135 140 Pro Ala Phe Ser Val Tyr Ser Ala Ser Lys Ala Ala Val Arg Ser Phe 145 150 155 160 Ala Arg Ser Trp Thr Val Asp Leu Lys Gly Arg Lys Ile Arg Ile Asn 165 170 175 Thr Leu Ser Pro Gly Pro Ile Asp Thr Pro Ile Leu Ser Gly Leu Ala 180 185 190 Ser Thr Glu Glu Glu Leu Lys Gln Val Lys Ala Asp Leu Ala Ala Gln 195 200 205 Val Pro Leu Gly Arg Met Gly Thr Ser Asp Glu Ile Ala Asn Val Ala 210 215 220 Leu Phe Leu Ala Ser Asp Asp Ser Ser Tyr Val Thr Gly Ile Glu Leu 225 230 235 240 Phe Val Asp Gly Gly Met Ala Gln Ile 245 <210> 2 <211> 259 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the ketoreductase <400> 2 Met Ala Arg Leu Ala Gly Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Pro Gly Leu Gly Ser Ala Thr Ala Ile Arg Phe Ala Gln Glu Gly 20 25 30 Ala Thr Val Tyr Leu Thr Asp Arg Asp Leu Ala Gly Ala Gln Ala Val 35 40 45 Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Gly Gly Arg Ala Thr Ala Leu Glu His 50 55 60 Asp Val Thr Ser Glu Ala Asp Trp Asp Arg Val Leu Ala Ala Ile Asp 65 70 75 80 Ala Ala Glu Gly Arg Leu Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala 85 90 95 Val Leu Gly Pro Leu Glu Asp Val Thr Ala Ala Asp Phe Leu Arg Gln 100 105 110 Asn Asp Val Asn Leu Asn Ser Val Phe His Gly Ser Lys Arg Ala Leu 115 120 125 Val Met Met Arg Arg Pro Gly Asp Gly Gly Thr Ala Arg Gly Gly Ser 130 135 140 Ile Ile Asn Ile Ser Ser Val Ala Gly Leu Ile Gly Val Pro Gly Cys 145 150 155 160 Gly Ser Tyr Ala Ala Ser Lys Gly Gly Val Arg Leu Phe Ser Lys Val 165 170 175 Val Ala Leu Glu Gly Ala Ala Asp Gly Val Arg Cys Asn Ser Val His 180 185 190 Pro Gly Met Ile Ala Thr Asn Ile Gln Gly Val Ala Leu Glu Asp Asn 195 200 205 Ala Ala Asn Phe Asp Ala Val Met Ala Leu Ile Pro Met Val Arg Met 210 215 220 Gly Glu Pro Glu Asp Ile Ala Asn Met Asn Leu Phe Leu Ala Ser Asp 225 230 235 240 Glu Ser Arg Tyr Ile Thr Gly Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Met 245 250 255 Thr Ala Arg <210> 3 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the glucose dehydrogenase <400> 3 Met Tyr Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly 1 5 10 15 Ala Ala Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu 20 25 30 Gln Ala Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn 35 40 45 Glu Val Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val 50 55 60 Gln Gly Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr 65 70 75 80 Ala Ile Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly 85 90 95 Leu Glu Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp 100 105 110 Lys Val Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu 115 120 125 Ala Ile Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn 130 135 140 Met Ser Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr 145 150 155 160 Ala Ala Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu 165 170 175 Glu Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala 180 185 190 Ile Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys 195 200 205 Ala Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu 210 215 220 Glu Ile Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr 225 230 235 240 Val Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro 245 250 255 Ser Phe Gln Ala Gly Arg Gly 260 <210> 4 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the ketoreductase <400> 4 Met Ser Ser Pro Ala Pro Thr Val Tyr Val Ile Ser Gly Ala Ser Arg 1 5 10 15 Gly Ile Gly Phe Ala Ile Thr Ser Ile Leu Ala Gln His Asp Asn Val 20 25 30 Leu Ile Phe Ala Gly Ala Arg Asp Leu Lys Ser Ala Gln Leu Asn Glu 35 40 45 Leu Ala Gln Lys Ser Ser Gly Lys Val Ile Pro Val Lys Leu Glu Ser 50 55 60 Thr Ser Val Glu Asp Ala Ala Ala Leu Ala Lys Val Val Glu Glu Lys 65 70 75 80 Ala Gly Lys Val Asp Tyr Val Leu Ala Val Ala Gly Ile Ser Gln Ser 85 90 95 Thr Asp Pro Ile Ala Gln Val Ser Leu Asp Asp Val Arg Arg His Phe 100 105 110 Glu Val Asn Thr Ile Gly Pro Leu Val Leu Phe Gln Ala Leu Leu Pro 115 120 125 Leu Thr Thr Lys Ser Thr Ala Pro His Phe Ile Val Val Ser Thr Ile 130 135 140 Ala Gly Ser Ile Ala Ser Met Pro Gln Val Thr Phe Pro Val Ser Ala 145 150 155 160 Tyr Ala Ile Ser Lys Thr Ala Val Asn Ser Ala Val Gly Arg Ile Ala 165 170 175 Ile Glu His Pro Asp Leu Asp Ala Phe Val Cys His Pro Gly Phe Val 180 185 190 Ser Ser Asp Met Val Lys Gln Phe Ala Glu Lys Thr Gly Ala Pro Leu 195 200 205 Ser Asp Phe Glu Ser Phe Gly Met Ile Thr Pro Glu Glu Ser Ala Ala 210 215 220 Ser Leu Val Lys Leu Phe Asp Glu Ala Lys Lys Glu Thr His Ser Gly 225 230 235 240 Lys Phe Phe Asn Val Asp Gly Thr 245 <210> 5 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the linker <400> 5 Glu Phe Glu Glu Glu Glu Lys Lys Lys Gln Gln Glu Glu Glu Ala Glu 1 5 10 15 Arg Leu Arg Arg Ile Gln Glu Glu Met Glu Lys Glu Arg Lys Arg Arg 20 25 30 Glu Glu Asp Glu Glu Arg Arg Arg Lys Glu Glu Glu Glu Arg Arg Met 35 40 45 Lys Leu Glu Met Glu Ala Lys Arg Lys Gln Glu Glu Glu Glu Arg Lys 50 55 60 Lys Arg Glu Asp Asp Glu Lys Arg Lys Lys Lys Lys Leu 65 70 75 <210> 6 <211> 1767 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the fusion enzyme <400> 6 atgtatatgt atccggattt aaaaggaaaa gtcgtcgcta ttacaggagc tgcttcaggg 60 ctcggaaagg cgatggccat tcgcttcggc aaggagcagg caaaagtggt tatcaactat 120 tatagtaata aacaagatcc gaacgaggta aaagaagagg tcatcaaggc gggcggtgaa 180 gctgttgtcg tccaaggaga tgtcacgaaa gaggaagatg taaaaaatat cgtgcaaacg 240 gcaattaagg agttcggcac actcgatatt atgattaata atgccggtct tgaaaatcct 300 gtgccatctc acgaaatgcc gctcaaggat tgggataaag tcatcggcac gaacttaacg 360 ggtgcctttt taggaagccg tgaagcgatt aaatatttcg tagaaaacga tattaaggga 420 aatgtcatta acatgtccag tgtgcacgaa gtgattcctt ggccgttatt tgtccactat 480 gcggcaagta aaggcgggat aaagctgatg acagaaacat tagcgttgga atacgcgccg 540 aagggcattc gcgtcaataa tattgggcca ggtgcgatca acacgccaat caatgctgaa 600 aaattcgctg accctaaaca gaaagctgat gtagaaagca tgattccaat gggatatatc 660 ggcgaaccgg aggagatcgc cgcagtagca gcctggcttg cttcgaagga agccagctac 720 gtcacaggca tcacgttatt cgcggacggc ggtatgacac aatatccttc attccaggca 780 ggccgcggtg aattcgaaga agaggaaaaa aagaaacagc aggaagaaga agcggaacgt 840 ctgcgtcgta ttcaggagga gatggagaaa gaacgtaaac gccgcgaaga ggacgaagaa 900 cgccgtcgta aagaggaaga ggagcgccgt atgaaactgg aaatggaagc gaaacgcaaa 960 caagaggagg aagagcgtaa aaagcgcgag gatgatgaaa aacgtaagaa aaaaaagctt 1020 atgtcttcgc ctgctcccac cgtctacgtc atctctggcg cctctcgcgg catcggcttc 1080 gccatcacct ccattctcgc tcaacacgac aacgtattga tctttgccgg cgcacgcgac 1140 ctcaagtcgg cgcaactgaa cgagctcgct cagaagtcta gcggcaaggt catcccggtc 1200 aagctcgagt cgacgagtgt cgaggatgcc gctgcgcttg ccaaggtcgt cgaggagaag 1260 gctggaaagg tggactacgt cttggccgtc gccggcatct cccagtcgac cgaccccatc 1320 gcccaagtct ccctcgacga cgtcaggcgt cacttcgagg tcaacaccat cggccctctc 1380 gtcctcttcc aggcgctcct ccccctcacc accaagtcga ccgcgccgca cttcatcgtc 1440 gtctccacca tcgccggctc aatcgcctcc atgcctcaag tcacgttccc cgtgagcgcc 1500 tacgctatct cgaagactgc cgtcaactcg gccgtaggac gaatcgcgat cgagcacccc 1560 gacctcgacg ccttcgtctg ccatccgggc tttgtgagca gcgacatggt caaacaattt 1620 gcggagaaga cgggcgcacc gttgtcggac tttgagtcgt ttggcatgat cacccccgaa 1680 gaatcggctg cgagtctcgt taagctgttc gacgaggcca agaaggagac gcactcgggc 1740 aagttcttta acgtcgacgg gacctag 1767 <210> 7 <211> 1779 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the fusion enzyme <400> 7 atgtcttcgc ctgctcccac cgtctacgtc atctctggcg cctctcgcgg catcggcttc 60 gccatcacct ccattctcgc tcaacacgac aacgtattga tctttgccgg cgcacgcgac 120 ctcaagtcgg cgcaactgaa cgagctcgct cagaagtcta gcggcaaggt catcccggtc 180 aagctcgagt cgacgagtgt cgaggatgcc gctgcgcttg ccaaggtcgt cgaggagaag 240 gctggaaagg tggactacgt cttggccgtc gccggcatct cccagtcgac cgaccccatc 300 gcccaagtct ccctcgacga cgtcaggcgt cacttcgagg tcaacaccat cggccctctc 360 gtcctcttcc aggcgctcct ccccctcacc accaagtcga ccgcgccgca cttcatcgtc 420 gtctccacca tcgccggctc aatcgcctcc atgcctcaag tcacgttccc cgtgagcgcc 480 tacgctatct cgaagactgc cgtcaactcg gccgtaggac gaatcgcgat cgagcacccc 540 gacctcgacg ccttcgtctg ccatccgggc tttgtgagca gcgacatggt caaacaattt 600 gcggagaaga cgggcgcacc gttgtcggac tttgagtcgt ttggcatgat cacccccgaa 660 gaatcggctg cgagtctcgt taagctgttc gacgaggcca agaaggagac gcactcgggc 720 aagttcttta acgtcgacgg gaccgaattc gaagaagagg aaaaaaagaa acagcaggaa 780 gaagaagcgg aacgtctgcg tcgtattcag gaggagatgg agaaagaacg taaacgccgc 840 gaagaggacg aagaacgccg tcgtaaagag gaagaggagc gccgtatgaa actggaaatg 900 gaagcgaaac gcaaacaaga ggaggaagag cgtaaaaagc gcgaggatga tgaaaaacgt 960 aagaaaaaaa agcttatgta tccggattta aaaggaaaag tcgtcgctat tacaggagct 1020 gcttcagggc tcggaaaggc gatggccatt cgcttcggca aggagcaggc aaaagtggtt 1080 atcaactatt atagtaataa acaagatccg aacgaggtaa aagaagaggt catcaaggcg 1140 ggcggtgaag ctgttgtcgt ccaaggagat gtcacgaaag aggaagatgt aaaaaatatc 1200 gtgcaaacgg caattaagga gttcggcaca ctcgatatta tgattaataa tgccggtctt 1260 gaaaatcctg tgccatctca cgaaatgccg ctcaaggatt gggataaagt catcggcacg 1320 aacttaacgg gtgccttttt aggaagccgt gaagcgatta aatatttcgt agaaaacgat 1380 attaagggaa atgtcattaa catgtccagt gtgcacgaag tgattccttg gccgttattt 1440 gtccactatg cggcaagtaa aggcgggata aagctgatga cagaaacatt agcgttggaa 1500 tacgcgccga agggcattcg cgtcaataat attgggccag gtgcgatcaa cacgccaatc 1560 aatgctgaaa aattcgctga ccctaaacag aaagctgatg tagaaagcat gattccaatg 1620 ggatatatcg gcgaaccgga ggagatcgcc gcagtagcag cctggcttgc ttcgaaggaa 1680 gccagctacg tcacaggcat cacgttattc gcggacggcg gtatgacaca atatccttca 1740 ttccaggcag gccgcggtca ccaccaccac caccactag 1779 <210> 8 <211> 588 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the fusion enzyme <400> 8 Met Tyr Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly 1 5 10 15 Ala Ala Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu 20 25 30 Gln Ala Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn 35 40 45 Glu Val Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val 50 55 60 Gln Gly Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr 65 70 75 80 Ala Ile Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly 85 90 95 Leu Glu Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp 100 105 110 Lys Val Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu 115 120 125 Ala Ile Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn 130 135 140 Met Ser Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr 145 150 155 160 Ala Ala Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu 165 170 175 Glu Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala 180 185 190 Ile Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys 195 200 205 Ala Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu 210 215 220 Glu Ile Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr 225 230 235 240 Val Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro 245 250 255 Ser Phe Gln Ala Gly Arg Gly Glu Phe Glu Glu Glu Glu Lys Lys Lys 260 265 270 Gln Gln Glu Glu Glu Ala Glu Arg Leu Arg Arg Ile Gln Glu Glu Met 275 280 285 Glu Lys Glu Arg Lys Arg Arg Glu Glu Asp Glu Glu Arg Arg Arg Lys 290 295 300 Glu Glu Glu Glu Arg Arg Met Lys Leu Glu Met Glu Ala Lys Arg Lys 305 310 315 320 Gln Glu Glu Glu Glu Arg Lys Lys Arg Glu Asp Asp Glu Lys Arg Lys 325 330 335 Lys Lys Lys Leu Met Ser Ser Pro Ala Pro Thr Val Tyr Val Ile Ser 340 345 350 Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly Phe Ala Ile Thr Ser Ile Leu Ala Gln 355 360 365 His Asp Asn Val Leu Ile Phe Ala Gly Ala Arg Asp Leu Lys Ser Ala 370 375 380 Gln Leu Asn Glu Leu Ala Gln Lys Ser Ser Gly Lys Val Ile Pro Val 385 390 395 400 Lys Leu Glu Ser Thr Ser Val Glu Asp Ala Ala Ala Leu Ala Lys Val 405 410 415 Val Glu Glu Lys Ala Gly Lys Val Asp Tyr Val Leu Ala Val Ala Gly 420 425 430 Ile Ser Gln Ser Thr Asp Pro Ile Ala Gln Val Ser Leu Asp Asp Val 435 440 445 Arg Arg His Phe Glu Val Asn Thr Ile Gly Pro Leu Val Leu Phe Gln 450 455 460 Ala Leu Leu Pro Leu Thr Thr Lys Ser Thr Ala Pro His Phe Ile Val 465 470 475 480 Val Ser Thr Ile Ala Gly Ser Ile Ala Ser Met Pro Gln Val Thr Phe 485 490 495 Pro Val Ser Ala Tyr Ala Ile Ser Lys Thr Ala Val Asn Ser Ala Val 500 505 510 Gly Arg Ile Ala Ile Glu His Pro Asp Leu Asp Ala Phe Val Cys His 515 520 525 Pro Gly Phe Val Ser Ser Asp Met Val Lys Gln Phe Ala Glu Lys Thr 530 535 540 Gly Ala Pro Leu Ser Asp Phe Glu Ser Phe Gly Met Ile Thr Pro Glu 545 550 555 560 Glu Ser Ala Ala Ser Leu Val Lys Leu Phe Asp Glu Ala Lys Lys Glu 565 570 575 Thr His Ser Gly Lys Phe Phe Asn Val Asp Gly Thr 580 585 <210> 9 <211> 592 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the fusion enzyme <400> 9 Met Ser Ser Pro Ala Pro Thr Val Tyr Val Ile Ser Gly Ala Ser Arg 1 5 10 15 Gly Ile Gly Phe Ala Ile Thr Ser Ile Leu Ala Gln His Asp Asn Val 20 25 30 Leu Ile Phe Ala Gly Ala Arg Asp Leu Lys Ser Ala Gln Leu Asn Glu 35 40 45 Leu Ala Gln Lys Ser Ser Gly Lys Val Ile Pro Val Lys Leu Glu Ser 50 55 60 Thr Ser Val Glu Asp Ala Ala Ala Leu Ala Lys Val Val Glu Glu Lys 65 70 75 80 Ala Gly Lys Val Asp Tyr Val Leu Ala Val Ala Gly Ile Ser Gln Ser 85 90 95 Thr Asp Pro Ile Ala Gln Val Ser Leu Asp Asp Val Arg Arg His Phe 100 105 110 Glu Val Asn Thr Ile Gly Pro Leu Val Leu Phe Gln Ala Leu Leu Pro 115 120 125 Leu Thr Thr Lys Ser Thr Ala Pro His Phe Ile Val Val Ser Thr Ile 130 135 140 Ala Gly Ser Ile Ala Ser Met Pro Gln Val Thr Phe Pro Val Ser Ala 145 150 155 160 Tyr Ala Ile Ser Lys Thr Ala Val Asn Ser Ala Val Gly Arg Ile Ala 165 170 175 Ile Glu His Pro Asp Leu Asp Ala Phe Val Cys His Pro Gly Phe Val 180 185 190 Ser Ser Asp Met Val Lys Gln Phe Ala Glu Lys Thr Gly Ala Pro Leu 195 200 205 Ser Asp Phe Glu Ser Phe Gly Met Ile Thr Pro Glu Glu Ser Ala Ala 210 215 220 Ser Leu Val Lys Leu Phe Asp Glu Ala Lys Lys Glu Thr His Ser Gly 225 230 235 240 Lys Phe Phe Asn Val Asp Gly Thr Glu Phe Glu Glu Glu Glu Lys Lys 245 250 255 Lys Gln Gln Glu Glu Glu Ala Glu Arg Leu Arg Arg Ile Gln Glu Glu 260 265 270 Met Glu Lys Glu Arg Lys Arg Arg Glu Glu Asp Glu Glu Arg Arg Arg 275 280 285 Lys Glu Glu Glu Glu Arg Arg Met Lys Leu Glu Met Glu Ala Lys Arg 290 295 300 Lys Gln Glu Glu Glu Glu Arg Lys Lys Arg Glu Asp Asp Glu Lys Arg 305 310 315 320 Lys Lys Lys Lys Leu Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala 325 330 335 Ile Thr Gly Ala Ala Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe 340 345 350 Gly Lys Glu Gln Ala Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln 355 360 365 Asp Pro Asn Glu Val Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala 370 375 380 Val Val Val Gln Gly Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile 385 390 395 400 Val Gln Thr Ala Ile Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn 405 410 415 Asn Ala Gly Leu Glu Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys 420 425 430 Asp Trp Asp Lys Val Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly 435 440 445 Ser Arg Glu Ala Ile Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn 450 455 460 Val Ile Asn Met Ser Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe 465 470 475 480 Val His Tyr Ala Ala Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr 485 490 495 Leu Ala Leu Glu Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly 500 505 510 Pro Gly Ala Ile Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro 515 520 525 Lys Gln Lys Ala Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly 530 535 540 Glu Pro Glu Glu Ile Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu 545 550 555 560 Ala Ser Tyr Val Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr 565 570 575 Gln Tyr Pro Ser Phe Gln Ala Gly Arg Gly His His His His His His 580 585 590

Claims

오르리스타트 중간체의 제조에서 생물학적 효소의 용도로서, 여기서, 상기 생물학적 효소의 기질은 β-카보닐테트라데카노에이트이고, 구조식은 I로 나타낸 바와 같고, 상기 오르리스타트 중간체는 (R)-β-하이드록시테트라데카노에이트이고, 구조식은 II로 나타낸 바와 같고, 구조식 I에서 R은 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 포화 알킬 기를 지칭하고, 구조식 II에서 R은 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 포화 알킬 기를 지칭하고:
[I]

[II]

;
상기 생물학적 효소는 케토환원효소 또는 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소이고, 상기 케토환원효소의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 2로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 4로 나타낸 바와 같고, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성/상동성을 가지고; 상기 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 8 및/또는 서열 번호 9로 나타낸 바와 같은, 용도.
제1항에 있어서, 상기 생물학적 효소는 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소이고, 상기 융합 효소에서, 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소는 링커에 의해 연결되고; 임의로, 상기 링커의 아미노산 서열은 서열 번호 5로 나타낸 바와 같은, 용도.
제2항에 있어서, 상기 생물학적 효소는 케토환원효소-링커-글루코스 탈수소효소 또는 글루코스 탈수소효소- 링커-케토환원효소인 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소인, 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 글루코스 탈수소효소의 아미노산 서열은 서열 번호 3으로 나타낸 바와 같은, 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 효소는 효소 분말 및/또는 효소 용액 및/또는 고정화 효소인, 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구조식 I에서 R은 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필 중 어느 하나이고, 상기 구조식 II에서 R은 메틸, 에틸, n-프로필 또는 이소프로필 중 어느 하나인, 용도.
융합 효소로서, 상기 융합 효소는 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소이고; 상기 융합 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 8 및/또는 서열 번호 9로 나타낸 바와 같은 융합 효소.
제7항에 있어서, 상기 융합 효소에서, 상기 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소는 링커에 의해 연결되어 있고; 임의로, 상기 링커의 아미노산 서열은 서열 번호 5로 나타낸 바와 같은, 융합 효소.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 융합 효소는 케토환원효소-링커-글루코스 탈수소효소 또는 글루코스 탈수소효소-링커-케토환원효소이고;
임의로, 상기 케토환원효소의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 2로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 4로 나타낸 바와 같고, 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성/상동성을 가지고,
임의로, 상기 글루코스 탈수소효소의 아미노산 서열은 서열 번호 3으로 나타낸 바와 같은, 융합 효소.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항의 융합 효소를 코딩하기 위한 뉴클레오티드 서열로서, 상기 융합 효소의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 6 또는 서열 번호 7로 표시되는, 뉴클레오티드 서열.
제10항에 따른 뉴클레오티드 서열을 작제하는 방법으로서, 서열 번호 3으로 나타낸 글루코스 탈수소효소의 유전자 단편의 3' 말단에 서열 번호 5로 나타낸 링커 서열을 삽입하는 단계 및 이어서 서열 번호 4에 나타낸 케토환원효소의 유전자 단편을 연결하여 서열 번호 6에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 플라스미드를 형성하는 단계를 포함하는 방법.
제10항에 따른 뉴클레오티드 서열을 작제하는 방법으로서, 서열 번호 4로 나타낸 케토환원효소의 유전자 단편의 3' 말단에 서열 번호 5로 나타낸 링커 서열을 삽입하는 단계 및 이어서 서열 번호 3에 나타낸 글루코스 탈수소효소의 유전자 단편을 연결하여 서열 번호 7에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 형성하는 단계를 포함하는 방법.
생물학적 효소 및 기질을 함유하는 조성물로서, 여기서, 상기 기질은 β-카보닐테트라데카노에이트이고, 이의 구조식은 화학식 I로 나타낸 바와 같고; 상기 생물학적 효소는 케토환원효소 또는 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소이고, 상기 케토환원효소의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 2로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 4로 나타낸 바와 같고, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성/상동성을 가지고; 상기 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 8로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 9로 나타낸 바와 같은 조성물:
[I]

구조식 I에서 R은 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 포화 알킬 기를 지칭한다.
제13항에 있어서, 상기 생물학적 효소 대 상기 기질의 중량비는 1:1.1-150인, 조성물.
제14항에 있어서, 상기 생물학적 효소 대 상기 기질의 중량비는 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:110, 1:120, 1:130, 1:140 및/또는 1:150인, 조성물.
반응 시스템으로서, 여기서, 상기 반응 시스템은 I에 나타낸 기질, 생물학적 효소, 글루코스, 글루코스 탈수소효소, NADP⁺ 및 완충 용액으로 구성되고; 여기서 상기 생물학적 효소는 케토환원효소이고, 상기 케토환원효소의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 2로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 4로 나타낸 바와 같고, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성/상동성을 갖거나; 상기 반응 시스템은 I에 나타낸 기질, 생물학적 효소, 글루코스, NADP⁺ 및 완충 용액으로 구성되고; 여기서, 상기 생물학적 효소는 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소이고, 상기 케토환원효소의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 2로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 4로 나타낸 바와 같고, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 동일성/상동성을 가지고; 상기 케토환원효소와 글루코스 탈수소효소의 융합 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 8로 나타낸 바와 같고/같거나 서열 번호 9로 나타낸 바와 같은 반응 시스템:
[I]

구조식 I에서 R은 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 포화 알킬 기를 지칭한다.
제16항에 있어서, 상기 반응 시스템의 pH 값은 6.0 내지 8.0이고; 임의로, 상기 완충 용액은 PBS 완충액 또는 Tris-HCl 완충액인, 반응 시스템.
제16항에 있어서, 상기 기질의 농도는 20 g/L 내지 150 g/L인, 반응 시스템.
제16항에 있어서, 상기 NADP⁺의 농도는 0.1-0.5 g/L인, 반응 시스템.
제16항에 있어서, 상기 화합물 I 및 상기 글루코스의 몰비는 1:1.2-4인, 반응 시스템.
제16항에 있어서, 상기 완충액의 농도는 0.01 내지 0.5 mol/L인, 반응 시스템.
제16항에 있어서, 상기 반응 시스템의 반응 시간은 15시간을 초과하지 않고, 반응 용액을 수득하는, 반응 시스템.
제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 반응 시스템을 기반으로 하는 오르리스타트 중간체를 제조하는 방법으로서, 여기서, 상기 반응 시스템은 교반하면서 20 내지 40℃에서 반응시켜 오르리스타트 중간체의 반응 용액을 수득하고, 상기 오르리스타트 중간체의 중간체는 (R)-β-하이드록시테트라데카노에이트이고 구조식은 II로 나타낸 바와 같은 방법:
[II]

구조식 II에서 R은 1 내지 3개의 탄소 원자를 포함하는 포화 알킬 기를 지칭한다.
제23항에 있어서, NaOH 수용액은 pH 조절제로서 사용되는, 방법.
제23항에 있어서, 상기 반응 시간은 15시간을 초과하지 않는, 방법.
제23항에 있어서, 상기 오르리스타트 중간체는 수득된 반응 용액으로부터 용매를 추출하는, 방법.
제23항에 있어서, 상기 용매는 무수 에탄올 또는 에틸 아세테이트인, 방법.
제27항에 있어서, 수득된 추출물을 감압 농축하고, 결정화를 위해 냉각시켜 백색 결정질 고체인 화합물 II를 수득하는, 방법.