KR20220158770A - 칸나비노이드 및 칸나비노이드 전구체의 생합성 - Google Patents

칸나비노이드 및 칸나비노이드 전구체의 생합성 Download PDF

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Abstract

본 개시내용의 양태는 재조합 세포에서 시험관내 칸나비노이드 및 칸나비노이드 전구체의 생합성에 관한 것이다.

Description

칸나비노이드 및 칸나비노이드 전구체의 생합성
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 3월 26일에 출원된 "칸나비노이드 및 칸나비노이드 전구체의 생합성"이라는 명칭의 미국 가출원 번호 63/000,419의 35 U.S.C. § 119(e)에 따른 이익을 주장하며, 그 전체 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
EFS-웹을 통한 텍스트 파일로서 제출된 서열 목록에 관한 참조
본 출원은 EFS-웹을 통해 ASCII 형식으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 2021년 3월 24일에 생성된 상기 ASCII 파일의 이름은 G091970059WO00-SEQ-OMJ.txt이며, 크기는 526 킬로바이트이다.
발명의 분야
본 개시내용은 재조합 세포에서와 같이 칸나비노이드 및 칸나비노이드 전구체의 생합성에 관한 것이다.
칸나비노이드는 엔도칸나비노이드 수용체에 대한 리간드 역할을 할 수 있는 화합물이며 다양한 의학적 용도를 가지고 있다. 전통적으로, 칸나비노이드는 대마초(Cannabis) 속의 식물로부터 단리되었다. 칸나비노이드를 생성하기 위한 식물의 사용은 비효율적이지만, 다른 칸나비노이드는 전형적으로 대마초 식물에서 매우 낮은 농도로 생성되기 때문에 단리된 생성물은 종종 가장 만연한 2개의 내인성 칸나비노이드인 THC 및 CBD로 제한된다. 또한, 대마초 식물의 재배는 많은 관할 구역(jurisdiction)에서 제한된다. 또한, 일관된 결과를 얻기 위해, 대마초 식물은 종종 창문이 없는 실내 재배실(indoor grow room)과 같은 통제된 환경에서 재배되어 조명, 온도, 습도, 기류 등과 같은 재배 조건을 유연하게 조절한다. 이러한 통제된 환경에서 대마초 식물을 재배하면 특히 식물이 소량만 생성하는 희귀한 칸나비노이드의 경우 생성되는 칸나비노이드 그램당 높은 에너지 사용량을 초래할 수 있다. 예를 들어, 이러한 재배실의 조명은 고출력 나트륨 조명과 같은 인공 광원에 의해 제공된다. 많은 종류의 대마초가 하루에 18시간 이상의 조명을 필요로 하는 식물 주기를 가지고 있기 때문에 이러한 조명에 전력을 공급하면 상당한 에너지 소비를 초래할 수 있다. 건조된 대마초 꽃 형태(예를 들어, 임의의 추출 또는 정제 전)로 1 그램의 THC를 생성하기 위해 0.88 kWh와 1.34 kWh 사이의 에너지가 필요한 것으로 추정된다. 또한, 성장 시즌이 건기와 일치하여 물 사용량이 하천의 연결된 지표수에 영향을 미칠 수 있는 캘리포니아와 같은 특정 관할 구역의 농업 관행에 대한 우려가 제기되었다(Dillis, Christopher, Connor McIntee, Van Butsic, Lance Le, Kason Grady, and Theodore Grantham. "Water storage and Irrigation practices for cannabis drive seasonal patterns of water extraction and use in Northern California." Journal of Environmental Management 272 (2020): 110955).
칸나비노이드는 화학적 합성을 통해 생성될 수 있다(예를 들어, Souza 등의 미국 특허 번호 7,323,576 참조). 그러나 이러한 방법은 낮은 생산량과 높은 비용으로 인해 어려움을 겪고 있다. 조작된 유기체를 사용한 칸나비노이드, 칸나비노이드 유사체 및 칸나비노이드 전구체의 생성은 이러한 화합물에 대한 증가하는 수요를 충족시키기 위한 유리한 접근법을 제공할 수 있다.
요약
본 개시내용의 양태는 유전적으로 변형된 숙주 세포를 사용하여 지방산 기질로부터 칸나비노이드 및 칸나비노이드 전구체의 생성 방법을 제공한다.
본 개시내용의 양태는 말단 신타제(TS)를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것으로, 여기서 TS는 서열번호 27 또는 25와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 숙주 세포는 적어도 하나의 칸나비노이드를 생성할 수 있다.
본 개시내용의 양태는 말단 신타제(TS)를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것으로, 여기서 TS는 서열번호 27 또는 25와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 숙주 세포는 적어도 하나의 칸나비노이드를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 27의 서열에 비해, TS는 서열번호 27의 위치 33, 39, 55, 57, 61, 62, 63, 71, 112, 122, 126, 129, 131, 180, 183, 202, 256, 257, 260, 287, 295, 341, 386, 392, 394, 398, 410, 423, 426, 450, 및/또는 472에 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 위치 33에 상응하는 잔기에서 아미노산 D; 서열번호 27의 위치 39에 상응하는 잔기에서 아미노산 F; 서열번호 27의 위치 55에 상응하는 잔기에서 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 57에 상응하는 잔기에서 아미노산 Q 또는 E; 서열번호 27의 위치 61에 상응하는 잔기에서 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 62에 상응하는 잔기에서 아미노산 I; 서열번호 27의 위치 63에 상응하는 잔기에서 아미노산 I; 서열번호 27의 위치 71에 상응하는 잔기에서 아미노산 I; 서열번호 27의 위치 112에 상응하는 잔기에서 아미노산 V 또는 T; 서열번호 27의 위치 122에 상응하는 잔기에서 아미노산 S, G, A 또는 E; 서열번호 27의 위치 126에 상응하는 잔기에서 아미노산 A, R, T, K, 또는 D; 서열번호 27의 위치 129에 상응하는 잔기에서 아미노산 W; 서열번호 27의 위치 131에 상응하는 잔기에서 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 180에 상응하는 잔기에서 아미노산 T; 서열번호 27의 위치 183에 상응하는 잔기에서 아미노산 T; 서열번호 27의 위치 202에 상응하는 잔기에서 아미노산 S 또는 G; 서열번호 27의 위치 256에 상응하는 잔기에서 아미노산 F 또는 M; 서열번호 27의 위치 257에 상응하는 잔기에서 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 260에 상응하는 잔기에서 아미노산 M 또는 F; 서열번호 27의 위치 287에 상응하는 잔기에서 아미노산 R; 서열번호 27의 위치 295에 상응하는 잔기에서 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 341에 상응하는 잔기에서 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 386에 상응하는 잔기에서 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 392에 상응하는 잔기에서 아미노산 H; 서열번호 27의 위치 394에 상응하는 잔기에서 아미노산 T; 서열번호 27의 위치 398에 상응하는 잔기에서 아미노산 F, T, A, 또는 L; 서열번호 27의 위치 410에 상응하는 잔기에서 아미노산 N; 서열번호 27의 위치 423에 상응하는 잔기에서 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 426에 상응하는 잔기에서 아미노산 Y; 서열번호 27의 위치 450에 상응하는 잔기에서 아미노산 K; 및/또는 서열번호 27의 위치 472에 상응하는 잔기에서 아미노산 R 또는 A를 포함한다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 서열에 비해 하기 아미노산 치환: T33D; Y39F; T55S; A57Q; A57E; G61A; V62I; V63I; Y71I; E112V; E112T; N122S; N122G; N122A; N122E; I126A; I126R; I126T; I126K; I126D; Y129W; N131S; S180T; R183T; N202S; N202G; Y256F; Y256M; N257S; V260M; V260F; H287R; N295S; A341S; V386A; L392H; M394T; V398F; V398T; V398A; V398L; D410N; S423A; H426Y; R450K; P472R; 및/또는 P472A 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 칸나비노이드는 CBC 유형 칸나비노이드이다. 일부 구현예에서, 칸나비노이드는 칸나비크로멘산(CBCA) 및/또는 칸나비크로메바린산(CBCVA)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 테트라하이드로칸나비놀산(THCA), 칸나비디올산(CBDA) 및/또는 테트라하이드로칸나비바린산(THCVA) 중 하나 이상을 추가로 생성한다.
일부 구현예에서, TS는 대조군 TS보다 더 높은 비율의 CBCA:CBDA, CBCA:THCA, 및/또는 CBCVA:THCVA를 생성한다. 일부 구현예에서, 대조군 TS는 서열번호 20, 23, 25 또는 27의 서열을 포함하는 TS이다. 일부 구현예에서, TS는 서열번호 27에 비해 하기 아미노산 치환: A57Q 및 G61A; Y71I; 및/또는 V260F 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, TS는 대조군 TS보다 CBC 유형 칸나비노이드에 대해 더 높은 생성물 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, 대조군 TS는 서열번호 20, 23, 25 또는 27의 서열을 포함하는 TS이다. 일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 서열에 비해 Y39F 및/또는 V63I를 포함한다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 25, 27, 105, 126, 134, 155, 162, 164, 또는 165 중 어느 하나의 서열을 포함하고, 임의로 여기서 서열번호 27의 서열에 비해, TS는 서열번호 27의 위치 33, 39, 55, 57, 61, 62, 63, 71, 112, 122, 126, 129, 131, 180, 183, 202, 256, 257, 260, 287, 295, 341, 386, 392, 394, 398, 410, 423, 426, 450, 및/또는 472에 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, TS의 서열은 하기 모티프 중 하나 이상을 포함한다: KVQARSGGH(서열번호 174); RASNTQNQD[VI][FL]FA[VI]K(서열번호 176); CPTI[KR]TGGH(서열번호 181); WFVTLSLEGGAINDV[AP]EDATAY[AG]H(서열번호 184); P[IV]S[DQE]TTY[EDG]F[TA]DGLYDVLA[RQK]AVPES[VA]GHAYLGCPDP[RK]M(서열번호 186); MKHF[TNS]QFSM(서열번호 189); P[EQ][TS]A[EAD][QE]IA[GA][VI]VKC(서열번호 193); RDCL[IV]SA[LV]GGN[SA]A[LH][AV][AV]F[PQ][ND][QE]LL[WY](서열번호 200); RT[EQ][PQ]APGLAVQYSY(서열번호 207); 및/또는 WQ[SA]FI[SA][AQ][KE]NLT[RW][QK]FY[NST]NM(서열번호 211).
본 개시내용의 추가 양태는 칸나비노이드를 생성하기 위한 숙주 세포에 관한 것으로, 여기서 숙주 세포는 말단 신타제(TS)를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 TS의 서열은 하기 모티프 중 하나 이상을 포함하고: KVQARSGGH(서열번호 174); RASNTQNQD[VI][FL]FA[VI]K(서열번호 176); CPTI[KR]TGGH(서열번호 181); WFVTLSLEGGAINDV[AP]EDATAY[AG]H(서열번호 184); P[IV]S[DQE]TTY[EDG]F[TA]DGLYDVLA[RQK]AVPES[VA]GHAYLGCP DP[RK]M(서열번호 186); MKHF[TNS]QFSM(서열번호 189); P[EQ][TS]A[EAD][QE]IA[GA][VI]VKC(서열번호 193); RDCL[IV]SA[LV]GGN[SA]A[LH][AV][AV]F[PQ][ND][QE]LL[WY](서열번호 200); RT[EQ][PQ]APGLAVQYSY(서열번호 207); 및/또는 WQ[SA]FI[SA][AQ][KE]NLT[RW][QK]FY[NST]NM(서열번호 211), 여기서 숙주 세포는 적어도 하나의 칸나비노이드를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 모티프 KVQARSGGH(서열번호 174)는 서열번호 27의 잔기 72-80에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고; 모티프 RASNTQNQD[VI][FL]FA[VI]K(서열번호 176)는 서열번호 27의 잔기 183-197에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고; 모티프 CPTI[KR]TGGH(서열번호 181)는 서열번호 27의 잔기 141-149에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고; 모티프 WFVTLSLEGGAINDV[AP]EDATAY[AG]H(서열번호 184)는 서열번호 27의 잔기 360-383에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고; 모티프 P[IV]S[DQE]TTY[EDG]F[TA]DGLYDVLA[RQK]AVPES[VA]GHAYLGCPDP[RK]M(서열번호 186)은 서열번호 27의 잔기 400-436에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고; 모티프 MKHF[TNS]QFSM(서열번호 189)은 서열번호 27의 잔기 98-106에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고; 모티프 P[EQ][TS]A[EAD][QE]IA[GA][VI]VKC(서열번호 193)는 서열번호 27의 잔기 53-65에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고; 모티프 RDCL[IV]SA[LV]GGN[SA]A[LH][AV][AV]F[PQ][ND][QE]LL[WY](서열번호 200)는 서열번호 27의 잔기 10-32에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고; 모티프 RT[EQ][PQ]APGLAVQYSY(서열번호 207)는 서열번호 27의 잔기 212-225에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고/하거나; 모티프 WQ[SA]FI[SA][AQ][KE]NLT[RW][QK]FY[NST]NM(서열번호 211)은 서열번호 27의 잔기 242-259에 상응하는 TS의 잔기에 위치한다.
일부 구현예에서, TS는 진균 TS 또는 이의 보존적으로 치환된 버전이다. 일부 구현예에서, TS는 아스페르길루스 TS 또는 이의 보존적으로 치환된 버전이다. 일부 구현예에서, TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 27의 서열에 비해, TS는 서열번호 27의 위치 33, 39, 55, 57, 61, 62, 63, 71, 112, 122, 126, 129, 131, 180, 183, 202, 256, 257, 260, 287, 295, 341, 386, 392, 394, 398, 410, 423, 426, 450, 및/또는 472에 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 위치 33에 상응하는 잔기에서 아미노산 D; 서열번호 27의 위치 39에 상응하는 잔기에서 아미노산 F; 서열번호 27의 위치 55에 상응하는 잔기에서 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 57에 상응하는 잔기에서 아미노산 Q 또는 E; 서열번호 27의 위치 61에 상응하는 잔기에서 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 62에 상응하는 잔기에서 아미노산 I; 서열번호 27의 위치 63에 상응하는 잔기에서 아미노산 I; 서열번호 27의 위치 71에 상응하는 잔기에서 아미노산 I; 서열번호 27의 위치 112에 상응하는 잔기에서 아미노산 V 또는 T; 서열번호 27의 위치 122에 상응하는 잔기에서 아미노산 S, G, A 또는 E; 서열번호 27의 위치 126에 상응하는 잔기에서 아미노산 A, R, T, K, 또는 D; 서열번호 27의 위치 129에 상응하는 잔기에서 아미노산 W; 서열번호 27의 위치 131에 상응하는 잔기에서 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 180에 상응하는 잔기에서 아미노산 T; 서열번호 27의 위치 183에 상응하는 잔기에서 아미노산 T; 서열번호 27의 위치 202에 상응하는 잔기에서 아미노산 S 또는 G; 서열번호 27의 위치 256에 상응하는 잔기에서 아미노산 F 또는 M; 서열번호 27의 위치 257에 상응하는 잔기에서 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 260에 상응하는 잔기에서 아미노산 M 또는 F; 서열번호 27의 위치 287에 상응하는 잔기에서 아미노산 R; 서열번호 27의 위치 295에 상응하는 잔기에서 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 341에 상응하는 잔기에서 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 386에 상응하는 잔기에서 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 392에 상응하는 잔기에서 아미노산 H; 서열번호 27의 위치 394에 상응하는 잔기에서 아미노산 T; 서열번호 27의 위치 398에 상응하는 잔기에서 아미노산 F, T, A, 또는 L; 서열번호 27의 위치 410에 상응하는 잔기에서 아미노산 N; 서열번호 27의 위치 423에 상응하는 잔기에서 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 426에 상응하는 잔기에서 아미노산 Y; 서열번호 27의 위치 450에 상응하는 잔기에서 아미노산 K; 및/또는 서열번호 27의 위치 472에 상응하는 잔기에서 아미노산 R 또는 A를 포함한다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 서열에 비해 하기 아미노산 치환: T33D; Y39F; T55S; A57Q; A57E; G61A; V62I; V63I; Y71I; E112V; E112T; N122S; N122G; N122A; N122E; I126A; I126R; I126T; I126K; I126D; Y129W; N131S; S180T; R183T; N202S; N202G; Y256F; Y256M; N257S; V260M; V260F; H287R; N295S; A341S; V386A; L392H; M394T; V398F; V398T; V398A; V398L; D410N; S423A; H426Y; R450K; P472R; 및/또는 P472A 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 143, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나의 서열 또는 이의 보존적으로 치환된 버전을 포함한다.
본 개시내용의 추가 양태는 말단 신타제(TS)를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것으로, 여기서 TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 숙주 세포는 적어도 하나의 칸나비노이드를 생성할 수 있다.
본 개시내용의 추가 양태는 말단 신타제(TS)를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것으로, 여기서 TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 숙주 세포는 적어도 하나의 칸나비노이드를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열은 하나 이상의 신호 펩티드에 연결된다. 일부 구현예에서, 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열은 서열번호 16, 또는 서열번호 16의 서열에 비해 2개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가 또는 결실을 갖는 서열을 포함하는 신호 펩티드에 연결된다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열의 N-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, N-말단 메티오닌은 서열번호 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172로부터 제거되고, 여기서 메티오닌 잔기는 신호 펩티드의 N-말단에 부가된다. 일부 구현예에서, 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열은 서열번호 17, 또는 서열번호 17의 서열에 비해 1개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 갖는 서열을 포함하는 신호 펩티드에 연결된다. 일부 구현예에서, 서열번호 17, 또는 서열번호 17의 서열에 비해 1개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 갖는 서열을 포함하는 신호 펩티드는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열의 C-말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 서열번호 27의 서열에 비해, TS는 서열번호 27의 위치 33, 39, 55, 57, 61, 62, 63, 71, 112, 122, 126, 129, 131, 180, 183, 202, 256, 257, 260, 287, 295, 341, 386, 392, 394, 398, 410, 423, 426, 450, 및/또는 472에 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 위치 33에 상응하는 잔기에서 아미노산 D; 서열번호 27의 위치 39에 상응하는 잔기에서 아미노산 F; 서열번호 27의 위치 55에 상응하는 잔기에서 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 57에 상응하는 잔기에서 아미노산 Q 또는 E; 서열번호 27의 위치 61에 상응하는 잔기에서 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 62에 상응하는 잔기에서 아미노산 I; 서열번호 27의 위치 63에 상응하는 잔기에서 아미노산 I; 서열번호 27의 위치 71에 상응하는 잔기에서 아미노산 I; 서열번호 27의 위치 112에 상응하는 잔기에서 아미노산 V 또는 T; 서열번호 27의 위치 122에 상응하는 잔기에서 아미노산 S, G, A 또는 E; 서열번호 27의 위치 126에 상응하는 잔기에서 아미노산 A, R, T, K, 또는 D; 서열번호 27의 위치 129에 상응하는 잔기에서 아미노산 W; 서열번호 27의 위치 131에 상응하는 잔기에서 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 180에 상응하는 잔기에서 아미노산 T; 서열번호 27의 위치 183에 상응하는 잔기에서 아미노산 T; 서열번호 27의 위치 202에 상응하는 잔기에서 아미노산 S 또는 G; 서열번호 27의 위치 256에 상응하는 잔기에서 아미노산 F 또는 M; 서열번호 27의 위치 257에 상응하는 잔기에서 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 260에 상응하는 잔기에서 아미노산 M 또는 F; 서열번호 27의 위치 287에 상응하는 잔기에서 아미노산 R; 서열번호 27의 위치 295에 상응하는 잔기에서 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 341에 상응하는 잔기에서 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 386에 상응하는 잔기에서 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 392에 상응하는 잔기에서 아미노산 H; 서열번호 27의 위치 394에 상응하는 잔기에서 아미노산 T; 서열번호 27의 위치 398에 상응하는 잔기에서 아미노산 F, T, A, 또는 L; 서열번호 27의 위치 410에 상응하는 잔기에서 아미노산 N; 서열번호 27의 위치 423에 상응하는 잔기에서 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 426에 상응하는 잔기에서 아미노산 Y; 서열번호 27의 위치 450에 상응하는 잔기에서 아미노산 K; 및/또는 서열번호 27의 위치 472에 상응하는 잔기에서 아미노산 R 또는 A를 포함한다. 일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 서열에 비해 하기 아미노산 치환: T33D; Y39F; T55S; A57Q; A57E; G61A; V62I; V63I; Y71I; E112V; E112T; N122S; N122G; N122A; N122E; I126A; I126R; I126T; I126K; I126D; Y129W; N131S; S180T; R183T; N202S; N202G; Y256F; Y256M; N257S; V260M; V260F; H287R; N295S; A341S; V386A; L392H; M394T; V398F; V398T; V398A; V398L; D410N; S423A; H426Y; R450K; P472R; 및/또는 P472A 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 서열번호 26, 28, 35, 42, 56, 60, 64, 74, 85, 89, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 및 102 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TS 서열은 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167 및 172 중 어느 하나를 포함한다.
본 개시내용의 추가 양태는 말단 신타제(TS)를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것으로, 여기서 TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나, 여기서 숙주 세포는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나의 보존적으로 치환된 버전을 포함한다.
본 개시내용의 추가 양태는 말단 신타제(TS)를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것으로, 여기서 숙주 세포는 적어도 하나의 칸나비노이드를 생성할 수 있고, 여기서 TS는 진균 TS 또는 이의 보존적으로 치환된 버전이다. 일부 구현예에서, 진균 TS는 아스페르길루스 TS 또는 이의 보존적으로 치환된 버전이다. 일부 구현예에서, 칸나비노이드는 CBC 유형 칸나비노이드이다. 일부 구현예에서, 칸나비노이드는 칸나비크로멘산(CBCA) 및/또는 칸나비크로메바린산(CBCVA)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 테트라하이드로칸나비놀산(THCA), 칸나비디올산(CBDA) 및/또는 테트라하이드로칸나비바린산(THCVA) 중 하나 이상을 추가로 생성한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 식물 세포, 조류 세포, 효모 세포, 박테리아 세포, 또는 동물 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 효모 세포이다. 일부 구현예에서, 효모 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces) 세포, 야로위아(Yarrowia) 세포, 코마가타엘라(Komagataella) 세포, 또는 피키아(Pichia) 세포이다. 일부 구현예에서, 사카로마이세스 세포는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 박테리아 세포이다. 일부 구현예에서, 박테리아 세포는 이. 콜라이(E. coli) 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 아실 활성화 효소(AAE), 폴리케타이드 신타제(PKS), 폴리케타이드 사이클라제(PKC), 프레닐트랜스퍼라제(PT), 및/또는 추가 말단 신타제(TS) 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, PKS는 올리베톨 신타제(OLS) 또는 디바리놀 신타제이다. 본 개시내용의 추가 양태는 본 개시내용과 관련된 임의의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 개시내용의 추가 양태는 CBG 유형 칸나비노이드를 말단 신타제(TS)와 접촉시키는 단계를 포함하는, 칸나비노이드를 생성하는 방법에 관한 것으로, 여기서 TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CBG 유형 칸나비노이드를 TS와 접촉시키는 단계는 시험관내에서 발생한다. 일부 구현예에서, CBG 유형 칸나비노이드를 TS와 접촉시키는 단계는 생체내에서 발생한다. 일부 구현예에서, CBG 유형 칸나비노이드를 TS와 접촉시키는 단계는 숙주 세포에서 발생한다. 본 개시내용의 추가 양태는 칸나비노이드 생성 방법에 관한 것으로, CBG 유형 칸나비노이드를 CBD 유형 칸나비노이드, THC 유형 칸나비노이드 또는 둘 모두와 비교하여 CBG 유형 칸나비노이드를 CBC 유형 칸나비노이드로 우선적으로 전환하도록 적응된 산화적 고리화 촉매와 생체내에서 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 칸나비노이드는 CBG 유형 칸나비노이드의 고리화 생성물이다. 일부 구현예에서, 칸나비노이드는 고리화된 프레닐 모이어티를 갖는 칸나비노이드이다. 일부 구현예에서, 칸나비노이드는 CBC 유형 칸나비노이드, CBD 유형 칸나비노이드, 또는 THC 유형 칸나비노이드이다. 일부 구현예에서, 칸나비노이드는 CBC 유형 칸나비노이드이다. 일부 구현예에서, CBG 유형 칸나비노이드는 칸나비게롤산이다. 일부 구현예에서, CBC 유형 칸나비노이드는 CBCA이다. 일부 구현예에서, TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나의 서열 또는 이의 보존적으로 치환된 버전을 포함한다.
본 개시내용의 추가 양태는 CBG 유형 칸나비노이드, 및 CBG 유형 칸나비노이드, THC 유형 칸나비노이드, 또는 둘 모두와 비교하여 CBG 유형 칸나비노이드를 CBC 유형 칸나비노이드로 우선적으로 전환하도록 CBG 유형 칸나비노이드의 산화적 고리화를 촉매하는 수단을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 개시내용의 추가 양태는 CBG 유형 칸나비노이드, 및 CBG 유형 칸나비노이드, THC 유형 칸나비노이드, 또는 둘 모두와 비교하여 CBG 유형 칸나비노이드를 CBC 유형 칸나비노이드로 우선적으로 전환되도록 적응된 산화적 고리화 촉매를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, CBC 유형 칸나비노이드를 생성하기 위해 CBG 유형 칸나비노이드의 산화적 고리화를 촉매하는 수단은 말단 신타제(TS)를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드이고, 여기서 TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열 또는 이의 보존적으로 치환된 버전을 포함한다. 일부 구현예에서, TS는 또한 THCA, THCVA 또는 CBDA를 생성할 수 있다.
본 개시내용의 추가 양태는 말단 신타제(TS)를 코딩하는 비-자연 발생 핵산에 관한 것으로, 여기서 비-자연 발생 핵산은 서열번호 26, 28, 35, 42, 56, 60, 64, 74, 85, 89, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 및 102 중 어느 하나와 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 본 개시내용의 추가 양태는 본 개시내용과 관련된 비-자연 발생 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 개시내용의 추가 양태는 본 개시내용과 관련된 비-자연 발생 핵산을 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다. 본 개시내용의 추가 양태는 본 개시내용과 관련된 비-자연 발생 핵산, 벡터, 또는 발현 카세트로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
본 개시내용의 추가 양태는 칸나비노이드를 생성하기 위한 생물반응기에 관한 것으로, 여기서 생물반응기는 CBG 유형 칸나비노이드 및 말단 신타제(TS)를 포함하고, 여기서 TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나, TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나의 보존적으로 치환된 버전을 포함한다.
본 개시내용의 추가 양태는 비-자연 발생 말단 신타제(TS)에 관한 것으로, 여기서 TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열을 포함한다.
본 개시내용의 추가 양태는 THC 유형 화합물 또는 CBD 유형 화합물과 비교하여 생체내에서 CBG 유형 칸나비노이드를 CBC 유형 화합물로 우선적으로 전환하도록 적응된 산화적 고리화 촉매에 관한 것이다.
본 발명의 각각의 제한은 본 발명의 다양한 구현예를 포함할 수 있다. 따라서, 어느 하나의 요소 또는 요소들의 조합을 포함하는 본 발명의 각각의 제한이 본 발명의 각각의 양태에 포함될 수 있음이 예상된다. 본 개시내용은 하기의 설명에 기재되거나 도면에 도시된 구성의 세부사항 및 구성요소의 배열에 대한 이의 적용에 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 구현예가 가능하고 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본 출원에서 사용되는 어구 및 용어는 설명을 위한 것이며 제한적으로 간주되어서는 안된다. "포함하는(including)", "포함하는(comprising)" 또는 "갖는(having)", "함유하는(containing)", "수반하는(involving)" 및 이들의 변형의 사용은 이후에 나열된 항목 및 이의 등가물뿐만 아니라 추가 항목을 포함하는 것을 의미한다.
첨부된 도면은 축척에 맞추어 그리려고 한 게 아니다. 도면에서, 다양한 도면에 도시된 동일하거나 거의 동일한 구성요소는 유사한 번호로 나타낸다. 명확성을 위해, 모든 구성요소가 모든 도면에서 표시될 수 있는 것은 아니다. 도면에서:
도 1은 (R1a) 아실 활성화 효소(AAE); (R2a) 올리베톨 신타제 효소(OLS); (R3a) 올리베톨산 사이클라제 효소(OAC); (R4a) 프레닐트랜스퍼라제 효소(PT); 및 (R5a) 말단 신타제 효소(TS)에 의해 매개되는 5개의 효소 단계를 포함하는 칸나비노이드 화합물의 생성을 위한 천연 대마초 생합성 경로를 도시하는 개략도이다. 화학식 1a-11a는 헥산산(1a), 헥사노일-CoA(2a), 말로닐-CoA(3a), 3,5,7-트리옥소도데카노일-CoA(4a), 올리베톨(5a), 올리베톨산(6a), 게라닐 피로포스페이트(7a), 칸나비게롤산(8a), 칸나비디올산(9a), 테트라하이드로칸나비놀산(10a), 및 칸나비크로멘산(11a)에 상응한다. 헥산산은 예시적인 카복실산 기질이고; 다른 카복실산도 사용될 수 있다(예를 들어, 부티르산, 이소발레르산, 옥탄산, 데칸산 등; 예를 들어, 하기 도 3 참조). 3,5,7-트리옥소도데카노일-CoA 및 올리베톨산의 합성을 촉매하는 효소는 각각 R2a 및 R3a에 나타내고, 3,5,7-트리옥소도데카노일-CoA 및 올리베톨산의 합성을 촉매하는 다기능 효소를 포함할 수 있다. 칸나비디올산, 테트라하이드로칸나비놀산, 및 칸나비크로멘산의 합성을 각각 촉매하는 효소 칸나비디올산 신타제(CBDAS), 테트라하이드로칸나비놀산 신타제(THCAS), 및 칸나비크로멘산 신타제(CBCAS)를 단계 R5a에 나타낸다. 도 1은 문헌(Carvalho et al. "Designing Microorganisms for Heterologous Biosynthesis of Cannabinoids" (2017) FEMS Yeast Research Jun 1;17(4))으로부터 적응되며 상기 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다.
도 2는 (R1) 아실 활성화 효소(AAE); (R2) 폴리케타이드 신타제 효소(PKS) 또는 이기능성 폴리케타이드 신타제-폴리케타이드 사이클라제 효소(PKS-PKC); (R3) 폴리케타이드 사이클라제 효소(PKC) 또는 이기능성 PKS-PKC 효소; (R4) 프레닐트랜스퍼라제 효소(PT); 및 (R5) 말단 신타제 효소(TS)에 의해 매개되는 5개의 효소 단계를 포함하는 칸나비노이드 화합물의 생성을 위한 이종 생합성 경로를 도시하는 개략도이다. 다양한 사슬 길이, 구조(예를 들어, 지방족, 지환족, 또는 방향족) 및 기능화(예를 들어, 하이드록실-, 케토-, 아미노-, 티올-, 아릴-, 또는 알로게노-)의 임의의 카복실산이 또한 전구체 기질(예를 들어, 티오프로피온산, 하이드록시 페닐 아세트산, 노르류신, 브로모데칸산, 부티르산, 이소발레르산, 옥탄산, 데칸산 등)로서 사용될 수 있다.
도 3은 도 2의 칸나비노이드 경로에 대한 선택된 추정 전구체의 비배타적 표현이다.
도 4는 칸나비게롤산(화학식 (8a))의 게라닐 모이어티가 고리화되어 칸나비디올산, 테트라하이드로칸나비놀산, 또는 칸나비크로멘산을 생성하는 TS 효소에 의해 촉매되는 반응을 나타내는 개략도이다.
도 5는 TS를 코딩하는 전사 단위를 보유하는 플라스미드를 나타내는 개략도이다. TS 효소에 대한 코딩 서열("라이브러리 유전자"로 표시됨)은 GAL1 프로모터에 의해 구동되었다. 각각의 TS 효소는 N-말단 융합된 에스. 세레비지아에 교배 인자 알파 2 신호 펩티드("MFα2"로 표시됨) 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드("LDEL"로 표시됨)를 보유했다.
도 6은 에스. 세레비지아에에서 생체내 활성 검정에 기초한 CBCA 생성에 대한 2차 스크리닝 데이터를 나타내는 그래프를 도시한다. N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하는 아스페르길루스 니제르(Aspergillus niger)(에이. 니제르) CBCAS를 발현하는 하나의 라이브러리 균주인 균주 t619896은 CBCA를 생성하는 것으로 관찰되었다. GFP를 발현하는 균주 t616313은 음성 대조군으로 사용되었다. N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하는 씨. 사티바(C. sativa) THCAS를 발현하는 균주 t616315는 THCAS 활성뿐만 아니라 CBCAS 활성을 나타내는 것으로 관찰되었기 때문에 양성 대조군으로서 사용되었다. 데이터는 4개의 생물학적 복제물의 평균 ± 평균에 대한 표준 편차 1을 나타낸다. 이러한 그래프로부터의 균주 ID 및 이들의 상응하는 활성을 표 5에 나타낸다.
도 7은 라이브러리 균주 t619896에 의한 에스. 세레비지아에에서의 생체내 활성 검정에 기초한 CBCVA의 생성을 나타내는 그래프를 도시한다. 데이터는 4개의 생물학적 복제물의 평균 ± 평균에 대한 표준 편차 1을 나타낸다. 이러한 그래프로부터 균주 ID 및 이들의 상응하는 활성을 표 6에 나타낸다.
도 8a-8c는 에스. 세레비지아에에서 생체내 활성 검정에 기초한 CBCA, THCA, 및 CBDA 생성에 대한 TS 변이체의 라이브러리의 2차 스크리닝 데이터를 나타내는 그래프를 도시한다. N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하는, 씨. 사티바 THCAS를 발현하는 균주 t865843은 THCAS 활성에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하는, 실시예 1에서 확인된 에이. 니제르 CBCAS를 발현하는 균주 t865768은 CBCAS 활성에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하는, 씨. 사티바 CBDAS를 발현하는 균주 t876607은 CBDAS 활성에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. GFP를 발현하는 균주 t865842는 음성 대조군으로 사용되었다. 모든 라이브러리 균주는 N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하였다. 도 8a는 CBCA 생성을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 8b는 THCA 생성을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 8c는 CBDA 생성을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 8a-8c에 도시된 균주 및 이들의 상응하는 활성을 표 8에 나타낸다.
도 9a-9c는 에스. 세레비지아에에서 생체내 활성 검정에 기초한 칸나비크로메바린산(CBCVA), 테트라하이드로칸나비바린산(THCVA), 및 칸나비디바린산(CBDVA) 생성에 대한 TS 변이체의 라이브러리의 2차 스크리닝 데이터를 나타내는 그래프를 도시한다. N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하는, 씨. 사티바 THCAS를 발현하는 균주 t865843은 THCVAS 활성에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하는, 실시예 1에서 확인된 에이. 니제르 CBCAS를 발현하는 균주 t865768은 CBCVAS 활성에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하는, 씨. 사티바 CBDAS를 발현하는 균주 t876607은 CBDVAS 활성에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. GFP를 발현하는 균주 t865842는 음성 대조군으로 사용되었다. 모든 라이브러리 균주는 N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하였다. 도 9a는 CBCVA 생성을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 9b는 THCVA 생성을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 9c는 CBDVA 생성을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 9a-9c에 도시된 균주 및 이들의 상응하는 활성을 표 9에 나타낸다.
도 10a-10c는 에스. 세레비지아에에서 생체내 활성 검정에 기초한 CBCA, THCA, 및 CBDA 생성에 대한 실시예 3에서 확인된 후보 CBCAS 효소의 2차 스크리닝 활성 데이터를 나타내는 그래프를 도시한다. N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하는, 실시예 1에서 확인된 에이. 니제르 CBCAS를 발현하는 균주 t807925는 CBCAS 활성에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. GFP를 발현하는 균주 t616313은 음성 대조군으로 사용되었다. 대마초 CBDAS를 발현하는 균주 t616314는 CBDAS 활성에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. 대마초 THCAS를 발현하는 균주 t701870은 THCAS 활성에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. 모든 라이브러리 균주 및 양성 대조군 균주는 N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함한다. 데이터는 4개의 생물학적 복제물의 평균 ± 평균에 대한 표준 편차 1을 나타낸다. 도 10a는 CBCA 생성을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 10b는 THCA 생성을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 10c는 CBDA 생성을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 10a-10c에 도시된 균주 및 이들의 상응하는 활성을 표 10에 나타낸다.
도 11a-11c는 에스. 세레비지아에에서 생체내 활성 검정에 기초한 CBCVA, THCVA, 및 CBDVA 생성에 대한 실시예 3에서 확인된 후보 CBCAS 효소의 2차 스크리닝 활성 데이터를 나타내는 그래프를 도시한다. N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하는, 실시예 1에서 확인된 에이. 니제르 CBCAS를 발현하는 균주 t807925는 양성 대조군으로 사용되었다. GFP를 발현하는 균주 t616313은 음성 대조군으로 사용되었다. 대마초 CBDAS를 발현하는 균주 t616314는 양성 대조군으로 사용되었다. 대마초 THCAS를 발현하는 균주 t701870은 양성 대조군으로 사용되었다. 모든 라이브러리 균주 및 양성 대조군 균주는 N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하였다. 데이터는 4개의 생물학적 복제물의 평균 ± 평균에 대한 표준 편차 1을 나타낸다. 도 11a는 CBCVA 생성을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 11b는 THCVA 생성을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 11c는 CBDVA 생성을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 11a-11c에 도시된 균주 및 이들의 상응하는 활성을 표 11에 나타낸다.
도 12a-12b는 에스. 세레비지아에에서 생체내 활성 검정에 기초한 실시예 3에서 확인된 후보 CBCAS 효소에 의한 CBGA 및 CBGVA의 기질 이용을 나타내는 그래프를 도시한다. N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하는, 실시예 1에서 확인된 에이. 니제르 CBCAS를 발현하는 균주 t807925는 양성 대조군으로 사용되었다. GFP를 발현하는 균주 t616313은 음성 대조군으로서 사용되었다. 모든 라이브러리 균주는 N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하였다. 데이터는 4개의 생물학적 복제물의 평균 ± 평균에 대한 표준 편차 1을 나타낸다. 도 12a는 CBGA 기질 이용을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 12b는 CBGVA 기질 이용을 나타내는 그래프를 도시한다. 도 12a-12b에 도시된 균주 및 이들의 상응하는 활성을 표 12에 나타낸다.
도 13은 실시예 3 및 4에서 확인된 후보 CBCAS 효소의 동일성 매트릭스 백분율을 도시한다. 맨 왼쪽 열과 맨 위 행은 특정 효소에 상응하는 서열 번호를 나열한다. 서열번호 27은 에이. 니제르로부터 UniProt 수탁 번호 A0A254UC34와 관련된 단백질 서열에 상응한다. 서열번호 144는 아마니타 무스카리아(Amanita muscaria)로부터의 UniProt 수탁 번호 A0A0C2SDS1과 관련된 단백질 서열에 상응하고; 서열번호 172는 페니실리움 루벤스(Penicillium rubens)로부터의 UniProt 수탁 번호 B6HV04와 관련된 단백질 서열에 상응하고; 서열번호 166은 아스페르길루스 테레우스(spergillus terreus)로부터의 UniProt 수탁 번호 Q0CYD9와 관련된 단백질 서열에 상응하고; 서열번호 159는 아스페르길루스 투르코수스(Aspergillus turcosus)로부터의 UniProt 수탁 번호 A0A397IKU4와 관련된 단백질 서열에 상응하고; 서열번호 167은 아스페르길루스 우다가와에(Aspergillus udagawae)로부터의 UniProt 수탁 번호 A0A0K8LLN9와 관련된 단백질 서열에 상응하고; 서열번호 163은 아스페르길루스 노보푸미가투스(Aspergillus novofumigatus)로부터의 UniProt 수탁 번호 A0A2I1CBC7과 관련된 단백질 서열에 상응하고; 서열번호 165는 아스페르길루스 니제르로부터의 UniProt 수탁 번호 G3Y7J1과 관련된 단백질 서열에 상응하고; 서열번호 162는 아스페르길루스 락티코페아투스(Aspergillus lacticoffeatus)로부터의 UniProt 수탁 번호 A0A319AGI5와 관련된 단백질 서열에 상응하고; 서열번호 164는 아스페르길루스 웰위치아에(Aspergillus welwitschiae)로부터의 UniProt 수탁 번호 A0A3F3PQ52와 관련된 단백질 서열에 상응하고; 서열번호 134는 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori)로부터의 UniProt 수탁 번호 A0A401KY63과 관련된 단백질 서열에 상응하고; 서열번호 105는 아스페르길루스 튜빙겐시스(Aspergillus tubingensis)로부터의 UniProt 수탁 번호 A0A1L9NII2와 관련된 단백질 서열에 상응하고; 서열번호 126은 아스페르길루스 네오니제르(Aspergillus neoniger)로부터의 UniProt 수탁 번호 A0A318Y6S9와 관련된 단백질 서열에 상응하고; 서열번호 155는 아스페르길루스 바덴시스(Aspergillus vadensis)로부터의 UniProt 수탁 번호 A0A319B6X5와 관련된 단백질 서열에 상응하고; 서열번호 112는 아스페르길루스 노미아에(Aspergillus nomiae)로부터의 UniProt 수탁 번호 A0A0L1J4J1과 관련된 단백질 서열에 상응하고; 서열번호 130은 아스페르길루스 오리자에(Aspergillus oryzae)로부터의 UniProt 수탁 번호 Q2UF91과 관련된 단백질 서열에 상응한다. 매트릭스의 각 셀에 있는 값은 상응하는 X 및 Y 축의 효소의 아미노산 서열 간의 동일성 백분율이다. 동일성이 100%인 셀은 흰색 텍스트와 함께 검은색으로 음영처리되고 동일성이 95-99.99%인 셀은 회색으로 음영처리된다.
도 14는 에스. 세레비지아에에서 생체내 활성 검정에 기초한 CBCA 생성에 대한 실시예 3에서 확인된 후보 CBCAS 효소의 2차 스크리닝 활성 데이터를 나타내는 그래프를 도시한다. N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하는, 실시예 1에서 확인된 에이. 니제르 CBCAS("AnCBCAS"로 지칭됨)를 발현하는 균주 861555는 양성 대조군으로 사용되었다. 균주 861565는 실시예 1에서 확인된 에이. 니제르 CBCAS("AnCBCAS"로 지칭됨)를 발현하지만 N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드는 제외된다. 모든 라이브러리 균주는 N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 포함하는 하나의 균주 및 N-말단 융합된 MFα2 신호 펩티드 및 C-말단 융합된 HDEL 신호 펩티드를 제외한 다른 균주와 쌍으로 검정되었다. 데이터는 4개의 생물학적 복제물의 평균 ± 평균에 대한 표준 편차 1을 나타낸다. 도 14에 도시된 균주 및 이들의 상응하는 활성을 표 13에 나타낸다.
도 15는 CBCA를 생성하는 데 효과적인 것으로 밝혀진 후보 비-대마초 CBCAS가 풍부한 것으로 확인된 서열 모티프의 대마초 TS의 3차원 구조 내의 예측된 위치를 도시하는 리본 다이어그램이다. 화살표로 나타낸 서열 모티프 KVQARSGGH(서열번호 174), CPTI[KR]TGGH(서열번호 181), 및 P[IV]S[DQE]TTY[EDG]F[TA]DGLYDVLA[RQK]AVPES[VA]GHAYLGCPDP[RK]M(서열번호 186)은 보조인자 결합 부위와 접촉할 것으로 예측된다.
도 16은 CBCA를 생성하는 데 효과적인 것으로 밝혀진 후보 비-대마초 CBCAS가 풍부한 것으로 확인된 서열 모티프의 대마초 TS의 3차원 구조 내의 예측된 위치를 도시하는 리본 다이어그램이다. TS의 활성 부위는 짙은 회색으로 나타낸다. FAD 보조인자는 다이어그램의 오른쪽에 막대로 나타낸다. 도면의 중앙에 나타낸 삼각형 보이드가 기질 결합 부위이다. 화살표로 나타낸 모티프 RT[EQ][PQ]APGLAVQYSY(서열번호 207) 및 WQ[SA]FI[SA][AQ][KE]NLT[RW][QK]FY[NST]NM(서열번호 211)은 기질 결합 포켓 근처에 있을 것으로 예측된다.
상세한 설명
본 개시내용은 유전적으로 변형된 숙주 세포를 사용하여 지방산 기질로부터 칸나비노이드 및 칸나비노이드 전구체를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 칸나비크로멘산 신타제(CBCAS)와 같은 말단 신타제(TS)의 이종 발현을 포함한다. 본 출원에는 에스. 세레비지아에와 같은 숙주 세포에서 기능적으로 발현될 수 있는 TS가 기재되어 있다. 실시예에 입증된 바와 같이, THCA, THCVA 및 CBDA와 같은 다른 TS 생성물뿐만 아니라 숙주 세포에서 칸나비크로멘산(CBCA) 및 칸나비크로메바린산(CBCVA)을 생성할 수 있는 다수의 비-대마초 CBCAS가 확인되었다. 본 개시내용에 기재된 TS는, 예를 들어, 이러한 효소의 활성 및/또는 풍부도를 변경함으로써 칸나비노이드 생성의 효율 및 순도를 증가시키는 데 유용할 수 있다.
정의
하기 용어들은 당업자에 의해 잘 이해되는 것으로 여겨지지만, 하기 정의는 개시된 주제에 대한 설명을 용이하게 하기 위해 기재되어 있다.
용어 "a" 또는 "an"은 하나 이상의 개체를 지칭하는데, 즉, 지시 대상을 복수로 식별할 수 있다. 따라서, 용어 "a" 또는 "an", "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 출원에서 상호교환적으로 사용된다. 또한, 부정 관사 "a" 또는 "an"에 의한 "요소"에 대한 언급은 문맥상 요소가 하나이거나 하나만이 존재하도록 명확하게 요구하지 않는 한, 하나 초과의 요소가 존재할 가능성을 배제하지 않는다.
용어 "미생물(microorganism)" 또는 "미생물(microbe)"은 널리 받아들여져야 한다. 이러한 용어는 상호교환적으로 사용되며 2개의 원핵생물 도메인인 박테리아 및 고세균뿐만 아니라 특정 진핵생물 진균 및 원생생물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 존재하는 목록/표 및 도면의 "미생물(microorganism)" 또는 "미생물(microbe)"을 지칭할 수 있다. 이러한 특성확인은 표와 도면의 확인된 분류학적 속뿐만 아니라 확인된 분류학적 종뿐만 아니라 표 또는 도면에 있는 임의의 유기체의 신규한 그리고 새로 확인되거나 설계된 다양한 균주를 참조할 수 있다. 동일한 특성확인은 실시예에서와 같이 명세서의 다른 부분에서 이러한 용어를 인용하는 경우에도 마찬가지이다.
용어 "원핵생물"은 당업계에서 인식되고 핵 또는 다른 세포 소기관을 포함하지 않는 세포를 지칭한다. 원핵생물은 일반적으로 박테리아 및 고세균이라는 두 도메인 중 하나로 분류된다.
"박테리아" 또는 "진정박테리아"는 원핵생물 유기체의 도메인을 지칭한다. 박테리아는 다음과 같이 적어도 11개의 별개의 군을 포함한다: (1) 그람-양성 (그람+) 박테리아로, 그 중 2개의 주요 하위분류가 있다: (a) 높은 G+C 군(액티노마이세티스(Actinomycetes), 마이코박테리아(Mycobacteria), 마이크로코커스(Micrococcus) 등) 및 (b) 낮은 G+C 군(바실러스(Bacillus), 클로스트리디아(Clostridia), 락토바실러스(Lactobacillus), 스타필로코시(Staphylococci), 스트렙토코시(Streptococci), 마이코플라스마(Mycoplasmas)); (2) 프로테오박테리아, 예를 들어, 보라색 광합성+비-광합성 그람-음성 박테리아(대부분의 "일반적인" 그람-음성 박테리아 포함); (3) 시아노박테리아, 예를 들어, 산소 광영양체(oxygenic phototroph); (4) 스피로케테스(Spirochetes) 및 관련 종; (5) 플랑토마이세스; (6)　박테로이데스(Bacteroides), 플라보박테리아(Flavobacteria);　(7)　클라미디아(Chlamydia); (8) 녹색 황 박테리아; (9) 녹색 비-황 박테리아(또한 혐기성 광영양체); (10) 방사선저항성 미세구균 및 동족류; 및 (11) 써모토가(Thermotoga) 및 써모시포 써모필레스(Thermosipho thermophiles).
용어 "고세균"은 생리학 및 계통발생학에서 박테리아와 구별되게 만드는 특정 특성을 갖는 원핵생물 유기체의 분류학적 분류를 지칭한다.
용어 "대마초"는 대마초과의 속을 지칭한다. 대마초는 이가(dioecious) 식물이다. 트리콤(trichomes)으로 불리는 대마초의 암꽃에 위치한 선 구조물(glandular structure)은 파이토칸나비노이드(아래에서 더 자세히 기재되어 있음)로 공지된 테르페노-페놀 화합물 부류의 비교적 많은 양을 축적한다. 대마초는 통상적으로 섬유질 및 종자 생산(일반적으로 "대마(hemp) 유형"으로 지칭됨) 또는 취화제(intoxicant) 생산(일반적으로 "약물 유형"으로 지칭됨)을 위해 재배되었다. 약물 유형의 대마초에서, 트리콤은 상대적으로 많은 양의 테트라하이드로칸나비놀산(THCA)을 포함하고 있으며, 이는, 예를 들어, 말린 대마초 꽃의 연소 시 탈카복실화 반응을 통해 테트라하이드로칸나비놀(THC)로 전환되어 중독 효과(intoxicating effect)를 제공할 수 있다. 약물 유형 대마초는 종종 다른 칸나비노이드를 더 적은 양으로 함유한다. 대조적으로, 대마 유형(heme-type) 대마초는 건조 중량 기준으로 THC가 종종 0.3% 미만인 비교적 낮은 농도의 THCA를 함유한다. 대마 유형 대마초는 칸나비디올산(CBDA), 칸나비디올(CBD) 및 기타 칸나비노이드와 같은 비-THC 및 비-THCA 칸나비노이드를 함유할 수 있다. 현재, 속 내의 종의 분류학적 조직에 대한 합의가 부족하다. 문맥에 달리 지시하지 않는 한, 용어 "대마초"는 대마초가 대마 유형 또는 약물 유형인지 여부와 관계없이, 제한 없이 대마초 사티바(Cannabis sativa), 대마초 인디카(Cannabis indica) 및 대마초 루데랄리스(Cannabis ruderalis)와 같은 속 내의 모든 추정 종을 포함하도록 의도된다.
폴리케타이드 신타제(PKS) 효소(예를 들어, 올리베톨 신타제(OLS) 효소) 또는 폴리케타이드 사이클라제(PKC) 효소(예를 들어, 올리베톨산 사이클라제(OAC) 효소)와 관련하여 용어 "사이클라제 활성"은 상응하는 분자내 고리화 생성물(예를 들어, 올리베톨산, 디바린산)에 대한 옥소 지방 아실-CoA(예를 들어, 3,5,7-트리옥소도데카노일-COA, 3,5,7-트리옥소데카노일-COA)의 고리화를 촉매하는 활성을 지칭한다. 일부 구현예에서, PKS 또는 PKC는 3개의 추가 케타이드 모이어티가 이에 부가된 아실-COA의 C2-C7 알돌 축합을 촉매한다.
"세포질" 또는 "가용성" 효소는 숙주 세포의 세포질에 우세하게 국소화된 (또는 국소화될 것으로 예상됨) 효소를 지칭한다.
"진핵생물"은 세포가 막 내에 둘러싸인 핵 및 기타 세포소기관을 포함하는 임의의 유기체이다. 진핵생물(Eukaryotes)은 분류군 진핵생물류(Eukarya) 또는 진핵생물(Eukaryota)에 속한다. 진핵생물 세포를 원핵생물 세포(즉, 박테리아 및 고세균)와 구별하는 정의적인 특징은 그들이 막에 결합된 세포소기관, 특히 유전 물질을 포함하고 핵 외피로 둘러싸여 있는 핵을 갖는다는 것이다.
용어 "숙주 세포"는 칸나비노이드 또는 칸나비노이드 전구체의 생합성에 사용되는 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드를 발현하는 데 사용될 수 있는 세포를 지칭한다. 용어 "유전적으로 변형된 숙주 세포", "재조합 숙주 세포" 및 "재조합 균주"는 상호교환적으로 사용되며, 예를 들어, 클로닝 및 형질전환 방법, 또는 당업계에 공지된 다른 방법(예를 들어, CRISPR과 같은 선택적 편집 방법)에 의해 유전적으로 변형된 숙주 세포를 지칭한다. 따라서, 상기 용어는 유전적으로 변경, 변형 또는 조작된 숙주 세포(예를 들어, 박테리아 세포, 효모 세포, 진균 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 세포, 인간 세포 등)를 포함하여 그것이 유래된 자연 발생 세포와 비교하여 변경, 변형 또는 상이한 유전자형 및/또는 표현형을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 용어는 해당 특정 재조합 숙주 세포뿐만 아니라 이러한 숙주 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하는 것으로 이해된다.
용어 "대조군 숙주 세포" 또는 숙주 세포와 관련하여 사용될 때 용어 "대조군"은 유전자 변형 또는 실험적 치료의 효과를 결정하기 위한 적절한 대조 숙주 세포를 지칭한다. 일부 구현예에서, 대조군 숙주 세포는 야생형 세포이다. 다른 구현예에서, 대조군 숙주 세포는 유전적으로 변형된 또는 실험적 처리 숙주 세포를 구별하는 유전자 변형(들)을 제외하고는 유전적으로 변형된 숙주 세포와 유전적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 대조군 숙주 세포는 다른 시험 숙주 세포에서 활성에 대해 시험되는 효소의 야생형 또는 달리 공지된 변이체를 발현하도록 유전적으로 변형되었다.
유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드와 관련하여 용어 "이종"은 용어 "외인성" 및 용어 "재조합"과 상호교환적으로 사용되며, 생물학적 시스템에 인위적으로 공급된 폴리뉴클레오티드; 생물학적 시스템 내에서 변형된 폴리뉴클레오티드; 또는 발현 또는 조절이 생물학적 시스템 내에서 조작된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 숙주 세포에 도입되거나 이에서 발현되는 이종 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포와 상이한 유기체 또는 종으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드일 수 있거나, 합성 폴리뉴클레오티드일 수 있거나, 또한 숙주 세포와 동일한 유기체 또는 종에서 내인성으로 발현되는 폴리뉴클레오티드 일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포에서 내인성으로 발현되는 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 비자연적으로 위치되거나; 안정적이거나 일시적으로 숙주 세포에서 재조합적으로 발현되거나; 숙주 세포 내에서 변형되거나; 숙주 세포 내에서 선택적으로 편집되거나; 숙주 세포 내에서 자연적으로 발생하는 카피 수와 상이한 카피 수로 표현되거나; 예컨대 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하는 조절 영역을 조작함으로써 숙주 세포 내에서 비천연 방식으로 발현되는 경우 이종성인 것으로 간주될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 내인성으로 발현되지만 이의 발현이 폴리뉴클레오티드의 발현을 자연적으로 조절하지 않는 프로모터에 의해 구동되는 폴리뉴클레오티드이다. 다른 구현예에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 내인성으로 발현되고 이의 발현이 폴리뉴클레오티드의 발현을 자연적으로 조절하는 프로모터에 의해 구동되지만 프로모터 또는 또 다른 조절 영역이 변형된 폴리뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 재조합적으로 활성화되거나 억제된다. 예를 들어, 유전자 편집 기반 기술은 내인성 프로모터를 포함하는 프로모터로부터 내인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Chavez et al., Nat Methods. 2016 Jul; 13(7): 563-567)을 참조한다. 이종 폴리뉴클레오티드는 참조 폴리뉴클레오티드 서열과 비교하여 야생형 서열 또는 돌연변이 서열을 포함할 수 있다.
핵산 또는 폴리펩티드의 "적어도 부분" 또는 "적어도 단편"이라는 용어는 이러한 서열의 최소 크기 특징을 갖는 부분, 또는 전장 분자 이하의 전장 분자의 임의의 더 큰 단편을 의미한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드의 단편은 촉매 도메인과 같은 효소의 생물학적 활성 부분을 코딩할 수 있다. 유전자 조절 요소의 생물학적 활성 부분은 전장 유전자 조절 요소의 일부 또는 단편을 포함할 수 있고, 전장 유전자 조절 요소와 동일한 유형의 활성을 갖지만, 유전자 조절 요소의 생물학적 활성 부분의 활성 수준은 전장 유전자 조절 요소의 활성 수준에 비해 다양할 수 있다.
코딩 서열 및 조절 서열은 코딩 서열 및 조절 서열이 공유적으로 연결되어 코딩 서열의 발현 또는 전사가 조절 서열의 영향 또는 제어 하에 있을 때 "작동적으로 연결(joined)" 또는 "작동적으로 연결(linked)"되어 있다고 한다. 코딩 서열이 기능성 단백질로 번역되어야 하는 경우, 코딩 서열 및 조절 서열은 5' 조절 서열에서 프로모터의 유도가 코딩 서열의 전사를 촉진한다면, 그리고 코딩 서열과 조절 서열 간의 연결 성질이 (1) 프레임-시프트 돌연변이의 도입을 초래하지 않거나, (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나, (3) 단백질로 번역되려는 상응하는 RNA 전사체의 능력을 방해하지 않는다면, 코딩 서열과 조절 서열이 작동 가능하게 연결되어 있다고 한다
용어 "연결(link)", "연결된(linked)" 또는 "연결(linkage)"은 2개의 개체(예를 들어, 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 단백질)가 임의의 물리화학적 수단에 의해 서로 결합됨을 의미한다. 공유 또는 비공유의 당업자에게 공지된 임의의 연결이 포함된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 효소를 코딩하는 핵산 서열은 신호 펩티드를 코딩하는 핵산에 연결된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 효소는 신호 펩티드에 연결된다. 연결은 직접적이거나 간접적일 수 있다.
숙주 세포와 관련하여 용어 "형질전환된" 또는 "형질전환"은 하나 이상의 핵산이, 예를 들어, 플라스미드 또는 벡터 상에서 또는 게놈으로의 통합에 의해 도입된 숙주 세포를 지칭한다. 하나 이상의 핵산이 플라스미드 또는 벡터 상의 숙주 세포 내로 도입되는 일부 경우에, 하나 이상의 핵산 또는 이의 단편은, 예컨대 세포의 게놈으로의 통합에 의해 세포에 보유될 수 있는 반면, 플라스미드 또는 벡터 자체는 세포로부터 제거될 수 있다. 이러한 경우에, 숙주 세포는 플라스미드 또는 벡터가 세포에 유지되는지 여부에 관계없이 세포에 도입된 핵산으로 형질전환된 것으로 간주된다.
용어 "부피 생산성" 또는 "생산율"은 단위 시간당 매질의 부피당 형성되는 생성물의 양을 지칭한다. 부피 생산성은 시간당 리터당 그램(g/L/h)으로 보고될 수 있다.
생성물의 "비생산성(specific productivity)"이라는 용어는 단위 부피 또는 매쓰 또는 바이오매쓰로 정규화된 생성물의 형성률을 지칭하며, 단위 매쓰 또는 부피당 단위 시간당 물질의 양의 물리적 치수를 갖는다[MㆍT-1ㆍM-1 또는 MㆍT-1ㆍL-3, 여기서 M은 매쓰 또는 몰이고, T는 시간이고, L은 길이임].
용어 "바이오매쓰 비생산성"은 시간당 세포 건조 중량(CDW) 그램당 생성물 그램(g/g CDW/h) 또는 시간당 세포 건조 중량(CDW) 그램당 생성물 mmol(mmol/g CDW/h)의 비생산성을 지칭한다. 주어진 미생물에 대한 OD600에 대한 CDW의 관계를 사용하여, 비생산성은 시간당 600 nm에서 배양 브로쓰의 광학 밀도(OD)당 배양 배지 리터당 생성물 그램(g/L/h/OD)으로 표시될 수도 있다. 또한, 바이오매쓰의 원소 조성이 공지된 경우, 바이오매쓰 비생산성은 시간당 바이오매쓰의 C-몰(탄소 몰)당 생성물 mmol(mmol/C-mol/h)로 표시될 수 있다.
용어 "수율"은 특정 기질의 단위 중량당 수득되는 생성물의 양을 지칭하며, 기질 g당 생성물 g(g/g) 또는 기질 몰당 생성물 몰(mol/mol)로 표시될 수 있다. 수율은 이론적 수율의 백분율로 표시될 수도 있다. "이론적 수율"은 생성물을 만드는 데 사용되는 대사 경로의 화학량론에 의해 지시되는 바와 같이 기질의 주어진 양당 생성될 수 있는 생성물의 최대량으로 정의되며, 기질 g당 생성물 g(g/g) 또는 기질 몰당 생성물 몰(mol/mol)로 표시될 수 있다.
용어 "역가"는 용액의 강도 또는 용액 중의 물질의 농도를 지칭한다. 예를 들어, 발효 브로쓰 중의 관심 생성물(예를 들어, 소분자, 펩티드, 합성 화합물, 연료, 알코올 등)의 역가는 발효 브로쓰 또는 무세포 브로쓰의 리터당 용액 중의 관심 생성물의 g(g/L)으로 또는 발효 브로쓰 또는 무세포 브로쓰의 kg당 용액 중의 관심 생성물의 g(g/Kg)으로 기재된다.
용어 "총 역가"는, 공정에서의 초기 부피 또는 공정에서의 작동 부피에 비해 용액 중의 관심 생성물, 해당되는 경우 가스상의 관심 생성물, 및 공정으로부터 제거되고 회수되는 임의의 관심 생성물을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 공정에서 생성되는 모든 관심 생성물의 합을 지칭한다. 예를 들어, 발효 브로쓰 중의 관심 생성물(예를 들어, 소분자, 펩티드, 합성 화합물, 연료, 알코올 등)의 총 역가는 발효 브로쓰 또는 무세포 브로쓰의 리터당 용액 중의 관심 생성물의 g(g/L)으로 또는 발효 브로쓰 또는 무세포 브로쓰의 kg당 용액 중의 관심 생성물의 g(g/Kg)으로 기재된다.
용어 "아미노산"은 아미노 기인 -NH2 및 카복실 기인 -COOH를 포함하는 유기 화합물을 지칭한다. 용어 "아미노산"은 자연 발생 아미노산과 비천연 아미노산 둘 모두를 포함한다. 20개의 일반적인 아미노산에 대한 명명법은 다음과 같다: 알라닌(ala 또는 A); 아르기닌(arg 또는 R); 아스파라긴(asn 또는 N); 아스파르트산(asp 또는 D); 시스테인(cys 또는 C); 글루타민(gln 또는 Q); 글루탐산(glu 또는 E); 글리신(gly 또는 G); 히스티딘(his 또는 H); 이소류신(ile 또는 I); 류신(leu 또는 L); 라이신(lys 또는 K); 메티오닌(met 또는 M); 페닐알라닌(phe 또는 F); 프롤린(pro 또는 P); 세린(ser 또는 S); 트레오닌(thr 또는 T); 트립토판(trp 또는 W); 티로신(tyr 또는 Y); 및 발린(val 또는 V). 비천연 아미노산의 비제한적인 예는 호모-아미노산, 프롤린 및 피루브산 유도체, 3-치환된 알라닌 유도체, 글리신 유도체, 고리-치환된 페닐알라닌 유도체, 고리-치환된 티로신 유도체, 선형 코어 아미노산, Fmoc, Boc, 및 CBz를 포함하는 보호기를 갖는 아미노산, β-아미노산(β3 및 β2), 및 N-메틸 아미노산을 포함한다.
용어 "지방족"은 알킬, 알케닐, 알키닐 및 카보사이클릭 기를 지칭한다. 마찬가지로, 용어 "헤테로지방족"은 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐 및 헤테로사이클릭 기를 지칭한다.
용어 "알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 포화 탄화수소 기의 라디칼 또는 치환기를 지칭한다("C1-20 알킬"). 특정 구현예에서, 용어 "알킬"은 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지형 포화 탄화수소 기의 라디칼 또는 치환기를 지칭한다("C1-10 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다("C1-9 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다("C1-8 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다("C1-7 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 2 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다("C2-7 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 3 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다("C3-7 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다("C1-6 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다("C2-6 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 3 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다("C3-5 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 5개의 탄소 원자를 갖는다("C5 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 3개의 탄소 원자를 갖는다("C3 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 7개의 탄소 원자를 갖는다("C7 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다("C1-5 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다("C1-4 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다("C1-3 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1 내지 2개의 탄소 원자를 갖는다("C1-2 알킬"). 일부 구현예에서, 알킬 기는 1개의 탄소 원자를 갖는다("C1 알킬").
C1-6 알킬 기의 예는 메틸(C1), 에틸(C2), 프로필(C3) (예를 들어, n-프로필, 이소프로필), 부틸(C4) (예를 들어, n-부틸, tert-부틸, sec-부틸, 이소-부틸), 펜틸(C5) (예를 들어, n-펜틸, 3-펜타닐, 아밀, 네오펜틸, 3-메틸-2-부타닐, 3차 아밀), 및 헥실(C6) (예를 들어, n-헥실)을 포함한다. 알킬 기의 추가 예는 n-헵틸(C7), n-옥틸(C8) 등을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 알킬 기의 각 경우는 독립적으로 비치환되거나("비치환된 알킬") 하나 이상의 치환기(예를 들어, 할로겐, 예컨대 F)로 치환된다("치환된 알킬"). 특정 구현예에서, 알킬 기는 비치환된 C1-10 알킬(예컨대, 비치환된 C1-6 알킬, 예를 들어, -CH3(Me), 비치환된 에틸(Et), 비치환된 프로필(Pr, 예를 들어, 비치환된 n-프로필(n-Pr), 비치환된 이소프로필(i-Pr)), 비치환된 부틸(Bu, 예를 들어, 비치환된 n-부틸(n-Bu), 비치환된 tert-부틸(tert-Bu 또는 t-Bu), 비치환된 sec-부틸(sec-Bu), 비치환된 이소부틸(i-Bu))이다. 특정 구현예에서, 알킬 기는 치환된 C1-10 알킬(예컨대, 치환된 C1-6 알킬, 예를 들어, -CF3, 벤질)이다.
용어 "아실"은 일반식 -C(=O)RX1, -C(=O)ORX1, -C(=O)-O-C(=O)RX1, -C(=O)SRX1, -C(=O)N(RX1)2, -C(=S)RX1, -C(=S)N(RX1)2, 및 -C(=S)S(RX1), -C(=NRX1)RX1, -C(=NRX1)ORX1, -C(=NRX1)SRX1, 및 -C(=NRX1)N(RX1)2를 갖는 기를 지칭하며, 여기서 RX1은 수소; 할로겐; 치환된 또는 비치환된 하이드록실; 치환된 또는 비치환된 티올; 치환된 또는 비치환된 아미노; 치환된 또는 비치환된 아실, 환형 또는 비환형, 치환된 또는 비치환된, 분지형 또는 비분지형 지방족; 환형 또는 비환형, 치환된 또는 비치환된, 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족; 환형 또는 비환형, 치환된 또는 비치환된, 분지형 또는 비분지형 알킬; 환형 또는 비환형, 치환된 또는 비치환된, 분지형 또는 비분지형 알케닐; 치환된 또는 비치환된 알키닐; 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 지방족옥시, 헤테로지방족옥시, 알킬옥시, 헤테로알킬옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 지방족티옥시, 헤테로지방족티옥시, 알킬티옥시, 헤테로알킬티옥시, 아릴티옥시, 헤테로아릴티옥시, 모노- 또는 디- 지방족아미노, 모노- 또는 디-헤테로지방족아미노, 모노- 또는 디-알킬아미노, 모노- 또는 디-헤테로알킬아미노, 모노- 또는 디-아릴아미노, 또는 모노- 또는 디-헤테로아릴아미노이거나; 2개의 RX1 기는 함께 취하여 5- 내지 6원 헤테로사이클릭 고리를 형성한다. 예시적인 아실 기는 알데하이드(-CHO), 카복실산(-CO2H), 케톤, 아실 할라이드, 에스테르, 아미드, 이민, 카보네이트, 카바메이트, 및 우레아를 포함한다. 아실 치환기는 안정한 모이어티(예를 들어, 지방족, 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로지방족, 헤테로사이클릭, 아릴, 헤테로아릴, 아실, 옥소, 이미노, 티오옥소, 시아노, 이소시아노, 아미노, 아지도, 니트로, 하이드록실, 티올, 할로, 지방족아미노, 헤테로지방족아미노, 알킬아미노, 헤테로알킬아미노, 아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 알킬아릴, 아릴알킬, 지방족옥시, 헤테로지방족옥시, 알킬옥시, 헤테로알킬옥시, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 지방족티옥시, 헤테로지방족티옥시, 알킬티옥시, 헤테로알킬티옥시, 아릴티옥시, 헤테로아릴티옥시, 아실옥시 등으로, 이들 각각은 추가로 치환될 수 있거나 치환되지 않을 수 있음)의 형성을 초래하는 본 출원에 기재된 임의의 치환기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"알케닐"은 2 내지 20개의 탄소 원자, 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖고 삼중 결합이 없는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 기의 라디칼 또는 치환기를 지칭한다("C2-20 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다("C2-10 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다("C2-9 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다("C2-8 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다("C2-7 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다("C2-6 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다("C2-5 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다("C2-4 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다("C2-3 알케닐"). 일부 구현예에서, 알케닐 기는 2개의 탄소 원자를 갖는다("C2 알케닐"). 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합은 내부(예컨대, 2-부테닐에서) 또는 말단(예컨대, 1-부테닐에서)일 수 있다. C2-4 알케닐 기의 예는 에테닐(C2), 1-프로페닐(C3), 2-프로페닐(C3), 1-부테닐(C4), 2-부테닐(C4), 부타디에닐(C4) 등을 포함한다. C2-6 알케닐 기의 예는 상기 언급된 C2-4 알케닐 기뿐만 아니라 펜테닐(C5), 펜타디에닐(C5), 헥세닐(C6) 등을 포함한다. 알케닐의 추가 예는 헵테닐(C7), 옥테닐(C8), 옥타트리에닐(C8) 등을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 알케닐 기의 각 경우는 독립적으로 임의로 치환되는데, 즉, 비치환되거나("비치환된 알케닐") 하나 이상의 치환기로 치환된다("치환된 알케닐"). 특정 구현예에서, 알케닐 기는 비치환된 C2-10 알케닐이다. 특정 구현예에서, 알케닐 기는 치환된 C2-10 알케닐이다.
"알키닐"은 2 내지 20개의 탄소 원자, 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합, 및 임의로 하나 이상의 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 기의 라디칼 또는 치환기를 지칭한다("C2-20 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다("C2-10 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 9개의 탄소 원자를 갖는다("C2-9 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다("C2-8 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 7개의 탄소 원자를 갖는다("C2-7 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다("C2-6 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 5개의 탄소 원자를 갖는다("C2-5 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다("C2-4 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다("C2-3 알키닐"). 일부 구현예에서, 알키닐 기는 2개의 탄소 원자를 갖는다("C2 알키닐"). 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합은 내부(예컨대, 2-부티닐에서) 또는 말단(예컨대, 1-부티닐에서)일 수 있다. C2-4 알키닐 기의 예는, 제한 없이, 에티닐(C2), 1-프로피닐(C3), 2-프로피닐(C3), 1-부티닐(C4), 2-부티닐(C4) 등을 포함한다. C2-6 알케닐 기의 예는 상기 언급된 C2-4 알키닐 기뿐만 아니라 펜티닐(C5), 헥시닐(C6) 등을 포함한다. 알키닐의 추가 예는 헵티닐(C7), 옥티닐(C8) 등을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 알키닐 기의 각 경우는 독립적으로 임의로 치환되는데, 즉, 비치환되거나("비치환된 알키닐") 하나 이상의 치환기로 치환된다("치환된 알키닐"). 특정 구현예에서, 알키닐 기는 비치환된 C2-10 알키닐이다. 특정 구현예에서, 알키닐 기는 치환된 C2-10 알키닐이다.
"카보사이클릴" 또는 "카보사이클릭"은 비방향족 고리 시스템에서 3 내지 10개의 고리 탄소 원자("C3-10 카보사이클릴") 및 0개의 헤테로원자를 갖는 비방향족 사이클릭 탄화수소 기의 라디칼을 지칭한다. 일부 구현예에서, 카보사이클릴 기는 3 내지 8개의 고리 탄소 원자를 갖는다("C3-8 카보사이클릴"). 일부 구현예에서, 카보사이클릴 기는 3 내지 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다("C3-6 카보사이클릴"). 일부 구현예에서, 카보사이클릴 기는 3 내지 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다("C3-6 카보사이클릴"). 일부 구현예에서, 카보사이클릴 기는 5 내지 10개의 고리 탄소 원자를 갖는다("C5-10 카보사이클릴"). 예시적인 C3-6 카보사이클릴 기는, 제한 없이, 사이클로프로필(C3), 사이클로프로페닐(C3), 사이클로부틸(C4), 사이클로부테닐(C4), 사이클로펜틸(C5), 사이클로펜테닐(C5), 사이클로헥실(C6), 사이클로헥세닐(C6), 사이클로헥사디에닐(C6) 등을 포함한다. 예시적인 C3-8 카보사이클릴 기는, 제한 없이, 상기 언급된 C3-6 카보사이클릴 기뿐만 아니라 사이클로헵틸(C7), 사이클로헵테닐(C7), 사이클로헵타디에닐(C7), 사이클로헵타트리에닐(C7), 사이클로옥틸(C8), 사이클로옥테닐(C8), 바이사이클로[2.2.1]헵타닐(C7), 바이사이클로[2.2.2]옥타닐(C8) 등을 포함한다. 예시적인 C3-10 카보사이클릴 기는, 제한 없이, 상기 언급된 C3-8 카보사이클릴 기뿐만 아니라 사이클로노닐(C9), 사이클로노네닐(C9), 사이클로데실(C10), 사이클로데세닐(C10), 옥타하이드로-1H-인데닐(C9), 데카하이드로나프탈레닐(C10), 스피로[4.5]데카닐(C10) 등을 포함한다. 상기 실시예가 예시하는 바와 같이, 특정 구현예에서, 카보사이클릴 기는 모노사이클릭("모노사이클릭 카보사이클릴")이거나, 바이사이클릭 시스템("바이사이클릭 카보사이클릴")과 같은 융합, 가교 또는 스피로 고리 시스템을 포함하고, 포화될 수 있거나 부분적으로 불포화될 수 있다. "카보사이클릴"은 또한 상기 정의된 바와 같은 카보사이클릭 고리가 하나 이상의 아릴 또는 헤테로아릴 기와 융합된 고리 시스템을 포함하며, 여기서, 부착점은 카보사이클릭 고리에 있고, 이러한 경우에, 탄소 수는 카보사이클릭 고리 시스템의 탄소 수를 계속 지정한다. 달리 명시되지 않는 한, 카보사이클릴 기의 각 경우는 독립적으로 임의로 치환되는데, 즉, 비치환되거나("비치환된 카보사이클릴") 하나 이상의 치환기로 치환된다("치환된 카보사이클릴"). 특정 구현예에서, 카보사이클릴 기는 비치환된 C3-10 카보사이클릴이다. 특정 구현예에서, 카보사이클릴 기는 치환된 C3-10 카보사이클릴이다.
일부 구현예에서, "카보사이클릴"은 3 내지 10개의 고리 탄소 원자를 갖는 모노사이클릭, 포화 카보사이클릴 기이다("C3-10 사이클로알킬"). 일부 구현예에서, 사이클로알킬 기는 3 내지 8개의 고리 탄소 원자를 갖는다("C3-8 사이클로알킬"). 일부 구현예에서, 사이클로알킬 기는 3 내지 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다("C3-6 사이클로알킬"). 일부 구현예에서, 사이클로알킬 기는 5 내지 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다("C5-6 사이클로알킬"). 일부 구현예에서, 사이클로알킬 기는 5 내지 10개의 고리 탄소 원자를 갖는다("C5-10 사이클로알킬"). C5-6 사이클로알킬 기의 예는 사이클로펜틸(C5) 및 사이클로헥실(C5)을 포함한다. C3-6 사이클로알킬 기의 예는 상기 언급된 C5-6 사이클로알킬 기뿐만 아니라 사이클로프로필(C3) 및 사이클로부틸(C4)을 포함한다. C3-8 사이클로알킬 기의 예는 상기 언급된 C3-6 사이클로알킬 기뿐만 아니라 사이클로헵틸(C7) 및 사이클로옥틸(C8)을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 사이클로알킬 기의 각 경우는 독립적으로 비치환되거나("비치환된 사이클로알킬") 하나 이상의 치환기로 치환된다("치환된 사이클로알킬"). 특정 구현예에서, 사이클로알킬 기는 비치환된 C3-10 사이클로알킬이다. 특정 구현예에서, 사이클로알킬 기는 치환된 C3-10 사이클로알킬이다.
"아릴"은 방향족 고리 시스템에 제공된 6-14개의 고리 탄소 원자 및 0개의 헤테로원자를 갖는 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭(예를 들어, 바이사이클릭 또는 트리사이클릭) 4n+2개의 방향족 고리 시스템(예를 들어, 사이클릭 배열에서 공유되는 6, 10, 또는 14개의 파이 전자를 가짐)의 라디칼을 지칭한다("C6-14 아릴"). 일부 구현예에서, 아릴 기는 6개의 고리 탄소 원자를 갖는다("C6 아릴"; 예를 들어, 페닐). 일부 구현예에서, 아릴 기는 10개의 고리 탄소 원자를 갖는다("C10 아릴"; 예를 들어, 나프틸, 예컨대 1-나프틸 및 2-나프틸). 일부 구현예에서, 아릴 기는 14개의 고리 탄소 원자를 갖는다("C10 아릴"; 예를 들어, 안트라실). "아릴"은 또한 상기 정의된 바와 같은 아릴 고리가 하나 이상의 카보사이클릴 또는 헤테로사이클릴 기와 융합된 고리 시스템을 포함하며, 여기서, 라디칼 또는 부착점은 아릴 고리 상에 있고, 이러한 경우에, 탄소 원자의 수는 아릴 고리 시스템에서 탄소 원자의 수를 계속 지정한다. 달리 명시되지 않는 한, 아릴 기의 각 경우는 독립적으로 임의로 치환되는데, 즉 비치환되거나("비치환된 아릴") 하나 이상의 치환기로 치환된다("치환된 아릴"). 특정 구현예에서, 아릴 기는 비치환된 C6-14 아릴이다. 특정 구현예에서, 아릴 기는 치환된 C6-14 아릴이다.
"아르알킬"은 알킬 및 아릴의 서브세트이고 임의로 치환된 아릴 기에 의해 치환된 임의로 치환된 알킬 기를 지칭한다. 특정 구현예에서, 아르알킬은 임의로 치환된 벤질이다. 특정 구현예에서, 아르알킬은 벤질이다. 특정 구현예에서, 아르알킬은 임의로 치환된 페네틸이다. 특정 구현예에서, 아르알킬은 페네틸이다. 특정 구현예에서, 아르알킬은 7-페닐헵타닐이다. 특정 구현예에서, 아르알킬은 임의로 치환된 아릴 기(예를 들어, 페닐)에 의해 치환된 C7 알킬이다. 특정 구현예에서, 아르알킬은 임의로 치환된 아릴 기(예를 들어, 페닐)에 의해 치환된 C7-C10 알킬 기이다.
"부분적으로 불포화된"은 적어도 하나의 이중 또는 삼중 결합을 포함하는 기를 지칭한다. "부분적으로 불포화된" 고리 시스템은 또한 다중 불포화 부위를 갖는 고리를 포함하도록 의도되지만, 본 출원에 정의된 바와 같은 방향족 기(예를 들어, 아릴 또는 헤테로아릴 기)를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 마찬가지로, "포화된"은 이중 또는 삼중 결합을 포함하지 않는, 즉 단일 결합을 모두 포함하는 기를 지칭한다.
용어 "임의로 치환된"은 치환 또는 비치환을 의미한다.
알킬, 알케닐, 알키닐, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 및 헤테로아릴 기는 임의로 치환된다(예를 들어, "치환된" 또는 "비치환된" 알킬, "치환된" 또는 "비치환된" 알케닐, "치환된" 또는 "비치환된" 알키닐, "치환된" 또는 "비치환된" 카보사이클릴, "치환된" 또는 "비치환된" 헤테로사이클릴, "치환된" 또는 "비치환된" 아릴 또는 "치환된" 또는 "비치환된" 헤테로아릴 기). 일반적으로, 용어 "임의로"가 앞에 있든 없든, 용어 "치환된"은 기(예를 들어, 탄소 또는 질소 원자)에 존재하는 적어도 하나의 수소가 허용되는 치환기, 예를 들어, 치환 시 안정한 화합물, 예를 들어, 재배열, 고리화, 제거 또는 기타 반응에 의한 것과 같은 자발적으로 변형되지 않는 화합물을 생성하는 치환기로 대체됨을 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, "치환된" 기는 기의 하나 이상의 치환 가능한 위치에 치환기를 갖고, 임의의 주어진 구조에서 하나 초과의 위치가 치환되는 경우, 치환기는 각 위치에서 동일하거나 상이하다. 용어 "치환된"은 안정한 화합물의 형성을 초래하는 본 출원에 기재된 임의의 치환기인 유기 화합물의 모든 허용 가능한 치환기로의 치환을 포함하는 것으로 고려된다. 본 발명은 안정한 화합물에 도달하기 위해 이러한 임의의 모든 조합을 고려한다. 본 발명의 목적을 위해, 질소와 같은 헤테로원자는 수소 치환기 및/또는 헤테로원자의 원자가를 만족시키고 안정한 모이어티의 형성을 초래하는 본 출원에 기재된 바와 같은 임의의 적합한 치환기를 가질 수 있다.
예시적인 탄소 원자 치환기는 할로겐, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -ORaa, -ON(Rbb)2, -N(Rbb)2, -N(Rbb)3 +X-, -N(ORcc)Rbb, -SH, -SRaa, -SSRcc, -C(=O)Raa, -CO2H, -CHO, -C(ORcc)2, -CO2Raa, -OC(=O)Raa, -OCO2Raa, -C(=O)N(Rbb)2, -OC(=O)N(Rbb)2, -NRbbC(=O)Raa, -NRbbCO2Raa, -NRbbC(=O)N(Rbb)2, -C(=NRbb)Raa, -C(=NRbb)ORaa, -OC(=NRbb)Raa, -OC(=NRbb)ORaa, -C(=NRbb)N(Rbb)2, -OC(=NRbb)N(Rbb)2, -NRbbC(=NRbb)N(Rbb)2, -C(=O)NRbbSO2Raa, -NRbbSO2Raa, -SO2N(Rbb)2, -SO2Raa, -SO2ORaa, -OSO2Raa, -S(=O)Raa, -OS(=O)Raa, -Si(Raa)3, -OSi(Raa)3 -C(=S)N(Rbb)2, -C(=O)SRaa, -C(=S)SRaa, -SC(=S)SRaa, -SC(=O)SRaa, -OC(=O)SRaa, -SC(=O)ORaa, -SC(=O)Raa, -P(=O)(Raa)2, -P(=O)(ORcc)2, -OP(=O)(Raa)2, -OP(=O)(ORcc)2, -P(=O)(N(Rbb)2)2, -OP(=O)(N(Rbb)2)2, -NRbbP(=O)(Raa)2, -NRbbP(=O)(ORcc)2, -NRbbP(=O)(N(Rbb)2)2, -P(Rcc)2, -P(ORcc)2, -P(Rcc)3 +X-, -P(ORcc)3 +X-, -P(Rcc)4, -P(ORcc)4, -OP(Rcc)2, -OP(Rcc)3 +X-, -OP(ORcc)2, -OP(ORcc)3 +X-, -OP(Rcc)4, -OP(ORcc)4, -B(Raa)2, -B(ORcc)2, -BRaa(ORcc), C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, 헤테로C1-10 알킬, 헤테로C2-10 알케닐, 헤테로C2-10 알키닐, C3-10 카보사이클릴, 3-14원 헤테로사이클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴을 포함하지만 이에 제한되지 않으며;
여기서:
Raa의 각 경우는, 독립적으로 C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, 헤테로C1-10 알킬, 헤테로C2-10알케닐, 헤테로C2-10알키닐, C3-10 카보사이클릴, 3-14원 헤테로사이클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴로부터 선택되거나, 2개의 Raa 기가 연결되어 3-14원 헤테로사이클릴 또는 5-14원 헤테로아릴 고리를 형성하고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 Rdd 기로 독립적으로 치환되고;
Rbb의 각 경우는, 독립적으로 수소, -OH, -ORaa, -N(Rcc)2, -CN, -C(=O)Raa, -C(=O)N(Rcc)2, -CO2Raa, -SO2Raa, -C(=NRcc)ORaa, -C(=NRcc)N(Rcc)2, -SO2N(Rcc)2, -SO2Rcc, -SO2ORcc, -SORaa, -C(=S)N(Rcc)2, -C(=O)SRcc, -C(=S)SRcc, -P(=O)(Raa)2, -P(=O)(ORcc)2, -P(=O)(N(Rcc)2)2, C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, 헤테로C1-10 알킬, 헤테로C2-10 알케닐, 헤테로C2-10알키닐, C3-10 카보사이클릴, 3-14원 헤테로사이클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴로부터 선택되거나, 2개의 Rbb 기가 연결되어 3-14원 헤테로사이클릴 또는 5-14원 헤테로아릴 고리를 형성하고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 Rdd 기로 독립적으로 치환되고; 여기서 X-는 반대이온이고;
Rcc의 각 경우는, 독립적으로 수소, C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, 헤테로C1-10 알킬, 헤테로C2-10 알케닐, 헤테로C2-10 알키닐, C3-10 카보사이클릴, 3-14원 헤테로사이클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴로부터 선택되거나, 2개의 Rcc 기가 연결되어 3-14원 헤테로사이클릴 또는 5-14원 헤테로아릴 고리를 형성하고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 Rdd 기로 독립적으로 치환되고;
Rdd의 각 경우는, 독립적으로 할로겐, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -ORee, -ON(Rff)2, -N(Rff)2, -N(Rff)3 +X-, -N(ORee)Rff, -SH, -SRee, -SSRee, -C(=O)Ree, -CO2H, -CO2Ree, -OC(=O)Ree, -OCO2Ree, -C(=O)N(Rff)2, -OC(=O)N(Rff)2, -NRffC(=O)Ree, -NRffCO2Ree, -NRffC(=O)N(Rff)2, -C(=NRff)ORee, -OC(=NRff)Ree, -OC(=NRff)ORee, -C(=NRff)N(Rff)2, -OC(=NRff)N(Rff)2, -NRffC(=NRff)N(Rff)2, -NRffSO2Ree, -SO2N(Rff)2, -SO2Ree, -SO2ORee, -OSO2Ree, -S(=O)Ree, -Si(Ree)3, -OSi(Ree)3, -C(=S)N(Rff)2, -C(=O)SRee, -C(=S)SRee, -SC(=S)SRee, -P(=O)(ORee)2, -P(=O)(Ree)2, -OP(=O)(Ree)2, -OP(=O)(ORee)2, C1-6 알킬, C1-6 퍼할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 헤테로C1-6 알킬, 헤테로C2-6 알케닐, 헤테로C2-6 알키닐, C3-10 카보사이클릴, 3-10원 헤테로사이클릴, C6-10 아릴, 5-10원 헤테로아릴로부터 선택되고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 Rgg 기로 독립적으로 치환되거나, 2개의 같은 자리(geminal) Rdd 치환기가 연결되어 =O 또는 =S를 형성할 수 있고; 여기서 X-는 반대이온이고;
Ree의 각 경우는, 독립적으로 C1-6 알킬, C1-6 퍼할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 헤테로C1-6 알킬, 헤테로C2-6 알케닐, 헤테로C2-6 알키닐, C3-10 카보사이클릴, C6-10 아릴, 3-10원 헤테로사이클릴, 및 3-10원 헤테로아릴로부터 선택되고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 Rgg 기로 독립적으로 치환되고;
Rff의 각 경우는, 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 퍼할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 헤테로C1-6 알킬, 헤테로C2-6 알케닐, 헤테로C2-6 알키닐, C3-10 카보사이클릴, 3-10원 헤테로사이클릴, C6-10 아릴 및 5-10원 헤테로아릴로부터 선택되거나, 2개의 Rff 기가 연결되어 3-10원 헤테로사이클릴 또는 5-10원 헤테로아릴 고리를 형성하고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 Rgg 기로 독립적으로 치환되고;
Rgg의 각 경우는, 독립적으로 할로겐, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -OC1-6 알킬, -ON(C1-6 알킬)2, -N(C1-6 알킬)2, -N(C1-6 알킬)3 +X-, -NH(C1-6 알킬)2 +X-, -NH2(C1-6 알킬)+X-, -NH3 +X-, -N(OC1-6 알킬)(C1-6 알킬), -N(OH)(C1-6 알킬), -NH(OH), -SH, -SC1-6 알킬, -SS(C1-6 알킬), -C(=O)(C1-6 알킬), -CO2H, -CO2(C1-6 알킬), -OC(=O)(C1-6 알킬), -OCO2(C1-6 알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)N(C1-6 알킬)2, -OC(=O)NH(C1-6 알킬), -NHC(=O)(C1-6 알킬), -N(C1-6 알킬)C(=O)(C1-6 알킬), -NHCO2(C1-6 알킬), -NHC(=O)N(C1-6 알킬)2, -NHC(=O)NH(C1-6 알킬), -NHC(=O)NH2, -C(=NH)O(C1-6 알킬), -OC(=NH)(C1-6 알킬), -OC(=NH)OC1-6 알킬, -C(=NH)N(C1-6 알킬)2, -C(=NH)NH(C1-6 알킬), -C(=NH)NH2, -OC(=NH)N(C1-6 알킬)2, -OC(NH)NH(C1-6 알킬), -OC(NH)NH2, -NHC(NH)N(C1-6 알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -NHSO2(C1-6 알킬), -SO2N(C1-6 알킬)2, -SO2NH(C1-6 알킬), -SO2NH2, -SO2C1-6 알킬, -SO2OC1-6 알킬, -OSO2C1-6 알킬, -SOC1-6 알킬, -Si(C1-6 알킬)3, -OSi(C1-6 알킬)3, -C(=S)N(C1-6 알킬)2, C(=S)NH(C1-6 알킬), C(=S)NH2, -C(=O)S(C1-6 알킬), -C(=S)SC1-6 알킬, -SC(=S)SC1-6 알킬, -P(=O)(OC1-6 알킬)2, -P(=O)(C1-6 알킬)2, -OP(=O)(C1-6 알킬)2, -OP(=O)(OC1-6 알킬)2, C1-6 알킬, C1-6 퍼할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 헤테로C1-6 알킬, 헤테로C2-6 알케닐, 헤테로C2-6 알키닐, C3-10 카보사이클릴, C6-10 아릴, 3-10원 헤테로사이클릴, 5-10원 헤테로아릴이거나; 2개의 같은 자리 Rgg 치환기가 연결되어 =O 또는 =S를 형성할 수 있고; 여기서 X-는 반대이온이다. 대안적으로, 탄소 원자 상의 2개의 같은 자리 수소는 기 =O, =S, =NN(Rbb)2, =NNRbbC(=O)Raa, =NNRbbC(=O)ORaa, =NNRbbS(=O)2Raa, =NRbb, 또는 =NORcc로 대체되고; 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 Rdd 기로 독립적으로 치환되고; 여기서 X-는 반대이온이고;
여기서:
Raa의 각 경우는, 독립적으로 C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, 헤테로C1-10 알킬, 헤테로C2-10 알케닐, 헤테로C2-10 알키닐, C3-10 카보사이클릴, 3-14원 헤테로사이클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴로부터 선택되거나, 2개의 Raa 기가 연결되어 3-14원 헤테로사이클릴 또는 5-14원 헤테로아릴 고리를 형성하고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 Rdd 기로 독립적으로 치환되고;
Rbb의 각 경우는, 독립적으로 수소, -OH, -ORaa, -N(Rcc)2, -CN, -C(=O)Raa, -C(=O)N(Rcc)2, -CO2Raa, -SO2Raa, -C(=NRcc)ORaa, -C(=NRcc)N(Rcc)2, -SO2N(Rcc)2, -SO2Rcc, -SO2ORcc, -SORaa, -C(=S)N(Rcc)2, -C(=O)SRcc, -C(=S)SRcc, -P(=O)(Raa)2, -P(=O)(ORcc)2, -P(=O)(N(Rcc)2)2, C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, 헤테로C1-10 알킬, 헤테로C2-10 알케닐, 헤테로C2-10 알키닐, C3-10 카보사이클릴, 3-14원 헤테로사이클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴로부터 선택되거나, 2개의 Rbb 기가 연결되어 3-14원 헤테로사이클릴 또는 5-14원 헤테로아릴 고리를 형성하고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 Rdd 기로 독립적으로 치환되고; 여기서 X-는 반대이온이고;
Rcc의 각 경우는, 독립적으로 수소, C1-10 알킬, C1-10 퍼할로알킬, C2-10 알케닐, C2-10 알키닐, 헤테로C1-10 알킬, 헤테로C2-10 알케닐, 헤테로C2-10 알키닐, C3-10 카보사이클릴, 3-14원 헤테로사이클릴, C6-14 아릴, 및 5-14원 헤테로아릴로부터 선택되거나, 2개의 Rcc 기가 연결되어 3-14원 헤테로사이클릴 또는 5-14원 헤테로아릴 고리를 형성하고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 Rdd 기로 독립적으로 치환되고;
Rdd의 각 경우는, 독립적으로 할로겐, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -ORee, -ON(Rff)2, -N(Rff)2, -N(Rff)3 +X-, -N(ORee)Rff, -SH, -SRee, -SSRee, -C(=O)Ree, -CO2H, -CO2Ree, -OC(=O)Ree, -OCO2Ree, -C(=O)N(Rff)2, -OC(=O)N(Rff)2, -NRffC(=O)Ree, -NRffCO2Ree, -NRffC(=O)N(Rff)2, -C(=NRff)ORee, -OC(=NRff)Ree, -OC(=NRff)ORee, -C(=NRff)N(Rff)2, -OC(=NRff)N(Rff)2, -NRffC(=NRff)N(Rff)2, -NRffSO2Ree, -SO2N(Rff)2, -SO2Ree, -SO2ORee, -OSO2Ree, -S(=O)Ree, -Si(Ree)3, -OSi(Ree)3, -C(=S)N(Rff)2, -C(=O)SRee, -C(=S)SRee, -SC(=S)SRee, -P(=O)(ORee)2, -P(=O)(Ree)2, -OP(=O)(Ree)2, -OP(=O)(ORee)2, C1-6 알킬, C1-6 퍼할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 헤테로C1-6 알킬, 헤테로C2-6 알케닐, 헤테로C2-6 알키닐, C3-10 카보사이클릴, 3-10원 헤테로사이클릴, C6-10 아릴, 5-10원 헤테로아릴로부터 선택되고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 Rgg 기로 독립적으로 치환되거나, 2개의 같은 자리 Rdd 치환기가 연결되어 =O 또는 =S를 형성할 수 있고; 여기서 X-는 반대이온이고;
Ree의 각 경우는, 독립적으로 C1-6 알킬, C1-6 퍼할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 헤테로C1-6 알킬, 헤테로C2-6 알케닐, 헤테로C2-6 알키닐, C3-10 카보사이클릴, C6-10 아릴, 3-10원 헤테로사이클릴, 및 3-10원 헤테로아릴로부터 선택되고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 Rgg 기로 독립적으로 치환되고;
Rff의 각 경우는, 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C1-6 퍼할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 헤테로C1-6 알킬, 헤테로C2-6 알케닐, 헤테로C2-6알키닐, C3-10 카보사이클릴, 3-10원 헤테로사이클릴, C6-10 아릴 및 5-10원 헤테로아릴로부터 선택되거나, 2개의 Rff 기가 연결되어 3-10원 헤테로사이클릴 또는 5-10원 헤테로아릴 고리를 형성하고, 여기서 각각의 알킬, 알케닐, 알키닐, 헤테로알킬, 헤테로알케닐, 헤테로알키닐, 카보사이클릴, 헤테로사이클릴, 아릴, 및 헤테로아릴은 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 Rgg 기로 독립적으로 치환되고;
Rgg의 각 경우는, 독립적으로 할로겐, -CN, -NO2, -N3, -SO2H, -SO3H, -OH, -OC1-6 알킬, -ON(C1-6 알킬)2, -N(C1-6 알킬)2, -N(C1-6 알킬)3 +X-, -NH(C1-6 알킬)2 +X-, -NH2(C1-6 알킬)+X-, -NH3 +X-, -N(OC1-6 알킬)(C1-6 알킬), -N(OH)(C1-6 알킬), -NH(OH), -SH, -SC1-6 알킬, -SS(C1-6 알킬), -C(=O)(C1-6 알킬), -CO2H, -CO2(C1-6 알킬), -OC(=O)(C1-6 알킬), -OCO2(C1-6 알킬), -C(=O)NH2, -C(=O)N(C1-6 알킬)2, -OC(=O)NH(C1-6 알킬), -NHC(=O)(C1-6 알킬), -N(C1-6 알킬)C(=O)(C1-6 알킬), -NHCO2(C1-6 알킬), -NHC(=O)N(C1-6 알킬)2, -NHC(=O)NH(C1-6 알킬), -NHC(=O)NH2, -C(=NH)O(C1-6 알킬), -OC(=NH)(C1-6 알킬), -OC(=NH)OC1-6 알킬, -C(=NH)N(C1-6 알킬)2, -C(=NH)NH(C1-6 알킬), -C(=NH)NH2, -OC(=NH)N(C1-6 알킬)2, -OC(NH)NH(C1-6 알킬), -OC(NH)NH2, -NHC(NH)N(C1-6 알킬)2, -NHC(=NH)NH2, -NHSO2(C1-6 알킬), -SO2N(C1-6 알킬)2, -SO2NH(C1-6 알킬), -SO2NH2, -SO2C1-6 알킬, -SO2OC1-6 알킬, -OSO2C1-6 알킬, -SOC1-6 알킬, -Si(C1-6 알킬)3, -OSi(C1-6 알킬)3, -C(=S)N(C1-6 알킬)2, C(=S)NH(C1-6 알킬), C(=S)NH2, -C(=O)S(C1-6 알킬), -C(=S)SC1-6 알킬, -SC(=S)SC1-6 알킬, -P(=O)(OC1-6 알킬)2, -P(=O)(C1-6 알킬)2, -OP(=O)(C1-6 알킬)2, -OP(=O)(OC1-6 알킬)2, C1-6 알킬, C1-6 퍼할로알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 헤테로C1-6 알킬, 헤테로C2-6 알케닐, 헤테로C2-6 알키닐, C3-10 카보사이클릴, C6-10 아릴, 3-10원 헤테로사이클릴, 5-10원 헤테로아릴이거나; 2개의 같은 자리 Rgg 치환기는 연결되어 =O 또는 =S를 형성할 수 있고; 여기서 X-는 반대이온이다.
"반대이온" 또는 "음이온성 반대이온"은 전자 중성을 유지하기 위해 양으로 하전된 기와 관련된 음으로 하전된 기이다. 음이온성 반대이온은 1가(즉, 하나의 형식 음전하 포함)일 수 있다. 음이온성 반대이온은 또한 2가 또는 3가와 같은 다가(즉, 하나 초과의 형식 음전하 포함)일 수 있다. 예시적인 반대이온은 할로겐화 이온(예를 들어, F-, Cl-, Br-, I-), NO3 -, ClO4 -, OH-, H2PO4 -, HCO3 -, HSO4 -, 설포네이트 이온(예를 들어, 메탄설포네이트, 트리플루오로메탄설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 벤젠설포네이트, 10-캄포르 설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 나프탈렌-1-설폰산-5-설포네이트, 에탄-1-설폰산-2-설포네이트 등), 카복실레이트 이온(예를 들어, 아세테이트, 프로파노에이트, 벤조에이트, 글리세레이트, 락테이트, 타르트레이트, 글리콜레이트, 글루코네이트 등), BF4 -, PF4 -, PF6 -, AsF6 -, SbF6 -, B[3,5-(CF3)2C6H3]4]-, B(C6F5)4 -, BPh4 -, Al(OC(CF3)3)4 -, 및 카보란 음이온(예를 들어, CB11H12 - 또는 (HCB11Me5Br6)-)을 포함한다. 다가일 수 있는 예시적인 반대이온은 CO3 2-, HPO4 2-, PO4 3- , B4O7 2-, SO4 2-, S2O3 2-, 카복실레이트 음이온(예를 들어, 타르트레이트, 시트레이트, 푸마레이트, 말레에이트, 말레이트, 말로네이트, 글루코네이트, 석시네이트, 글루타레이트, 아디페이트, 피멜레이트, 수베레이트, 아젤레이트, 세바케이트, 살리실레이트, 프탈레이트, 아스파르테이트, 글루타메이트 등), 및 카보란을 포함한다.
용어 "약학적으로 허용되는 염"은 건전한 의학적 판단 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 이득/위험 비율에 부합되는 이러한 염을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 염은 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, Berge 등은 문헌(J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19)에서 약학적으로 허용되는 염을 상세하게 기재하며, 이 문헌은 참조로 포함된다. 본 출원에 개시된 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 적합한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유도된 것들을 포함한다. 약학적으로 허용되는 무독성 산 부가염의 예는 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산으로, 또는 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 석신산 또는 말론산과 같은 유기산으로, 또는 이온 교환과 같은 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 형성된 아미노 기의 염이다. 다른 약학적으로 허용되는 염은 아디페이트, 알지네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 등을 포함한다. 적절한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄 및 N+(C1-4 알킬)4 - 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가의 약학적으로 허용되는 염은, 적절한 경우, 할라이드, 하이드록사이드, 카복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 저급 알킬 설포네이트 및 아릴 설포네이트와 같은 반대이온을 사용하여 형성된 무독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 아민 양이온을 포함한다.
용어 "용매화물"은 일반적으로 가용매분해 반응에 의해 용매와 회합된 화합물의 형태를 지칭한다. 이러한 물리적 회합은 수소 결합을 포함할 수 있다. 통상적인 용매는 물, 메탄올, 에탄올, 아세트산, DMSO, THF, 디에틸 에테르 등을 포함한다. 화학식 (1), (9), (10), 및 (11)의 화합물은, 예를 들어, 결정질 형태로 제조될 수 있고 용매화될 수 있다. 적합한 용매화물은 약학적으로 허용되는 용매화물을 포함하고, 화학량론적 용매화물과 비화학량론적 용매화물 둘 모두를 추가로 포함한다. 특정 경우에, 용매화물은, 예를 들어, 하나 이상의 용매 분자가 결정질 고체의 결정 격자에 혼입될 때 단리될 수 있을 것이다. "용매화물"은 용액 상(solution-phase) 및 단리 가능한 용매화물 둘 모두를 포함한다. 대표적인 용매화물은 수화물, 에탄올레이트, 및 메탄올레이트를 포함한다.
용어 "수화물"은 물과 회합된 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 화합물의 수화물에 함유된 물 분자의 수는 수화물 중 화합물 분자의 수에 대한 일정한 비율이다. 따라서, 화합물의 수화물은, 예를 들어, 일반식 RㆍxH2O로 표시될 수 있으며, 여기서 R은 화합물이고 x는 0 초과의 수이다. 주어진 화합물은, 예를 들어, 일수화물(x는 1임), 저급 수화물(x는 0 초과 1 미만의 수로, 예를 들어, 반수화물(Rㆍ0.5 H2O)임) 및 다가수화물(polyhydrate) (x는 1 초과의 수로, 예를 들어, 이수화물(Rㆍ2 H2O) 및 육수화물(Rㆍ6 H2O)임)을 포함하는 하나 초과의 유형의 수화물을 형성할 수 있다.
용어 "호변이성질체"는 특정 화합물 구조의 상호교환 가능한 형태이고 수소 원자 및 전자의 변위가 다양한 화합물을 지칭한다. 따라서, 두 구조는 π 전자와 원자(일반적으로 H)의 이동을 통해 평형 상태에 있을 수 있다. 예를 들어, 에놀과 케톤은 산 또는 염기로 처리하여 신속하게 상호 전환되기 때문에 호변이성질체이다. 호변이성질 현상의 또 다른 예는 산 또는 염기로 처리하여 마찬가지로 형성되는 페닐니트로메탄의 산 및 니트로 형태이다. 호변이성질체 형태는 관심 화합물의 최적의 화학 반응성 및 생물학적 활성의 달성과 관련될 수 있다.
또한, 동일한 분자식을 갖지만 원자의 결합 성질 또는 순서 또는 공간에서 원자의 배열이 상이한 화합물은 "이성질체"로 지칭되는 것으로 이해되어야 한다. 공간에서 원자의 배열이 상이한 이성질체는 "입체이성질체"로 지칭된다.
서로의 거울상이 아닌 입체이성질체는 "부분입체이성질체"로 지칭되고, 서로의 거울상이 중첩될 수 없는 것들은 "거울상이성질체"로 지칭된다. 화합물이 비대칭 중심을 갖는 경우, 예를 들어, 4개의 다른 기에 결합되는 경우, 한 쌍의 거울상이성질체가 가능하다. 거울상이성질체는 비대칭 중심의 절대적 구성을 특징으로 할 수 있으며 칸 및 프렐로그(Cahn and Prelog)의 R- 및 S- 순서결정 규칙에 의해 설명된다. 거울상이성질체는 또한 분자가 편광면을 회전시키는 방식을 특징으로 할 수 있으며 우선성 또는 좌선성으로서(즉, 각각 (+) 또는 (-)-이성질체로서) 지정된다. 키랄 화합물은 개별 거울상이성질체 또는 거울상이성질체의 혼합물로서 존재할 수 있다. 동일한 비율의 거울상이성질체를 함유하는 혼합물은 "라세미 혼합물"로 불린다.
용어 "공결정"은 적어도 2개의 상이한 성분(예를 들어, 본 출원에 기재된 화합물 및 산)을 포함하는 결정질 구조를 지칭하며, 여기서 각각의 성분은 독립적으로 원자, 이온 또는 분자이다. 특정 구현예에서, 어떠한 성분도 용매가 아니다. 특정 구현예에서, 성분 중 적어도 하나는 용매이다. 화합물과 산의 공결정은 화합물과 산으로부터 형성된 염과는 상이하다. 염에서, 본 출원에 기재된 화합물은 산으로부터 본 출원에 기재된 화합물로의 양성자 이동(예를 들어, 완전한 양성자 이동)이 실온에서 쉽게 발생하는 방식으로 산과 착물을 형성한다. 그러나, 공결정에서, 본 출원에 기재된 화합물은 산으로부터 본 출원에 기재된 화합물로의 양성자 이동이 실온에서 쉽게 발생하지 않는 방식으로 산과 착물을 형성한다. 특정 구현예에서, 공결정에서, 산으로부터 본 출원에 기재된 화합물로의 양성자 이동이 없다. 특정 구현예에서, 공결정에서, 산으로부터 본 출원에 기재된 화합물로의 부분적인 양성자 이동이 있다. 공결정은 본 출원에 기재된 화합물의 특성(예를 들어, 용해도, 안정성, 및 제형화의 용이성)을 개선하는 데 유용할 수 있다.
용어 "다형체"는 특정 결정 패킹 배열에서 화합물 (또는 이의 염, 수화물 또는 용매화물)의 결정질 형태를 지칭한다. 동일한 화합물의 모든 다형체는 동일한 원소 조성을 갖는다. 상이한 결정질 형태는 일반적으로 X선 회절 패턴, 적외선 스펙트럼, 융점, 밀도, 경도, 결정 형상, 광학 및 전기적 특성, 안정성 및 용해도가 상이하다. 재결정화 용매, 결정화 속도, 보관 온도 및 기타 요인으로 인해 하나의 결정 형태가 지배적일 수 있다. 화합물의 다양한 다형체는 상이한 조건 하에 결정화하여 제조될 수 있다.
용어 "프로드럭"은 절단 가능한 기를 갖고 가용매분해에 의해 또는 생리학적 조건 하에 화학식 (X), (8), (9), (10), 또는 (11)의 화합물이 되고 생체내에서 약학적으로 활성인 화학식 (X), (8), (9), (10), 또는 (11)의 화합물의 유도체를 포함한 화합물을 지칭한다. 프로드럭은, 제한 없이, 용해도, 생체이용률, 조직 적합성, 또는 포유동물 유기체에서의 지연된 방출과 같은 속성을 가질 수 있다. 예는 본 출원에 기재된 화합물의 글리코실화로부터 형성된 유도체(예를 들어, 글리코시드 유도체), 담체-연결된 프로드럭(예를 들어, 에스테르 유도체), 생물전구체 프로드럭(분자 변형에 의해 활성 화합물로 대사되는 프로드럭) 등을 포함하는 본 출원에 기재된 화합물의 유도체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 글리코시드 유도체의 비제한적인 예는 PCT 공개 번호 WO2018208875 및 미국 특허 공개 번호 2019/0078168에 개시되어 있으며 이로부터 참조로 포함된다. 에스테르 유도체의 비제한적인 예는 미국 특허 공개 번호 US2017/0362195에 개시되어 있으며 이로부터 참조로 포함된다.
본 발명의 화합물의 다른 유도체는 이들의 산 및 산 유도체 형태 둘 모두에서 활성을 갖지만, 산 민감성 형태는 종종 포유동물 유기체에서 용해도, 생체이용률, 조직 적합성 또는 지연된 방출의 이점을 제공한다(문헌(Bundgard, H., Design of Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985) 참조). 프로드럭은, 예를 들어, 모산(parent acid)과 적합한 알코올의 반응에 의해 제조된 에스테르, 또는 모산 화합물과 치환 또는 비치환된 아민, 또는 산 무수물, 또는 혼합 무수물의 반응에 의해 제조된 아미드와 같은 당업자에게 익히 공지된 산 유도체를 포함한다. 본 발명의 화합물에 펜던트된 산성 기로부터 유도된 단순 지방족 또는 방향족 에스테르, 아미드 및 무수물이 특정 프로드럭이다. 일부 경우에, (아실옥시)알킬 에스테르 또는 ((알콕시카보닐)옥시)알킬에스테르와 같은 이중 에스테르 유형 프로드럭을 제조하는 것이 바람직하다. 화학식 (X), (8), (9), (10), 또는 (11)의 화합물의 C1-C8 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, 아릴, C7-C12 치환된 아릴, 및 C7-C12 아릴알킬 에스테르가 바람직할 수 있다.
칸나비노이드
본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "칸나비노이드"는 하기 화학식 (X)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 공결정, 호변이성질체, 입체이성질체, 용매화물, 수화물, 다형체, 동위원소적으로 농축된 유도체, 또는 프로드럭을 포함한다:
Figure pct00001
상기 식에서, R1은 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 카보사이클릴, 또는 임의로 치환된 아릴이고; R2 및 R6은 독립적으로 수소 또는 카복실이고; R3 및 R5는 독립적으로 하이드록실, 할로겐, 또는 알콕시이고; R4는 수소 또는 임의로 치환된 프레닐 모이어티이거나; 임의로 R4 및 R3은 이들의 개재 원자와 함께 취하여 사이클릭 모이어티를 형성하거나, 임의로 R4 및 R5는 이들의 개재 원자와 함께 취하여 사이클릭 모이어티를 형성하거나, 임의로 1) R4 및 R3은 이들의 개재 원자와 함께 취하여 사이클릭 모이어티를 형성할 뿐만 아니라, 2) R4 및 R5는 이들의 개재 원자와 함께 취하여 사이클릭 모이어티도 형성한다. 특정 구현예에서, R4 및 R3은 이들의 개재 원자와 함께 취하여 사이클릭 모이어티를 형성한다. 특정 구현예에서, R4 및 R5는 이들의 개재 원자와 함께 취하여 사이클릭 모이어티를 형성한다. 특정 구현예에서, "칸나비노이드"는 화학식 (X)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 지칭한다. 특정 구현예에서, 1) R4 및 R3은 이들의 개재 원자와 함께 취하여 사이클릭 모이어티를 형성할 뿐만 아니라, 2) R4 및 R5는 이들의 개재 원자와 함께 취하여 사이클릭 모이어티도 형성한다.
일부 구현예에서, 칸나비노이드는 다음 단계를 통해 합성될 수 있다: a) 3개의 추가 케톤 모이어티를 아실-CoA 스캐폴드에 혼입시키기 위한 하나 이상의 반응으로, 여기서 아실-CoA 스캐폴드의 아실 모이어티는 4개와 14개 사이의 탄소를 포함하는 것인, 하나 이상의 반응; b) 단계 (a)의 생성물을 고리화하는 반응; 및 c) 프레닐 모이어티를 단계 (b)의 생성물 또는 단계 (b)의 생성물의 유도체에 혼입시키기 위한 반응. 일부 구현예에서, 단계 (a)에 기재된 아실-CoA 스캐폴드의 비제한적인 예는 헥사노일-CoA 및 부티릴-CoA를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)의 생성물 또는 단계 (b)의 생성물의 유도체의 비제한적인 예는 올리베톨산 디바린산, 및 스패로포롤산을 포함한다.
일부 구현예에서, 화학식 (X)의 칸나비노이드 화합물은 하기 화학식 (X-A), (X-B), 또는 (X-C) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 다형체, 공결정, 호변이성질체, 입체이성질체, 동위원소적으로 표지된 유도체, 또는 프로드럭이다:
Figure pct00002
상기 식에서,
Figure pct00003
는 원자가가 허용하는 대로 이중 결합 또는 단일 결합이고;
R은 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 카보사이클릴, 또는 임의로 치환된 아릴이고;
RZ1은 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 카보사이클릴, 또는 임의로 치환된 아릴이고;
RZ2는 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 카보사이클릴, 또는 임의로 치환된 아릴이고;
또는 임의로, RZ1 및 RZ2는 이들의 개재 원자와 함께 취하여 임의로 치환된 카보사이클릭 고리를 형성하고;
R3A는 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 또는 임의로 치환된 알키닐이고;
R3B는 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 또는 임의로 치환된 알키닐이고;
RY는 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 또는 임의로 치환된 알키닐이고;
RZ는 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 또는 임의로 치환된 알키닐이다.
특정 구현예에서, 칸나비노이드 화합물은 하기 화학식 (X-A)의 화합물이다:
Figure pct00004
.
상기 식에서,
Figure pct00005
는 이중 결합이고, 각각의 RZ1 및 RZ2는 수소이고, R3A 및 R3B 중 하나는 임의로 치환된 C2-6 알케닐이고, R3A 및 R3B 중 다른 하나는 임의로 치환된 C2-6 알킬이다. 일부 구현예에서, 화학식 (X)의 칸나비노이드 화합물은 화학식 (X-A)의 화합물이고, 여기서 각각의 RZ1 및 RZ2는 수소이고, R3A 및 R3B 중 하나는 프레닐 기이고, R3A 및 R3B 중 다른 하나는 임의로 치환된 메틸이다.
특정 구현예에서, 화학식 (X-A)의 화학식 (X)의 칸나비노이드 화합물은 하기 화학식 (11-z)의 화합물이다:
Figure pct00006
.
상기 식에서,
Figure pct00007
는 원자가가 허용하는 대로 이중 결합 또는 단일 결합이고; R3A 및 R3B 중 하나는 알케닐로 임의로 치환된 C1-6 알킬이고, R3A 및 R3B 중 다른 하나는 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 특정 구현예에서, 화학식 (11-z)의 화합물에서,
Figure pct00008
는 단일 결합이고; R3A 및 R3B 중 하나는 프레닐로 임의로 치환된 C1-6 알킬이고; R3A 및 R3B 중 다른 하나는 비치환된 메틸이고; R은 본 출원에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, 화학식 (11-z)의 화합물에서,
Figure pct00009
는 단일 결합이고; R3A 및 R3B 중 하나는
Figure pct00010
이고; R3A 및 R3B 중 다른 하나는 비치환된 메틸이고; R은 본 출원에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, 화학식 (11-z)의 칸나비노이드 화합물은 하기 화학식 (11a)의 화합물이다:
Figure pct00011
특정 구현예에서, 화학식 (X-A)의 화학식 (X)의 칸나비노이드 화합물은 하기 화학식 (11a)의 화합물이다:
Figure pct00012
특정 구현예에서, 화학식 (X-A)의 칸나비노이드 화합물은 하기 화학식 (10-z)의 화합물이다:
Figure pct00013
.
상기 식에서,
Figure pct00014
는 원자가가 허용하는 대로 이중 결합 또는 단일 결합이고; RY는 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 또는 임의로 치환된 알키닐이고; 각각의 R3A 및 R3B는 독립적으로 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 특정 구현예에서, 화학식 (10-z)의 화합물에서,
Figure pct00015
는 단일 결합이고; 각각의 R3A 및 R3B는 비치환된 메틸이고, R은 본 출원에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, 화학식 (10-z)의 칸나비노이드 화합물은 하기 화학식 (10a)의 화합물이다:
Figure pct00016
. 특정 구현예에서, 화학식 (10a)의 화합물(
Figure pct00017
)은 탄소 10에서 *로 표지된 키랄 원자 및 탄소 6에서 **로 표지된 키랄 원자를 갖는다. 특정 구현예에서, 화학식 (10a)의 화합물(
Figure pct00018
)에서, 탄소 10에서 *로 표지된 키랄 원자는 R-배열 또는 S-배열이고; 탄소 6에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (10a)의 화합물(
Figure pct00019
)에서, 탄소 10에서 *로 표지된 키랄 원자는 S-배열이고; 탄소 6에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열 또는 S-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (10a)의 화합물(
Figure pct00020
)에서, 탄소 10에서 *로 표지된 키랄 원자는 R-배열이고, 탄소 6에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (10a)의 화합물(
Figure pct00021
)은 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00022
특정 구현예에서, 화학식 (10a)의 화합물(
Figure pct00023
)에서, 탄소 10에서 *로 표지된 키랄 원자는 S-배열이고 탄소 6에서 **로 표지된 키랄 원자는 S-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (10a)의 화합물(
Figure pct00024
)은 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00025
특정 구현예에서, 칸나비노이드 화합물은 하기 화학식 (X-B)의 화합물이다:
Figure pct00026
상기 식에서,
Figure pct00027
는 이중 결합이고; RY는 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 또는 임의로 치환된 알키닐이고; 각각의 R3A 및 R3B는 독립적으로 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 특정 구현예에서, 화학식 (X-B)의 화합물에서, RY는 임의로 치환된 C1-6 알킬이고; R3A 및 R3B 중 하나는
Figure pct00028
이고; R3A 및 R3B 중 다른 하나는 비치환된 메틸이고, R은 본 출원에 기재된 바와 같다. 특정 구현예에서, 화학식 (X-B)의 화합물은 하기 화학식 (9a)의 화합물이다:
Figure pct00029
특정 구현예에서, 화학식 (9a)의 화합물(
Figure pct00030
)은 탄소 3에서 *로 표지된 키랄 원자 및 탄소 4에서 **로 표지된 키랄 원자를 갖는다. 특정 구현예에서, 화학식 (9a)의 화합물(
Figure pct00031
)에서, 탄소 3에서 *로 표지된 키랄 원자는 R-배열 또는 S-배열이고; 탄소 4에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (9a)의 화합물(
Figure pct00032
)에서, 탄소 3에서 *로 표지된 키랄 원자는 S-배열이고; 탄소 4에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열 또는 S-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (9a)의 화합물(
Figure pct00033
)에서, 탄소 3에서 *로 표지된 키랄 원자는 R-배열이고, 탄소 4에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (9a)의 화합물(
Figure pct00034
)은 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00035
특정 구현예에서, 화학식 (9a)의 화합물(
Figure pct00036
)에서, 탄소 3에서 *로 표지된 키랄 원자는 S-배열이고, 탄소 4에서 **로 표지된 키랄 원자는 S-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (9a)의 화합물(
Figure pct00037
)은 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00038
특정 구현예에서, 칸나비노이드 화합물은 하기 화학식 (X-C)의 화합물이다:
Figure pct00039
상기 식에서, RZ는 임의로 치환된 알킬 또는 임의로 치환된 알케닐이다. 특정 구현예에서, 화학식 (X-C)의 화합물은 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00040
상기 식에서, a는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 특정 구현예에서, a는 1이다. 특정 구현예에서, a는 2이다. 특정 구현예에서, a는 3이다. 특정 구현예에서, a는 화학식 (X-C)의 화합물의 경우, 1, 2, 또는 3이다. 특정 구현예에서, 칸나비노이드 화합물은 화학식 (X-C)의 화합물이고, a는 1, 2, 3, 4, 또는 5이다. 특정 구현예에서, 화학식 (X-C)의 화합물은 하기 화학식 (8a)의 화합물이다:
Figure pct00041
일부 구현예에서, 본 개시내용의 칸나비노이드는 칸나비노이드 수용체 리간드를 포함한다. 칸나비노이드 수용체는 G 단백질-결합된 수용체 슈퍼패밀리에 있는 세포막 수용체 부류이다. 칸나비노이드 수용체는 CB1 수용체 및 CB2 수용체를 포함한다. 일부 구현예에서, 칸나비노이드 수용체는 GPR18, GPR55, 및 PPAR을 포함한다(문헌(Bram et al. "Activation of GPR18 by cannabinoid compounds: a tale of biased agonism" Br J Pharmcol v171 (16) (2014); Shi et al. "The novel cannabinoid receptor GPR55 mediates anxiolytic-like effects in the medial orbital cortex of mice with acute stress" Molecular Brain 10, No. 38 (2017); and O'Sullvan, Elizabeth. "An update on PPAR activation by cannabinoids" Br J Pharmcol v. 173(12) (2016)) 참조).
일부 구현예에서, 칸나비노이드는 체내에서 생성되는 물질인 엔도칸나비노이드와 대마초 속의 식물에 의해 자연적으로 생성되는 칸나비노이드인 파이토칸나비노이드로 구성된다. 일부 구현예에서, 파이토칸나비노이드는 자연 발생 식물 유래 칸나비노이드의 산성 및 탈카복실화된 산 형태 및 이들의 합성 및 생합성 등가물로 구성된다.
현재까지 94개 초과의 파이토칸나비노이드가 확인되었다(Berman, Paula, et al. "A new ESI-LC/MS approach for comprehensive metabolic profiling of phytocannabinoids in Cannabis."　Scientific reports　8.1 (2018): 14280; El-Alfy et al., 2010, "Antidepressant-like effect of delta-9-tetrahydrocannabinol and other cannabinoids isolated from Cannabis sativa L", Pharmacology Biochemistry and Behavior 95 (4): 434-42; Rudolf Brenneisen, 2007, Chemistry and Analysis of Phytocannabinoids, Citti, Cinzia, et al. "A novel phytocannabinoid isolated from Cannabis sativa L. with an in vivo cannabimimetic activity higher than △9-tetrahydrocannabinol: △9-Tetrahydrocannabiphorol." Sci Rep 9 (2019): 20335, 이들 각각은 그 전체가 본 출원에 참조로 포함됨). 일부 구현예에서, 칸나비노이드는 △9-테트라하이드로칸나비놀(THC) 유형(예를 들어, (-)-트랜스-델타-9-테트라하이드로칸나비놀 또는 드로나비놀, (+)-트랜스-델타-9-테트라하이드로칸나비놀, (-)-시스-델타-9-테트라하이드로칸나비놀, 또는 (+)-시스-델타-9-테트라하이드로칸나비놀), 칸나비디올(CBD) 유형, 칸나비게롤(CBG) 유형, 칸나비크로멘(CBC) 유형, 칸나바이사이클롤(CBL) 유형, 칸나비노디올(CBND) 유형, 또는 칸나비트리올(CBT) 유형 칸나비노이드, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다(예를 들어, 문헌(R Pertwee, ed, Handbook of Cannabis (Oxford, UK: Oxford University Press, 2014) 참조, 이는 그 전체가 본 출원에 참조로 포함됨). 칸나비노이드의 비제한적인 목록은 다음을 포함한다: 칸나비오르콜-C1(CBNO), CBND-C1(CBNDO), △9-트랜스-테트라하이드로칸나비오르콜산-C1(△9-THCO), 카나비디오르콜-C1(CBDO), 카나비오르크로멘-C1(CBCO), (-)-△8-트랜스-(6aR,10aR)-테트라하이드로칸나비오르콜-C1(△8-THCO), 칸나비오르사이클롤 C1(CBLO), CBG-C1(CBGO), 칸나비놀-C2(CBN-C2), CBND-C2, △9-THC-C2, CBD-C2, CBC-C2, △8-THC-C2, CBL-C2, 비스노르-칸나비엘소인-C1(CBEO), CBG-C2, 칸나비바린-C3(CBNV), 칸나비노디바린-C3(CBNDV), (-)-△9-트랜스-테트라하이드로칸나비바린-C3(△9-THCV), (-)-칸나비디바린-C3(CBDV), (±)-칸나비크로메바린-C3(CBCV), (-)-△8-트랜스-THC-C3(△8-THCV), (±)-(1aS,3aR,8bR,8cR)-칸나비사이클로바린-C3(CBLV), 2-메틸-2-(4-메틸-2-펜테닐)-7-프로필-2H-1-벤조피란-5-올, △7-테트라하이드로칸나비바린-C3(△7-THCV), CBE-C2, 칸나비게로바린-C3(CBGV), 칸나비트리올-C1(CBTO), 칸나비놀-C4(CBN-C4), CBND-C4, (-)-△9-트랜스-테트라하이드로칸나비놀-C4(△9-THC-C4), 칸나비디올-C4(CBD-C4), CBC-C4, (-)-트랜스-△8-THC-C4, CBL-C4, 칸나비엘소인-C3(CBEV), CBG-C4, CBT-C2, 칸나비크로마논-C3, 칸나비글렌돌-C3(OH-이소-HHCV-C3), 칸나비옥세판-C5(CBX), 데하이드로칸나비푸란-C5(DCBF), 칸나비놀-C5(CBN), 칸나비노디올-C5(CBND), (-)-△9-트랜스-테트라하이드로칸나비놀-C5(△9-THC), (-)-△8-트랜스-(6aR,10aR)-테트라하이드로칸나비놀-C5(△8-THC), (±)-칸나비크로멘-C5(CBC), (-)-칸나비디올-C5(CBD), (±)-(1aS,3aR,8bR,8cR)-칸나비사이클롤C5(CBL), 칸나비시트란-C5(CBR), (-)-△9-(6aS,10aR-시스)-테트라하이드로칸나비놀-C5((-)-시스-△9-THC), (-)-△7-트랜스-(1R,3R,6R)-이소테트라하이드로칸나비놀-C5(트랜스-이소△7-THC), CBE-C4, 칸나비게롤-C5(CBG), 칸나비트리올-C3(CBTV), 칸나비놀 메틸 에테르-C5(CBNM), CBNDM-C5, 8-OH-CBN-C5(OH-CBN), OH-CBND-C5(OH-CBND), 10-옥소-△6a(10a)-테트라하이드로칸나비놀-C5(OTHC), 칸나비크로마논 D-C5, 칸나비쿠마로논-C5(CBCON-C5), 칸나비디올 모노메틸 에테르-C5(CBDM), △9-THCM-C5, (±)-3"-하이드록시-△4"-칸나비크로멘-C5, (5aS,6S,9R,9aR)-칸나비엘소인-C5(CBE), 2-게라닐-5-하이드록시-3-n-펜틸-1,4-벤조퀴논-C5, 5-게라닐 올리베톨산, 5-게라닐 올리베톨레이트, 8α-하이드록시-△9-테트라하이드로칸나비놀-C5(8α-OH-△9-THC), 8β-하이드록시-△9-테트라하이드로칸나비놀-C5(8β-OH-△9-THC), 10α-하이드록시-△8-테트라하이드로칸나비놀-C5(10α-OH-△8-THC), 10β-하이드록시-△8-테트라하이드로칸나비놀-C5(10β-OH-△8-THC), 10α-하이드록시-△9,11-헥사하이드로칸나비놀-C5, 9β,10β-에폭시헥사하이드로칸나비놀-C5, OH-CBD-C5(OH-CBD), 칸나비게롤 모노메틸 에테르-C5(CBGM), 칸나비크로마논-C5, CBT-C4, (±)-6,7-시스-에폭시칸나비게롤-C5, (±)-6,7-트랜스-에폭시칸나비게롤-C5, (-)-7-하이드록시칸나비크로만-C5, 칸나비모본-C5, (-)-트랜스-칸나비트리올-C5((-)-트랜스-CBT), (+)-트랜스-칸나비트리올-C5((+)-트랜스-CBT), (±)-시스-칸나비트리올-C5((±)-시스-CBT), (-)-트랜스-10-에톡시-9-하이드록시-△6a(10a)-테트라하이드로칸나비바린-C3 [(-)-트랜스-CBT-OEt], (-)-(6aR,9S,10S,10aR)-9,10-디하이드록시헥사하이드로칸나비놀-C5 [(-)-칸나비립솔] (CBR), 칸나비크로마논 C-C5, (-)-6a,7,10a-트리하이드록시-△9-테트라하이드로칸나비놀-C5[(-)-칸나비테트롤] (CBTT), 칸나비크로마논 B-C5, 8,9-디하이드록시-△6a(10a)-테트라하이드로칸나비놀-C5(8,9-디-OHCBT), (±)-4-아세톡시칸나비크로멘-C5, 2-아세톡시-6-게라닐-3-n-펜틸-1,4-벤조퀴논-C5, 11-아세톡시-△9-테트라하이드로칸나비놀C5(11-OAc-△9-THC), 5-아세틸-4-하이드록시칸나비게롤-C5, 4-아세톡시-2-게라닐-5-하이드록시-3-펜틸페놀-C5, (-)-트랜스-10-에톡시-9-하이드록시-△6a(10a)-테트라하이드로칸나비놀-C5((-)-트랜스-CBTOEt), 세스퀴칸나비게롤-C5(SesquiCBG), 카마게롤-C5, 4-테르페닐 칸나비놀레이트-C5, β-펜칠-△9-테트라하이드로칸나비놀레이트-C5, α-펜칠-△9-테트라하이드로칸나비놀레이트-C5, 에피-보르닐-△9-테트라하이드로칸나비놀레이트-C5, 보르닐-△9-테트라하이드로칸나비놀레이트-C5, α-테르페닐-△9-테트라하이드로칸나비놀레이트-C5, 4-테르페닐-△9-테트라하이드로칸나비놀레이트-C5, 6,6,9-트리메틸-3-펜틸-6H-디벤조[b,d]피란-1-올, 3-(1,1-디메틸헵틸)-6,6a,7,8,10,10a-헥사하이드로-1-하이드록시-6,6-디메틸-9H-디벤조[b,d]피란-9-온, (-)-(3S,4S)-7-하이드록시-△6-테트라하이드로칸나비놀-1,1-디메틸헵틸, (+)-(3S,4S)-7-하이드록시-△6-테트라하이드로칸나비놀-1,1-디메틸헵틸, 11-하이드록시-△9-테트라하이드로칸나비놀, 및 △8-테트라하이드로칸나비놀-11-오익산)); 특정 피페리딘 유사체(예를 들어, (-)-(6S,6aR,9R,10aR)-5,6,6a,7,8,9,10,10a-옥타하이드로-6-메틸-3-[(R)-1-메틸-4-페닐부톡시]-1,9-페난트리딘디올 1-아세테이트)), 특정 아미노알킬인돌 유사체(예를 들어, (R)-(+)-[2,3-디하이드로-5-메틸-3-(4-모르폴리닐메틸)-피롤로[1,2,3-데]-1,4-벤족사진-6-일]-1-나프탈레닐-메타논), 특정 개방 피란 고리 유사체(예를 들어, 2-[3-메틸-6-(1-메틸에테닐)-2-사이클로헥센-1-일]-5-펜틸-1,3-벤젠디올 및 4-(1,1-디메틸헵틸)-2,3'-디하이드록시-6'알파-(3-하이드록시프로필)-1',2',3',4',5',6'-헥사하이드로비페닐, 테트라하이드로칸나비포롤(THCP), 칸나비디포롤(CBDP), CBGP, CBCP, 이들의 산성 형태, 산성 형태의 염, 상기의 임의의 조합의 이량체, 상기의 임의의 조합의 삼량체, 상기의 임의의 조합의 중합체, 또는 이들의 임의의 조합.
본 출원에 기재된 칸나비노이드는 희귀 칸나비노이드일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 칸나비노이드는 암꽃의 건조 중량 기준으로 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.25%, 또는 0.1% 미만의 농도로 통상적인 대마초 품종에서 자연적으로 생성되는 칸나비노이드에 상응한다. 일부 구현예에서, 휘귀 칸나비노이드는 CBGA, CBGVA, THCVA, CBDVA, CBCVA, 및 CBCA를 포함한다. 일부 구현예에서, 휘귀 칸나비노이드는 THCA, THC, CBDA 또는 CBD가 아닌 칸나비노이드이다.
본 출원에 기재된 칸나비노이드는 또한 희귀하지 않은 칸나비노이드일 수 있다.
일부 구현예에서, 칸나비노이드는 표 1에 열거된 칸나비노이드로부터 선택된다.
표 1. 본 개시내용에 따른 칸나비노이드의 비제한적인 예.
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
칸나비노이드는 종종 "유형", 즉 프레닐 모이어티의 위상학적 배열에 의해 분류된다(예를 들어, 문헌(M. A. Elsohly and D. Slade, Life Sci., 2005, 78, 539-548; 및 L.O. Hanus et al. Nat. Prod. Rep., 2016, 33, 1357) 참조). 일반적으로, 칸나비노이드의 각각의 "유형"은 메타 위치에서 2개의 하이드록실 모이어티에 대한 레조르시놀 모이어티의 고리 치환에 대해 가능한 변형을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "CBG 유형" 칸나비노이드는 벤조산 모이어티의 6 위치에서 임의로 치환된 3-[(2E)-3,7-디메틸옥타-2,6-디에닐]-2,4-디하이드록시벤조산이다. 본원에 사용된 바와 같이, "CBG 유형" 칸나비노이드는 크로멘 모이어티의 7 위치에서 임의로 치환된 5-하이드록시-2-메틸-2-(4-메틸펜트-3-에닐)-크로멘-6-카복실산을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "THC 유형" 칸나비노이드는 벤조[c]크로멘 모이어티의 3 위치에서 임의로 치환된 (6aR,10aR)-1-하이드록시-6,6,9-트리메틸-6a,7,8,10a-테트라하이드로벤조[c]크로멘-2-카복실산이다. 본원에 사용된 바와 같이, "CBD 유형" 칸나비노이드는 벤조산 모이어티의 6 위치에서 임의로 치환된 2,4-디하이드록시-3-[(1R,6R)-3-메틸-6-프로프-1-엔-2-일사이클로헥스-2-엔-1-일]-벤조산이다. 일부 구현예에서, 각 "유형"에 대한 임의의 고리 치환은 임의로 치환된 C1-C11 알킬, 임의로 치환된 C1-C11 알케닐, 임의로 치환된 C1-C11 알키닐, 또는 임의로 치환된 C1-C11 아르알킬이다.
칸나비노이드 및 칸나비노이드 전구체의 생합성
본 개시내용의 양태는 숙주 세포에서 칸나비노이드의 생합성 생성을 위한 도구, 서열 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 생합성에 의해 칸나비노이드를 생성할 수 있는 효소의 발현을 교시한다.
비제한적인 예로서, 도 2에 도시된 효소 중 하나 이상을 사용하여 관심 칸나비노이드 또는 칸나비노이드 전구체를 생성할 수 있다. 도 1은 대마초에서 발견되는 가장 풍부한 파이토칸나비노이드에 대한 칸나비노이드 생합성 경로를 나타낸다. 또한 문헌(de Meijer et al. I, II, III, and IV (I: 2003, Genetics, 163:335-346; II: 2005, Euphytica, 145:189-198; III: 2009, Euphytica, 165:293-311; and IV: 2009, Euphytica, 168:95-112), 및 Carvalho et al. "Designing Microorganisms for Heterologous Biosynthesis of Cannabinoids" (2017) FEMS Yeast Research Jun 1;17(4))을 참조하며, 이들 각각은 그 전체가 본 출원에 참조로 포함된다.
칸나비노이드 생합성에 사용하기 위한 전구체 기질은 일반적으로 관심 칸나비노이드에 기초하여 선택된다는 것을 인식해야 한다. 칸나비노이드 전구체의 비제한적인 예는 도 2의 화학식 (1)-(8)의 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 화학식 (5)의 화합물을 포함하는 폴리케타이드는 프레닐화될 수 있다. 특정 구현예에서, 전구체는 도 1, 2, 또는 3에 나타낸 전구체 화합물이다. R이 1-40개의 탄소 원자를 포함하는 기질이 바람직하다. 일부 구현예에서, R이 3-8개의 탄소 원자를 포함하는 기질이 가장 바람직하다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 칸나비노이드 또는 칸나비노이드 전구체는 R 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 2를 참조한다. 일부 구현예에서, R은 수소일 수 있다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-40 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C2-40 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 직쇄 또는 분지형 알킬인 임의로 치환된 C2-40 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C3-8 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-C40 알킬, C1-C20 알킬, C1-C10 알킬, C1-C8 알킬, C1-C5 알킬, C3-C5 알킬, C3 알킬, 또는 C5 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-C20 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-C10 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-C8 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-C5 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-C7 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C3-C5 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C3 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 비치환된 C3 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 n-C3 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 n-프로필이다. 특정 구현예에서, R은 n-부틸이다. 특정 구현예에서, R은 n-펜틸이다. 특정 구현예에서, R은 n-헥실이다. 특정 구현예에서, R은 n-헵틸이다. 특정 구현예에서, R은 하기 화학식이다:
Figure pct00045
특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C4 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 비치환된 C4 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C5 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 비치환된 C5 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C6 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 비치환된 C6 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C7 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 비치환된 C7 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 하기 화학식이다:
Figure pct00046
특정 구현예에서, R은 하기 화학식이다:
Figure pct00047
특정 구현예에서, R은 하기 화학식이다:
Figure pct00048
특정 구현예에서, R은 하기 화학식이다:
Figure pct00049
특정 구현예에서, R은 하기 화학식이다:
Figure pct00050
특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 n-프로필이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 아릴로 임의로 치환된 n-프로필이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 페닐로 임의로 치환된 n-프로필이다. 특정 구현예에서, R은 비치환된 페닐로 치환된 n-프로필이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 부틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 n-부틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 아릴로 임의로 치환된 n-부틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 페닐로 임의로 치환된 n-부틸이다. 특정 구현예에서, R은 비치환된 페닐로 치환된 n-부틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 펜틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 n-펜틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 아릴로 임의로 치환된 n-펜틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 페닐로 임의로 치환된 n-펜틸이다. 특정 구현예에서, R은 비치환된 페닐로 치환된 n-펜틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 헥실이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 n-헥실이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 n-헵틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 n-옥틸이다. 특정 구현예에서, R은 아릴(예를 들어, 페닐)로 임의로 치환된 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 아실(예를 들어, -C(=O)Me)이다.
특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 알케닐(예를 들어, 치환된 또는 비치환된 C2-6 알케닐)이다. 특정 구현예에서, R은 치환된 또는 비치환된 C2-6 알케닐이다. 특정 구현예에서, R은 치환된 또는 비치환된 C2-5 알케닐이다. 특정 구현예에서, R은 하기 화학식이다:
Figure pct00051
특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 알키닐(예를 들어, 치환된 또는 비치환된 C2-6 알키닐)이다. 특정 구현예에서, R은 치환된 또는 비치환된 C2-6 알키닐이다. 특정 구현예에서, R은 하기 화학식이다:
Figure pct00052
특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 카보사이클릴이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 아릴(예를 들어, 페닐 또는 나프틸)이다.
전구체 기질의 사슬 길이는 C1-C40일 수 있다. 이들 기질은, 제한 없이, 지방족, 지환족 및 방향족을 포함하는 임의의 정도 및 임의의 종류의 분지화 또는 포화 또는 사슬 구조를 가질 수 있다. 또한, 이들은 하이드록시, 할로겐, 탄수화물, 포스페이트, 메틸-함유 또는 질소-함유 작용기를 포함하는 임의의 작용기를 포함할 수 있다.
예를 들어, 도 3은 칸나비노이드 경로에 대한 추정 전구체의 비배타적인 세트를 나타낸다. 4개 내지 8개의 총 탄소(도 3에서 "C4"-"C8") 및 선형 또는 분지형 사슬을 갖는 최대 10-12개의 총 탄소를 포함하는 지방족 카복실산이 이종 경로에 대한 전구체로서 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 메탄산, 부티르산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 이소발레르산, 옥탄산, 및 데칸산을 포함한다. 추가의 전구체는 에탄산 및 프로판산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 산 이외에, 에스테르, 염 및 산 형태가 모두 기질로서 사용될 수 있다. 기질은, 제한 없이, 지방족, 지환족 및 방향족을 포함하는 임의의 정도 및 임의의 종류의 분지화, 포화 및 사슬 구조를 가질 수 있다. 또한, 이들은, 제한 없이, 할로겐화, 하이드록실화, 아민화, 아실화, 알킬화, 페닐화 및/또는 펜던트 탄수화물, 포스페이트, 설페이트, 헤테로사이클 또는 지질, 또는 임의의 다른 작용기의 도입을 포함하는 임의의 기능적 변형 또는 변형의 조합을 포함할 수 있다.
본 출원에 개시된 임의의 효소에 대한 기질은 외인성으로 제공될 수 있거나 숙주 세포에 의해 내인성으로 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 칸나비노이드는 글루코스 기질로부터 생성되어 도 2에 나타낸 화학식 1의 화합물 및 CoA 전구체가 세포에 의해 합성된다. 다른 구현예에서, 전구체는 반응에 공급된다. 일부 구현예에서, 전구체는 도 2의 화학식 1-8로부터 선택된 화합물이다.
본 출원에 개시된 방법에 의해 생성된 칸나비노이드는 희귀 칸나비노이드를 포함한다. 휘귀 칸나비노이드를 포함하여 칸나비노이드가 자연에서 발생하는 낮은 농도로 인해, 대마초 식물로부터 산업적으로 상당한 양의 단리된 또는 정제된 칸나비노이드를 생성하는 것은, 예를 들어, 큰 부피의 대마초 식물과 식물 재료를 재배, 수확 및/또는 처리하기 위한 막대한 양의 공간, 노동, 시간 및 자본 요구사항으로 인해 금지될 수 있다(예를 들어, 문헌(Crandall, K., 2016. A Chronic Problem: Taming Energy Costs and Impacts from Marijuana Cultivation. EQ Research; Mills, E., 2012. The carbon footprint of indoor Cannabis production. Energy Policy, 46, pp.58-67; Jourabchi, M. and M. Lahet. 2014. Electrical Load Impacts of Indoor Commercial Cannabis Production. Presented to the Northwest Power and Conservation Council; O'Hare, M., D. Sanchez, and P. Alstone. 2013. Environmental Risks and Opportunities in Cannabis Cultivation. Washington State Liquor and Cannabis Board; 2018. Comparing Cannabis Cultivation Energy Consumption. New Frontier Data; and Madhusoodanan, J., 2019. Can cannabis go green? Nature Outlook: Cannabis) 참조; 이들 모두는 본 개시내용에 참조로 포함됨). 본 출원에 제공된 개시내용은 희귀 칸나비노이드를 포함하는 칸나비노이드를 고수율로 생성하기 위한 잠재적으로 효율적인 방법을 나타낸다. 본 출원에 제공된 개시내용은 또한 전통적인 칸나비노이드 생성 방법과 관련된 농업 관행 및 물 사용과 관련된 문제를 해결하기 위한 잠재적인 방법을 나타낸다(본 개시내용에 참조로 포함된 문헌(Dillis et al. "Water storage and Irrigation practices for cannabis drive seasonal patterns of water extraction and use in Northern California." Journal of Environmental Management 272 (2020): 110955) 참조).
개시된 방법에 의해 생성된 칸나비노이드는 또한 휘귀하지 않은 칸나비노이드를 포함한다. 특정 이론에 국한되지 않고, 본 출원에 기재된 방법은 희귀하지 않은 칸나비노이드를 생성하기 위한 전통적인 식물 기반 방법과 비교하여 유리할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 제공된 방법은 휘귀하지 않은 칸나비노이드를 일관되고 높은 수율로 생성하기 위한 잠재적으로 효율적인 수단을 나타낸다. 칸나비노이드를 식물로부터 수확하는 전통적인 칸나비노이드 생성 방법으로는 기류, 영양분, 조명, 온도 및 습도를 포함하여 일관되고 균일한 조건을 유지하는 것이 어려울 수 있다. 예를 들어, 식물 기반 방법을 사용하면 분기에 의해 생성된 미기후(microclimate)가 있을 수 있으며, 이것은 일관성 없는 수확량과 부산물 형성을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 방법은 식물로부터 칸나비노이드를 수확하는 것과 비교하여 관심 칸나비노이드를 생성하는 데 더 효율적이다. 예를 들어, 식물 기반 방법을 사용하면 종자에서 수확하는 데 최대 반년이 소요될 수 있는 반면, 절단에서 수확하는 데는 일반적으로 약 4개월이 소요된다. 건조, 경화 및 추출을 포함한 추가 단계는 일반적으로 식물 기반 방법에도 필요하다. 대조적으로, 일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 발효 기반 방법은 단지 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일이 소요된다. 일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 발효 기반 방법은 단지 약 3-5일이 소요된다. 일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 발효 기반 방법은 단지 약 5일이 소요된다. 일부 구현예에서, 본 출원에서 제공되는 방법은 규제 표준을 준수하는 데 필요한 보안의 양을 감소시킨다. 예를 들어, 식물 재배와 비교하여 본 출원에 기재된 방법을 실행하기 위해 더 작은 보안 영역을 모니터링하고 보호할 필요가 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 방법은 식물로부터 얻어진 칸나비노이드보다 유리하다.
말단 신타제(TS)
본 출원에 기재된 숙주 세포는 말단 신타제(TS)를 포함할 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "TS"는 프레닐 모이어티(예를 들어, 테르펜)의 산화적 고리화를 촉매하여 고리-함유 생성물(예를 들어, 헤테로사이클릭 고리-함유 생성물)을 생성할 수 있는 효소를 지칭한다. 특정 구현예에서, TS는 프레닐 모이어티(예를 들어, 테르펜)의 산화적 고리화를 촉매하여 카보사이클릭-고리 함유 생성물(예를 들어, 칸나비노이드)을 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, TS는 프레닐 모이어티(예를 들어, 테르펜)의 산화적 고리화를 촉매하여 헤테로고리-고리 함유 생성물(예를 들어, 칸나비노이드)을 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, TS는 프레닐 모이어티(예를 들어, 테르펜)의 산화적 고리화를 촉매하여 칸나비노이드를 생성할 수 있다.
TS 효소는 FAD-결합 및 BBE(Berberine Bridge Enzyme) 서열 모티프를 포함하는 단량체이다.
일부 구현예에서, TS는 "조상(ancestral)" 말단 신타제이다. 조상 TS는 전사체 데이터 세트를 기반으로 말단 신타제 계통발생에 적용된 돌연변이의 확률 모델로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, Hochberg 등은 본 개시내용에 그 전체가 참조로 포함된 문헌(Annu. Rev. Biophys. 2017. 46:247-69)에서 조상 단백질을 재구성하는 과정을 설명한다.
a. 기질
TS는 하나 이상의 기질을 사용할 수 있다. 일부 경우에, 프레닐 기 및/또는 R 기의 위치는 TS 기질 간에 상이하다. 예를 들어, TS는 화학식 (8w), 화학식 (8x), 화학식 (8'), 화학식 (8y), 및/또는 화학식 (8z)의 하나 이상의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 다형체, 공결정, 호변이성질체, 입체이성질체, 동위원소적으로 표지된 유도체, 또는 프로드럭을 기질로서 사용할 수 있다:
Figure pct00053
Figure pct00054
상기 식에서, a는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다.
특정 구현예에서, 화학식 (8')의 화합물은 하기 화학식 (8)의 화합물이다:
Figure pct00055
일부 구현예에서, R은 수소, 임의로 치환된 C1-C11 알킬, 임의로 치환된 C1-C11 알케닐, 임의로 치환된 C1-C11 알키닐, 또는 임의로 치환된 C1-C11 아르알킬이다.
일부 구현예에서, TS는 본 출원에 기재되고 도 2에 나타낸 화학식 (8)의 화합물의 프레닐 모이어티(예를 들어, 테르펜)의 산화적 고리화를 촉매한다. 특정 구현예에서, 화학식 (8)의 화합물은 하기 화학식 (8a)의 화합물이다:
Figure pct00056
일부 구현예에서, 화학식 (11)의 화합물의 생성은 대조군 기질로부터 화학식 (11)의 화합물의 생성과 비교하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 기질로부터 화학식 (10)의 화합물의 생성은 대조군 기질로부터 화학식 (10)의 화합물의 생성과 비교하여 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 기질로부터 화학식 (9)의 화합물의 생성은 대조군 기질로부터 화학식 (9)의 화합물의 생성과 비교하여 평가될 수 있다.
b. 생성물
일부 구현예에서, TS 효소는 CBG 유형 칸나비노이드로부터 CBD 유형 칸나비노이드, THC 유형 칸나비노이드 및/또는 CBC 유형 칸나비노이드의 형성을 촉매한다. CBGA가 기질인 구현예에서, TS 효소 CBDAS, THCAS 및 CBCAS는 일반적으로 칸나비디올산(CBDA), △9-테트라하이드로칸나비놀산(THCA) 및 칸나비크로멘산(CBCA)의 형성을 각각 촉매한다. 그러나, 일부 구현예에서, TS는 반응 조건에 따라 2개 초과의 상이한 생성물을 생성할 수 있다. 생성물의 다중기능성(promiscuity)이 대마초 말단 신타제 사이에서 언급되었다(예를 들어, Zirpel et al., J. Biotechnol. 2018 April 20; 272:40-7). 어떠한 이론에도 국한되지 않고, 반응 조건은 TS 효소의 기질 결합 부위를 형성하는 아미노산의 양성자화 상태 및 배향에 영향을 미치며, 이는 기질 및/또는 이들 효소의 생성물의 도킹에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 반응 환경의 pH는 THCAS 또는 CBDAS가 각각 THCA 또는 CBDAS보다 더 큰 비율로 CBCA를 생성하도록 할 수 있다(예를 들어, 그 전체가 참조로 포함된 Winnicki 및 Donsky의 미국 특허 번호 9,359,625 참조). 일부 구현예에서, TS는 세포질 조건 또는 세포소기관 조건과 같은 세포내 조건에서 소정의 생성물 특이성을 갖는다. 세포내 조건에 기초하여 소정의 생성물 특이성을 갖는 TS를 발현함으로써, TS를 발현하는 세포에 의해 생성된 생체내 생성물이 보다 예측 가능하게 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, TS는 pH 5.5에서 원하는 생성물을 생성한다. 일부 구현예에서, TS는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14의 pH에서 원하는 생성물을 생성한다. 일부 구현예에서, TS는 4.5와 8.0 사이의 pH에서 원하는 생성물을 생성한다. 일부 구현예에서, TS는 5와 6 사이의 pH에서 원하는 생성물을 생성한다. 일부 구현예에서, TS는 그 사이의 모든 값을 포함하여 약 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5,1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 또는 8.0인 pH에서 원하는 생성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 신포 펩티드가 TS에 의해 생성되는 생성물의 유형을 조절하는 특정 세포내 조건(예를 들어, 특정 세포소기관)을 갖는 특정 세포내 위치로 TS를 표적화하기 때문에 TS의 생성물 프로파일은 TS의 신호 펩티드에 의존한다. 예시적인 신호 펩티드는 아래에 더 상세히 논의된다. 세포내 조건의 차이는, 예를 들어, pH의 변화 및/또는 샤페론 단백질의 존재로 인한 TS 효소의 폴딩의 차이로 인해 TS 효소의 활성에 영향을 미칠 수 있다.
TS는 본 출원에 기재된 하나 이상의 기질을 사용하여 하나 이상의 생성물을 생성할 수 있다. TS 생성물의 비제한적인 예를 표 1에 나타낸다. 일부 경우에, TS는 하나의 기질을 사용하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 생성물을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, TS는 하나 초과의 기질을 사용하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상이한 기질을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, TS는 하기 화학식 (X-A)의 화합물 및/또는 화학식 (X-B)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 다형체, 공결정, 호변이성질체, 입체이성질체, 동위원소적으로 표지된 유도체, 또는 프로드럭을 생성할 수 있다:
Figure pct00057
상기 식에서,
Figure pct00058
는 원자가가 허용하는 대로 이중 결합 또는 단일 결합이고;
R은 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 카보사이클릴, 또는 임의로 치환된 아릴이고;
RZ1은 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 카보사이클릴, 또는 임의로 치환된 아릴이고;
RZ2는 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 카보사이클릴, 또는 임의로 치환된 아릴이고;
또는 임의로, RZ1 및 RZ2는 이들의 개재 원자와 함께 취하여 임의로 치환된 카보사이클릭 고리를 형성하고;
R3A는 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 또는 임의로 치환된 알키닐이고;
R3B는 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 또는 임의로 치환된 알키닐이고/이거나;
RY는 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 또는 임의로 치환된 알키닐이다.
일부 구현예에서, 화학식 (X-A)의 화합물은 하기 화합물이다:
Figure pct00059
Figure pct00060
; 및/또는
Figure pct00061
(테트라하이드로칸나비놀산(THCA) (10a)).
특정 구현예에서, 화학식 (10)의 화합물(
Figure pct00062
)은 탄소 10에서 *로 표지된 키랄 원자 및 탄소 6에서 **로 표지된 키랄 원자를 갖는다. 특정 구현예에서, 화학식 (10a)의 화합물(
Figure pct00063
)에서, 탄소 10에서 *로 표지된 키랄 원자는 R-배열 또는 S-배열이고; 탄소 6에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (10)의 화합물(
Figure pct00064
)에서, 탄소 10에서 *로 표지된 키랄 원자는 S-배열이고; 탄소 6에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열 또는 S-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (10)의 화합물(
Figure pct00065
)에서, 탄소 10에서 *로 표지된 키랄 원자는 R-배열이고, 탄소 6에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (10)의 화합물(
Figure pct00066
)은 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00067
특정 구현예에서, 화학식 (10)의 화합물(
Figure pct00068
)에서, 탄소 10에서 *로 표지된 키랄 원자는 S-배열이고, 탄소 6에서 **로 표지된 키랄 원자는 S-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (10)의 화합물(
Figure pct00069
)은 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00070
특정 구현예에서, 화학식 (10a)의 화합물(
Figure pct00071
)은 탄소 10에서 *로 표지된 키랄 원자 및 탄소 6에서 **로 표지된 키랄 원자를 갖는다. 특정 구현예에서, 화학식 (10a)의 화합물(
Figure pct00072
)에서, 탄소 10에서 *로 표지된 키랄 원자는 R-배열 또는 S-배열이고; 탄소 6 에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (10a)의 화합물(
Figure pct00073
)에서, 탄소 10에서 *로 표지된 키랄 원자는 S-배열이고; 탄소 6에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열 또는 S-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (10a)의 화합물(
Figure pct00074
)에서, 탄소 10에서 *로 표지된 키랄 원자는 R-배열이고, 탄소 6에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (10a)의 화합물(
Figure pct00075
)은 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00076
특정 구현예에서, 화학식 (10a)의 화합물(
Figure pct00077
)에서, 탄소 10에서 *로 표지된 키랄 원자는 S-배열이고, 탄소 6에서 **로 표지된 키랄 원자는 S-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (10a)의 화합물(
Figure pct00078
)은 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00079
일부 구현예에서, 화학식 (X-A)의 화합물은 하기 화합물이다:
Figure pct00080
Figure pct00081
; 및/또는
Figure pct00082
(칸나비크로멘산(CBCA) (11a)).
일부 구현예에서, 화학식 (X-A)의 화합물은 하기 화합물이다:
Figure pct00083
; 및/또는
Figure pct00084
(칸나비크로멘산(CBCA) (11a)).
일부 구현예에서, 화학식 (X-B)의 화합물은 하기 화합물이다:
Figure pct00085
; 및/또는
Figure pct00086
(칸나비디올산(CBDA) (9a)).
특정 구현예에서, 화학식 (9)의 화합물(
Figure pct00087
)은 탄소 3에서 *로 표지된 키랄 원자 및 탄소 4에서 **로 표지된 키랄 원자를 갖는다. 특정 구현예에서, 화학식 (9)의 화합물(
Figure pct00088
)에서, 탄소 3에서 *로 표지된 키랄 원자는 R-배열 또는 S-배열이고; 탄소 4에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (9)의 화합물(
Figure pct00089
)에서, 탄소 3에서 *로 표지된 키랄 원자는 S-배열이고; 탄소 4에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열 또는 S-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (9)의 화합물(
Figure pct00090
)에서, 탄소 3에서 *로 표지된 키랄 원자는 R-배열이고, 탄소 4에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (9)의 화합물의 화합물(
Figure pct00091
)은 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00092
특정 구현예에서, 화학식 (9)의 화합물(
Figure pct00093
)에서, 탄소 3에서 *로 표지된 키랄 원자는 S-배열이고, 탄소 4에서 **로 표지된 키랄 원자는 S-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (9)의 화합물(
Figure pct00094
)은 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00095
특정 구현예에서, 화학식 (9a)의 화합물(CBDA) (
Figure pct00096
)은 탄소 3에서 *로 표지된 키랄 원자 및 탄소 4에서 **로 표지된 키랄 원자를 갖는다. 특정 구현예에서, 화학식 (9a)의 화합물(
Figure pct00097
)에서, 탄소 3에서 *로 표지된 키랄 원자는 R-배열 또는 S-배열이고; 탄소 4에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (9a)의 화합물(
Figure pct00098
)에서, 탄소 3에서 *로 표지된 키랄 원자는 S-배열이고; 탄소 4에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열 또는 S-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (9a)의 화합물(
Figure pct00099
)에서, 탄소 3에서 *로 표지된 키랄 원자는 R-배열이고, 탄소 4에서 **로 표지된 키랄 원자는 R-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (9a)의 화합물(
Figure pct00100
)은 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00101
특정 구현예에서, 화학식 (9a)의 화합물(
Figure pct00102
)에서, 탄소 3에서 *로 표지된 키랄 원자는 S-배열이고, 탄소 4에서 **로 표지된 키랄 원자는 S-배열이다. 특정 구현예에서, 화학식 (9a)의 화합물(
Figure pct00103
)은 하기 화학식의 화합물이다:
Figure pct00104
일부 구현예에서, 도 2에 나타낸 바와 같이, TS는, 제한 없이, 임의의 다른 기질을 사용하여 화학식 (8')의 화합물:
Figure pct00105
(상기 식에서, a는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이고; R은 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 카보사이클릴, 또는 임의로 치환된 아릴임)로부터 생성된 화학식 (9), (10) 또는 (11)의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 다형체, 공결정, 호변이성질체, 입체이성질체, 동위원소적으로 표지된 유도체, 또는 프로드럭을 생성할 수 있는 효소를 포함하는 PT의 생성물로부터 칸나비노이드를 생성할 수 있다:
Figure pct00106
상기 식에서, R은 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 카보사이클릴, 또는 임의로 치환된 아릴이다. 특정 구현예에서, 화학식 (8')의 화합물은 하기 화학식 (8)의 화합물이다:
Figure pct00107
특정 구현예에서, 화학식 (9), (10), 또는 (11)의 화합물은, 예를 들어, 화학식 (8')의 기질 화합물(예를 들어, 화학식 (8)의 화합물)로부터 TS를 사용하여 생성된다. 화학식 (8')의 기질 화합물의 비제한적인 예는 칸나비게롤산(CBGA), 칸나비게로바린산(CBGVA), 또는 칸나비네롤산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 화학식 (9), (10), 또는 (11)의 생성물 화합물의 하이드록실 기 중 적어도 하나는 추가로 메틸화된다. 특정 구현예에서, 화학식 (9)의 화합물은 메틸화되어 하기 화학식 (12)의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 다형체, 공결정, 호변이성질체, 입체이성질체, 동위원소적으로 표지된 유도체, 또는 프로드럭을 형성한다:
Figure pct00108
본 출원에 기재된 임의의 효소, 숙주 세포, 및 방법은 표 1에 제공된 것과 같은 칸나비노이드 및 칸나비노이드 전구체의 생성에 사용될 수 있다. 일반적으로, 용어 "생성"은, 예를 들어, 특정 기질 또는 반응물로부터 하나 이상의 생성물(예를 들어, 관심 생성물 및/또는 부산물/오프-산물(off-product))의 생성을 지칭하기 위해 사용된다. 생성량은 당업자에게 친숙한 측정기준을 사용하여 최종 생성물 또는 중간 생성물과 같은 경로의 임의의 하나 이상의 단계에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 생성량은 단일 효소 반응(예를 들어, TS에 의한 화학식 (8)의 화합물의 화학식 (11)의 화합물로의 전환)에 대해 평가될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 생성량은 일련의 효소 반응(예를 들어, 도 1 및/또는 도 2에 나타낸 생합성 경로)에 대해 평가될 수 있다. 생성은, 예를 들어, 부피 생산성, 효소 동역학/반응 속도, 비생산성, 바이오매쓰 특이적 생산성, 역가, 수율, 및 하나 이상의 생성물(예컨대, 관심 생성물 및/또는 부산물/오프-산물)의 총 역가를 평가함으로써 당업계에 공지된 임의의 측정기준에 의해 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 생성을 측정하는 데 사용되는 측정기준은 연속 공정이 모니터링되는지(예를 들어, 여러 칸나비노이드 생합성 단계가 조합되어 사용되는지) 또는 특정 최종 생성물이 측정되는지 여부에 의존할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 연속 공정에 의해 생성을 모니터링하는 데 사용되는 측정기준은 부피 생산성, 효소 동역학 및 반응 속도를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 생성물의 생성을 모니터링하는 데 사용되는 측정기준은 비생산성, 바이오매쓰-특이적 생산성, 역가, 수율, 및/또는 하나 이상의 생성물(예를 들어, 관심 생성물 및/또는 부산물/오프-산물)의 총 역가를 포함할 수 있다.
하나 이상의 생성물(예를 들어, 관심 생성물 및/또는 부산물/오프-산물)의 생성은, 예를 들어, 반응/발효 종료 후 남아 있는 기질의 양을 결정함으로써 간접적으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 생성물(예를 들어, CBGA를 포함하는 화학식 (8)의 화합물 (화학식 8(a))로부터 칸나비크로멘산(CBCA)을 포함하는 화학식 (11)의 화합물 (화학식 (11a)))의 형성을 촉매하는 TS의 경우, 생성물의 생성은 화학식 (11)의 화합물을 직접 정량하거나 반응 후에 남아 있는 기질의 양(예를 들어, 화학식 (8)의 화합물의 양)을 정량함으로써 평가할 수 있다. 생성물(예를 들어, CBGA를 포함하는 화학식 (8)의 화합물 (화학식 8(a))로부터 테트라하이드로칸나비놀산(THCA)을 포함하는 화학식 (10)의 화합물 (화학식 (10a)))의 형성을 촉매하는 TS의 경우, 생성물의 생성은 화학식 (10)의 화합물을 직접 정량하거나 반응 후에 남아 있는 기질의 양(예를 들어, 화학식 (8)의 화합물의 양)을 정량함으로써 평가할 수 있다. 생성물(예를 들어, CBGA를 포함하는 화학식 (8)의 화합물 (화학식 8(a))로부터 칸나비디올산(CBDA)을 포함하는 화학식 (9)의 화합물 (화학식 (9a)))의 형성을 촉매하는 TS의 경우, 생성물의 생성은 화학식 (9)의 화합물을 직접 정량하거나 반응 후에 남아 있는 기질의 양(예를 들어, 화학식 (8)의 화합물의 양)을 정량함으로써 평가할 수 있다.
일부 구현예에서, 부산물의 생산량은 높지만 원하는 생성물의 생산량은 낮은 TS는, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실이 TS에 도입되어 원하는 생성물로의 생성을 이동하는 경우, 또는 TS가 반응 조건이 원하는 생성물의 생성에 유리한 위치에서 표시될 수 있는 경우 여전히 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, TS는 THCAS이거나, THCAS 활성을 갖는다. THCAS의 비제한적인 부산물은 화학식 (9) 및 (11)의 화합물, 및 화학식 (8)의 화합물의 테르펜이 다른 개방 -OH 기(탄소 1에서)로 고리화되어 생성된 생성물을 포함한다. 일부 구현예에서, TS는 CBDAS이거나, CBDAS 활성을 갖는다. CBDAS의 비제한적인 부산물은 화학식 (10) 및 (11)의 화합물, 및 화학식 (8)의 화합물의 테르펜이 다른 개방 -OH 기(탄소 1에서)로 고리화되어 생성된 생성물을 포함한다. 일부 구현예에서, TS는 CBCAS이거나, CBCAS 활성을 갖는다. CBCAS의 비제한적인 부산물은 화학식 (9) 또는 (10)의 화합물, 및 화학식 (8)의 화합물의 테르펜이 다른 개방 -OH 기(탄소 1에서)로 고리화되어 생성된 생성물을 포함한다. 화학식 (8)의 화합물에서 탄소는 다음과 같이 넘버링될 수 있다:
Figure pct00109
예를 들어, 문헌(Hanus et al., Nat Prod Rep. (2016) Nov 23;33(12):1357-1392)을 참조한다.
일부 구현예에서, 특정 TS에 의한 생성물(예를 들어, 관심 생성물 및/또는 부산물/오프-산물)의 생성은, 예를 들어, 대조군 TS에 대한 상대적 생성으로 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 숙주 세포에 의한 생성물의 생성은 대조군 숙주 세포와 비교하여 평가될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용과 관련된 TS 또는 숙주 세포는 대조군에 비해 더 높은 역가 또는 수율로 생성물을 생성할 수 있을 수 있다. 일부 구현예에서, TS는 대조군에 비해 더 빠른 속도로(예를 들어, 더 높은 생산성) 생성물을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, TS는 또 다른 기질에 비해 하나의 기질에 대해 우선적인 결합 및/또는 활성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TS는 또 다른 생성물에 비해 하나의 생성물을 우선적으로 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, TS는 그 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 0.0001 μg/L, 적어도 0.001 μg/L, 적어도 0.01 μg/L, 적어도 0.02 μg/L, 적어도 0.03 μg/L, 적어도 0.04 μg/L, 적어도 0.05 μg/L, 적어도 0.06 μg/L, 적어도 0.07 μg/L, 적어도 0.08 μg/L, 적어도 0.09 μg/L, 적어도 0.1 μg/L, 적어도 0.11 μg/L, 적어도 0.12 μg/L, 적어도 0.13 μg/L, 적어도 0.14 μg/L, 적어도 0.15 μg/L, 적어도 0.16 μg/L, 적어도 0.17 μg/L, 적어도 0.18 μg/L, 적어도 0.19 μg/L, 적어도 0.2 μg/L, 적어도 0.21 μg/L, 적어도 0.22 μg/L, 적어도 0.23 μg/L, 적어도 0.24 μg/L, 적어도 0.25 μg/L, 적어도 0.26 μg/L, 적어도 0.27 μg/L, 적어도 0.28 μg/L, 적어도 0.29 μg/L, 적어도 0.3 μg/L, 적어도 0.31 μg/L, 적어도 0.32 μg/L, 적어도 0.33 μg/L, 적어도 0.34 μg/L, 적어도 0.35 μg/L, 적어도 0.36 μg/L, 적어도 0.37 μg/L, 적어도 0.38 μg/L, 적어도 0.39 μg/L, 적어도 0.4 μg/L, 적어도 0.41 μg/L, 적어도 0.42 μg/L, 적어도 0.43 μg/L, 적어도 0.44 μg/L, 적어도 0.45 μg/L, 적어도 0.46 μg/L, 적어도 0.47 μg/L, 적어도 0.48 μg/L, 적어도 0.49 μg/L, 적어도 0.5 μg/L, 적어도 0.51 μg/L, 적어도 0.52 μg/L, 적어도 0.53 μg/L, 적어도 0.54 μg/L, 적어도 0.55 μg/L, 적어도 0.56 μg/L, 적어도 0.57 μg/L, 적어도 0.58 μg/L, 적어도 0.59 μg/L, 적어도 0.6 μg/L, 적어도 0.61 μg/L, 적어도 0.62 μg/L, 적어도 0.63 μg/L, 적어도 0.64 μg/L, 적어도 0.65 μg/L, 적어도 0.66 μg/L, 적어도 0.67 μg/L, 적어도 0.68 μg/L, 적어도 0.69 μg/L, 적어도 0.7 μg/L, 적어도 0.71 μg/L, 적어도 0.72 μg/L, 적어도 0.73 μg/L, 적어도 0.74 μg/L, 적어도 0.75 μg/L, 적어도 0.76 μg/L, 적어도 0.77 μg/L, 적어도 0.78 μg/L, 적어도 0.79 μg/L, 적어도 0.8 μg/L, 적어도 0.81 μg/L, 적어도 0.82 μg/L, 적어도 0.83 μg/L, 적어도 0.84 μg/L, 적어도 0.85 μg/L, 적어도 0.86 μg/L, 적어도 0.87 μg/L, 적어도 0.88 μg/L, 적어도 0.89 μg/L, 적어도 0.9 μg/L, 적어도 0.91 μg/L, 적어도 0.92 μg/L, 적어도 0.93 μg/L, 적어도 0.94 μg/L, 적어도 0.95 μg/L, 적어도 0.96 μg/L, 적어도 0.97 μg/L, 적어도 0.98 μg/L, 적어도 0.99 μg/L, 적어도 1 μg/L, 적어도 1.1 μg/L, 적어도 1.2 μg/L, 적어도 1.3 μg/L, 적어도 1.4 μg/L, 적어도 1.5 μg/L, 적어도 1.6 μg/L, 적어도 1.7 μg/L, 적어도 1.8 μg/L, 적어도 1.9 μg/L, 적어도 2 μg/L, 적어도 2.1 μg/L, 적어도 2.2 μg/L, 적어도 2.3 μg/L, 적어도 2.4 μg/L, 적어도 2.5 μg/L, 적어도 2.6 μg/L, 적어도 2.7 μg/L, 적어도 2.8 μg/L, 적어도 2.9 μg/L, 적어도 3 μg/L, 적어도 3.1 μg/L, 적어도 3.2 μg/L, 적어도 3.3 μg/L, 적어도 3.4 μg/L, 적어도 3.5 μg/L, 적어도 3.6 μg/L, 적어도 3.7 μg/L, 적어도 3.8 μg/L, 적어도 3.9 μg/L, 적어도 4 μg/L, 적어도 4.1 μg/L, 적어도 4.2 μg/L, 적어도 4.3 μg/L, 적어도 4.4 μg/L, 적어도 4.5 μg/L, 적어도 4.6 μg/L, 적어도 4.7 μg/L, 적어도 4.8 μg/L, 적어도 4.9 μg/L, 적어도 5 μg/L, 적어도 5.1 μg/L, 적어도 5.2 μg/L, 적어도 5.3 μg/L, 적어도 5.4 μg/L, 적어도 5.5 μg/L, 적어도 5.6 μg/L, 적어도 5.7 μg/L, 적어도 5.8 μg/L, 적어도 5.9 μg/L, 적어도 6 μg/L, 적어도 6.1 μg/L, 적어도 6.2 μg/L, 적어도 6.3 μg/L, 적어도 6.4 μg/L, 적어도 6.5 μg/L, 적어도 6.6 μg/L, 적어도 6.7 μg/L, 적어도 6.8 μg/L, 적어도 6.9 μg/L, 적어도 7 μg/L, 적어도 7.1 μg/L, 적어도 7.2 μg/L, 적어도 7.3 μg/L, 적어도 7.4 μg/L, 적어도 7.5 μg/L, 적어도 7.6 μg/L, 적어도 7.7 μg/L, 적어도 7.8 μg/L, 적어도 7.9 μg/L, 적어도 8 μg/L, 적어도 8.1 μg/L, 적어도 8.2 μg/L, 적어도 8.3 μg/L, 적어도 8.4 μg/L, 적어도 8.5 μg/L, 적어도 8.6 μg/L, 적어도 8.7 μg/L, 적어도 8.8 μg/L, 적어도 8.9 μg/L, 적어도 9 μg/L, 적어도 9.1 μg/L, 적어도 9.2 μg/L, 적어도 9.3 μg/L, 적어도 9.4 μg/L, 적어도 9.5 μg/L, 적어도 9.6 μg/L, 적어도 9.7 μg/L, 적어도 9.8 μg/L, 적어도 9.9 μg/L, 적어도 10 μg/L, 적어도 10.1 μg/L, 적어도 10.2 μg/L, 적어도 10.3 μg/L, 적어도 10.4 μg/L, 적어도 10.5 μg/L, 적어도 10.6 μg/L, 적어도 10.7 μg/L, 적어도 10.8 μg/L, 적어도 10.9 μg/L, 적어도 11 μg/L, 적어도 11.1 μg/L, 적어도 11.2 μg/L, 적어도 11.3 μg/L, 적어도 11.4 μg/L, 적어도 11.5 μg/L, 적어도 11.6 μg/L, 적어도 11.7 μg/L, 적어도 11.8 μg/L, 적어도 11.9 μg/L, 적어도 12 μg/L, 적어도 12.1 μg/L, 적어도 12.2 μg/L, 적어도 12.3 μg/L, 적어도 12.4 μg/L, 적어도 12.5 μg/L, 적어도 12.6 μg/L, 적어도 12.7 μg/L, 적어도 12.8 μg/L, 적어도 12.9 μg/L, 적어도 13 μg/L, 적어도 13.1 μg/L, 적어도 13.2 μg/L, 적어도 13.3 μg/L, 적어도 13.4 μg/L, 적어도 13.5 μg/L, 적어도 13.6 μg/L, 적어도 13.7 μg/L, 적어도 13.8 μg/L, 적어도 13.9 μg/L, 적어도 14 μg/L, 적어도 14.1 μg/L, 적어도 14.2 μg/L, 적어도 14.3 μg/L, 적어도 14.4 μg/L, 적어도 14.5 μg/L, 적어도 14.6 μg/L, 적어도 14.7 μg/L, 적어도 14.8 μg/L, 적어도 14.9 μg/L, 적어도 15 μg/L, 적어도 15.1 μg/L, 적어도 15.2 μg/L, 적어도 15.3 μg/L, 적어도 15.4 μg/L, 적어도 15.5 μg/L, 적어도 15.6 μg/L, 적어도 15.7 μg/L, 적어도 15.8 μg/L, 적어도 15.9 μg/L, 적어도 16 μg/L, 적어도 16.1 μg/L, 적어도 16.2 μg/L, 적어도 16.3 μg/L, 적어도 16.4 μg/L, 적어도 16.5 μg/L, 적어도 16.6 μg/L, 적어도 16.7 μg/L, 적어도 16.8 μg/L, 적어도 16.9 μg/L, 적어도 17 μg/L, 적어도 17.1 μg/L, 적어도 17.2 μg/L, 적어도 17.3 μg/L, 적어도 17.4 μg/L, 적어도 17.5 μg/L, 적어도 17.6 μg/L, 적어도 17.7 μg/L, 적어도 17.8 μg/L, 적어도 17.9 μg/L, 적어도 18 μg/L, 적어도 18.1 μg/L, 적어도 18.2 μg/L, 적어도 18.3 μg/L, 적어도 18.4 μg/L, 적어도 18.5 μg/L, 적어도 18.6 μg/L, 적어도 18.7 μg/L, 적어도 18.8 μg/L, 적어도 18.9 μg/L, 적어도 19 μg/L, 적어도 19.1 μg/L, 적어도 19.2 μg/L, 적어도 19.3 μg/L, 적어도 19.4 μg/L, 적어도 19.5 μg/L, 적어도 19.6 μg/L, 적어도 19.7 μg/L, 적어도 19.8 μg/L, 적어도 19.9 μg/L, 적어도 20 μg/L, 적어도 25 μg/L, 적어도 30 μg/L, 적어도 35 μg/L, 적어도 40 μg/L, 적어도 45 μg/L, 적어도 50 μg/L, 적어도 55 μg/L, 적어도 60 μg/L, 적어도 65 μg/L, 적어도 70 μg/L, 적어도 75 μg/L, 적어도 80 μg/L, 적어도 85 μg/L, 적어도 90 μg/L, 적어도 95 μg/L, 적어도 100 μg/L, 적어도 105 μg/L, 적어도 110 μg/L, 적어도 115 μg/L, 적어도 120 μg/L, 적어도 125 μg/L, 적어도 130 μg/L, 적어도 135 μg/L, 적어도 140 μg/L, 적어도 145 μg/L, 적어도 150 μg/L, 적어도 155 μg/L, 적어도 160 μg/L, 적어도 165 μg/L, 적어도 170 μg/L, 적어도 175 μg/L, 적어도 180 μg/L, 적어도 185 μg/L, 적어도 190 μg/L, 적어도 195 μg/L, 적어도 200 μg/L, 적어도 205 μg/L, 적어도 210 μg/L, 적어도 215 μg/L, 적어도 220 μg/L, 적어도 225 μg/L, 적어도 230 μg/L, 적어도 235 μg/L, 적어도 240 μg/L, 적어도 245 μg/L, 적어도 250 μg/L, 적어도 255 μg/L, 적어도 260 μg/L, 적어도 265 μg/L, 적어도 270 μg/L, 적어도 275 μg/L, 적어도 280 μg/L, 적어도 285 μg/L, 적어도 290 μg/L, 적어도 295 μg/L, 적어도 300 μg/L, 적어도 305 μg/L, 적어도 310 μg/L, 적어도 315 μg/L, 적어도 320 μg/L, 적어도 325 μg/L, 적어도 330 μg/L, 적어도 335 μg/L, 적어도 340 μg/L, 적어도 345 μg/L, 적어도 350 μg/L, 적어도 355 μg/L, 적어도 360 μg/L, 적어도 365 μg/L, 적어도 370 μg/L, 적어도 375 μg/L, 적어도 380 μg/L, 적어도 385 μg/L, 적어도 390 μg/L, 적어도 395 μg/L, 적어도 400 μg/L, 적어도 405 μg/L, 적어도 410 μg/L, 적어도 415 μg/L, 적어도 420 μg/L, 적어도 425 μg/L, 적어도 430 μg/L, 적어도 435 μg/L, 적어도 440 μg/L, 적어도 445 μg/L, 적어도 450 μg/L, 적어도 455 μg/L, 적어도 460 μg/L, 적어도 465 μg/L, 적어도 470 μg/L, 적어도 475 μg/L, 적어도 480 μg/L, 적어도 485 μg/L, 적어도 490 μg/L, 적어도 495 μg/L, 적어도 500 μg/L, 적어도 600 μg/L, 적어도 700 μg/L, 적어도 800 μg/L, 적어도 900 μg/L, 적어도 1,000 μg/L, 적어도 2,000 μg/L, 적어도 3,000 μg/L, 적어도 4,000 μg/L, 적어도 5,000 μg/L, 적어도 6,000 μg/L, 적어도 7,000 μg/L, 적어도 8,000 μg/L, 적어도 900 μg/L, 적어도 10,000 μg/L, 적어도 11,000 μg/L, 적어도 12,000 μg/L, 적어도 13,000 μg/L, 적어도 14,000 μg/L, 적어도 15,000 μg/L, 적어도 16,000 μg/L, 적어도 17,000 μg/L, 적어도 18,000 μg/L, 적어도 19,000 μg/L, 적어도 20,000 μg/L, 적어도 21,000 μg/L, 적어도 22,000 μg/L, 적어도 23,000 μg/L, 적어도 24,000 μg/L, 적어도 25,000 μg/L, 적어도 26,000 μg/L, 적어도 27,000 μg/L, 적어도 28,000 μg/L, 적어도 29,000 μg/L, 적어도 30,000 μg/L, 적어도 31,000 μg/L, 적어도 32,000 μg/L, 적어도 33,000 μg/L, 적어도 34,000 μg/L, 적어도 35,000 μg/L, 적어도 36,000 μg/L, 적어도 37,000 μg/L, 적어도 38,000 μg/L, 적어도 39,000 μg/L, 적어도 40,000 μg/L, 적어도 41,000 μg/L, 적어도 42,000 μg/L, 적어도 43,000 μg/L, 적어도 44,000 μg/L, 적어도 45,000 μg/L, 적어도 46,000 μg/L, 적어도 47,000 μg/L, 적어도 48,000 μg/L, 적어도 49,000 μg/L, 적어도 50,000 μg/L, 적어도 51,000 μg/L, 적어도 52,000 μg/L, 적어도 53,000 μg/L, 적어도 54,000 μg/L, 적어도 55,000 μg/L, 적어도 56,000 μg/L, 적어도 57,000 μg/L, 적어도 58,000 μg/L, 적어도 59,000 μg/L, 적어도 60,000 μg/L, 적어도 61,000 μg/L, 적어도 62,000 μg/L, 적어도 63,000 μg/L, 적어도 64,000 μg/L, 적어도 65,000 μg/L, 적어도 66,000 μg/L, 적어도 67,000 μg/L, 적어도 68,000 μg/L, 적어도 69,000 μg/L, 적어도 70,000 μg/L, 적어도 71,000 μg/L, 적어도 72,000 μg/L, 적어도 73,000 μg/L, 적어도 74,000 μg/L, 적어도 75,000 μg/L, 적어도 76,000 μg/L, 적어도 77,000 μg/L, 적어도 78,000 μg/L, 적어도 79,000 μg/L, 적어도 80,000 μg/L, 적어도 81,000 μg/L, 적어도 82,000 μg/L, 적어도 83,000 μg/L, 적어도 84,000 μg/L, 적어도 85,000 μg/L, 적어도 86,000 μg/L, 적어도 87,000 μg/L, 적어도 88,000 μg/L, 적어도 89,000 μg/L, 적어도 90,000 μg/L, 적어도 91,000 μg/L, 적어도 92,000 μg/L, 적어도 93,000 μg/L, 적어도 94,000 μg/L, 적어도 95,000 μg/L, 적어도 96,000 μg/L, 적어도 97,000 μg/L, 적어도 98,000 μg/L, 적어도 99,000 μg/L, 적어도 100,000 μg/L, 적어도 105,000 μg/L, 적어도 110,000 μg/L, 적어도 115,000 μg/L, 적어도 120,000 μg/L, 적어도 125,000 μg/L, 적어도 130,000 μg/L, 적어도 135,000 μg/L, 적어도 140,000 μg/L, 적어도 145,000 μg/L, 적어도 150,000 μg/L, 적어도 155,000 μg/L, 적어도 160,000 μg/L, 적어도 165,000 μg/L, 적어도 170,000 μg/L, 적어도 175,000 μg/L, 적어도 180,000 μg/L, 적어도 185,000 μg/L, 적어도 190,000 μg/L, 적어도 195,000 μg/L, 적어도 200,000 μg/L, 적어도 205,000 μg/L, 적어도 210,000 μg/L, 적어도 215,000 μg/L, 적어도 220,000 μg/L, 적어도 225,000 μg/L, 적어도 230,000 μg/L, 적어도 235,000 μg/L, 적어도 240,000 μg/L, 적어도 245,000 μg/L, 적어도 250,000 μg/L, 적어도 255,000 μg/L, 적어도 260,000 μg/L, 적어도 265,000 μg/L, 적어도 270,000 μg/L, 적어도 275,000 μg/L, 적어도 280,000 μg/L, 적어도 285,000 μg/L, 적어도 290,000 μg/L, 적어도 295,000 μg/L, 적어도 300,000 μg/L, 적어도 305,000 μg/L, 적어도 310,000 μg/L, 적어도 315,000 μg/L, 적어도 320,000 μg/L, 적어도 325,000 μg/L, 적어도 330,000 μg/L, 적어도 335,000 μg/L, 적어도 340,000 μg/L, 적어도 345,000 μg/L, 적어도 350,000 μg/L, 적어도 355,000 μg/L, 적어도 360,000 μg/L, 적어도 365,000 μg/L, 적어도 370,000 μg/L, 적어도 375,000 μg/L, 적어도 380,000 μg/L, 적어도 385,000 μg/L, 적어도 390,000 μg/L, 적어도 395,000 μg/L, 적어도 400,000 μg/L, 적어도 405,000 μg/L, 적어도 410,000 μg/L, 적어도 415,000 μg/L, 적어도 420,000 μg/L, 적어도 425,000 μg/L, 적어도 430,000 μg/L, 적어도 435,000 μg/L, 적어도 440,000 μg/L, 적어도 445,000 μg/L, 적어도 450,000 μg/L, 적어도 455,000 μg/L, 적어도 460,000 μg/L, 적어도 465,000 μg/L, 적어도 470,000 μg/L, 적어도 475,000 μg/L, 적어도 480,000 μg/L, 적어도 485,000 μg/L, 적어도 490,000 μg/L, 적어도 495,000 μg/L, 적어도 500,000 μg/L, 적어도 600,000 μg/L, 적어도 700,000 μg/L, 적어도 800,000 μg/L, 적어도 900,000 μg/L, 또는 적어도 1,000,000 μg/L의 본원에 기재된 생성물을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (11)의 화합물(예를 들어, 화학식 (11a)의 화합물)이다. 일부 구현예에서, 생성물은 CBCA 및/또는 CBCVA이다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (9)의 화합물(예를 들어, 화학식 (9a)의 화합물)이다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (10)의 화합물(예를 들어, 화학식 (10a)의 화합물)이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용과 관련된 TS 또는 숙주 세포는 대조군(예를 들어, 양성 대조군)에 의해 생성된 것보다 더 많은 양의 하나 이상의 생성물을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용과 관련된 TS 또는 숙주 세포는 대조군(예를 들어, 양성 대조군)에 의해 생성된 하나 이상의 생성물의 양의 적어도 0.05%(예를 들어, 적어도 0.075%, 적어도 0.1%, 적어도 0.5%, 적어도 0.75%, 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 적어도 1,000%)를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 생성물은 CBCA 및/또는 CBCVA이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용과 관련된 TS 또는 숙주 세포는 대조군(예를 들어, 양성 대조군)에 의해 생성된 하나 초과의 생성물을 적어도 0.05%(예를 들어, 적어도 0.075%, 적어도 0.1%, 적어도 0.5%, 적어도 0.75%, 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 9, 적어도 9, 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 적어도 1,000%) 더 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (11)의 화합물(예를 들어, 화학식 (11a)의 화합물)이다. 일부 구현예에서, 생성물은 CBCA 및/또는 CBCVA이다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (9)의 화합물(예를 들어, 화학식 (9a)의 화합물)이다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (10)의 화합물(예를 들어, 화학식 (10a)의 화합물)이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용과 관련된 TS 또는 숙주 세포는 대조군(예를 들어, 양성 대조군)에 의해 생성된 하나 이상의 생성물의 역가 또는 수율의 적어도 0.05%(예를 들어, 적어도 0.075%, 적어도 0.1%, 적어도 0.5%, 적어도 0.75%, 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 적어도 1,000%)를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 생성물은 CBCA 및/또는 CBCVA이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용과 관련된 TS 또는 숙주 세포는 대조군과 비교하여 하나 이상의 생성물의 적어도 0.05%(예를 들어, 적어도 0.075%, 적어도 0.1%, 적어도 0.5%, 적어도 0.75%, 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 적어도 1,000%) 더 높은 역가 또는 수율을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (11)의 화합물(예를 들어, 화학식 (11a)의 화합물)이다. 일부 구현예에서, 생성물은 CBCA 및/또는 CBCVA이다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (9)의 화합물(예를 들어, 화학식 (9a)의 화합물)이다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (10)의 화합물(예를 들어, 화학식 (10a)의 화합물)이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용과 관련된 TS 또는 숙주 세포는 대조군(예를 들어, 양성 대조군)의 속도에 비해 적어도 0.05%(예를 들어, 적어도 0.075%, 적어도 0.1%, 적어도 0.5%, 적어도 0.75%, 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 적어도 1,000%)인 속도로 하나 이상의 생성물을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 생성물은 CBCA 및/또는 CBCVA이다. 일부 구현예에서, TS는 대조군(예를 들어, 양성 대조군)에 비해 적어도 1%(예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 적어도 1,000%) 더 빠른 속도로 하나 이상의 생성물을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (11)의 화합물(예를 들어, 화학식 (11a)의 화합물)이다. 일부 구현예에서, 생성물은 CBCA 및/또는 CBCVA이다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (9)의 화합물(예를 들어, 화학식 (9a)의 화합물)이다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (10)의 화합물(예를 들어, 화학식 (10a)의 화합물)이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용과 관련된 TS 또는 숙주 세포는 대조군(예를 들어, 양성 대조군)에 의해 생성된 것보다 적은 양의 하나 이상의 생성물을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용과 관련된 TS 또는 숙주 세포는 대조군(예를 들어, 양성 대조군)에 비해 하나 이상의 생성물을 적어도 0.05%(예를 들어, 적어도 0.075%, 적어도 0.1%, 적어도 0.5%, 적어도 0.75%, 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 적어도 1,000%) 더 적게 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (11)의 화합물(예를 들어, 화학식 (11a)의 화합물)이다. 일부 구현예에서, 생성물은 CBCA 및/또는 CBCVA이다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (9)의 화합물(예를 들어, 화학식 (9a)의 화합물)이다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (10)의 화합물(예를 들어, 화학식 (10a)의 화합물)이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용과 관련된 TS 또는 숙주 세포는 대조군(예를 들어, 양성 대조군)에 비해 하나 이상의 생성물을 적어도 0.05%(예를 들어, 적어도 0.075%, 적어도 0.1%, 적어도 0.5%, 적어도 0.75%, 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 적어도 1,000%) 더 낮은 역가 또는 수율로 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (11)의 화합물(예를 들어, 화학식 (11a)의 화합물)이다. 일부 구현예에서, 생성물은 CBCA 및/또는 CBCVA이다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (9)의 화합물(예를 들어, 화학식 (9a)의 화합물)이다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (10)의 화합물(예를 들어, 화학식 (10a)의 화합물)이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용과 관련된 TS 또는 숙주 세포는 대조군(예를 들어, 양성 대조군)에 비해 적어도 0.5%(예를 들어, 적어도 0.075%, 적어도 0.1%, 적어도 0.5%, 적어도 0.75%, 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 100%, 적어도 125%, 적어도 150%, 적어도 175%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400%, 적어도 500%, 적어도 600%, 적어도 700%, 적어도 800%, 적어도 900%, 또는 적어도 1,000%) 더 느린 속도로 하나 이상의 생성물을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (11)의 화합물(예를 들어, 화학식 (11a)의 화합물)이다. 일부 구현예에서, 생성물은 CBCA 및/또는 CBCVA이다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (9)의 화합물(예를 들어, 화학식 (9a)의 화합물)이다. 일부 구현예에서, 생성물은 화학식 (10)의 화합물(예를 들어, 화학식 (10a)의 화합물)이다.
실험 TS와 대조군의 비교를 포함하는 본원에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 대조군은 야생형 참조 TS이다. 일부 구현예에서, 대조군은 야생형 씨. 사티바 THCAS(예를 들어, 서열 21 포함)이다. 일부 구현예에서, 대조군은 THCAS 활성 이외에 CBCAS 활성도 나타내는 야생형 씨. 사티바 THCAS(예를 들어, 서열번호 21 포함)이다. 일부 구현예에서, 대조군 TS는 실험 TS 내에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실의 존재를 제외하고 실험 TS와 동일하다.
실험 숙주 세포와 대조군 숙주 세포의 비교를 포함하는 본원에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 대조군 숙주 세포는 TS를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 대조군 숙주 세포는 야생형 세포이다. 일부 구현예에서, 대조군 숙주 세포는 야생형 씨. 사티바 THCAS를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 대조군은 THCAS 활성 이외에 CBCAS 활성도 나타내는 야생형 씨. 사티바 THCAS이다. 대마초에서, 야생형 CsTHCAS는 선모(glandular trichome)로 분비된다. 그러나, 하기에 더 상세히 기재된 바와 같이, 예를 들어, 특정 세포 구획 및/또는 세포 분비 경로에 대한 재조합 숙주 세포에 의해 생성된 칸나비노이드의 국소화를 제어하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 대조군은 CBCAS 활성을 또한 나타내는 야생형 씨. 사티바 THCAS이며, 여기서 천연 신호 서열이 제거되고(예를 들어, 서열 번호 21에 기재된 바와 같음), 임의로 하나 이상의 이종 신호 서열로 대체된다. 일부 구현예에서, 대조군 숙주 세포는 서열번호 22를 포함하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 대조군 숙주 세포는 실험 숙주 세포에서 이종 발현되는 TS 내의 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실의 존재를 제외하고 실험 숙주 세포와 유전적으로 동일하다.
일부 구현예에서, TS는 생성물의 혼합물을 생성할 수 있다. 예를 들어, 혼합물은 하나 이상의 화학식 (11)의 화합물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 혼합물은 화학식 (9), 화학식 (10), 및/또는 화학식 (11)의 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 생성물 혼합물 내의 화합물의 적어도 약 50-100%, 적어도 약 50-60%, 적어도 약 60-70%, 적어도 약 70-80%, 적어도 약 80-90%, 적어도 약 90-100%는 화학식 (11a)의 화합물이다. 일부 구현예에서, 생성물 혼합물 내의 화합물의 약 50-100%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%는 CBCA이다. 일부 구현예에서, 생성물 혼합물 내의 화합물의 약 50-100%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%는 CBCVA이다.
일부 구현예에서, TS는 화학식 (11)의 또 다른 화합물, 화학식 (10a)의 화합물, 화학식 (9a)의 화합물, 또는 이들의 임의의 조합보다 화학식 (11a)의 화합물을 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4배, 5배, 6배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배 또는 1,000배 더 많이 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, TS는 화학식 (11)의 또 다른 화합물, 화학식 (10a)의 화합물, 화학식 (9a)의 화합물, 또는 이들의 임의의 조합보다 화학식 (11a)의 화합물을 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4배, 5배, 6배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배 또는 1,000배 더 적게 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 생성물 혼합물 내의 화합물의 적어도 약 50-100%, 적어도 약 50-60%, 적어도 약 60-70%, 적어도 약 70-80%, 적어도 약 80-90%, 적어도 약 90-100%는 화학식 (9a)의 화합물이다. 일부 구현예에서, TS는 화학식 (9)의 또 다른 화합물, 화학식 (10a)의 화합물, 화학식 (11a)의 화합물, 또는 이들의 임의의 조합보다 화학식 (9a)의 화합물을 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4배, 5배, 6배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배 또는 1,000배 더 많이 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, TS는 화학식 (9)의 또 다른 화합물, 화학식 (10a)의 화합물, 화학식 (11a)의 화합물, 또는 이들의 임의의 조합보다 화학식 (9a)의 화합물을 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4배, 5배, 6배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배 또는 1,000배 더 적게 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 생성물 혼합물 내의 화합물의 적어도 약 50-100%, 적어도 약 50-60%, 적어도 약 60-70%, 적어도 약 70-80%, 적어도 약 80-90%, 적어도 약 90-100%는 화학식 (10a)의 화합물이다. 일부 구현예에서, TS는 화학식 (10)의 또 다른 화합물, 화학식 (9a)의 화합물, 화학식 (11a)의 화합물, 또는 이들의 임의의 조합보다 화학식 (10a)의 화합물을 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4배, 5배, 6배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배 또는 1,000배 더 많이 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, TS는 화학식 (10)의 또 다른 화합물, 화학식 (9a)의 화합물, 화학식 (11a)의 화합물, 또는 이들의 임의의 조합보다 화학식 (10a)의 화합물을 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2배, 2.1배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 2.6배, 2.7배, 2.8배, 2.9배, 3배, 3.1배, 3.2배, 3.3배, 3.4배, 3.5배, 3.6배, 3.7배, 3.8배, 3.9배, 4배, 5배, 6배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배 또는 1,000배 더 적게 생성할 수 있다.
c. 신호 펩티드
TS를 포함하여 본 출원에 기재된 임의의 효소는 신호 펩티드를 포함할 수 있다. "신호 서열"로도 지칭되는 신호 펩티드는 일반적으로 약 15-30개의 아미노산을 포함하고 새로 번역된 단백질을 특정 세포 구획 및/또는 세포 분비 경로로 이동을 조절하는 데 관여한다.
일부 경우에, 신호 펩티드는 관심 효소의 국소화를 촉진한다. 세포내 공간에서 관심 효소의 국소화를 촉진하는 신호 펩티드의 비제한적인 예는 MF알파2 신호 펩티드이다. 예를 들어, UniProtKB - U3N2M0 (잔기 1-19) 및 문헌(Singh et al., Nucleic Acids Res. (1983) Jun 25; 11(12): 4049-4063)으로부터의 신호 서열을 참조한다. 다른 경우에, 신호 펩티드는 단백질이 소포체(ER)로부터 분비되는 것을 방지할 수 있고/있거나 이러한 단백질이 의도치 않게 내보내진 경우 이러한 단백질의 복귀를 촉진할 수 있다. 이러한 신호 펩티드는 "ER 체류 신호"로 지칭될 수 있다. 단백질이 ER로부터 분비되는 것을 방지할 수 있고/있거나 이러한 단백질이 의도치 않게 내보내진 경우 이러한 단백질의 복귀를 촉진할 수 있는 신호 펩티드의 비제한적인 예는 HDEL 신호 펩티드이다. 예를 들어, 문헌(Pelham et al., EMBO J (1988)7:1757-1762)을 참조한다.
신호 펩티드의 비제한적인 예는 하기 표 2에 열거된 것들을 포함한다. 당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 당업계에 공지된 다른 신호 펩티드도 본 개시내용의 양태와 양립할 수 있을 것이다. 신호 펩티드는 관심 효소를 코딩하는 서열에 대해 N-말단 또는 C-말단에 위치할 수 있다. 관심 효소를 코딩하는 서열은 2개 이상의 신호 펩티드에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 효소는 N-말단에서 하나 이상의 신호 펩티드 및 C-말단에서 하나 이상의 신호 펩티드에 연결될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, MF알파2 신호 펩티드는 관심 효소를 코딩하는 서열의 N-말단에 위치할 수 있고/있거나 HDEL 신호 펩티드는 관심 효소를 코딩하는 서열의 C-말단에 위치할 수 있다. 다른 구현예에서, HDEL 신호 펩티드는 관심 효소를 코딩하는 서열의 N-말단에 위치할 수 있고/있거나 MF알파2 신호 펩티드는 관심 효소를 코딩하는 서열의 C-말단에 위치할 수 있다.
어떠한 이론에도 국한되지 않고, MF알파2 신호 펩티드 및/또는 HDEL 신호 펩티드에 연결된 TS 효소와 같은 효소는 ER 및/또는 골지체와 같은 분비 경로와 관련된 세포내 위치에 국소화될 것으로 여겨진다. 분비 경로의 조건 중 하나 이상이 씨. 사티바로부터 유래된 TS 효소의 개선된 활성에 기여하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, ER 및 골지체는 이황화물 브릿지의 형성을 도울 수 있는 산화적 환경이다. 어떠한 이론에도 국한되지 않고, 신호 펩티드, 및 신호 펩티드를 포함하는 단백질의 결과적인 세포내 국소화는 단백질의 안정성 및/또는 반감기에 차등적으로 영향을 미칠 수 있다.
일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호 3, 4, 16-19, 31, 또는 32 중 하나 이상과, 그 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 또는 100% 동일한 핵산 또는 단백질 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호 3, 4, 16, 또는 31 중 어느 하나와 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개 이하의 아미노산이 상이한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호 3, 4, 16, 또는 31의 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호 16, 또는 서열번호 16의 서열에 비해 2개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호 17과 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산이 상이한 단백질 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드는 서열번호 17, 또는 서열번호 17의 서열에 비해 1개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 갖는 서열을 포함한다.
관심 효소를 코딩하는 서열의 N-말단에 위치한 신호 펩티드는 신호 펩티드의 N-말단에 메티오닌을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 신호 펩티드가 관심 효소를 코딩하는 서열의 N-말단에 위치할 경우 메티오닌이 신호 펩티드에 첨가된다. 일부 구현예에서, 일반적으로 관심 효소와 관련된 신호 펩티드(예를 들어, 자연 발생 관심 효소에 존재하는 자연 발생 신호 펩티드)는 관심 숙주 세포에서 특정 세포 구획으로 효소를 표적화하기에 적합한 하나 이상의 상이한 신호 펩티드로 제거되거나 대체될 수 있다.
표 2. 신호 펩티드의 비제한적인 예
Figure pct00110
일부 구현예에서, TS는 테트라하이드로칸나비놀산 신타제(THCAS), 칸나비디올산 신타제(CBDAS), 및/또는 칸나비크로멘산 신타제(CBCAS)이다. 당업자는 TS가 자연 발생 공급원 및 합성 공급원(예를 들어, 비자연 발생 TS)을 포함하는 임의의 공급원으로부터 얻어질 수 있음을 인식할 것이다.
테트라하이드로칸나비놀산 신타제(THCAS)
본 출원에 기재된 숙주 세포는 테트라하이드로칸나비놀산 신타제(THCAS)인 TS를 포함할 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "테트라하이드로칸나비놀산 신타제(THCAS)" 또는 "△1-테트라하이드로칸나비놀산(THCA) 신타제"는 화학식 (8)의 화합물의 프레닐 모이어티(예를 들어, 테르펜)의 산화적 고리화를 촉매하여 화학식 (10)의 고리-함유 생성물(예를 들어, 헤테로사이클릭 고리-함유 생성물, 카보사이클릭-고리 함유 생성물)을 생성할 수 있는 효소를 지칭한다. 특정 구현예에서, THCAS는 화학식 (8)의 화합물로부터 △9-테트라하이드로칸나비놀산(△-THCA, THCA, △-테트라하이드로-칸나비바린산 A(△-THCVA-C3 A), THCVA, THCPA, 또는 화학식 10(a)의 화합물을 생성할 수 있는 효소를 지칭한다. 특정 구현예에서, THCAS는 △9-테트라하이드로칸나비놀산(△9-THCA, THCA, 또는 화학식 10(a)의 화합물)을 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, THCAS는 △9-테트라하이드로칸나비바린산(△-THCVA, THCVA, 또는 R이 n-프로필인 화학식 10의 화합물)을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, THCAS는 3-프레닐-2,4-디하이드록시-6-알킬벤조산과 같은 기질의 산화적 고리화를 촉매할 수 있다. 일부 구현예에서, THCAS는 칸나비게롤산(CBGA)을 기질로 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, THCAS는 CBGA로부터 △9-THCA를 생성한다. 일부 구현예에서, THCAS는 칸나비게로바린산(CBGVA)의 산화적 고리화를 촉매할 수 있다. 일부 구현예에서, THCAS는 다른 기질과 비교하여 CBGA 기질에 대한 특이성을 나타낸다. 일부 구현예에서, THCAS는 R이 C4 알킬(예를 들어, n-부틸)이거나 R이 C7 알킬(예를 들어, n-헵틸)인 도 2의 화학식 (8)의 화합물을 기질로서 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, THCAS는 R이 C4 알킬(예를 들어, n-부틸)인 화학식 (8)의 화합물을 기질로서 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, THCAS는 R이 C7 알킬(예를 들어, n-헵틸)인 도 2의 화학식 (8)의 화합물을 기질로서 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, THCAS는 생성물로서 THCP를 생성할 수 있는 기질에 대한 특이성을 나타낸다.
일부 구현예에서, THCAS는 씨. 사티바로부터 유래한다. 씨. 사티바 THCAS는 공유 결합된 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD)를 보조인자로서 사용하고 분자 산소를 최종 전자 수용체로서 사용하여 칸나비게롤산(CBGA)(도 4 구조 8a)의 게라닐 모이어티의 산화적 고리화를 수행하여 테트라하이드로칸나비놀산(도 4 구조 10a)을 형성한다. THCAS는 씨. 사티바의 잎 싹으로부터 효소를 추출하고 CBGA를 기질로 부가할 때 시험관내에서 THCA 신타제 활성을 확인한 후 Taura 등(JACS. 1995)에 의해 처음 발견되고 특성화되었다. Shoyama 등(J Mol Biol. 2012 Oct 12;423(1):96-105)에 의해 발표된 효소의 결정 구조는 효소가 보조인자 FAD의 분자에 공유 결합된다는 것을 보여주었다. 예를 들어, 문헌(Sirikantarams et al., J. Biol. Chem. 2004 Sept 17; 279(38):39767-39774) 또한 참조한다. 씨. 사티바에는 여러 THCAS 동질효소가 있다.
일부 구현예에서, 씨. 사티바 THCAS(Uniprot KB 수탁 번호: I1V0C5)는 하기에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 신호 펩티드는 밑줄 치고 볼드체로 표시되어 있다:
Figure pct00111
일부 구현예에서, THCAS는 하기에 나타낸 서열을 포함한다:
Figure pct00112
서열번호 21을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 예는 다음과 같다:
Figure pct00113
일부 구현예에서, THCS는 하기에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 신호 펩티드는 밑줄 치고 볼드체로 표시되어 있다:
Figure pct00114
신호 펩티드를 코딩하는 서열에 밑줄 치고 볼드체로 표시된 서열번호 23을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 비제한적인 예를 하기에 나타낸다:
Figure pct00115
일부 구현예에서, 씨. 사티바 THCAS는 UniProtKB - Q8GTB6(서열번호 14)에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 신호 펩티드는 밑줄 치고 볼드체로 표시되어 있다:
Figure pct00116
일부 구현예에서, THCAS는 하기에 나타낸 서열을 포함한다:
Figure pct00117
THCAS 효소의 추가의 비제한적인 예는 또한 미국 특허 번호 9,512,391 및 미국 공개 번호 2018/0179564에서 찾을 수 있으며, 이들은 그 전체가 본 출원에 참조로 포함된다.
칸나비디올산 신타제(CBDAS)
본 출원에 기재된 숙주 세포는 칸나비디올산 신타제(CBDAS)인 TS를 포함할 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "CBDAS"는 화학식 (8)의 화합물의 프레닐 모이어티(예를 들어, 테르펜)의 산화적 고리화를 촉매하여 화학식 9의 화합물을 생성할 수 있는 효소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 화학식 9의 화합물은 화학식 (9a)의 화합물(칸나비디올산(CBDA)), CBDVA, 또는 CBDP이다. CBDAS는 칸나비게롤산(CBGA) 또는 칸나비네롤산을 기질로서 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 칸나비디올산 신타제는 칸나비게롤산(CBGA)을 산화적 고리화하여 칸나비디올산(CBDA)을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, CBDAS는 칸나비게로바린산(CBVGA)과 같은 3-게라닐-2,4-디하이드로-6-알킬벤조산과 같은 다른 기질의 산화적 고리화를 촉매할 수 있다. 일부 구현예에서, CBDAS는 CBGA 기질에 대한 특이성을 나타낸다.
일부 구현예에서, CBDAS는 대마초로부터 유래된다. 씨. 사티바에서, CBDAS는 CBDAS 유전자에 의해 코딩되며 플라보효소이다. CBDAS를 포함하는 아미노산 서열의 비제한적인 예는 씨. 사티바로부터의 UniProtKB - A6P6V9(서열번호 13)에 의해 제공되며, 여기서 신호 펩티드가 밑줄 치고 볼드체로 표시되어 있다:
Figure pct00118
일부 구현예에서, CBDAS는 하기에 나타낸 서열을 포함한다:
Figure pct00119
CBDAS 효소의 추가의 비제한적인 예는 또한 미국 특허 번호 9,512,391 및 미국 공개 번호 2018/0179564에서 찾을 수 있으며, 이들은 그 전체가 본 출원에 참조로 포함된다.
칸나비크로멘산 신타제(CBCAS)
본 출원에 기재된 숙주 세포는 칸나비크로멘산 신타제(CBCAS)인 TS를 포함할 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "CBCAS"는 화학식 (8)의 화합물의 프레닐 모이어티(예를 들어, 테르펜)의 산화적 고리화를 촉매하여 화학식 (11)의 화합물을 생성할 수 있는 효소를 지칭한다. 일부 구현예에서, 화학식 (11)의 화합물은 화학식 (11a)의 화합물(칸나비크로멘산(CBCA)), CBCVA, 또는 C7 알킬(헵틸) 기로서 R을 갖는 화학식 (8)의 화합물이다. CBCAS는 칸나비게롤산(CBGA)을 기질로서 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, CBCAS는 칸나비게롤산(CBGA)으로부터 칸나비크로멘산(CBCA)을 생성한다. 일부 구현예에서, CBCAS는 칸나비게로바린산(CBVGA)과 같은 3-게라닐-2,4-디하이드로-6-알킬벤조산과 같은 다른 기질, 또는 C7 알킬 (헵틸) 기로서 R을 갖는 화학식 (8)의 기질의 산화적 고리화를 촉매할 수 있다. 일부 구현예에서, CBCAS는 CBGA 기질에 대한 특이성을 나타낸다.
일부 구현예에서, CBCAS는 대마초로부터 유래된다. 씨. 사티바 CBCAS는 하기와 같은 아미노산 서열을 가지며, 여기서 신호 펩티드는 밑줄 치고 볼드체로 표시되어 있다:
Figure pct00120
일부 구현예에서, CBCAS는 하기에 나타낸 서열을 포함한다:
Figure pct00121
다른 구현예에서, CBCAS는 미국 특허 번호 9359625에 기재된 CBCAS일 수 있으며 상기 특허는 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, CBCAS는 Uniprot KB 수탁 번호: I1V0C5에 상응하는 THCAS와 같은 THCAS 활성도 나타내는 씨. 사티바 효소일 수 있다. 일부 구현예에서, CBCAS는 서열번호 20-24 중 어느 하나에 상응하는 씨. 사티바 THCAS일 수 있다.
실시예 섹션에 기재된 바와 같이, 놀랍게도 에이. 니제르(곰팡이)로부터의 효소와 같은 아스페르길루스 과의 효소를 포함하는 다수의 진균 효소가 화학식 (8)의 화합물의 전환을 촉매하여 화학식 (11)의 화합물을 생성하고 일부 경우에, 또한 화학식 (10)의 화합물 및/또는 화학식 (9)의 화합물을 생성할 수 있다는 것을 발견하였다. 대마초 식물은 수 세기 동안 인간의 개입을 통해 칸나비노이드를 생성하기 위해 인위적으로 높은 선택 압력을 받았지만 에이. 니제르 곰팡이와 같은 진균 종은 칸나비노이드 생성을 위한 선택 압력을 받지 않았다. 따라서, 특정 이론에 국한되지 않고, 본 출원에 개시된 에이. 니제르 CBCAS와 같은 진균 CBCAS는 TS의 활성 및/또는 풍부도를 변경하기 위한 조작에 유용할 수 있다(예를 들어, 생성물 프로파일, 기질 프로파일, 및/또는 TS의 동역학(예를 들어, Kcat/Vmax 및/또는 Kd) 변화). 또한 실시에 섹션에 나타낸 바와 같이, 놀랍게도 본 개시내용에서 확인된 에이. 니제르 효소와 같은 아스페르길루스 과의 효소를 포함하는 많은 진균 효소가 CBCAS 활성, CBCVAS 활성, 또는 둘 모두를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이들 효소 중 일부는 추가로 THCAS 활성, THCVAS 활성, CBDAS 활성 또는 이들의 조합을 나타냈다.
일부 구현예에서, 에이. 니제르로부터의 CBCAS는 하기에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00122
에스. 세레비지아에에서의 발현을 위한 서열번호 25를 코딩하는 핵산 서열의 비제한적인 예는 다음과 같다:
Figure pct00123
일부 구현예에서, 에이. 니제르로부터의 CBCAS는 하기에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다(UniProt 수탁 번호 A0A254UC34에 상응함):
Figure pct00124
에스. 세레비지아에에서의 발현을 위한 서열번호 27을 코딩하는 핵산 서열의 비제한적인 예는 다음과 같다:
Figure pct00125
일부 구현예에서, CBCAS는 각각 서열번호 25; MF알파2 신호 펩티드; 및 HDEL 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 CBCAS는 하기에 나타낸 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 신호 펩티드는 밑줄 치고 볼드체로 표시되어 있다:
Figure pct00126
서열번호 29를 코딩하는 핵산 서열의 비제한적인 예를 하기에 나타내고, 여기서 신호 펩티드를 코딩하는 서열은 밑줄 치고 불드체로 표시되어 있다:
Figure pct00127
일부 구현예에서, TS는 서열번호 20-30 또는 34-173 중 하나 이상, 표 15의 서열 중 어느 하나, 또는 본 출원에 개시된 임의의 TS와, 그 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 핵산 또는 단백질 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TS는 서열번호 25, 26, 27, 28, 35, 56, 64, 85, 92, 94, 95, 105, 126, 134, 155, 162, 164, 및 165 중 하나 이상과, 그 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 핵산 또는 단백질 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TS는 서열번호 25, 26, 27, 28, 35, 42, 56, 60, 64, 105, 85, 92, 94, 95, 112, 126, 130, 134, 155, 162, 164, 165 중 하나 이상과, 그 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 핵산 또는 단백질 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TS는 서열번호 25, 26, 27, 28, 35, 42, 56, 60, 64, 105, 85, 89, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 102, 112, 126, 130, 134, 155, 159, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 및 172 중 하나 이상과, 그 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 핵산 또는 단백질 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 20-30 또는 34-173 중 하나 이상, 표 15의 서열 중 어느 하나, 또는 본 출원에 개시된 임의의 TS와, 그 사이의 모든 값을 포함하여 최대 5%, 최대 10%, 최대 15%, 최대 20%, 최대 25%, 최대 30%, 최대 35%, 최대 40%, 최대 45%, 최대 50%, 최대 55%, 최대 60%, 최대 65%, 최대 70%, 최대 71%, 최대 72%, 최대 73%, 최대 74%, 최대 75%, 최대 76%, 최대 77%, 최대 78%, 최대 79%, 최대 80%, 최대 81%, 최대 82%, 최대 83%, 최대 84%, 최대 85%, 최대 86%, 최대 87%, 최대 88%, 최대 89%, 최대 90%, 최대 91%, 최대 92%, 최대 93%, 최대 94%, 최대 95%, 최대 96%, 최대 97%, 최대 98%, 최대 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, TS는 서열번호 20-30 또는 34-173 중 하나 이상, 표 15의 서열 중 어느 하나, 또는 본 출원에 개시된 임의의 TS와, 그 사이의 모든 값을 포함하여 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호 29와 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 TS 서열은 서열번호 16, 또는 서열번호 16의 서열에 비해 2개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 갖는 서열을 포함하는 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 16, 또는 서열번호 16의 서열에 비해 2개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 갖는 서열을 포함하는 신호 펩티드는 TS 서열의 N-말단에 위치한다. 예를 들어, 서열번호 16, 또는 서열번호 16의 서열에 비해 2개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 갖는 서열을 포함하는 신호 펩티드는 메티오닌 잔기 다음에 오는 TS 서열의 위치 2에서 시작할 수 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 29와 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 TS 서열은 서열번호 17, 또는 서열번호 17의 서열에 비해 1개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 갖는 서열을 포함하는 신호 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 17, 또는 서열번호 17의 서열에 비해 1개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 갖는 서열을 포함하는 신호 펩티드는 서열번호 29와 적어도 90% 동일한 서열의 C-말단에 위치한다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 25, 27 또는 104-173 중 어느 하나와 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 서열은 하나 이상의 신호 펩티드에 연결된다. 일부 구현예에서, 서열번호 16, 또는 서열번호 16의 서열에 비해 2개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 갖는 서열을 포함하는 신호 펩티드는 서열번호 25, 27 또는 104-173 중 어느 하나와 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열의 N-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 서열번호 27 또는 104-173 중 어느 하나의 N-말단 메티오닌 잔기는 서열이 N-말단 신호 펩티드에 연결되는 경우 포함되지 않는다. 일부 구현예에서, 메티오닌 잔기는 N-말단 신호 펩티드(예를 들어, 서열번호 16)의 N-말단에 부가된다. 일부 구현예에서, 서열번호 17, 또는 서열번호 17의 서열에 비해 1개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 갖는 서열을 포함하는 신호 펩티드는 서열번호 25, 27 또는 104-173과 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열의 카복실 말단에 연결된다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 155, 159, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 및 172 중 어느 하나와 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하고, 여기서 서열은 하나 이상의 신호 펩티드에 연결된다. 일부 구현예에서, 서열번호 16, 또는 서열번호 16의 서열에 비해 2개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 갖는 서열을 포함하는 신호 펩티드는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 155, 159, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 및 172와 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열의 N-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, 서열번호 27, 105, 112, 126, 130, 134, 155, 159, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 및 172 중 어느 하나의 N-말단 메티오닌 잔기는 서열이 N-말단 신호 펩티드에 연결되는 경우 포함되지 않는다. 일부 구현예에서, 메티오닌 잔기는 N-말단 신호 펩티드(예를 들어, 서열번호 16)의 N-말단에 부가된다. 일부 구현예에서, 서열번호 17, 또는 서열번호 17의 서열에 비해 1개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 갖는 서열을 포함하는 신호 펩티드는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 155, 159, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 및 172 중 어느 하나와 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열의 카복실 말단에 연결된다.
일부 구현예에서, 서열번호 21에 비해, TS는 서열번호 21의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 39, 41, 48, 49, 51, 55, 58, 60, 61, 62, 70, 72, 74, 75, 76, 81, 88, 89, 91, 94, 97, 100, 101, 102, 104, 105, 106, 108, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 119, 122, 123, 125, 127, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 145, 147, 149, 150, 164, 165, 168, 169, 172, 173, 175, 176, 177, 180, 181, 183, 184, 185, 187, 193, 201, 208, 209, 212, 214, 215, 217, 222, 225, 226, 227, 229, 231, 233, 235, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 250, 251, 253, 254, 255, 256, 257, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 284, 286, 287, 288, 290, 292, 293, 294, 295, 297, 298, 299, 301, 302, 309, 310, 311, 312, 315, 317, 322, 323, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 344, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 357, 361, 362, 365, 366, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 376, 377, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 394, 396, 401, 402, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 436, 437, 439, 440, 441, 447, 448, 451, 452, 459, 461, 463, 464, 465, 467, 468, 469, 470, 471, 473, 474, 477, 484, 485, 488, 492, 496, 497, 500, 505, 511, 513, 514, 515, 516, 및/또는 517에 상응하는 잔기에서 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, TS는 서열번호 21의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 39, 41, 48, 49, 51, 55, 58, 60, 61, 62, 70, 72, 74, 75, 76, 81, 88, 89, 91, 94, 97, 100, 101, 102, 104, 105, 106, 108, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 119, 122, 123, 125, 127, 130, 132, 133, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 145, 147, 149, 150, 164, 165, 168, 169, 172, 173, 175, 176, 177, 180, 181, 183, 184, 185, 187, 193, 201, 208, 209, 212, 214, 215, 217, 222, 225, 226, 227, 229, 231, 233, 235, 236, 238, 239, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 250, 251, 253, 254, 255, 256, 257, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 284, 286, 287, 288, 290, 292, 293, 294, 295, 297, 298, 299, 301, 302, 309, 310, 311, 312, 315, 317, 322, 323, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 344, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 357, 361, 362, 365, 366, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 376, 377, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 389, 394, 396, 401, 402, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 436, 437, 439, 440, 441, 447, 448, 451, 452, 459, 461, 463, 464, 465, 467, 468, 469, 470, 471, 473, 474, 477, 484, 485, 488, 492, 496, 497, 500, 505, 511, 513, 514, 515, 516, 및/또는 517에 상응하는 위치에서 서열번호 25에 존재하는 아미노산 잔기를 포함한다.
실시예 1 및 3은 CBCA를 생성하는데 놀랍게도 효과적인 진균 후보 TS의 확인을 설명한다. 표 14는 CBCA 생성에 효과적인 후보 TS의 서열이 풍부한 것으로 확인된 서열 모티프의 비제한적인 예를 제공한다. 일부 구현예에서, TS는 표 14에 제공된 하기 모티프 중 하나 이상을 포함한다: KVQARSGGH(서열번호 174), RASNTQNQD[VI][FL]FA[VI]K(서열번호 176), CPTI[KR]TGGH(서열번호 181), WFVTLSLEGGAINDV[AP]EDATAY[AG]H(서열번호 184), P[IV]S[DQE]TTY[EDG]F[TA]DGLYDVLA[RQK]AVPES[VA]GHAYLGCPDP[RK]M(서열번호 186), MKHF[TNS]QFSM(서열번호 189), P[EQ][TS]A[EAD][QE]IA[GA][VI]VKC(서열번호 193), RDCL[IV]SA[LV]GGN[SA]A[LH][AV][AV]F[PQ][ND][QE]LL[WY](서열번호 200), RT[EQ][PQ]APGLAVQYSY(서열번호 207), 및/또는 WQ[SA]FI[SA][AQ][KE]NLT[RW][QK]FY[NST]NM(서열번호 211). 일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 잔기 72-80에 상응하는 잔기에 모티프 KVQARSGGH(서열번호 174)를 포함한다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 잔기 183-197에 상응하는 잔기에 모티프 RASNTQNQD[VI][FL]FA[VI]K(서열번호 176)를 포함한다. 일부 구현예에서, 모티프 RASNTQNQD[VI][FL]FA[VI]K(서열번호 176)는 RASNTQNQDVFFAVK(서열번호 177), RASNTQNQDILFAVK(서열번호 178), RASNTQNQDILFAIK(서열번호 179), 또는 RASNTQNQDVLFAVK(서열번호 180)이다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 잔기 141-149에 상응하는 잔기에 모티프 CPTI[KR]TGGH(서열번호 181)를 포함한다. 일부 구현예에서, 모티프 CPTI[KR]TGGH(서열번호 181)는 CPTIKTGGH(서열번호 182) 또는 CPTIRTGGH(서열번호 183)이다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 잔기 360-383에 상응하는 잔기에 모티프 WFVTLSLEGGAINDV[AP]EDATAY[AG]H(서열번호 184)를 포함한다. 일부 구현예에서, 모티프 WFVTLSLEGGAINDV[AP]EDATAY[AG]H(서열번호 184)는 WFVTLSLEGGAINDVAEDATAYAH(서열번호 185)이다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 잔기 400-436에 상응하는 잔기에 모티프 P[IV]S[DQE]TTY[EDG]F[TA]DGLYDVLA[RQK]AVPES[VA]GHAYLGCPDP[RK]M(서열번호 186)을 포함한다. 일부 구현예에서, 모티프 P[IV]S[DQE]TTY[EDG]F[TA]DGLYDVLA[RQK]AVPES[VA]GHAYLGCPDP[RK]M(서열번호 186)은 PISDTTYEFTDGLYDVLARAVPESVGHAYLGCPDPRM(서열번호 187) 또는 PISETTYEFTDGLYDVLARAVPESVGHAYLGCPDPRM(서열번호 188)이다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 잔기 98-106에 상응하는 잔기에 모티프 MKHF[TNS]QFSM(서열번호 189)을 포함한다. 일부 구현예에서, 모티프 MKHF[TNS]QFSM(서열번호 189)은 MKHFTQFSM(서열번호 190), MKHFSQFSM(서열번호 191), 또는 MKHFNQFSM(서열번호 192)이다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 잔기 53-65에 상응하는 잔기에 모티프 P[EQ][TS]A[EAD][QE]IA[GA][VI]VKC(서열번호 193)를 포함한다. 일부 구현예에서, 모티프 P[EQ][TS]A[EAD][QE]IA[GA][VI]VKC(서열번호 193)는 PETAEQIAGIVKC(서열번호 194), PQSADEIAAVVKC(서열번호 195), PETAAQIAGVVKC(서열번호 196), PQSAEEIAAVVKC(서열번호 197), PETAEQIAGVVKC(서열번호 198), 또는 PETAEQIAAVVKC(서열번호 199)이다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 잔기 10-32에 상응하는 잔기에 모티프 RDCL[IV]SA[LV]GGN[SA]A[LH][AV][AV]F[PQ][ND][QE]LL[WY](서열번호 200)을 포함한다. 일부 구현예에서, 모티프 RDCL[IV]SA[LV]GGN[SA]A[LH][AV][AV]F[PQ][ND][QE]LL[WY](서열번호 200)은 RDCLISAVGGNAAHVAFQDQLLY(서열번호 201), RDCLISALGGNSALAVFPNELLW(서열번호 202), RDCLISALGGNSALAAFPNELLW(서열번호 203), RDCLISALGGNSALAVFPNQLLW(서열번호 204), RDCLISALGGNSALAAFPNQLLW(서열번호 205), 또는 RDCLVSALGGNSALAAFPNQLLW (서열번호 206)이다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 잔기 212-225에 상응하는 잔기에 모티프 RT[EQ][PQ]APGLAVQYSY(서열번호 207)를 포함한다. 일부 구현예에서, 모티프 RT[EQ][PQ]APGLAVQYSY(서열번호 207)는 RTEPAPGLAVQYSY(서열번호 208), RTEQAPGLAVQYSY(서열번호 209), 또는 RTQPAPGLAVQYSY(서열번호 210)이다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 잔기 242-259에 상응하는 잔기에 모티프 WQ[SA]FI[SA][AQ][KE]NLT[RW][QK]FY[NST]NM(서열번호 211)을 포함한다. 일부 구현예에서, 모티프 WQ[SA]FI[SA][AQ][KE]NLT[RW][QK]FY[NST]NM(서열번호 211)은 WQSFISAKNLTRQFYNNM(서열번호 212) 또는 WQSFISAKNLTRQFYTNM(서열번호 213)이다.
일부 구현예에서, 상기 기재된 하나 이상의 모티프는 TS의 보조인자(FAD) 결합 부위와 접촉할 수 있다. 예를 들어, 도 15에 화살표로 나타낸 KVQARSGGH(서열번호 174), CPTI[KR]TGGH(서열번호 181), 및 P[IV]S[DQE]TTY[EDG]F[TA]DGLYDVLA[RQK]AVPES[VA]GHAYLGCPDP[RK]M(서열번호 186)은 보조인자 결합 부위와 접촉할 것으로 예측되고 따라서 보조인자 결합에 영향을 미칠 수 있다. 어떠한 이론에도 국한되지 않고, 이러한 모티프는 보조인자의 산화환원 전위 조절에 관여할 수 있으며, 예를 들어, 효소 회전율(turnover)을 조절함으로써 효소 활성에 중요할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 기재된 하나 이상의 모티프는 TS의 활성 부위의 공동에 라인을 형성할 수 있다. 예를 들어, 도 16에 화살표로 나타낸 WQ[SA]FI[SA][AQ][KE]NLT[RW][QK]FY[NST]NM(서열번호 211)은 활성 부위의 공동에 라인을 형성할 것으로 예측된다. 일부 구현예에서, 모티프 RT[EQ][PQ]APGLAVQYSY(서열번호 207) 및 WFVTLSLEGGAINDV[AP]EDATAY[AG]H(서열번호 184)는 또한 활성 부위의 공동에 라인을 형성할 수 있고 기질 결합 포켓 근처에 있을 수 있다. 어떠한 이론에도 국한되지 않고, 이러한 모티프는 기질 또는 생성물 특이성에 영향을 미칠 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용과 관련된 TS는 본 개시내용에 제공된 임의의 TS의 서열과 관련된 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 삽입을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 27의 서열에 비해, TS는 서열번호 27의 위치 25, 33, 35, 39, 43, 55, 57, 61, 62, 63, 71, 102, 112, 114, 122, 126, 129, 131, 161, 180, 183, 202, 256, 257, 260, 262, 280, 287, 295, 341, 353, 386, 392, 394, 398, 410, 423, 426, 446, 450, 456, 458, 466, 469, 및/또는 472에 상응하는 잔기에 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 27의 서열에 비해, TS는 위치 33, 39, 55, 57, 61, 62, 63, 71, 112, 122, 126, 129, 131, 180, 183, 202, 256, 257, 260, 287, 295, 341, 386, 392, 394, 398, 410, 423, 426, 450, 및/또는 472에 상응하는 잔기에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 27의 위치 25에 상응하는 잔기에 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 33에 상응하는 잔기에 아미노산 D; 서열번호 27의 위치 35에 상응하는 잔기에 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 39에 상응하는 잔기에 아미노산 F; 서열번호 27의 위치 43에 상응하는 잔기에 아미노산 I; 서열번호 27의 위치 55에 상응하는 잔기에 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 57에 상응하는 잔기에 아미노산 Q; 서열번호 27의 위치 57에 상응하는 잔기에 아미노산 E; 서열번호 27의 위치 61에 상응하는 잔기에 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 62에 상응하는 잔기에 아미노산 I; 서열번호 27의 위치 63에 상응하는 잔기에 아미노산 I; 서열번호 27의 위치 71에 상응하는 잔기에 아미노산 I; 서열번호 27의 위치 102에 상응하는 잔기에 아미노산 N; 서열번호 27의 위치 102에 상응하는 잔기에 아미노산 Q; 서열번호 27의 위치 102에 상응하는 잔기에 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 112에 상응하는 잔기에 아미노산 V; 서열번호 27의 위치 112에 상응하는 잔기에 아미노산 T; 서열번호 27의 위치 114에 상응하는 잔기에 아미노산 T; 서열번호 27의 위치 122에 상응하는 잔기에 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 122에 상응하는 잔기에 아미노산 G; 서열번호 27의 위치 122에 상응하는 잔기에 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 122에 상응하는 잔기에 아미노산 E; 서열번호 27의 위치 126에 상응하는 잔기에 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 126에 상응하는 잔기에 아미노산 R; 서열번호 27의 위치 126에 상응하는 잔기에 아미노산 T; 서열번호 27의 위치 126에 상응하는 잔기에 아미노산 K; 서열번호 27의 위치 126에 상응하는 잔기에 아미노산 D; 서열번호 27의 위치 129에 상응하는 잔기에 아미노산 W; 서열번호 27의 위치 131에 상응하는 잔기에 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 161에 상응하는 잔기에 아미노산 K; 서열번호 27의 위치 180에 상응하는 잔기에 아미노산 T; 서열번호 27의 위치 183에 상응하는 잔기에 아미노산 T; 서열번호 27의 위치 202에 상응하는 잔기에 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 202에 상응하는 잔기에 아미노산 G; 서열번호 27의 위치 202에 상응하는 잔기에 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 256에 상응하는 잔기에 아미노산 F; 서열번호 27의 위치 256에 상응하는 잔기에 아미노산 M; 서열번호 27의 위치 257에 상응하는 잔기에 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 260에 상응하는 잔기에 아미노산 M; 서열번호 27의 위치 260에 상응하는 잔기에 아미노산 F; 서열번호 27의 위치 262에 상응하는 잔기에 아미노산 I; 서열번호 27의 위치 280에 상응하는 잔기에 아미노산 N; 서열번호 27의 위치 287에 상응하는 잔기에 아미노산 R; 서열번호 27의 위치 295에 상응하는 잔기에 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 341에 상응하는 잔기에 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 353에 상응하는 잔기에 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 386에 상응하는 잔기에 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 392에 상응하는 잔기에 아미노산 H; 서열번호 27의 위치 394에 상응하는 잔기에 아미노산 T; 서열번호 27의 위치 398에 상응하는 잔기에 아미노산 F; 서열번호 27의 위치 398에 상응하는 잔기에 아미노산 T; 서열번호 27의 위치 398에 상응하는 잔기에 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 398에 상응하는 잔기에 아미노산 L; 서열번호 27의 위치 410에 상응하는 잔기에 아미노산 N; 서열번호 27의 위치 423에 상응하는 잔기에 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 426에 상응하는 잔기에 아미노산 Y; 서열번호 27의 위치 446에 상응하는 잔기에 아미노산 P; 서열번호 27의 위치 450에 상응하는 잔기에 아미노산 K; 서열번호 27의 위치 456에 상응하는 잔기에 아미노산 A; 서열번호 27의 위치 458에 상응하는 잔기에 아미노산 W; 서열번호 27의 위치 466에 상응하는 잔기에 아미노산 N; 서열번호 27의 위치 469에 상응하는 잔기에 아미노산 S; 서열번호 27의 위치 472에 상응하는 잔기에 아미노산 R; 서열번호 27의 위치 472에 상응하는 잔기에 아미노산 A; 및/또는 서열번호 27의 위치 450에 상응하는 잔기에 아미노산 K를 포함한다.
일부 구현예에서, TS는 서열번호 27에 비해 하기 아미노산 치환: V25A; T33D; D35A Y39F; L43I; T55S; A57Q; A57E; G61A; V62I; V63I; Y71I; T102N; T102Q; T102S; E112V; E112T; V114T; N122S; N122G; N122A; N122E; I126A; I126R; I126T; I126K; I126D; Y129W; N131S; Q161K; S180T; R183T; N202S; N202G; Y256F; Y256M; N257S; V260M; V260F; F262I; D280N; H287R; N295S; A341S; H353A; V386A; L392H; M394T; V398F; V398T; V398A; V398L; D410N; S423A; H426Y; T446P; R450K; E456A; L458W; H466N; G469S; P472R; P472A; 및/또는 R450K 중 하나 이상을 포함한다.
모두 큰 소수성 아미노산인 서열번호 27의 잔기 Y256, L392, 및 M394는 활성 부위 내에 위치할 것으로 예측된다. 어떠한 이론에도 국한되지 않고, 이러한 위치에서의 돌연변이는 CBDA 합성을 입체적으로 방지하는 방식으로 CBGA의 폴딩을 물리적으로 차단함으로써 적어도 부분적으로 생성물 프로파일을 CBCA 쪽으로 그리고 CBDA로부터 멀리 이동할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 이러한 치환이 없는 TS와 비교하여 화학식 (11)의 화합물, CBCA, CBCVA 또는 이들의 조합에 대한 특이성과 같은 TS의 생성물 특이성을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A57Q 및 G61A; V260M; V62I; V386A; V260F; E112V 및 N122S; A57E 및 I126A; T33D 및 N257S; N202S 및 P472A; D410N; R450K; S180T; R183T; N122G 및 I126R; N122A 및 I126T; Y71I; H287R 및 A341S; T55S 및 I126T; N122G 및 V398F; M394T; A57E; N131S; V63I; N122G 및 I126R; P472R; S180T; V398A; R183T; V260M; V386A; H426Y; Y256M; N202S 및 P472A; N122G 및 I126K; V62I; R450K; Y129W; S423A; H287R 및 A341S; N295S; Y39F; V260F; L392H; A57E 및 N131S; E112V 및 N122S; T33D 및 N257S를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환은 A57Q 및 G61A; Y71I; 및/또는 V260F를 포함한다.
표 3: 증가된 CBCA 역가를 나타내는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이
Figure pct00128
추가 칸나비노이드 경로 효소
칸나비노이드 및 칸나비노이드 전구체의 생성 방법은 아실 활성화 효소(AAE); 폴리케타이드 신타제(PKS) (예를 들어, OLS); 폴리케타이드 사이클라제(PKC); 및 프레닐트랜스퍼라제(PT) 중 하나 이상의 발현을 추가로 포함할 수 있다.
아실 활성화 효소(AAE)
본 개시내용에 기재된 숙주 세포는 AAE를 포함할 수 있다. 본 개시내용에서 사용된 바와 같이, AAE는 티올과, 카복실산 모이어티를 갖는 기질(예를 들어, 임의로 치환된 지방족 또는 아릴 기) 사이의 에스테르화를 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다. 일부 구현예에서, AAE는 하기 화학식 (1):
Figure pct00129
또는 이의 염, 용매화물, 수화물, 다형체, 공결정, 호변이성질체, 입체이성질체, 동위원소적으로 표지된 유도체를 사용하여 화학식 (2)의 생성물을 생성할 수 있다:
Figure pct00130
R은 본 출원에서 정의된 바와 같다. 특정 구현예에서, R은 수소이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-40 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C2-40 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 직쇄 또는 분지형 알킬인 임의로 치환된 C2-40 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 직쇄 또는 분지형 알킬인 임의로 치환된 C2-10 알킬, 임의로 치환된 C10-C20 알킬, 임의로 치환된 C20-C30 알킬, 임의로 치환된 C30-C40 알킬, 또는 임의로 치환된 C40-C50 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C3-8 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-C40 알킬, C1-C20 알킬, C1-C10 알킬, C1-C8 알킬, C1-C5 알킬, C3-C5 알킬, C3 알킬, 또는 C5 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-C20 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-C20 분지형 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-C20 알킬, 임의로 치환된 C1-C10 알킬, 임의로 치환된 C10-C20 알킬, 임의로 치환된 C20-C30 알킬, 임의로 치환된 C30-C40 알킬, 또는 임의로 치환된 C40-C50 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-C10 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C3 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 n-프로필이다. 특정 구현예에서, R은 비치환된 n-프로필이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-C8 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 C2-C6 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C1-C5 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C3-C5 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C3 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 C5 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 하기 화학식이다:
Figure pct00131
특정 구현예에서, R은 하기 화학식이다:
Figure pct00132
특정 구현예에서, R은 하기 화학식이다:
Figure pct00133
특정 구현예에서, R은 하기 화학식이다:
Figure pct00134
특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 프로필이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 n-프로필이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 아릴로 임의로 치환된 n-프로필이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 페닐로 임의로 치환된 n-프로필이다. 특정 구현예에서, R은 비치환된 페닐로 치환된 n-프로필이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 부틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 n-부틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 아릴로 임의로 치환된 n-부틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 페닐로 임의로 치환된 n-부틸이다. 특정 구현예에서, R은 비치환된 페닐로 치환된 n-부틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 펜틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 n-펜틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 아릴로 임의로 치환된 n-펜틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 페닐로 임의로 치환된 n-펜틸이다. 특정 구현예에서, R은 비치환된 페닐로 치환된 n-펜틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 헥실이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 n-헥실이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 n-헵틸이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 n-옥틸이다. 특정 구현예에서, R은 아릴(예를 들어, 페닐)로 임의로 치환된 알킬이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 아실(예를 들어, -C(=O)Me)이다.
특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 알케닐(예를 들어, 치환된 또는 비치환된 C2-6 알케닐)이다. 특정 구현예에서, R은 치환된 또는 비치환된 C2-6 알케닐이다. 특정 구현예에서, R은 치환된 또는 비치환된 C2-5 알케닐이다. 특정 구현예에서, R은 하기 화학식이다:
Figure pct00135
특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 알키닐(예를 들어, 치환된 또는 비치환된 C2-6 알키닐)이다. 특정 구현예에서, R은 치환된 또는 비치환된 C2-6 알키닐이다. 특정 구현예에서, R은 하기 화학식이다:
Figure pct00136
특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 카보사이클릴이다. 특정 구현예에서, R은 임의로 치환된 아릴(예를 들어, 페닐 또는 나프틸)이다.
일부 구현예에서, AAE에 대한 기질은 숙주 세포 내 지방산 대사에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, AAE에 대한 기질은 외인성으로 제공된다.
일부 구현예에서, AAE는 헥산산과 조효소 A(CoA)로부터 헥사노일-조효소 A(헥사노일-CoA)의 형성을 촉매할 수 있다. 일부 구현예에서, AAE는 부탄산과 조효소 A(CoA)로부터 부타노일-조효소 A(부타노일-CoA)의 형성을 촉매할 수 있다.
당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, AAE는 자연 발생 공급원 및 합성 공급원(예를 들어, 비-자연 발생 AAE)을 포함하는 임의의 공급원으로부터 얻어질 수 있다. 일부 구현예에서, AAE는 대마초 효소이다. AAE의 비제한적인 예는 미국 특허 번호 9,546,362호에 개시된 바와 같은 씨. 사티바 헥사노일-CoA 신타제 1(CsHCS1) 및 씨. 사티바 헥사노일-CoA 신타제 2(CsHCS2)를 포함하며, 상기 특허는 그 전체가 본 출원에 참조로 포함된다.
CsHCS1은 하기 서열을 갖는다:
Figure pct00137
CsHCS2는 하기 서열을 갖는다:
Figure pct00138
폴리케타이드 신타제(PKS)
본 출원에 기재된 숙주 세포는 PKS를 포함할 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "PKS"는 폴리케타이드를 생성할 수 있는 효소를 지칭한다. 특정 구현예에서, PKS는 화학식 (2)의 화합물을 화학식 (4), (5), 및/또는 (6)의 화합물로 전환시킨다. 특정 구현예에서, PKS는 화학식 (2)의 화합물을 화학식 (4)의 화합물로 전환시킨다. 특정 구현예에서, PKS는 화학식 (2)의 화합물을 화학식 (5)의 화합물로 전환시킨다. 특정 구현예에서, PKS는 화학식 (2)의 화합물을 화학식 (4) 및/또는 (5)의 화합물로 전환시킨다. 특정 구현예에서, PKS는 화학식 (2)의 화합물을 화학식 (5) 및/또는 (6)의 화합물로 전환시킨다.
일부 구현예에서, PKS는 테트라케타이드 신타제(TKS)이다. 특정 구현예에서, PKS는 올리베톨 신타제(OLS)이다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "OLS"는 도 1에 나타낸 바와 같이 화학식 (2a)의 기질을 사용하여 화학식 (4a), (5a) 또는 (6a)의 화합물을 형성할 수 있는 효소를 지칭한다.
특정 구현예에서, PKS는 디바린산 신타제(DVS)이다.
특정 구현예에서, 폴리케타이드 신타제는 헥사노일-CoA 또는 임의의 아실-CoA 또는 하기 화학식 (2)의 생성물:
Figure pct00139
및 3개의 말로닐-CoA를 기질로서 사용하여 기질에 따라 3,5,7-트리옥소도데카노일-CoA 또는 기타 3,5,7-트리옥소-아실-CoA 유도체를 형성할 수 있거나; 하기 화학식 (4)의 화합물을 형성할 수 있다:
Figure pct00140
상기 식에서, R은 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 카보사이클릴, 또는 임의로 치환된 아릴이다. R은 본 출원에 정의된 바와 같다. 일부 구현예에서, R은 C2-C6 임의로 치환된 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 프로필 또는 펜틸이다. 일부 구현예에서, R은 펜틸이다. 일부 구현예에서, R은 프로필이다. PKS는 또한 이소발레릴-CoA, 옥타노일-CoA, 헥사노일-CoA, 및 부티릴-CoA에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, PKS는 3,5,7-트리옥소알카노일-CoA(예를 들어, 3,5,7-트리옥소도데카노일-CoA)의 형성을 촉매할 수 있다. 일부 구현예에서, OLS는 3,5,7-트리옥소알카노일-CoA(예를 들어, 3,5,7-트리옥소도데카노일-CoA)의 형성을 촉매할 수 있다.
일부 구현예에서, PKS는 화학식 (2)의 기질을 사용하여 하기 화학식 (4)의 화합물을 형성한다:
Figure pct00141
상기 식에서, R은 비치환된 펜틸이다.
당업자는 OLS와 같은 PKS가 자연 발생 공급원 및 합성 공급원(예를 들어, 비-자연 발생 PKS)을 포함하는 임의의 공급원으로부터 얻어질 수 있음을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, PKS는 대마초로부터 유래된다. 일부 구현예에서, PKS는 딕티오스텔리움(Dictyostelium)으로부터 유래된다. PKS 효소의 비제한적인 예는 US 6,265,633; WO 2018/148848 A1; WO 2018/148849 A1; 및 US 2018/155748에서 찾을 수 있으며, 상기 특허들은 그 전체가 본 출원에 참조로 포함된다.
OLS의 비제한적인 예는 씨. 사티바로부터 UniProtKB - B1Q2B6에 의해 제공된다. 씨. 사티바에서, 이 OLS는 헥사노일-CoA 및 말로닐-CoA를 기질로서 사용하여 3,5,7-트리옥소도데카노일-CoA를 형성한다. OLS(예를 들어, UniProtKB - B1Q2B6)는 올리베톨산 사이클라제(OAC)와 조합하여 씨. 사티바에서 올리베톨산(OA)을 형성한다.
UniProtKB - B1Q2B6의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure pct00142
본 출원에 기재된 PKS 효소는 사이클라제 활성을 가질 수도 있고 갖지 않을 수도 있다. PKS 효소가 사이클라제 활성을 갖지 않는 일부 구현예에서, 폴리케타이드 사이클라제(PKC) 효소를 코딩하는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오티드는 또한 헥산산 또는 부티르산의 전환 또는 올리베톨산 또는 디바리놀산 또는 칸나비노이드의 다른 전구체로의 다른 지방산 전환을 가능하게 하기 위해 동일한 숙주 세포에서 공동 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, PKS 효소 및 PKC 효소는 별도의 개별 효소로서 발현된다. 일부 구현예에서, 사이클라제 활성이 결핍된 PKS 효소 및 PKC는 이기능성 PKS인 융합 폴리펩티드의 일부로서 연결된다. 일부 구현예에서, 이기능성 PKC는 이기능성 PKS-PKC로 지칭된다. 일부 구현예에서, 이기능성 PKC는 이기능성 테트라케타이드 신타제(TKS-TKC)이다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 이기능성 PKS는 하기 화학식 (2)의 화합물:
Figure pct00143
및 하기 화학식 (3)의 화합물:
Figure pct00144
로부터 화학식 (6)의 화합물을 생성할 수 있는 효소이다:
Figure pct00145
.
일부 구현예에서, PKS는 하기 화학식 (5)의 화합물:
Figure pct00146
과 비교하여 하기 화학식 (6)의 화합물을 더 많이 생성한다:
Figure pct00147
.
비제한적인 예로서, 하기 화학식 (6)의 화합물:
Figure pct00148
은 하기 올리베톨산(화학식 (6a))이다:
Figure pct00149
비제한적인 예로서, 하기 화학식 (5)의 화합물:
Figure pct00150
은 하기 올리베톨(화학식 (5a))이다:
Figure pct00151
일부 구현예에서, 본 개시내용의 폴리케타이드 신타제는 하기 화학식 (2)의 화합물:
Figure pct00152
및 하기 화학식 (3)의 화합물:
Figure pct00153
을 촉매하여 하기 화학식 (4)의 화합물:
Figure pct00154
을 생성할 수 있고, 또한 화학식 (4)의 화합물:
Figure pct00155
을 추가로 촉매하여 하기 화학식 (6)의 화합물:
Figure pct00156
을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, PKS는 융합 단백질이 아니다. 일부 구현예에서, 하기 화학식 (2)의 화합물:
Figure pct00157
및 하기 화학식 (3)의 화합물:
Figure pct00158
을 촉매하여 하기 화학식 (4)의 화합물:
Figure pct00159
을 형성할 수 있고, 또한 하기 화학식 (4)의 화합물:
Figure pct00160
로부터 하기 화학식 (6)의 화합물의 화합물:
Figure pct00161
의 생성물을 추가로 촉매할 수 있는 PKS가 바람직한데, 이는 하기 화학식 (6)의 화합물을 생성하기 위해 추가의 폴리케타이드 사이클라제가 필요하지 않기 때문이다:
Figure pct00162
일부 구현예에서, 이기능성 PKS인 이러한 효소는 폴리케타이드 사이클라제의 추가와 함께 필요한 수송 고려사항을 제거하며, 이에 의해 PKS의 생성물인 화학식 (4)의 화합물은 기질로 사용하기 위해 PKS로 수송되어 화학식 (6)의 화합물로 전환되어야 한다.
일부 구현예에서, PKS는 하기 화학식 (2a)의 화합물:
Figure pct00163
및 하기 화학식 (3a):
Figure pct00164
의 존재 하에 올리베톨산을 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, OLS는 하기 화학식 (2a)의 화합물:
Figure pct00165
및 하기 화학식 (3a):
Figure pct00166
의 존재 하에 올리베톨산을 생성할 수 있다.
폴리케타이드 사이클라제(PKC)
본 개시내용에 기재된 숙주 세포는 PKC를 포함할 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "PKC"는 폴리케타이드를 고리화할 수 있는 효소를 지칭한다.
특정 구현예에서, 폴리케타이드 사이클라제(PKC)는 옥소 지방 아실-CoA(예를 들어, 화학식 (4)의 화합물:
Figure pct00167
또는 3,5,7-트리옥소도데카노일-COA, 3,5,7-트리옥소데카노일-COA)의 상응하는 분자내 고리화 생성물(예를 들어, 올리베톨산 및 디바린산을 포함하는 화학식 (6)의 화합물)로의 고리화를 촉매한다. 일부 구현예에서, PKC는 PKS의 존재 하에 발생하는 화합물의 형성을 촉매한다. PKC 기질은 트리옥소알칸올-CoA, 예컨대 3,5,7-트리옥소도데카노일-CoA, 또는 하기 화학식 (4)의 화합물을 포함한다:
Figure pct00168
.
상기 식에서, R은 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 카보사이클릴, 또는 임의로 치환된 아릴이다. 특정 구현예에서, PKC는 하기 화학식 (4)의 화합물:
Figure pct00169
(상기 식에서, R은 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 카보사이클릴, 또는 임의로 치환된 아릴이다)을 촉매하여; 기질로서 하기 화학식 (6)의 화합물을 형성한다:
Figure pct00170
.
상기 식에서, R은 수소, 임의로 치환된 아실, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 알케닐, 임의로 치환된 알키닐, 임의로 치환된 카보사이클릴, 또는 임의로 치환된 아릴이다. R은 본 출원에서 정의된 바와 같다. 일부 구현예에서, R은 C2-C6 임의로 치환된 알킬이다. 일부 구현예에서, R은 프로필 또는 펜틸이다. 일부 구현예에서, R은 펜틸이다. 일부 구현예에서, R은 프로필이다. 특정 구현예에서, PKC는 올리베톨산 사이클라제(OAC)이다. 특정 구현예에서, PKC는 디바린산 사이클라제(DAC)이다.
당업자는 PKC가 자연 발생 공급원 및 합성 공급원(예를 들어, 비-자연 발생 PKC)을 포함하는 임의의 공급원으로부터 얻어질 수 있음을 인식할 것이다. 일부 구현예에서, PKC는 대마초로부터 유래된다. PKC의 비제한적인 예는 미국 특허 번호 9,611,460; US 10,059,971; 및 미국 특허 번호 2019/0169661에 개시된 것들을 포함하며, 상기 특허들은 그 전체가 본 출원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, PKC는 OAC이다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "OAC"는 올리베톨산(OA)의 형성을 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다. 일부 구현예에서, OAC는 하기 화학식 (4a)의 기질(3,5,7-트리옥소도데카노일-CoA):
Figure pct00171
을 사용하여 하기 화학식 (6a)의 화합물(올리베톨산):
Figure pct00172
을 형성할 수 있는 효소이다.
씨. 사티바로부터의 올리베톨산 사이클라제(CsOAC)는 올리베톨 신타제의 테트라케타이드 생성물(도 4 구조 4a)의 비-데카복실화 고리화를 알돌 축합을 통해 수행하여 올리베톨산(도 4 구조 6a)을 형성하는 101 아미노산 효소이다. CsOAC는 전사체 마이닝을 통해 Gagne 등(PNAS 2012)에 의해 확인되고 특성화되었으며 그 고리화 기능은 CsOAC가 씨. 사티바에서 올리베톨산의 형성에 필요하다는 것을 입증하기 위해 시험관내에서 재점검하였다. 효소의 결정 구조는 Yang 등(FEBS J. 2016 Mar;283(6):1088-106)에 의해 발표되었는데, 이것은 효소가 동종이량체이고 단백질 폴딩의 α+β 배럴(DABB) 슈퍼패밀리에 속한다는 것을 밝혀냈다. CsOAC는 유일하게 알려진 식물 폴리케타이드 사이클라제이다. 폴리케타이드 신타제와 고리화 기능 둘 모두를 수행하는 다수의 진균 유형 III 폴리케타이드 신타제가 확인되었다(Funa et al., J Biol Chem. 2007 May 11;282(19):14476-81); 그러나, 식물에서 그러한 이중 기능 효소는 아직 발견되지 않았다.
씨. 사티바에서 OAC의 아미노산 서열의 비제한적인 예는 3,5,7-트리옥소도데카노일-CoA로부터 올리베톨산(OA)의 형성을 촉매하는 UniProtKB - I6WU39(서열 번호 1)에 의해 제공된다.
UniProtKB - I6WU39의 서열(서열번호 1)은 다음과 같다:
Figure pct00173
씨. 사티바 OAC를 코딩하는 핵산 서열의 비제한적인 예는 다음과 같다:
Figure pct00174
프레닐트랜스퍼라제(PT)
본 출원에 기재된 숙주 세포는 프레닐트랜스퍼라제(PT)를 포함할 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "PT"는 프레닐 기를 수용체 분자 기질로 전달할 수 있는 효소를 지칭한다. 프레닐트랜스퍼라제의 비제한적인 예는 PCT 공개 번호 WO2018200888(예를 들어, CsPT4), 미국 특허 번호 8,884,100(예를 들어, CsPT1); 캐나다 특허 번호 CA2718469; 문헌(Valliere et al., Nat Commun. 2019 Feb 4;10(1):565; 및 Luo et al., Nature 2019 Mar;567(7746):123-126)에 기재되어 있으며, 이들은 그 전체가 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, PT는 칸나비게롤산(CBGA), 칸나비게로바린산(CBGVA), 또는 기타 칸나비노이드 또는 칸나비노이드 유사 물질을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, PT는 칸나비게롤산 신타제(CBGAS)이다. 일부 구현예에서, PT는 칸나비게로바린산 신타제(CBGVAS)이다.
일부 구현예에서, PT는 NphB 프레닐트랜스퍼라제이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7544498; 및 문헌(Kumano et al., Bioorg Med Chem. 2008 Sep 1; 16(17): 8117-8126)을 참조하고, 이들은 그 전체가 본 출원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, PT는 스트렙토마이세스 종(Streptomyces sp.)으로부터의 NphB에 상응한다(예를 들어, UniprotKB 수탁 번호 Q4R2T2 참조; 또한 미국 특허 7,361,483의 서열번호 2 참조). UniprotKB 수탁 번호 Q4R2T2에 상응하는 단백질 서열은 서열번호 8에 의해 제공된다:
Figure pct00175
NphB를 코딩하는 핵산 서열의 비제한적인 예는 다음과 같다:
Figure pct00176
다른 구현예에서, PT는 미국 특허 번호 8,884,100에서 서열번호 2로서 개시되어 있는 CsPT1에 상응한다(씨. 사티바; 본 출원의 서열 번호 10에 상응함):
Figure pct00177
일부 구현예에서, PT는 PCT 공개 번호 WO2019071000에서 서열번호 1로 개시되어 있는 CsPT4에 상응하며 이는 본 출원에서 서열번호 11에 상응한다:
Figure pct00178
일부 구현예에서, PT는 서열번호 12로 제공되는 절단된 CsPT4에 상응한다:
Figure pct00179
에스. 세레비지아에에서 이원체(paralog) 씨. 사티바 CBGAS 효소의 기능적 발현 및 주요 칸나비노이드 CBGA의 생성이 보고되었다(미국 특허 공개 2012/0144523, 및 Luo et al. Nature, 2019 Mar;567(7746):123-126). Luo 등은 천연 신호 펩티드가 제거된 씨. 사티바 CBGAS, CsPT4의 절단된 버전을 발현함으로써 에스. 세레비지아에에서 CBGA의 생성을 보고하였다. 특정 이론에 국한되지 않고, 씨. 사티바 CBGAS 효소의 내재-막(integral-membrane) 성질은 이종 숙주에서 씨. 사티바 CBGAS 효소의 기능적 발현을 어렵게 만들 수 있다. 막관통 도메인(들) 또는 신호 서열의 제거 또는 막과 연관되지 않고 내재 막 단백질이 아닌 프레닐트랜스퍼라제의 사용은 예를 들어, 세포 세포질 및/또는 국소화를 부여하는 펩티드를 사용하여 표적화될 수 있는 세포소기관에서 효소와 이용 가능한 기질 사이의 증가된 상호작용을 촉진할 수 있다.
일부 구현예에서, PT는 가용성 PT이다. 일부 구현예에서, PT는 세포질 PT이다. 일부 구현예에서, PT는 분비된 단백질이다. 일부 구현예에서, PT는 막-연관된 단백질이 아니다. 일부 구현예에서, PT는 내재 막 단백질이 아니다. 일부 구현예에서, PT는 막관통 도메인 또는 예측된 막관통을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, PT는 주로 세포질에서 검출될 수 있다(예를 들어, 세포막과 관련하여 검출된 것보다 더 큰 정도로 세포질에서 검출됨). 일부 구현예에서, PT는 하나 이상의 막관통 도메인이 제거 및/또는 돌연변이되어(예를 들어, 절단, 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가에 의해) PT가 숙주 세포의 세포질, 또는 숙주 세포 내의 세포질 세포소기관, 또는 박테리아 숙주의 경우 원형질막공간에 위치하거나 위치할 것으로 예상되는 단백질이다. 일부 구현예에서, PT는 하나 이상의 막관통 도메인이 제거되거나 돌연변이되어(예를 들어, 절단, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가에 의해) 막 국소화와 비교하여 PT가 숙주 세포의 세포질, 세포소기관 또는 원형질막공간으로의 국소화를 증가시킨다.
용어 "막관통 도메인"의 범위 내에는 경험적으로 결정된 막관통 도메인 이외에 예측되거나 추정되는 막관통 도메인이 있다. 일반적으로, 막관통 도메인은 세포막으로의 통합을 촉진하는 소수성 영역을 특징으로 한다. 단백질이 막 단백질인지 또는 막-연관된 단백질인지를 예측하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 아미노산 서열 분석, 친수도 플롯(hydropathy plot) 및/또는 단백질 국소화 검정을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, PT는 신호 서열이 제거 및/또는 돌연변이되어 PT가 세포 분비 경로로 향하지 않는 단백질이다. 일부 구현예에서, PT는 신호 서열이 제거 및/또는 돌연변이되어 PT가 세포질로 국한되거나 세포질로 국소화가 증가된 단백질이다(예를 들어, 분비 경로와 비교하여).
일부 구현예에서, PT는 분비된 단백질이다. 일부 구현예에서, PT는 신호 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, PT는 융합 단백질이다. 예를 들어, PT는 숙주 세포의 대사 경로에서 하나 이상의 유전자에 융합될 수 있다. 특정 구현예에서, PT는 숙주 세포의 대사 경로에서 하나 이상의 유전자의 돌연변이 형태에 융합될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 PT는 하기에 나타낸 화학식 (6)의 화합물에서 하나 이상의 프레닐 기를 위치 1, 2, 3, 4, 또는 5 중 어느 하나로 전달한다:
Figure pct00180
일부 구현예에서, PT는 하기에 나타낸 화학식 (6)의 화합물에서 프레닐 기를 위치 1, 2, 3, 4, 또는 5 중 어느 하나로 전달하여:
Figure pct00181
화학식 (8w), 화학식 (8x), 화학식 (8'), 화학식 (8y), 화학식 (8z) 중 어느 하나의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물, 다형체, 공결정, 호변이성질체, 입체이성질체, 동위원소적으로 표지된 유도체, 또는 프로드럭을 형성한다:
Figure pct00182
Figure pct00183
상기 식에서, a는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다.
변이체
본 개시내용의 양태는 본 출원에 기재된 임의의 폴리펩티드(예를 들어, AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS)를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 포함되는 핵산은 AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS를 코딩하는 핵산에 높은 또는 중간 엄격성(stringency) 조건 하에 혼성화하고 생물학적으로 활성인 핵산이다. 예를 들어, 65℃에서 0.2 내지 1 x SSC의 높은 엄격성 조건에 이어 65℃에서 0.2 x SSC로 세척할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 포함되는 핵산은 낮은 엄격성 조건 하에 AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS를 코딩하는 핵산에 혼성화하고 생물학적으로 활성인 핵산이다. 예를 들어, 실온에서 6 x SSC의 낮은 엄격성 조건에 이어 실온에서 2 x SSC로 세척할 수 있다. 다른 혼성화 조건은 40 또는 50℃에서 3 x SSC에 이어 20, 30, 40, 50, 60 또는 65℃에서 1 또는 2 x SSC에서 세척을 포함한다.
혼성화는 포름알데히드, 예를 들어, 10%, 20%, 30% 40% 또는 50%의 존재 하에 수행될 수 있으며, 이는 혼성화의 엄격성을 추가로 증가시킨다. 핵산 혼성화의 이론 및 실제는, 예를 들어, 문헌(S. Agrawal (ed.) Methods in Molecular Biology, volume 20; and Tijssen (1993) Laboratory Techniques in biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acid probes, e.g., part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," Elsevier, New York provide a basic guide to nucleic acid hybridization)에 기재되어 있다.
본 출원에 기재된 효소 서열의 변이체(예를 들어, 핵산 또는 아미노산 서열을 포함하는 AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS)도 본 개시내용에 포함된다. 변이체는 참조 서열과, 그 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 100% 서열 동일성을 공유할 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 당업계에 공지된 바와 같이, 용어 "동일성 백분율"과 본 개시내용에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "서열 동일성"은 서열 비교(정렬)에 의해 결정된 바와 같은 2개의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 서열 사이의 관계를 지칭한다. 일부 구현예에서, 서열 동일성은 서열(예를 들어, AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS 서열)의 전장에 걸쳐 결정된다. 일부 구현예에서, 서열 동일성은 서열(예를 들어, AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS 서열)의 영역(예를 들어, 아미노산 또는 핵산의 스트레치, 예를 들어, 활성 부위를 포괄하는 서열)에 걸쳐 결정된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 서열 동일성은 참조 서열 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 초과에 상응하는 영역에 걸쳐 결정된다.
동일성은 특정 수학적 모델, 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램에 의해 해결된 (만약 있다면) 갭 정렬에 의한 둘 이상의 서열 중 더 작은 것 사이의 동일한 일치 백분율을 측정한다.
관련된 폴리펩티드 또는 핵산 서열의 동일성은 당업자에게 공지된 임의 방법으로 쉽게 계산될 수 있다. 2개 서열(예를 들어, 핵산 또는 아미노산 서열)의 동일성 백분율은, 예를 들어, 문헌(Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993)에서와 같이 변형된, 문헌(Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990)의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 알고리즘은 문헌(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)의 NBLAST® 및 XBLAST® 프로그램(버전 2.0)에 통합된다. BLAST® 단백질 검색은 본 출원에 기재된 단백질에 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위해서, 예를 들어, XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 단어길이 = 3을 사용하여 수행될 수 있다. 2개 서열 간에 갭이 존재하는 경우, Gapped BLAST®는 예를 들어, 문헌(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997)에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST® 및 Gapped BLAST® 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST® 및 NBLAST®)의 디폴트 매개변수가 사용될 수 있거나, 또는 매개변수는 당업자가 이해하게 되는 바와 같이 적절하게 조정될 수 있다.
예를 들어, 사용할 수 있는 또 다른 국소 정렬 기술은 스미스-워터만 (Smith-Waterman) 알고리즘(Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) "Identification of common molecular subsequences." J. Mol. Biol. 147:195-197)을 기반으로 한다. 예를 들어, 사용할 수 있는 일반적인 전역 정렬 기술은 동적 프로그래밍을 기반으로 하는 니들만-분치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins." J. Mol. Biol. 48:443-453)이다.
보다 최근에, 니들만-분치 알고리즘을 포함하는 다른 최적 전역 정렬 방법보다 더 빠른 핵산 및 아미노산 서열의 전역 정렬을 알려진 대로 생성하는 신속 최적 전역 서열 정렬 알고리즘(Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm: FOGSAA)이 개발되었다. 일부 구현예에서, 2개 폴리펩티드의 동일성은 2개의 아미노산 서열을 정렬하고 동일한 아미노산의 수를 계산하고 아미노산 서열 중 하나의 길이로 나눔으로써 결정된다. 일부 구현예에서, 2개의 핵산의 동일성은 2개의 뉴클레오티드 서열을 정렬하고 동일한 뉴클레오티드의 수를 계산하고 핵산 중 하나의 길이로 나눔으로써 결정된다.
다중 서열 정렬을 위해, 클러스털 오메가(Clustal Omega)를 포함한 컴퓨터 프로그램(Sievers et al., Mol Syst Biol. 2011 Oct 11;7:539)이 사용될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 핵산 또는 아미노산 서열을 포함하는 서열은 서열 동일성이 문헌(Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993)에서와 같이 변형된, 문헌(Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990)의 알고리즘(예를 들어, 각각의 프로그램의 디폴트 매개변수를 사용하는, BLAST®, NBLAST®, XBLAST® 또는 Gapped BLAST® 프로그램)을 사용하여 결정될 때 본 출원에 개시되고/되거나 청구범위에 인용된 서열과 같은 참조 서열과 명시된 동일성 백분율을 갖는 것으로 밝혀졌다.
일부 구현예에서, 핵산 또는 아미노산 서열을 포함하는 서열은 서열 동일성이 디폴트 매개변수를 사용하여 스미스-워터만 알고리즘(Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) "Identification of common molecular subsequences." J. Mol. Biol. 147:195-197) 또는 니들만-분치 알고리즘(Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) "A general method applicable to the search for similarities in the amino acids of two proteins." J. Mol. Biol. 48:443-453)을 사용하여 결정될 때 본 출원에 개시되고/되거나 청구범위에 인용된 서열과 같은 참조 서열과 명시된 동일성 백분율을 갖는 것으로 밝혀졌다.
일부 구현예에서, 핵산 또는 아미노산 서열을 포함하는 서열은 서열 동일성이 디폴트 매개변수를 사용한 신속 최적 전역 서열 정렬 알고리즘(FOGSAA)을 사용하여 결정될 때 본 출원에 개시되고/되거나 청구범위에 인용된 서열과 같은 참조 서열과 명시된 동일성 백분율을 갖는 것으로 밝혀졌다.
일부 구현예에서, 핵산 또는 아미노산 서열을 포함하는 서열은 서열 동일성이 디폴트 매개변수를 사용한 클러스털 오메가(Sievers et al., Mol Syst Biol. 2011 Oct 11;7:539)를 사용해 결정될 때 본 출원에 개시되고/되거나 청구범위에 인용된 서열과 같은 참조 서열과 명시된 동일성 백분율을 갖는 것으로 밝혀졌다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 서열 "X"의 잔기(예컨대 핵산 잔기 또는 아미노산 잔기)는 서열 X 및 Y가 당업계에 공지된 아미노산 서열 정렬 도구를 사용해 정렬될 때 서열 "X"의 잔기가 서열 "Y"의 "Z"의 대응 위치에 있는 경우 상이한 서열 "Y"의 위치 또는 잔기(예컨대 핵산 잔기 또는 아미노산 잔기) "Z"에 상응하는 것으로 지칭된다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 변이체 서열은 상동성 서열일 수 있다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 상동성 서열은 특정 동일성 백분율(예를 들어, 그 사이의 모든 값을 포함하는 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성)를 공유하는 서열(예를 들어, 핵산 또는 아미노산 서열)이다. 상동성 서열은 파랄로그 또는 오솔로그 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 파랄로그 서열은 종의 게놈 내 유전자의 중복으로부터 발생되는 반면, 오솔로그 서열은 종분화 사건 이후에 분기된다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드 변이체(예를 들어, AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS 효소 변이체)는 참조 폴리펩티드(예를 들어, 참조 AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS 효소)와 2차 구조(예를 들어, 알파 나선, 베타 시트)를 공유하는 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드 변이체(예를 들어, AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS 효소 변이체)는 참조 폴리펩티드(예를 들어, 참조 AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS 효소)와 3차 구조를 공유한다. 비제한적인 예로서, 폴리펩티드 변이체(예를 들어, AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS 효소)는 참조 폴리펩티드와 비교하여 낮은 1차 서열 동일성(예를 들어, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만의 서열 동일성)을 갖지만 하나 이상의 2차 구조(예를 들어, 루프, 알파 나선, 또는 베타 시트를 포함하지만 이에 제한되지 않음)를 공유하거나, 참조 폴리펩티드와 동일한 3차 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 루프는 베타 시트와 알파 나선 사이, 2개의 알파 나선 사이, 또는 2개의 베타 시트 사이에 위치될 수 있다. 상동성 모델링은 2개 이상의 3차 구조를 비교하는 데 사용될 수 있다.
본 출원에 개시된 재조합 AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS 효소의 기능적 변이체는 본 개시내용에 포함된다. 예를 들어, 기능적 변이체는 하나 이상의 동일한 기질에 결합하거나 하나 이상의 동일한 생성물을 생성할 수 있다. 기능적 변이체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 문헌(Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990)의 알고리즘이 공지된 기능을 갖는 상동 단백질을 확인하는 데 사용될 수 있다.
추정의 기능적 변이체는 또한 기능적으로 주석이 달린 도메인을 갖는 폴리펩티드를 검색함으로써 확인될 수 있다. Pfam을 포함하는 데이터베이스(Sonnhammer et al., Proteins. 1997 Jul;28(3):405-20)를 사용하여 특정 도메인을 갖는 폴리펩티드를 확인할 수 있다.
상동성 모델링은 또한 기능에 영향을 미치지 않으면서 돌연변이(예를 들어, 치환, 결실 및/또는 삽입)될 수 있는 아미노산 잔기를 확인하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법의 비제한적인 예는 위치-특이적 스코어링 매트릭스(PSSM) 및 에너지 최소화 프로토콜의 사용을 포함할 수 있다.
위치-특이적 스코어링 매트릭스(PSSM)는 위치 가중치 매트릭스를 사용하여 컨센서스 서열(예컨대, 모티프)을 확인한다. PSSM은 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 수행될 수 있다. 서열이 정렬되며 이 방법은 특정 위치에서 특정 잔기(예컨대, 아미노산 또는 뉴클레오티드)의 관찰된 빈도 및 분석된 서열 수를 고려한다. 예를 들어, 문헌(Stormo et al., Nucleic Acids Res. 1982 May 11;10(9):2997-3011)을 참조한다. 주어진 위치에서 특정 잔기를 관찰할 가능성이 계산될 수 있다. 특정 이론에 국한되지 않고, 높은 가변성을 갖는 서열의 위치는 기능적 상동체를 생성하기 위해 돌연변이(예를 들어, 치환, 결실 및/또는 삽입; 예를 들어, PSSM 점수 ≥0) 될 수 있다.
PSSM은 야생형 및 단일-점 돌연변이체 간의 차이를 결정하는 로제타(Rosetta) 에너지 함수의 계산과 쌍을 이룰 수 있다. 로제타 에너지 함수는 이 차이를 (△△G calc )로 계산한다. 로제타 함수를 사용하여, 돌연변이된 잔기와 주변 원자 간의 결합 상호작용을 사용하여 돌연변이가 단백질 안정성을 증가 또는 감소시키는지 여부를 결정한다. 예를 들어, PSSM 점수(예를 들어, PSSM 점수≥0)에 의해 유리하다고 지정된 돌연변이는 이어서 단백질 안정성에 대한 돌연변이의 잠재적 영향을 결정하기 위해서 로제타 에너지 함수를 사용해 분석될 수 있다. 특정 이론에 국한되지 않고, 잠재적으로 안정한 아미노산 돌연변이가 단백질 조작(예를 들어, 기능적 상동체의 생성)에 바람직하다. 일부 구현예에서, 잠재적으로 안정한 아미노산 돌연변이는 -0.1 미만 (예를 들어, -0.2 미만, -0.3 미만, -0.35 미만, -0.4 미만, -0.45 미만, -0.5 미만, -0.55 미만, -0.6 미만, -0.65 미만, -0.7 미만, -0.75 미만, -0.8 미만, -0.85 미만, -0.9 미만, -0.95 미만, 또는 -1.0 미만)의 로제타 에너지 단위(R.e.u.)의 △△G calc 값을 갖는다. 예를 들어, 문헌(Goldenzweig et al., Mol Cell. 2016 Jul 21;63(2):337-346. Doi: 10.1016/j.molcel.2016.06.012)을 참조한다.
일부 구현예에서, 코딩 서열은 참조 코딩 서열에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 또는 100 초과 위치에 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 코딩 서열은 참조 코딩 서열에 비해 코딩 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 이상의 코돈 중 아미노산 돌연변이를 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 코돈 내의 치환, 삽입 또는 결실은 유전자 코드의 축퇴성에 인해 코돈에 의해 코딩되는 아미노산을 변화시키거나 변화시키지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 코딩 서열의 하나 이상의 치환, 삽입, 또는 결실은 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 코딩 서열의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다.
일부 구현예에서, 서열의 하나 이상의 돌연변이는 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 상응하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시키고 참조 폴리펩티드에 비해 폴리펩티드의 활성을 변경(향상 또는 감소)시킨다.
본 출원에 기재된 임의의 재조합 폴리펩티드(예를 들어, AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS)의 활성(예를 들어, 비활성)은 통상적인 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 비제한적인 예로서, 재조합 폴리펩티드의 활성은 기질 특이성, 생성된 생성물(들), 생성된 생성물(들)의 농도, 또는 이들의 임의의 조합을 측정함으로써 결정될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 재조합 폴리펩티드의 "비활성"은 단위 시간당 재조합 폴리펩티드의 주어진 양(예를 들어, 농도)에 대해 생성된 특정 생성물의 양(예를 들어, 농도)을 지칭한다.
당업자는 또한 코딩 서열의 돌연변이가 상기 폴리펩티드의 기능적으로 동등한 변이체, 예를 들어, 폴리펩티드의 활성을 보유하는 변이체를 제공하기 위해 보존적 아미노산 치환을 초래할 수 있음을 인식할 것이다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 치환이 이루어지는 단백질의 상대적 전하 또는 크기 특징 또는 기능적 활성을 변경하지 않는 아미노산 치환을 지칭한다.
일부 경우에, 아미노산은 R 기에 의해 특징지어진다(예를 들어, 표 4 참조). 예를 들어, 아미노산은 비극성 지방족 R 기, 양으로 하전된 R 기, 음으로 하전된 R 기, 비극성 방향족 R 기, 또는 극성의 비하전된 R 기를 포함할 수 있다. 비극성 지방족 R 기를 포함하는 아미노산의 비제한적인 예는 알라닌, 글리신, 발린, 류신, 메티오닌, 및 이소류신을 포함한다. 양으로 하전된 R 기를 포함하는 아미노산의 비제한적인 예는 라이신, 아르기닌, 및 히스티딘을 포함한다. 음으로 하전된 R 기를 포함하는 아미노산의 비제한적인 예는 아스파르테이트 및 글루타메이트를 포함한다. 비극성 방향족 R 기를 포함하는 아미노산의 비제한적인 예는 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판을 포함한다. 극성의 비하전된 R 기를 포함하는 아미노산의 비제한적인 예는 세린, 트레오닌, 시스테인, 프롤린, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다.
폴리펩티드의 기능적으로 동등한 변이체의 비제한적인 예는 본 출원에 개시된 단백질의 아미노산 서열에서 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, "보존적 치환"은 "보존적 아미노산 치환"과 상호교환적으로 사용되며, 표 4에 제공된 아미노산 치환 중 어느 하나를 지칭한다.
일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 20개 초과의 잔기가 변이체 폴리펩티드를 제조할 때 변화될 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노산은 보존적 아미노산 치환으로 대체된다.
표 4. 보존적 아미노산 치환
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원하는 특성 및/또는 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드(예를 들어, AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS) 변이체를 생성하기 위한 폴리펩티드의 아미노산 서열에서의 아미노산 치환은 폴리펩티드(예를 들어, AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS)의 코딩 서열의 변경에 의해 이루어질 수 있다. 마찬가지로, 폴리펩티드의 기능적으로 동등한 변이체를 생성하기 위한 폴리펩티드의 아미노산 서열에서의 보존적 아미노산 치환은 전형적으로 재조합 폴리펩티드(예를 들어, AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS)의 코딩 서열의 변경에 의해 이루어진다.
돌연변이(예를 들어, 치환, 삽입, 부가, 또는 결실)는 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 핵산 서열에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 돌연변이(예를 들어, 치환, 삽입, 부가, 또는 결실)는 PCR 유도된 돌연변이, 쿤켈(Kunkel)의 방법(Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985)에 따른 부위 지정된 돌연변이유발, 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 화학적 합성, CRISPR, 또는 태그(예를 들어, HIS 태그 또는 GFP 태그)의 삽입과 같은 삽입에 의해 이루어질 수 있다. 돌연변이는, 예를 들어, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성된 치환, 삽입, 부가, 결실, 및 전위를 포함할 수 있다. 돌연변이를 생성하는 방법은 문헌(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012, or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York, 2010)과 같은 참조문헌에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, 변이체를 생성하는 방법은 원형 순열을 포함한다(Yu and Lutz, Trends Biotechnol. 2011 Jan;29(1):18-25). 원형 순열에서, 폴리펩티드의 선형 1차 서열은 (예를 들어, 서열의 N-말단 및 C-말단 끝을 연결함으로써) 원형화될 수 있고, 폴리펩티드는 상이한 위치에서 절단("파단")될 수 있다. 따라서, 새로운 폴리펩티드의 선형 1차 서열은 선형 서열 정렬 방법(예를 들어, 클러스털 오메가 또는 BLAST)에 의해 결정 시 낮은 서열 동일성(예를 들어, 그 사이의 모든 값을 포함하여 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만, 45% 미만, 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만)을 가질 수 있다. 그러나, 2개의 단백질의 위상 분석은 2개의 폴리펩티드의 3차 구조가 유사하거나 유사하지 않다는 것을 밝힐 수 있다. 특정 이론에 국한되지 않고, 참조 폴리펩티드의 원형 순열을 통해 생성되고 참조 폴리펩티드와 유사한 3차 구조를 갖는 변이체 폴리펩티드는 유사한 기능적 특징(예를 들어, 효소 활성, 효소 동역학, 기질 특이성 또는 생성물 특이성)을 공유할 수 있다. 일부 경우에, 원형 순열은 2차 구조, 3차 구조 또는 4차 구조를 변경하고 상이한 기능적 특징(예를 들어, 증가 또는 감소된 효소 활성, 상이한 기질 특이성, 또는 상이한 생성물 특이성)을 갖는 효소를 생성할 수 있다. 예를 들어, 문헌(Yu and Lutz, Trends Biotechnol. 2011 Jan;29(1):18-25)을 참조한다.
원형 순열을 거친 단백질에서 단백질의 선형 아미노산 서열은 원형 순열을 거치지 않은 참조 단백질과 상이할 수 있음을 인식해야 한다. 그러나, 당업자는, 예를 들어, 서열을 정렬하고 보존된 모티프를 검출함으로써 및/또는 단백질의 구조 또는 예측된 구조를, 예를 들어, 상동성 모델링에 의해 비교함으로써 원형 순열을 거친 단백질의 어느 잔기가 원형 순열을 거치지 않은 참조 단백질의 잔기에 상응하는지를 쉽게 결정할 수 있을 것이다.
일부 구현예에서, 관심 서열과 본 출원에 기재된 참조 서열 사이의 동일성 백분율을 결정하는 알고리즘은 서열 사이의 원형 순열의 존재를 설명한다. 원형 순열의 존재는, 예를 들어, RASPODOM(Weiner et al., Bioinformatics. 2005 Apr 1;21(7):932-7)을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 원형 순열의 존재는 관심 서열과 본 출원에 기재된 서열 간의 동일성 백분율의 계산 전에 교정된다(예를 들어, 적어도 하나의 서열의 도메인이 재배열됨). 본 출원의 청구범위는 서열의 잠재적 원형 순열을 고려한 후에 참조 서열에 대한 동일성 백분율이 계산되는 서열을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
숙주 세포에서 핵산의 발현
본 개시내용의 양태는 재조합 효소, 이의 기능적 변형 및 변이체뿐만 아니라 이들의 용도에 관한 것이다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 방법은 칸나비노이드 및/또는 칸나비노이드 전구체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 상기 방법은 본 출원에 개시된 효소, 세포 용해물, 단리된 효소, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 숙주 세포를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 숙주 세포에서 본 출원에 개시된 효소를 코딩하는 유전자의 재조합 발현을 포함하는 방법이 본 개시내용에 포함된다. 반응 혼합물에서 하나 이상의 칸나비노이드 전구체 또는 칸나비노이드를 본 출원에 개시된 효소와 반응시키는 것을 포함하는 시험관내 방법이 또한 본 개시내용에 포함된다. 일부 구현예에서, 효소는 TS이다.
본 출원에 기재된 임의의 재조합 폴리펩티드(예를 들어, AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS 효소)를 코딩하는 핵산은 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 임의의 적절한 벡터에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 바이러스 벡터(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노 관련 바이러스 벡터), 일시적 발현에 적합한 임의의 벡터, 항상성 발현에 적합한 임의의 벡터, 또는 유도성 발현에 적합한 임의의 벡터(예를 들어, 갈락토스 유도성 또는 독시사이클린 유도성 벡터)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 발현 벡터일 수 있다.
본 출원에 기재된 임의의 재조합 폴리펩티드(예를 들어, AAE, PKS, PKC, PT, 또는 TS 효소)를 코딩하는 벡터는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 효모 형질전환 프로토콜의 비제한적인 예는 그 전체가 본원에 참조로 포함된 문헌(Gietz et al., Yeast transformation can be conducted by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Mol Biol. 2006;313:107-20)에 기재되어 있다. 숙주 세포는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 적합한 임의의 조건 하에 배양될 수 있다. 예를 들어, 당업계에 공지된 임의의 배지, 온도 및 인큐베이션 조건이 사용될 수 있다. 유도성 벡터를 보유하는 숙주 세포의 경우, 세포는 발현을 촉진하기 위해 적절한 유도제와 함께 배양될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 세포에서 자율적으로 복제된다. 일부 구현예에서, 벡터는 세포 내 염색체에 통합된다. 벡터는 세포에서 복제될 수 있는 재조합 벡터를 생성하기 위해서 본 출원에 기재된 유전자를 함유하는 핵산을 삽입 및 결찰시키도록 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단되는 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 함유할 수 있다. 벡터는 전형적으로 DNA로 구성되지만, RNA 벡터도 이용 가능하다. 클로닝 벡터는 플라스미드, 포스미드, 파지미드, 바이러스 게놈, 및 인공 염색체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현 벡터" 또는 "발현 작제물"은 숙주 세포(예를 들어, 미생물), 예컨대 효모 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 명시된 핵산 요소를 갖는, 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된, 핵산 작제물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 유전자의 핵산 서열은 조절 서열에 작동적으로 연결되어서, 일부 구현예에서, RNA 전사물로서 발현되도록 클로닝 벡터에 삽입된다. 일부 구현예에서, 벡터는 재조합 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 세포를 확인하기 위해서, 본 출원에 기재된 바와 같은 선택 가능한 마커와 같은 하나 이상의 마커를 함유한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 이미 하나 이상의 벡터로 형질전환되었다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 후속적으로 하나 이상의 벡터로 형질전환된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 하나 초과의 벡터로 동시에 형질전환된다. 일부 구현예에서, 벡터 또는 발현 카세트로 형질전환된 세포는 벡터 또는 발현 카세트의 전부 또는 일부를 게놈에 통합한다. 일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 유전자의 핵산 서열은 재코딩된다. 재코딩은 재코딩되지 않은 참조 서열에 비해 그 사이의 모든 값을 포함하여 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%까지 유전자 생성물의 생성을 증가시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 임의의 단백질을 코딩하는 핵산은 조절 서열(예를 들어, 인핸서 서열)의 제어 하에 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 프로모터의 제어 하에 발현된다. 프로모터는 천연 프로모터, 예를 들어, 유전자의 발현의 정상 조절을 제공하는, 이의 내인성 환경에서의 유전자의 프로모터일 수 있다. 대안적으로, 프로모터는 유전자의 천연 프로모터와 상이한 프로모터일 수 있고, 예를 들어, 프로모터는 이의 내인성 상황에서의 유전자의 프로모터와 상이하다.
일부 구현예에서, 프로모터는 진핵생물 프로모터이다. 진핵생물 프로모터의 비제한적인 예는 당업자에게 공지된 바와 같은 TDH3, PGK1, PKC1, PDC1, TEF1, TEF2, RPL18B, SSA1, TDH2, PYK1, TPI1, GAL1, GAL10, GAL7, GAL3, GAL2, MET3, MET25, HXT3, HXT7, ACT1, ADH1, ADH2, CUP1-1, ENO2, 및 SOD1을 포함한다(예를 들어, Addgene 웹사이트: blog.addgene.org/plasmids-101-the-promoter-region 참조). 일부 구현예에서, 프로모터는 원핵생물 프로모터(예를 들어, 박테리오파지 또는 박테리아 프로모터)이다. 박테리오파지 프로모터의 비제한적인 예는 Pls1con, T3, T7, SP6, 및 PL을 포함한다. 박테리아 프로모터의 비제한적인 예는 Pbad, PmgrB, Ptrc2, Plac/ara, Ptac, 및 Pm을 포함한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "유도성 프로모터"는 분자의 존재 또는 부재에 의해 제어되는 프로모터이다. 이것은, 예를 들어, 효소의 발현을 제어 가능하게 유도시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 효소에 연결된 유도성 프로모터는, 예를 들어, 특정 시나리오에서(예를 들어, 특정 관할 구역의 규제 제한을 충족하기 위해 유전적으로 변형된 유기체를 수송하는 동안 또는 칸나비노이드가 배송되지 않을 수 있는 관할 구역 간에) 칸나비노이드 생성을 감소시키기 위해 효소(들)의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 효소에 연결된 유도성 프로모터는, 예를 들어, 특정 시나리오에서(예를 들어, 특정 관할 구역의 규제 제한을 충족하기 위해 유전적으로 변형된 유기체를 수송하는 동안 또는 칸나비노이드가 배송되지 않을 수 있는 관할 구역 간에) 칸나비노이드 생성을 감소시키기 위해 효소(들)의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있다. 유도성 프로모터의 비제한적인 예는 화학적으로 조절되는 프로모터 및 물리적으로 조절되는 프로모터를 포함한다. 화학적으로 조절되는 프로모터의 경우, 전사 활성은 하나 이상의 화합물, 예컨대 알코올, 테트라사이클린, 갈락토스, 스테로이드, 금속, 아미노산, 또는 다른 화합물에 의해 조절될 수 있다. 물리적으로 조절되는 프로모터 경우, 전사 활성은 현상, 예컨대 광 또는 온도에 의해 조절될 수 있다. 테트라사이클린-조절된 프로모터의 비제한적인 예는 언하이드로테트라사이클린(aTc)-반응성 프로모터 및 다른 테트라사이클린-반응성 프로모터 시스템(예를 들어, 테트라사이클린 리프레서 단백질(tetR), 테트라사이클린 오퍼레이터 서열(tetO) 및 테트라사이클린 트랜스활성인자 융합 단백질(tTA))을 포함한다. 스테로이드-조절된 프로모터의 비제한적인 예는 래트 글루코코르티코이드 수용체, 인간 에스트로겐 수용체, 나방 엑디손 수용체를 기반으로 하는 프로모터, 및 스테로이드/레티노이드/갑상선 수용체 수퍼패밀리로부터의 프로모터를 포함한다. 금속-조절된 프로모터의 비제한적인 예는 메탈로티오네인(금속 이온에 결합하여 격리시키는 단백질) 유전자로부터 유래된 프로모터를 포함한다. 발병기전-조절된 프로모터의 비제한적인 예는 살리실산, 에틸렌 또는 벤조티아디아졸(BTH)에 의해 유도되는 프로모터를 포함한다. 온도/열-유도성 프로모터의 비제한적인 예는 열충격 프로모터를 포함한다. 광-조절된 프로모터의 비제한적인 예는 식물 세포 유래의 광 반응성 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 유도성 프로모터는 갈락토스-유도성 프로모터이다. 특정 구현예에서, 유도성 프로모터는 하나 이상의 생리적 조건(예를 들어, pH, 온도, 방사선, 삼투압, 염수 구배, 세포 표면 결합, 또는 하나 이상의 외인성 또는 내인성 유도제의 농도)에 의해 유도된다. 외인성 유도인자 또는 유도제의 비제한적인 예는 아미노산 및 아미노산 유사체, 사카라이드 및 폴리사카라이드, 핵산, 단백질 전사 활성인자 및 리프레서, 사이토카인, 독소, 석유-기반 화합물, 금속 함유 화합물, 염, 이온, 효소 기질 유사체, 호르몬 또는 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 프로모터는 항상성 프로모터이다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "항상성 프로모터"는 유전자의 연속 전사를 허용하는 비조절된 프로모터를 지칭한다. 항상성 프로모터의 비제한적인 예는 TDH3, PGK1, PKC1, PDC1, TEF1, TEF2, RPL18B, SSA1, TDH2, PYK1, TPI1, HXT3, HXT7, ACT1, ADH1, ADH2, ENO2, 및 SOD1을 포함한다.
당업자에게 공지되어 있을 수 있는 합성 프로모터를 포함하는 다른 유도성 프로모터 또는 항상성 프로모터가 또한 고려된다.
유전자 발현에 필요한 조절 서열의 정확한 성질은 종 또는 세포 유형 간에 다양할 수 있지만, 일반적으로 필요에 따라, 각각 전사 및 번역의 개시에 관여되는 5' 비-전사 및 5' 비-번역 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함한다. 특히, 이러한 5' 비-전사 조절 서열은 작동적으로 연결된 유전자의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 조절 서열은 또한 인핸서 서열 또는 상류 활성자 서열을 포함할 수 있다. 개시된 벡터는 5' 리더(leader) 또는 신호 서열을 포함할 수 있다. 조절 서열은 또한 종결자 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 종결자 서열은 전사 동안 DNA 내 유전자의 끝을 표시한다. 이종 유기체에서 본 출원에 기재된 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 데 적합한 하나 이상의 적절한 벡터의 선택 및 설계는 당업자의 능력 및 재량 내에 있다.
발현에 필요한 요소를 함유하는 발현 벡터는 상업적으로 입수 가능하고 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012) 참조).
숙주 세포
개시된 칸나비노이드 생합성 방법 및 숙주 세포는 에스. 세레비지아에로 예시되지만, 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이 다른 숙주 세포에도 적용 가능하다.
적합한 숙주 세포는 효모 세포, 박테리아 세포, 조류 세포, 식물 세포, 진균 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포를 포함한 동물 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 일 구현예에서, 적합한 숙주 세포는 이. 콜라이(예를 들어, 매사추세츠주 입스에 위치한 New England BioLabs로부터 입수 가능한 ShuffleTM 컴피턴트 이. 콜라이)를 포함한다.
본 개시내용의 다른 적합한 숙주 세포는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 미생물을 포함한다. 일부 구현예에서, 바람직한 코리네박테리움 균주/종은 다음을 포함한다: 기탁형 균주가 DSM44549인 씨 에피시엔스(C. efficiens), 기탁형 균주가 ATCC13032인 씨. 글루타미쿰(C. glutamicum), 및 기탁형 균주가 ATCC6871인 씨. 암모니아게네스(C. ammoniagenes). 일부 구현예에서, 본 개시내용의 바람직한 숙주 세포는 씨. 글루타미쿰이다.
코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적합한 숙주 세포는 특히 공지된 야생형 균주이다: 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806, 코리네박테리움 아세토아시도필름(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870, 코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola) ATCC17965, 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067, 브레비박테리움 락토퍼멘툼(revibacterium lactofermentum) ATCC13869, 및 브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020; 및 L-아미노산-생성 돌연변이체, 또는 이로부터 제조된 균주, 예를 들어, L-리신-생성 균주: 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709, 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708, 브레비박테리움 락토퍼멘툼 FERM-P 1712, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464, 코리네박테리움 글루타미쿰 DM58-1, 코리네박테리움 글루타미쿰 DG52-5, 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5714, 및 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM12866.
적합한 효모 숙주 세포는 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 피키아(Pichia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 및 야로위아(Yarrowia)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 효모 세포는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 칼스베르겐시스(Saccaromyces carlsbergensis), 사카로마이세스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 이전에 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 핀란디카(Pichia finlandica), 피키아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 피키아 코다마에(Pichia kodamae), 피키아 멤브라나에파시엔스(Pichia membranaefaciens), 피키아 오푼티아에(Pichia opuntiae), 피키아 써모톨레란스(Pichia thermotolerans), 피키아 살릭타리아(Pichia salictaria), 피키아 쿠에르쿠움(Pichia quercuum), 피키아 피지페리(Pichia pijperi), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피키아 안구스타(Pichia angusta)로 공지된 코마가타엘라 파피(Komagataella phaffii), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 또는　야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)이다.
일부 구현예에서, 효모 균주는 산업용 배수체 효모 균주이다. 진균 세포의 다른 비제한적인 예는 아스페르길루스(Aspergillus) 종, 페니실리움(Penicillium) 종, 푸사리움(Fusarium) 종, 리조푸스(Rhizopus) 종, 아크레모니움(Acremonium) 종, 뉴로스포라(Neurospora) 종, 솔다리아(Sordaria) 종, 마그나포르테(Magnaporthe) 종, 알로마이세스(Allomyces) 종, 우스틸라고(Ustilago) 종, 보트리티스(Botrytis) 종, 및 트리코더마(Trichoderma) 종으로부터 얻어진 세포를 포함한다.
특정 구현예에서, 숙주 세포는 조류 세포, 예컨대 클라미도모나스(Chlamydomonas)　(예를 들어,　씨. 레인하르티이(C. Reinhardtii)) 및 포르미디움(Phormidium)　(피. 종 ATCC29409)이다.
다른 구현예에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포이다. 적합한 원핵생물 세포는 그람 양성, 그람 음성, 및 그람-가변성 박테리아 세포를 포함한다. 숙주 세포는 아그로박테리움(Agrobacterium), 알리시클로바실러스(Alicyclobacillus), 아나바에나(Anabaena), 아나시스티스(Anacystis), 아시네토박터(Acinetobacter), 아시도써머스(Acidothermus), 아트로박터(Arthrobacter), 아조박터(Azobacter), 바실러스(Bacillus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 부티리비브리오(Butyrivibrio), 부크네라(Buchnera), 캄페스트리스(Campestris), 캄필로박터(Campylobacter), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 크로마티움(Chromatium), 코프로코커스(Coprococcus), 에스케리치아(Escherichia), 엔테로코커스(Enterococcus), 엔테로박터(Enterobacter), 어위니아(Erwinia), 푸소박테리움(Fusobacterium), 파에칼리박테리움(Faecalibacterium), 프란시셀라(Francisella), 플라보박테리움 (Flavobacterium), 지오바실러스(Geobacillus), 해모필러스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 일리오박터(Ilyobacter), 미크로코커스(Micrococcus), 미크로박테리움(Microbacterium), 메소리조비움(Mesorhizobium), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 메틸로박테리움(Methylobacterium), 미코박테리움 (Mycobacterium), 네이세리아(Neisseria), 판토에아 (Pantoea), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로클로로코커스(Prochlorococcus), 로도박터(Rhodobacter), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 로세부리아 (Roseburia), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 로도코커스(Rhodococcus), 세네데스머스(Scenedesmus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스트렙토코커스(Streptococcus), 시네코커스(Synecoccus), 사카로모노스포라(Saccharomonospora), 사카로폴리스포라(Saccharopolyspora), 스타필로코커스(Staphylococcus), 세라티아(Serratia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 써모아나에로박테리움(Thermoanaerobacterium), 트로페리마(Tropheryma), 툴라렌시스(Tularensis), 테머큘라(Temecula), 써모시네코코커스(Thermosynechococcus), 써모코커스(Thermococcus), 우레아플라스마(Ureaplasma), 잔토모나스(Xanthomonas), 자일렐라(Xylella), 여시니아(Yersinia),　및 자이모모나스(Zymomonas)의 종일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 박테리아 숙주 균주는 산업용 균주이다. 수많은 박테리아 산업용 균주가 공지되어 있고 본 출원에 기재된 방법 및 조성물에 적합하다.
일부 구현예에서, 박테리아 숙주 세포는 아그로박테리움(Agrobacterium) 종(예를 들어,　에이. 라디오박터(A. radiobacter), 에이. 리조게네스(A. rhizogenes), 에이. 루비(A. rubi)), 아트로박터(Arthrobacter) 종(예를 들어,　에이. 아우레센스(A. aurescens), 에이. 시트레우스(A. citreus), 에이. 글롭포르미스(A. globformis), 에이. 하이드로카르보글루타미커스(A. hydrocarboglutamicus), 에이. 미소렌스(A. mysorens), 에이. 니코티아나에(A. nicotianae), 에이. 파라피네우스(A. paraffineus), 에이. 프로토폰니아에(A. protophonniae), 에이. 로세오파라피너스(A. roseoparaffinus), 에이. 술푸레우스(A. sulfureus), 에이. 우레아파시엔스(A. ureafaciens)), 바실러스(Bacillus) 종(예를 들어,　비. 투린지엔시스(B. thuringiensis), 비. 안트라시스(B. anthracis), 비. 메가테리움(B. megaterium), 비. 서브틸리스(B. subtilis), 비. 렌터스(B. lentus), 비. 서큘라스(B. circulars), 비. 푸밀러스(B. pumilus), 비. 라우터스(B. lautus), 비. 코아굴란스(B. coagulans), 비. 브레비스(B. brevis), 비. 퍼머스(B. firmus), 비. 알카오피우스(B. alkaophius), 비. 리체니포르미스(B. licheniformis), 비. 클라우시이(B. clausii), 비. 스테아로써모필러스(B. stearothermophilus), 비. 할로두란스(B. halodurans) 및 비. 아밀로리케파시엔스(B. amyloliquefaciens)의 것이다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 비. 서브틸리스(B. subtilis), 비. 푸밀러스(B. pumilus), 비. 리체니포르미스(B. licheniformis), 비. 메가테리움(B. megaterium), 비. 클라우시이(B. clausii), 비. 스테아로써모필러스(B. stearothermophilus)　및 비. 아밀로리케파시엔스(B. amyloliquefaciens)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 산업용 바실러스 균주일 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 산업용 클로스트리듐 종(예를 들어,　씨. 아세토부틸리컴(C. acetobutylicum), 씨. 테타니(C. tetani)　E88,　씨. 리투세부렌스(C. lituseburense), 씨. 사카로부틸리컴(C. saccharobutylicum), 씨. 퍼프린젠스(C. perfringens), 씨. 베이제린키이(C. beijerinckii))일 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 산업용 코리네박테리움 종(예를 들어,　씨. 글루타미컴(C. glutamicum), 씨. 아세토아시도필럼(C. acetoacidophilum))일 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 산업용 에스케리치아 종(예를 들어,　이. 콜라이)일 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 산업용 어위니아 종(예를 들어, 이. 우레도보라(E. uredovora), 이. 카로토보라(E. carotovora), 이. 아나나스(E. ananas), 이. 허비콜라(E. herbicola), 이. 푼타타(E. punctata), 이. 테레우스(E. terreus))일 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 산업용 판토에아 종(예를 들어, 피. 시트레아 (P. citrea), 피. 아글로머란스(P. agglomerans))일 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 산업용 슈도모나스 종(예를 들어,　피. 푸티다(P. putida), 피. 애루지노사(P. aeruginosa), 피. 메발로니이(P. mevalonii))일 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 산업용 스트렙토코커스 종(예를 들어,　에스. 에퀴시밀레스(S. equisimiles), 에스. 피오게네스(S. pyogenes), 에스. 우베리스(S. uberis))일 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 산업용 스트렙토마이세스 종(예를 들어,　에스. 암보파시엔스(S. ambofaciens), 에스, 아크로모게네스(S. achromogenes), 에스. 아버미틸리스(S. avermitilis), 에스. 코엘리콜러(S. coelicolor), 에스. 아우레오파시엔스(S. aureofaciens), 에스. 아우레우스(S. aureus), 에스. 푼지시디커스(S. fungicidicus), 에스. 그리세우스(S. griseus), 에스. 리비단스(S. lividans))일 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 산업용 자이모모나스 종(예를 들어, 지. 모빌리스(Z. mobilis), 지. 리폴리티카(Z. lipolytica)) 등일 것이다.
본 개시내용은 또한 포유동물 세포, 예를 들어, 인간(293, HeLa, WI38, PER.C6 및 바우스 흑색종 세포 포함), 마우스(3T3,　NS0, NS1, Sp2/0 포함), 햄스터(CHO, BHK), 원숭이(COS, FRhL, Vero), 곤충 세포, 예를 들어, 가을 거미벌레(Sf9 및 Sf21 포함), 누에나방(BmN 포함), 양배추 자벌레(BTI-Tn-5B1-4 포함) 및 일반 초파리(슈나이더(Schneider) 2 포함), 및 하이브리도마 세포주를 포함한 다양한 동물 세포 유형과 함께 사용하기에 적합하다.
다양한 구현예에서, 균주는 원핵생물 및 진핵생물 균주 둘 모두를 포함하여 본 개시내용의 실시에서 사용될 수 있으며 수많은 생물자원 센터, 예컨대 미국 생물자원 센터(American Type Culture Collection) (ATCC), 독일 생물자원 센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH) (DSM), 네덜란드 곰팡이 자원 센터(Centraalbureau Voor Schimmelcultures) (CBS), 및 농업 특허 자원 센터, 북부 연구소(Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center) (NRRL)에서 공공으로 쉽게 접근 가능하다. 본 개시내용은 또한 다양한 식물 세포 유형과 함께 사용하기에 적합하다. 일부 구현예에서, 식물은 대마초과의 대마초 속이다. 특정 구현예에서, 식물은 대마초 사티바, 대마초 인디카, 또는 대마초 루데랄리스 종이다. 다른 구현예에서, 식물은 가지과의 니코티아나 속의 식물이다. 특정 구현예에서, 식물은 니코티아나 루스티카(Nicotiana rustica) 종이다.
본 출원에 사용된 용어 "세포"는 단일 세포, 또는 동일한 세포주 또는 균주에 속하는 세포 집단과 같은 세포 집단을 지칭할 수 있다. 단수 용어 "세포"의 사용은 세포 집단보다 단일 세포를 명시적으로 지칭하는 것으로 해석되어서는 안된다. 숙주 세포는 야생형 대응물에 대한 유전자 변형을 포함할 수 있다. 숙주 세포에서 유전자 발현 및/또는 유전자 불활성화의 감소는 유전자의 결실, 유전자에 점 돌연변이의 도입, 유전자의 선택적 편집 및/또는 유전자의 절단을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 방법을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR)-기반 방법이 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌(Gardner et al., Methods Mol Biol. 2014;1205:45-78) 참조). 비제한적인 예로서, 유전자는 유전자 교체(예를 들어, 선택 마커를 포함하는 마커로)를 통해 결실될 수 있다. 유전자는 또한 트랜스포존 시스템의 사용을 통해 절단될 수 있다(예를 들어, 문헌(Poussu et al., Nucleic Acids Res. 2005; 33(12): e104) 참조). 유전자는 또한 CRISPR 기반 기술과 같은 당업계에 공지된 유전자 편집 기술의 사용을 통해 편집될 수 있다.
숙주 세포 배양
본 출원에 개시된 임의의 세포는 핵산의 접촉 및/또는 통합 이전, 동안 및/또는 이후에 임의의 유형(풍부 또는 최소) 및 임의의 조성의 배지에서 배양될 수 있다. 배양 또는 배양 공정의 조건은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 통상적인 실험을 통해 최적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택된 배지는 다양한 성분으로 보충된다. 일부 구현예에서, 보충 성분의 농도 및 양이 최적화된다. 일부 구현예에서, 배지의 다른 양태 및 성장 조건(예를 들어, pH, 온도 등)은 통상적인 실험을 통해 최적화된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 보충 성분이 배지에 보충되는 빈도, 및 세포가 배양되는 시간량이 최적화된다.
본 출원에서 기재된 세포의 배양은 당업계에 공지되어 사용되는 배양 용기에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 통기형 반응 용기(예를 들어, 교반식 탱크 반응기)가 세포를 배양하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 생물반응기 또는 발효기를 사용하여 세포를 배양한다. 따라서, 일부 구현예에서, 세포는 발효에 사용된다. 본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "생물반응기" 및 "발효기"는 상호교환적으로 사용되며, 살아있는 유기체, 살아있는 유기체의 일부를 포함하는, 생물학적, 생화학적, 및/또는 화학적 반응이 일어나는, 인클로저 또는 부분 인클로저를 지칭한다. "대규모 생물반응기" 또는 "산업적 규모 생물반응기"는 상업적 또는 준-상업적 규모로 생성물을 생성하는 데 사용되는 생물반응기이다. 대규모 생물반응기는 전형적으로 리터, 수백 리터, 수천 리터 또는 그 초과의 범위의 부피를 갖는다.
생물반응기의 비제한적인 예는 교반식 탱크 발효기, 회전식 혼합 장치, 케모스타트에 의해 교반되는 생물반응기, 진탕 장치로 교반되는 생물반응기, 에어리프트 발효기, 충전층 반응기, 고정층 반응기, 유동층 생물반응기, 파동 유발 교반을 사용한 생물반응기, 원심 생물반응기, 롤러병(roller bottle), 및 중공 섬유 생물반응기, 롤러 장비(예를 들어, 벤치탑, 카트-장착, 및/또는 자동화 버라이어티), 수직-적층 플레이트, 스피너 플라스크, 교반식 또는 진동식 플라스크, 진탕 다중-웰 플레이트, MD 병, T-플라스크, 루(Roux) 병, 다중-표면 조직 배양 전파기, 변형식 발효기, 및 코팅된 비드(예를 들어, 세포 부착을 방지하기 위해 혈청 단백질, 니트로셀룰로오스, 또는 카복시메틸 셀룰로오스로 코팅된 비드)를 포함한다.
일부 구현예에서, 생물반응기는 세포(예를 들어, 효모 세포)가 이동하는 액체 및/또는 가스 버블과 접촉하는 세포 배양 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 또는 세포 배양물은 현탁 성장된다. 다른 구현예에서, 세포 또는 세포 배양물은 고상(solid phase) 담체에 부착된다. 담체 시스템의 비제한적인 예는 마이크로담체(예를 들어, 다공성 또는 비-다공성일 수 있는 중합체구, 마이크로비드, 및 마이크로디스크), 특별한 화학기(예를 들어, 4차 아민 기)가 충전된 가교결합된 비드(예를 들어, 덱스트란), 비다공성 중합체 섬유에 포획된 세포를 포함하는 2D 마이크로담체, 3D 담체(예를 들어, 캐리어 섬유, 중공 섬유, 다중카트리지 반응기, 및 다공성 섬유를 포함할 수 있는 반투과성막), 이온 교환 능력이 감소된 마이크로담체, 캡슐화 세포, 모세관, 및 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 담체는 덱스트란, 젤라틴, 유리, 또는 셀룰로오스와 같은 재료로 제작된다.
일부 구현예에서, 산업적 규모의 과정은 연속식, 반-연속식, 또는 비-연속식 방식으로 작업된다. 작업 방식의 비제한적인 예는 배치식, 유가식(fed batch), 확장형 배치식, 반복형 배치식, 추출/충전(draw/fill), 회전-벽, 스피닝 플라스크, 및/또는 관류 작업 방식을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물반응기는 기질 스톡, 예를 들어, 탄수화물 공급원의 연속 또는 반연속 보충 및/또는 생물반응기로부터 생성물의 연속 또는 반연속 분리를 허용한다.
일부 구현예에서, 생물반응기 또는 발효기는 반응 매개변수를 측정하고/하거나 조정하기 위한 센서 및/또는 제어 시스템을 포함한다. 반응 매개변수의 비제한적인 예는 생물학적 매개변수(예를 들어, 성장 속도, 세포 크기, 세포 수, 세포 밀도, 세포 유형, 또는 세포 상태 등), 화학적 매개변수(예를 들어, pH, 산화환원 전위, 반응 기질 및/또는 생성물의 농도, 용존 가스의 농도, 예컨대 산소 농도 및 CO2 농도, 영양소 농도, 대사산물 농도, 올리고펩티드의 농도, 아미노산의 농도, 비타민의 농도, 호르몬의 농도, 첨가제의 농도, 혈청 농도, 이온 강도, 이온의 농도, 상대 습도, 몰농도, 삼투압 농도, 다른 화학 물질, 예를 들어 완충제, 보강제 또는 반응 부산물의 농도), 물리적/기계적 매개변수(예를 들어, 밀도, 전도도, 교반 정도, 압력, 및 유속, 전단 응력, 전단 속도, 점도, 색상, 탁도, 흡광도, 혼합율, 전환율뿐만 아니라 열역학적 매개변수, 예컨대 온도, 광 강도/품질 등)를 포함한다. 본 출원에 기재된 매개변수를 측정하기 위한 센서는 관련 기계 및 전자 분야의 당업자에게 익히 공지되어 있다. 본 출원에 기재된 센서로부터 투입물 기반으로 생물반응기의 매개변수를 조정하기 위한 제어 시스템은 생물반응기 조작의 당업자에게 익히 공지되어 있다.
일부 구현예에서, 방법은 배치식 발효(예를 들어, 진탕 플라스크 발효)를 포함한다. 배치식 발효(예를 들어, 진탕 플라스크 발효)에 대한 일반 고려사항은 산소 및 글루코스 수준을 포함한다. 예를 들어, 배치식 발효(예를 들어, 진탕 플라스크 발효)는 산소 및 글루코스가 제한될 수 있어서, 일부 구현예에서, 잘-설계된 유가식 발효에서 수행하는 균주의 능력이 과소평가된다. 또한, 최종 생성물(예를 들어, 칸나비노이드 또는 칸나비노이드 전구체)은 가용성, 독성, 세포 축적 및 분비의 관점에서 기질과 일부 편차를 나타낼 수 있고 일부 구현예에서 상이한 발효배양 동역학을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 세포는 생체내에서 칸나비노이드 또는 칸나비노이드 전구체를 생성하도록 적응된다. 일부 구현예에서, 세포는 칸나비노이드 합성을 위한 하나 이상의 효소(예를 들어, AAE, PKS, PKC, PT 또는 TS)를 분비하도록 적응된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 세포는 용해되고, 나머지 용해물은 후속 사용을 위해 회수된다. 이러한 구현예에서, 분비되거나 용해된 효소는 시험관내 또는 생체외 과정에서 생물전환에 의한 칸나비노이드 또는 전구체의 생성을 위한 반응을 촉매할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 임의의 모든 전환은 시험관내 또는 생체내에서 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 생체내에서 칸나비노이드 또는 칸나비노이드 전구체를 생성하도록 적응된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 하나 이상의 칸나비노이드 경로 기질, 중간체 및/또는 말단 생성물(예를 들어, 올리베톨, THCA, THC, CBDA, CBD, CBGA, CBGVA, THCVA, CBDVA, CBCVA, 또는 CBCA)을 분비하도록 적응된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 숙주 세포는 용해되고, 용해물은 후속 사용을 위해 회수된다. 이러한 구현예에서, 분비된 기질, 중간체 및/또는 말단 생성물은 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
정제 및 추가 처리
일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 임의의 방법은 생성된(예를 들어, 생물반응기에서 생성된) 칸나비노이드 및/또는 칸나비노이드 전구체의 단리 및/또는 정제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단리 및/또는 정제는 세포 용해, 원심분리, 추출, 컬럼 크로마토그래피, 증류, 결정화 및 동결건조 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 출원에 기재된 방법은 당업계에 공지된 임의의 칸나비노이드 또는 칸나비노이드 전구체의 생성을 포함한다. 본 출원에 개시된 임의의 재조합 세포, 또는 본 출원에 기재된 임의의 시험관내 방법에 의해 생성되는 칸나비노이드 또는 칸나비노이드 전구체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인 및 추출될 수 있다. 질량 분석법(예를 들어, LC-MS, GC-MS)은 확인 방법의 비제한적인 예이며 관심 화합물을 추출하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 임의의 방법은 칸나비노이드 또는 칸나비노이드 전구체의 탈카복실화를 추가로 포함한다. 비제한적인 예로서, 칸나비노이드 또는 칸나비노이드 전구체의 산 형태는 칸나비노이드 또는 칸나비노이드 전구체를 탈카복실화하기 위해 가열(예를 들어, 적어도 90℃)될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 10,159,908, 미국 특허 번호 10,143,706, 미국 특허 번호 9,908,832 및 미국 특허 번호 7,344,736을 참조한다. 또한, 예를 들어, 문헌(Wang et al., Cannabis Cannabinoid Res. 2016; 1(1): 262 - 271)을 참조한다.
조성물, 키트, 및 투여
본 개시내용은 본 출원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 칸나비노이드 또는 칸나비노이드 전구체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 임의로 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 포함한 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 출원에 기재된 칸나비노이드 또는 칸나비노이드 전구체는 약학 조성물과 같은 조성물에 유효량으로 제공된다. 특정 구현예에서, 유효량은 치료학적 유효량이다. 특정 구현예에서, 유효량은 예방학적 유효량이다.
본 출원에 기재된 약학 조성물과 같은 조성물은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 이러한 제조 방법은 본 출원에 기재된 화합물(예를 들어, "활성 성분")을 담체 또는 부형제, 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 회합되도록 하는 단계, 및 이어서 필요하고/하거나 바람직하다면, 바람직한 단일 용량 단위 또는 다중 용량 단위로 생성물을 성형 및/또는 포장하는 단계를 포함한다.
약학 조성물은 단일 단위 용량 및/또는 복수의 단일 단위 용량으로서 대량으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. "단위 용량"은 소정량의 활성 성분을 포함하는 약학 조성물의 별개의 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체에게 투여될 활성 성분의 투여량 및/또는 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 같은 이러한 투여량의 편리한 분획과 동일하다.
본 출원에 기재된 약학 조성물 중 활성 성분, 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 임의의 추가 성분의 상대적인 양은 치료 대상체의 정체, 크기, 및/또는 상태에 따라 그리고 조성물이 투여될 경로에 따라 추가로 달라질 것이다. 조성물은 0.1%와 100% (w/w) 사이의 활성 성분을 포함할 수 있다.
약학 조성물의 제조에 사용되는 약학적으로 허용되는 부형제는 불활성 희석제, 분산제 및/또는 과립화제, 표면 활성제 및/또는 유화제, 붕해제, 결합제, 방부제, 완충제, 윤활제 및/또는 오일을 포함한다. 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제, 착색제, 코팅제, 감미제, 향미제, 및 방향제가 또한 조성물에 존재할 수 있다. 예시적인 부형제는 본 출원에 개시된 바와 같은 희석제, 분산제 및/또는 과립화제, 표면 활성제 및/또는 유화제, 붕해제, 결합제, 방부제, 완충제, 윤활제, 및/또는 오일(예를 들어, 합성 오일, 반합성 오일)을 포함한다.
예시적인 희석제는 탄산칼슘, 탄산나트륨, 인산칼슘, 인산이칼슘, 황산칼슘, 인산수소칼슘, 인산나트륨 락토스, 수크로스, 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 카올린, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 염화나트륨, 건조 전분, 옥수수 전분, 분말 설탕 및 이들의 혼합물을 포함한다.
예시적인 과립화제 및/또는 분산제는 감자 전분, 옥수수 전분, 타피오카 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트, 점토, 알긴산, 구아 검, 감귤 펄프, 한천, 벤토나이트, 셀룰로오스, 및 목제품, 천연 스펀지, 양이온 교환 수지, 탄산칼슘, 규산염, 탄산나트륨, 가교결합된 폴리(비닐-피롤리돈) (크로스포비돈), 나트륨 카복시메틸 전분(나트륨 전분 글리콜레이트), 카복시메틸 셀룰로오스, 가교결합된 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스(크로스카르멜로스), 메틸셀룰로오스, 전호화 전분(전분 1500), 미정질 전분, 수불용성 전분, 칼슘 카복시메틸 셀룰로오스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트(Veegum), 나트륨 라우릴 설페이트, 4차 암모늄 화합물, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
예시적인 표면 활성제 및/또는 유화제는 천연 유화제(예를 들어, 아카시아, 한천, 알긴산, 알긴산나트륨, 트라가칸트, 콘드룩스, 콜레스테롤, 크산탄, 펙틴, 젤라틴, 난황, 카제인, 양모지방, 콜레스테롤, 왁스, 레시틴), 콜로이드 점토(예를 들어, 벤토나이트(규산알루미늄) 및 Veegum(규산알루미늄 마그네슘)), 장쇄 아미노산 유도체, 고분자량 알코올(예를 들어, 스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 올레일 알코올, 트리아세틴 모노스테아레이트, 에틸렌 글리콜 디스테아레이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 및 프로필렌 글리콜 모노스테아레이트, 폴리비닐 알코올), 카보머(예를 들어, 카복시 폴리메틸렌, 폴리아크릴산, 아크릴산 중합체 및 카복시비닐 중합체), 카라기난, 셀룰로오스 유도체(예를 들어, 카복시메틸셀룰로오스 나트륨, 분말 셀룰로오스, 하이드록시메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스), 소르비탄 지방산 에스테르(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트(Tween® 20), 폴리옥시에틸렌 소르비탄(Tween® 60), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(Tween® 80), 소르비탄 모노팔미테이트(Span® 40), 소르비탄 모노스테아레이트(Span® 60), 소르비탄 트리스테아레이트(Span® 65), 글리세릴 모노올레에이트, 소르비탄 모노올레에이트(Span® 80), 폴리옥시에틸렌 에스테르(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트(Myrj® 45), 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리에톡실화 피마자유, 폴리옥시메틸렌 스테아레이트, 및 Solutol®), 수크로스 지방산 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르(예를 들어, Cremophor®), 폴리옥시에틸렌 에테르(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르(Brij® 30)), 폴리(비닐-피롤리돈), 디에틸렌 글리콜 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 올레산나트륨, 올레산칼륨, 올레산에틸, 올레산, 에틸 라우레이트, 나트륨 라우릴 설페이트, Pluronic® F-68, 폴록사머 P-188, 브롬화세트리모늄, 염화세틸피리디늄, 염화벤잘코늄, 도쿠세이트 나트륨 및/또는 이들의 혼합물을 포함한다.
예시적인 결합제는 전분(예를 들어, 옥수수 전분 및 전분 페이스트), 젤라틴, 당(예를 들어, 수크로스, 글루코스, 덱스트로스, 덱스트린, 당밀, 락토스, 락티톨, 만니톨 등), 천연 및 합성 검(예를 들어, 아카시아, 알긴산나트륨, 아일랜드 이끼(Irish moss) 추출물, 판와르 검(panwar gum), 가티 검, 이사폴 껌집의 점액질, 카복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리(비닐-피롤리돈), 마그네슘 알루미늄 실리케이트(Veegum®), 및 낙엽송 아라보갈락탄), 알지네이트, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌 글리콜, 무기 칼슘 염, 규산, 폴리메타크릴레이트, 왁스, 물, 알코올, 및/또는 이들의 혼합물을 포함한다.
예시적인 방부제는 항산화제, 킬레이트제, 항미생물 방부제, 항진균 방부제, 항원충 방부제, 알코올 방부제, 산성 방부제, 및 기타 방부제를 포함한다. 특정 구현예에서, 방부제는 항산화제이다. 다른 구현예에서, 방부제는 킬레이트제이다.
예시적인 항산화제는 알파 토코페롤, 아스코르브산, 아코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 모노티오글리세롤, 메타중아황산칼륨, 프로피온산, 프로필 갈레이트, 아스코르브산나트륨, 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨 및 아황산나트륨을 포함한다.
예시적인 킬레이트제는 에틸렌디아민테티라아세트산(EDTA) 및 이의 염 및 수화물(예를 들어, 에데트산나트륨, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 에데트산칼슘이나트륨, 에데트산이칼륨 등), 시트르산 및 이의 염 및 수화물(예를 들어, 시트르산 일수화물), 푸마르산 및 이의 염 및 수화물, 말산 및 이의 염 및 수화물, 인산 및 이의 염 및 수화물, 및 타르타르산 및 이의 염 및 수화물을 포함한다. 예시적인 항미생물 방부제는 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 벤질 알코올, 브로노폴, 세트리미드, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로르헥시딘, 클로로부탄올, 클로로크레졸, 클로록실레놀, 크레졸, 에틸 알코올, 글리세린, 헥세티딘, 이미두레아, 페놀, 페녹시에탄올, 페닐에틸 알코올, 질산페닐수은, 프로필렌 글리콜 및 티메로살을 포함한다.
예시적인 항진균 방부제는 부틸 파라벤, 메틸 파라벤, 에틸 파라벤, 프로필 파라벤, 벤조산, 하이드록시벤조산, 벤조산칼륨, 소르브산칼륨, 벤조산나트륨, 프로피온산타륨, 및 소르브산을 포함한다.
예시적인 알코올 방부제는 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 페놀, 페놀 화합물, 비스페놀, 클로로부탄올, 하이드록시벤조에이트, 및 페닐에틸 알코올을 포함한다.
예시적인 산성 방부제는 비타민 A, 비타민 C, 비타민 E, 베타-카로틴, 시트르산, 아세트산, 데하이드로아세트산, 아스코르브산, 소르브산 및 피트산(phytic acid)을 포함한다.
다른 방부제는 토코페롤, 토코페롤 아세테이트, 데테록심 메실레이트, 세트리미드, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 에틸렌디아민, 나트륨 라우릴 설페이트(SLS), 나트륨 라우릴 에테르 설페이트(SLES), 중아황산나트륨, 메타중아황산나트륨, 아황산칼륨, 메타중아황산칼륨, Glydant® Plus, Phenonip®, 메틸파라벤, Germall® 115, Germaben® II, Neolone®, Kathon®, 및 Euxyl®을 포함한다.
예시적인 완충제는 시트레이트 완충 용액, 아세테이트 완충 용액, 포스페이트 완충 용액, 염화암모늄, 탄산칼슘, 염화칼슘, 시트르산칼슘, 글루비온산칼슘, 글루셉산칼슘, 글루콘산칼슘, D-글루콘산, 글리세로인산칼슘, 락트산칼슘, 프로판산, 레불린산칼슘, 펜탄산, 이염기성 인산칼슘, 인산, 삼염기성 인산칼슘, 수산화칼슘 인산염, 아세트산칼륨, 염화칼륨, 글루콘산칼륨, 칼륨 혼합물, 이염기성 인산칼륨, 일염기성 인산칼륨, 인산칼륨 혼합물, 아세트산나트륨, 중탄산나트륨, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 락트산나트륨, 이염기성 인산나트륨, 일염기성 인산나트륨, 인산나트륨 혼합물, 트로메타민, 수산화마그네슘, 수산화알루미늄, 알긴산, 발열원 없는 물, 등장 식염수, 링거액, 에틸 알코올, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
예시적인 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 스테아르산, 실리카, 활석, 맥아, 글리세릴 베헤네이트, 경화 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 류신, 마그네슘 라우릴 설페이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
예시적인 천연 오일은 아몬드, 살구씨, 아보카도, 바바수야자나무(babassu), 베르가못, 블랙 커런트 씨(black current seed), 서양지치(borage), 케이드(cade), 카밀레(camomile), 캐놀라, 캐러웨이(caraway), 카나우바, 피마자, 계피, 코코아 버터, 코코넛, 대구 간, 커피, 옥수수, 목화씨, 에뮤(emu), 유칼립투스, 달맞이꽃, 생선, 아마씨, 게라니올(geraniol), 박(gourd), 포도씨, 헤이즐넛, 우슬초, 이소프로필 미리스테이트, 호호바, 쿠쿠이넛(kukui nut), 라반딘, 라벤더, 레몬, 리체아 큐베바(litsea cubeba), 마카데미아 넛, 당아욱(mallow), 망고 씨, 메도우폼 씨(meadowfoam seed), 밍크, 육두구(nutmeg), 올리브, 오렌지, 오렌지 러피(orange roughy), 팜, 팜 커널, 복숭아 커널, 땅콩, 양귀비씨, 호박씨, 유채, 쌀겨, 로즈마리, 잇꽃, 백단, 사스콰나(sasquana), 세이버리, 바다 갈매 나무속(sea buckthorn), 참깨, 시어 버터, 실리콘, 대두, 해바라기, 티 트리(tea tree), 엉겅퀴, 츠바키(tsubaki), 베티버, 호두 및 밀 배아 오일을 포함한다. 예시적인 합성 또는 반합성 오일은 부틸 스테아레이트, 중쇄 트리글리세리드(예컨대 카프릴산 트리글리세리드 및 카프르산 트리글리세리드), 사이클로메티콘, 디에틸 세바케이트, 디메티콘 360, 이소프로필 미리스테이트, 미네랄 오일, 옥틸도데칸올, 올레일 알코올, 실리콘 오일 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 예시적인 합성 오일은 중쇄 트리글리세리드(예컨대 카프릴산 트리글리세리드 및 카프릴산 트리글리세리드)를 포함한다.
경구 및 비경구 투여를 위한 액체 투여 형태는 약학적으로 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 활성 성분 이외에, 액체 투여 형태는, 예를 들어, 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일(예를 들어, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물과 같은 당업계에 일반적으로 사용되는 불활성 희석제를 포함할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미제 및 방향제와 같은 애쥬번트를 포함할 수 있다. 비경구 투여를 위한 특정 구현예에서, 본 출원에 기재된 접합체는 Cremophor®, 알코올, 오일, 개질된 오일, 글리콜, 폴리소르베이트, 사이클로덱스트린, 중합체 및 이들의 혼합물과 같은 가용화제와 혼합된다.
주사 가능한 제제, 예를 들어, 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사 가능한 제제는 무독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 가능한 용액, 현탁액 또는 에멀젼, 예를 들어 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액, USP 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정유는 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이를 위해, 합성 모노- 또는 디-글리세리드를 포함한 임의의 무자극(bland) 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 주사제의 제조에는 올레산과 같은 지방산이 사용된다.
주사 가능한 제형은, 예를 들어, 박테리아-보유 필터를 통한 여과에 의해, 또는 사용 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사 가능한 매질에 용해 또는 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균제를 혼입함으로써 멸균될 수 있다.
약물의 효과를 연장하기 위해, 종종 피하 또는 근육내 주사로부터 약물의 흡수를 늦추는 것이 바람직하다. 이는 불량한 수용성의 결정질 또는 무정형 물질의 액체 현탁액을 사용하여 달성될 수 있다. 이어서, 약물의 흡수 속도는 용해 속도에 따라 달라지며, 이는 차례로 결정 크기와 결정질 형태에 따라 달라질 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여된 약물 형태의 지연된 흡수는 오일 비히클에 약물을 용해 또는 현탁시킴으로써 달성될 수 있다.
직장 또는 질 투여용 조성물은 전형적으로, 주위 온도에서는 고체이지만 체온에서는 액체이므로 직장 또는 질강에서 용해되어 활성 성분을 방출하는, 본 출원에 기재된 접합체를 적합한 비자극성 부형제 또는 담체, 예컨대 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 좌약 왁스와 혼합하여 제조될 수 있는 좌약이다.
경구 투여용 고체 투여 형태는 캡슐, 정제, 환제, 분말 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 투여 형태에서, 활성 성분은 적어도 하나의 불활성, 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체, 예컨대 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘 및/또는 (a) 충전제 또는 증량제, 예컨대 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨, 및 규산, (b) 결합체, 예를 들어, 카복시메틸셀룰로오스, 알지네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리디논, 수크로스, 및 아카시아, (c) 보습제, 예컨대 글리세롤, (d) 붕해제, 예컨대 한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염 및 탄산나트륨, (e) 용액 지연제, 예컨대 파라핀, (f) 흡수 촉진제, 예컨대 4차 암모늄 화합물, (g) 습윤제, 예를 들어, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트, (h) 흡수제, 예컨대 카올린 및 벤토나이트 점토, 및 (i) 윤활제, 예컨대 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트, 및 이들의 혼합물과 혼합된다. 캡슐, 정제, 및 환제의 경우, 투여 형태는 완충제를 포함할 수 있다.
유사한 유형의 고체 조성물은 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등뿐만 아니라 락토스 또는 유당과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용될 수 있다. 정제, 당의정, 캡슐, 환제, 및 과립의 고체 투여 형태는 장용 코팅 및 약리학 분야에 익히 공지된 기타 코팅과 같은 코팅 및 쉘로 제조될 수 있다. 이들은 임의로 불투명화제를 포함할 수 있고 활성 성분(들)만을 또는 우선적으로 장관의 특정 부분에서 임의로 지연된 방식으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 캡슐화 조성물의 예는 중합체 물질 및 왁스를 포함한다. 유사한 유형의 고체 조성물은 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등뿐만 아니라 락토스 또는 유당과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용될 수 있다.
활성 성분은 상기 언급된 바와 같이 하나 이상의 부형제와 함께 마이크로-캡슐화된 형태일 수 있다. 정제, 당의정, 캡슐, 환제, 및 과립의 고체 투여 형태는 장용 코팅, 방출 제어 코팅, 및 제약 제형화 분야에서 익히 공지된 기타 코팅과 같은 코팅 및 쉘로 제조될 수 있다. 이러한 고체 투여 형태에서, 활성 성분은 수크로스, 락토스 또는 전분과 같은 적어도 하나의 불활성 희석제와 혼합될 수 있다. 이러한 투여 형태는 일반적인 관행에서와 같이 불활성 희석제 이외의 추가 물질, 예를 들어, 정제화 윤활제 및 기타 정제화 보조제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 및 미정질 셀룰로오스를 포함할 수 있다. 캡슐, 정제 및 환제의 경우, 투여 형태는 완충제를 포함할 수 있다. 이들은 임의로 불투명화제를 포함할 수 있고 활성 성분(들)만을 또는 우선적으로 장관의 특정 부분에서 임의로 지연된 방식으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용할 수 있는 캡슐화제의 예는 중합체 물질 및 왁스를 포함한다.
본 출원에 기재된 화합물의 국소 및/또는 경피 투여를 위한 투여 형태는 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 및/또는 패치를 포함할 수 있다. 일반적으로, 활성 성분은 멸균 조건 하에 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제 및/또는 요구될 수 있는 임의의 필요한 방부제 및/또는 완충제와 혼합된다. 추가로, 본 개시내용은 종종 신체에 활성 성분의 제어된 전달을 제공하는 추가 이점을 갖는 경피 패치의 사용을 고려한다. 이러한 투여 형태는, 예를 들어, 활성 성분을 적절한 매질에 용해 및/또는 분배함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 속도는 속도 조절 막을 제공하고/하거나 활성 성분을 중합체 매트릭스 및/또는 겔에 분산시킴으로써 조절될 수 있다.
본 출원에 기재된 피내 약학 조성물을 전달하는 데 사용하기에 적합한 장치는 짧은 바늘 장치를 포함한다. 피내 조성물은 피부로의 바늘의 유효 침투 길이를 제한하는 장치에 의해 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 통상적인 주사기는 피내 투여의 고전적인 망투(mantoux) 방법에서 사용될 수 있다. 액체 제트 주입기를 통해 및/또는 각질층을 관통하고 진피에 도달하는 제트를 생성하는 바늘을 통해 액체 제형을 진피에 전달하는 제트 주입 장치가 적합하다. 압축 가스를 사용하여 피부의 외부 층을 통해 진피까지 분말 형태의 화합물을 가속화하는 탄도 분말/입자 전달 장치가 적합하다.
국소 투여에 적합한 제형은 액체 및/또는 반액체 제제, 예컨대 도찰제, 로션, 수중유 및/또는 유중수 에멀젼, 예컨대 크림, 연고, 및/또는 페이스트, 및/또는 용액 및/또는 현탁액을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 국소 투여 가능한 제형은, 예를 들어, 약 1% 내지 약 10% (w/w) 활성 성분을 포함할 수 있지만, 활성 성분의 농도는 용매 중의 활성 성분의 용해도 한계만큼 높을 수 있다. 국소 투여용 제형은 본 출원에 기재된 추가 성분 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원에 기재된 약학 조성물은 협측강을 통한 폐 투여에 적합한 제형으로 제조, 포장 및/또는 판매될 수 있다. 이러한 제형은 활성 성분을 포함하고 약 0.5 내지 약 7 나노미터, 또는 약 1 내지 약 6 나노미터 범위의 직경을 갖는 건조 입자를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 분말을 분산시키기 위해 추진제의 스트림이 지향될 수 있는 건조 분말 저장소를 포함하는 장치를 사용하고/하거나 밀봉된 용기 내의 저비점 추진제에 용해 및/또는 현탁된 활성 성분을 포함하는 장치와 같은 자체 추진 용매/분말 분배 용기를 사용하여 투여하기 위한 건조 분말 형태로 편리하게 존재한다. 이러한 분말은 중량 기준으로 입자의 적어도 98%가 0.5 나노미터 초과의 직경을 갖고 개수 기준으로 입자의 적어도 95%가 7 나노미터 미만의 직경을 갖는 입자를 포함한다. 대안적으로, 중량 기준으로 입자의 적어도 95%는 1 나노미터 초과의 직경을 갖고, 개수 기준으로 입자의 적어도 90%는 6 나노미터 미만의 직경을 갖는다. 건조 분말 조성물은 당과 같은 고체 미세 분말 희석제를 포함할 수 있고 단위 용량 형태로 편리하게 제공된다.
저비점 추진제는 일반적으로 대기압에서 65°F 미만의 비점을 갖는 액체 추진제를 포함한다. 일반적으로, 추진제는 조성물의 50 내지 99.9% (w/w)를 구성할 수 있고, 활성 성분은 조성물의 0.1 내지 20% (w/w)를 구성할 수 있다. 추진제는 액체 비이온성 및/또는 고체 음이온성 계면활성제 및/또는 고체 희석제(활성 성분을 포함하는 입자와 동일한 차수의 입자 크기를 가질 수 있음)와 같은 추가 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 출원에 제공된 약학 조성물에 대한 설명은 주로 인간에게 투여하기에 적합한 약학 조성물에 관한 것이지만, 이러한 조성물은 일반적으로 모든 종류의 동물에 투여하기에 적합하다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 다양한 동물에 대한 투여에 적합한 조성물을 만들기 위한 인간에 대한 투여에 적합한 약학 조성물의 변형은 잘 이해되며, 통상의 숙련된 수의 약리학자는 일반적인 실험을 통해 이러한 변형을 설계 및/또는 수행할 수 있다.
본 출원에서 제공된 화합물은 전형적으로 투여의 용이성과 투여량의 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제형화된다. 그러나, 본 출원에 기재된 조성물의 총 1일 사용량은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 의사에 의해 결정될 것임을 이해할 것이다. 임의의 특정 대상체 또는 유기체에 대한 특정 치료적 유효 용량 수준은 치료되는 질환 및 장애의 중증도를 포함하는 다양한 인자; 사용된 특정 활성 성분의 활성; 사용된 특정 조성; 대상체의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식단; 사용된 특정 활성 성분의 투여 시간, 투여 경로 및 배설 속도; 치료 기간; 사용된 특정 활성 성분과 함께 또는 동시에 사용되는 약물; 및 의학계에서 익히 공지된 유사 인자에 따라 달라질 것이다.
본 출원에서 제공되는 화합물 및 조성물은 장내(예를 들어, 경구), 비경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 척수내, 피하, 뇌실내, 경피, 피내, 직장, 질내, 복강내, 국소(분말, 연고, 크림, 및/또는 점적제에 의해), 점막, 비강, 협측, 설하를 포함한 임의의 경로에 의해; 기관내 점적, 기관지 점적 및/또는 흡입에 의해; 및/또는 경구 스프레이, 비강 스프레이, 및/또는 에어로졸에 의해 투여될 수 있다. 구체적으로 고려되는 경로는 경구 투여, 정맥내 투여(예를 들어, 전신 정맥내 주사), 혈액 및/또는 림프 공급을 통한 국소(regional) 투여, 및/또는 환부로의 직접 투여이다. 일반적으로, 가장 적절한 투여 경로는 제제의 성질(예를 들어, 위장관 환경에서의 안정성) 및/또는 대상체의 상태(예를 들어, 대상체가 경구 투여를 견딜 수 있는지 여부)를 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다.
일부 구현예에서, 본 출원에 개시된 화합물 또는 조성물은 나노입자로 제형화되고/되거나 투여된다. 나노입자는 나노규모의 입자이다. 일부 구현예에서, 나노입자는 직경이 1 μm 미만이다. 일부 구현예에서, 나노입자는 직경이 약 1 nm와 100 nm 사이이다. 나노입자는 덴드리머, 리포솜 또는 중합체 나노입자와 같은 유기 나노입자를 포함한다. 나노입자는 또한 풀러렌, 양자점 및 금 나노입자와 같은 무기 나노입자를 포함한다. 조성물은 나노입자의 응집체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 나노입자의 응집체는 균질한 반면, 다른 구현예에서, 나노입자의 응집체는 이질적이다.
유효량을 달성하는 데 필요한 화합물의 정확한 양은, 예를 들어, 대상체의 종, 연령 및 일반적인 상태, 부작용 또는 장애의 중증도, 특정 화합물의 실체, 투여 방식 등에 따라 대상체마다 다를 것이다. 유효량은 단일 용량(예를 들어, 단일 경구 용량) 또는 다중 용량(예를 들어, 다중 경구 용량)에 포함될 수 있다. 특정 구현예에서, 다중 용량이 대상체에게 투여되거나 조직 또는 세포에 적용되는 경우, 다중 용량의 임의의 2회 용량은 본 출원에 기재된 화합물의 상이하거나 실질적으로 동일한 양을 포함한다. 특정 구현예에서, 다중 용량이 대상체에게 투여되거나 조직 또는 세포에 적용되는 경우, 대상체에게 다중 용량을 투여하거나 조직 또는 세포에 다중 용량을 적용하는 빈도는 1일 3회 용량, 1일 2회 용량, 1일 1회 용량, 격일에 1회 용량, 3일에 1회 용량, 매주 1회 용량, 2주에 1회 용량, 3주에 1회 용량, 또는 4주에 1회 용량이다. 특정 구현예에서, 대상체에게 다중 용량을 투여하거나 조직 또는 세포에 다중 용량을 적용하는 빈도는 1일에 1회 용량이다. 특정 구현예에서, 대상체에게 다중 용량을 투여하거나 조직 또는 세포에 다중 용량을 적용하는 빈도는 1일에 2회 용량이다. 특정 구현예에서, 대상체에게 다중 용량을 투여하거나 조직 또는 세포에 다중 용량을 적용하는 빈도는 1일에 3회 용량이다. 특정 구현예에서, 다중 용량이 대상체에게 투여되거나 조직 또는 세포에 적용되는 경우, 다중 용량의 제1 투여와 마지막 투여 사이의 기간은 1일, 2일, 4일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 9개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 7년, 10년, 15년, 20년, 또는 대상체, 조직 또는 세포의 수명이다. 특정 구현예에서, 다중 용량의 제1 용량과 마지막 용량 사이의 기간은 3개월, 6개월 또는 1년이다. 특정 구현예에서, 다중 용량의 제1 용량과 마지막 용량 사이의 기간은 대상체, 조직 또는 세포의 수명이다. 특정 구현예에서, 본 출원에 기재된 용량(예를 들어, 단일 용량, 또는 다중 용량의 임의의 용량)은 독립적으로 0.1 μg에서 1 μg까지, 0.001 mg에서 0.01 mg까지, 0.01 mg에서 0.1 mg까지, 0.1 mg에서 1 mg까지, 1 mg에서 3 mg까지, 3 mg에서 10 mg까지, 10 mg에서 30 mg까지, 30 mg에서 100 mg까지, 100 mg에서 300 mg까지, 300 mg에서 1,000 mg까지, 또는 1 g에서 10 g까지의 본 출원에 기재된 화합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 출원에 기재된 용량은 독립적으로 1 mg에서 3 mg까지의 본 출원에 기재된 화합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 출원에 기재된 용량은 독립적으로 3 mg에서 10 mg까지의 본 출원에 기재된 화합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 출원에 기재된 용량은 독립적으로 10 mg에서 30 mg까지의 본 출원에 기재된 화합물을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 출원에 기재된 용량은 독립적으로 30 mg에서 100 mg까지의 본 출원에 기재된 화합물을 포함한다.
본 출원에 기재된 용량 범위는 제공된 약학 조성물을 성인에게 투여하기 위한 지침서를 제공한다. 예를 들어, 어린이 또는 청소년에게 투여되는 양은 의료 종사자 또는 당업자에 의해 결정될 수 있고 성인에게 투여되는 양보다 더 낮거나 동일할 수 있다.
본 출원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물은 하나 이상의 추가 약제(예를 들어, 치료적 및/또는 예방적 활성제)와 조합하여 투여될 수 있다. 화합물 또는 조성물은 이들의 활성을 개선하고, 생체이용률을 개선하고, 안전성을 개선하고, 약물 내성을 감소시키고, 대사를 감소 및/또는 변형하고, 배설을 억제하고/하거나 대상체 또는 세포에서 분포를 변형시키는 추가 약제와 조합하여 투여될 수 있다. 또한 사용된 요법이 동일한 장애에 대해 원하는 효과를 달성할 수 있고/있거나 상이한 효과를 달성할 수 있음을 인식할 것이다. 특정 구현예에서, 본 출원에 기재된 화합물 및 추가 약제를 포함하는 본 출원에 기재된 약학 조성물은 화합물 및 추가 약제 중 하나를 포함하지만 둘 모두가 아닌 약학 조성물에 없는 상승 효과를 나타낸다.
화합물 또는 조성물은, 예를 들어, 조합 요법으로서 유용할 수 있는 하나 이상의 추가 약제와 동시에, 그 이전에 또는 이후에 투여될 수 있다. 약제는 치료적 활성제를 포함한다. 약제는 또한 예방적 활성제를 포함한다. 약제는 작은 유기 분자, 예컨대 약물 화합물(예를 들어, 연방규정집(Code of Federal Regulations: CFR)에 제공된 바와 같이 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration)에 의한 인간 또는 동물용으로 승인된 화합물), 펩티드, 단백질, 탄수화물, 모노사카라이드, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 핵단백질, 점액단백질, 지단백질, 합성 폴리펩티드 또는 단백질, 단백질에 연결된 소분자, 당단백질, 스테로이드, 핵산, DNA, RNA, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 지질, 호르몬, 비타민 및 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 추가 약제는 질환(예를 들어, 증식성 질환, 신경학적 질환, 통증 병태, 정신 장애 또는 대사 장애)을 치료 및/또는 예방하는 데 유용한 약제이다. 각각의 추가 약제는 해당 약제에 대해 결정된 용량 및/또는 시간 스케줄에 따라 투여될 수 있다. 추가 약제는 또한 단일 용량으로 서로 및/또는 본 출원에 기재된 화합물 또는 조성물과 함께 투여되거나 상이한 용량으로 개별적으로 투여될 수 있다. 용법에서 사용하기 위한 특정 조합은 본 출원에 기재된 화합물과 추가 약제(들)의 상용성 및/또는 달성하고자 하는 원하는 치료 및/또는 예방 효과를 고려할 것이다. 일반적으로, 추가 약제(들)를 조합하여 이들의 개별적으로 사용되는 수준을 초과하지 않는 수준으로 사용할 것으로 예상된다. 일부 구현예에서, 조합하여 사용되는 수준은 개별적으로 사용되는 수준보다 더 낮을 것이다.
일부 구현예에서, 본 출원에 기재된 하나 이상의 조성물이 대상체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 대상체는 동물이다. 동물은 두 성별 모두일 수 있고 어떠한 발달 단계에도 있을 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다. 다른 구현예에서, 대상체는 비인간 동물이다. 특정 구현예에서, 대상체는 포유동물이다. 특정 구현예에서, 대상체는 비인간 포유동물이다. 특정 구현예에서, 대상체는 가축, 예컨대 개, 고양이, 소, 돼지, 말, 양, 닭, 또는 염소이다. 특정 구현예에서, 대상체는 반려 동물, 예컨대 개 또는 고양이이다. 특정 구현예에서, 대상체는 가축, 예컨대 소, 돼지, 말, 양, 닭, 또는 염소이다. 특정 구현예에서, 대상체는 동물원 동물이다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 연구 동물, 예컨대 설치류(예를 들어, 마우스, 래트), 개, 돼지, 또는 인간 이외의 영장류이다.
또한 본 개시내용에 포함되는 것은 키트(예를 들어, 약학적 팩)이다. 제공된 키트는 조성물, 예컨대 약학 조성물, 또는 본 출원에 기재된 화합물 및 용기(예를 들어, 바이알, 앰풀, 병, 주사기 및/또는 디스펜서 패키지, 또는 기타 적합한 용기)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 키트는 임의로 본 출원에 기재된 약학 조성물 또는 화합물의 희석 또는 현탁액을 위한 약학적 부형제를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 용기 및 제2 용기에 제공된 본 출원에 기재된 약학 조성물 또는 화합물은 조합되어 하나의 단위 투여 형태를 형성한다.
따라서, 한 양태에서, 본 출원에 기재된 화합물 또는 조성물을 포함하는 제1 용기를 포함하는 키트가 제공된다. 특정 구현예에서, 키트는 이를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하는 데 유용하다. 특정 구현예에서, 키트는 이를 필요로 하는 대상체에서 질환을 예방하는 데 유용하다. 특정 구현예에서, 키트는 이를 필요로 하는 대상체에서 질환이 발병할 위험을 감소시키는 데 유용하다.
특정 구현예에서, 본 출원에 기재된 키트는 키트를 사용하기 위한 지침서를 추가로 포함한다. 본 출원에 기재된 키트는 미국 식품의약국(FDA)과 같은 규제 기관에 의해 요구되는 정보를 포함할 수도 있다. 특정 구현예에서, 키트에 포함된 정보는 처방 정보이다. 특정 구현예에서, 키트 및 지침서는 이를 필요로 하는 대상체에서 질환을 치료하기 위해 제공된다. 특정 구현예에서, 키트 및 지침서는 이를 필요로 하는 대상체에서 질환을 예방하기 위해 제공된다. 특정 구현예에서, 키트 및 지침서는 이를 필요로 하는 대상체에서 질환이 발병할 위험을 감소시키기 위해 제공된다. 본 출원에 기재된 키트는 별도의 조성물로서 본 출원에 기재된 하나 이상의 추가 약제를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 소비재, 예컨대 식료품, 화장품, 세면도구, 음용 가능, 흡입 가능 및 웰빙 제품을 포함한다. 예시적인 소비재는 연고, 왁스, 분말 농축액, 페이스트, 추출물, 팅크제(tincture), 분말, 오일, 캡슐, 피부 패치, 설하 경구 용량 점적제, 점막 경구 스프레이 용량, 메이크업, 향수, 샴푸, 화장품 비누, 화장품 크림, 스킨 로션, 아로마 에센셜 오일, 마사지 오일, 면도용 제제, 세면용 오일, 립밤, 화장품 오일, 세안 워시, 보습 크림, 보습 바디 로션, 보습 페이스 로션, 목욕 소금, 목욕 젤, 액체 형태의 목욕 비누, 샤워 젤, 배스 밤(bath bomb), 헤어 케어 제제, 샴푸, 컨디셔너, 초콜릿 바, 브라우니, 초콜릿, 쿠키, 크래커, 케이크, 컵케이크, 푸딩, 꿀, 초콜릿 과자, 냉동 과자, 과일 기반 과자, 설탕 과자, 젤리 사탕, 당의정, 패스트리, 시리얼 바, 초콜릿, 시리얼 기반 에너지 바, 사탕, 아이스크림, 차 기반 음료, 커피 기반 음료 및 허브 주입물을 포함한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 결코 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참조(문헌 참조, 허여된 특허, 공개 특허 출원 및 계류중 특허 출원 포함)의 전체 내용은 본원에 명시적으로 참조로 포함된다. 본 출원에 포함된 참조는 그 정의가 본 개시내용에서 정의된 것과 동일한 용어의 정의와 모순되거나 양립할 수 없는 용어를 포함하는 경우, 본 개시내용의 용어에 부여된 의미가 우선될 것이다. 그러나, 본 출원에 인용된 임의의 참조, 논물, 공개물, 특허, 특허 공보 및 특허 출원에 대한 언급은 이들이 유효한 선행 기술을 구성하거나 전 세계 모든 국가에서 공통 일반 지식의 일부를 형성한다는 제안의 임의의 형태 또는 승인으로서 간주되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 칸나비크로멘산 신타제(CBCAS)의 기능적 발현을 확인하기 위한 1차 고처리량 스크린
숙주 세포에서 기능적으로 발현될 수 있는 CBCAS 유전자를 확인하기 위해, 약 3000개의 후보 CBCAS 유전자의 라이브러리는 내부 코드베이스 및 도메인 지식을 기반으로 설계되었으며, 효소 패밀리, 생태적 지위(ecological niche) 및 구조적 상동성에 걸쳐 샘플링되었다. 단백질 서열은 에스. 세레비지아에에서의 발현을 위해 인 실리코로 기록되었고 도 5에 나타낸 통합 효모 발현 벡터에서 합성되었다. 각각의 후보 효소 발현 작제물은 도 2에서 반응 R4를 촉매할 수 있는 프레닐트랜스퍼라제 효소를 또한 발현하는 에스. 세레비지아에 CEN PK 균주로 형질전환되었다. GFP를 발현하는 균주 t616313은 효소 활성에 대한 음성 대조군으로서 라이브러리 스크린에 포함되었다.
이전에 개시된 추정 씨. 사티바 CBCAS 효소는 활성인 것으로 밝혀지지 않았다. 대신에, 씨. 사티바 THCAS 효소(서열번호 23에 기재됨)는 본 실시예에 기재된 검정을 사용하여 THCAS 활성 이외에 CBCAS 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 CBCAS 활성에 대한 양성 대조군(균주 t616315)으로서 사용되었다. 라이브러리의 모든 후보 효소뿐만 아니라 양성 대조군 균주 t616315에 의해 발현된 효소는 N-말단 MF알파2 신호 펩티드(서열번호 16), (MF알파2 신호 펩티드의 N-말단에 부가된 메티오닌 잔기 포함), 및 C-말단 HDEL 신호 펩티드(서열번호 17)를 포함하였다.
TS 활성을 검출하기 위한 검정을 다음과 같이 수행하였다: 후보 CBCAS 형질전환체의 해동된 글리세롤 스톡 각각을 YEP + 4% 덱스트로스 배지의 웰에 스탬핑하였다. 샘플을 2일 동안 진탕 인큐베이터에서 30℃에서 인큐베이션하였다. 생성된 배양물 각각의 일부를 YEP + 4% 갈락토스 + 1 mM 올리베톨산의 웰에 스탬핑하였다(도 1 구조 6a). 샘플을 20℃에서 인큐베이션하고 진탕 인큐베이터에서 4일 동안 진탕하였다. 그 4일 동안 24시간마다 2% 갈락토오스와 1 mM 올리베톨산을 배양액에 첨가하였다. pH 5.5로 조정된 시트르산나트륨 완충액을 100 mM의 최종 농도로 각 웰에 첨가하였다. 샘플을 20℃에서 인큐베이션하고 진탕 인큐베이터에서 2일 동안 진탕하였다. 생성된 생성물 배양물 각각의 일부를 인산염 완충 식염수(PBS)의 웰에 스탬핑하였다. 광학 측정은 플레이트 판독기에서 수행되었으며 이때 흡광도는 600 nm에서 측정되었고 485 nm의 여기로 형광은 528 nm에서 측정되었다. 샘플을 2일 동안 진탕 인큐베이터에서 30℃에서 인큐베이션하였다. 100% 메탄올을 절반-높이 딥웰 플레이트에서 생성 배양물에 스탬핑하였다. 플레이트를 열 밀봉하고 동결시켰다. 이어서, 샘플을 30분 동안 해동하고 4℃에서 회전하였다. 상층액의 일부를 절반-영역 96웰 플레이트에 스탬핑하였다. 샘플에서 CBCA, THCA 및 CBDA 생성은 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 통해 정량화되었다.
후보 CBCAS 효소의 라이브러리는 상기 기재된 검정을 사용하여 1차 고처리량 스크린에서 활성에 대해 검정하였다. LC-MS 분석은 측정 가능한 양의 CBCA를 생성하는 단일 "히트" CBCAS(균주 t619896, N-말단 MF알파2 신호 펩티드 (MF알파2 신호 펩티드의 N-말단에 부가된 메티오닌 잔기와 함께) 및 C-말단 HDEL 신호 펩티드에 연결된 서열번호 25의 에이. 니제르 단백질을 발현함)를 밝혀냈다.
놀랍게도, 후보 에이. 니제르 CBCAS 효소는 씨. 사티바 CBCAS 및 THCAS 효소와 매우 낮은 서열 동일성을 갖는다. 에이. 니제르 CBCAS 효소(서열번호 27 (UniProt 수탁 번호 A0A254UC34), 서열번호 25 + N-말단에서 메티오닌 잔기에 상응함)와 추정 씨. 사티바 CBCAS 효소(서열번호 15) 및 씨. 사티바 THCAS 효소(서열번호 20, UniProt 수탁 번호 I1V0C5에 상응함)의 정렬은 디폴트 매개변수를 갖는 BLASTP를 사용하여 각각 21.15% 동일성 및 21.71% 동일성을 나타낸다.
1차 스크린에서 확인된 후보 CBCAS 효소의 활성을 확인하기 위해, 2차 스크리닝을 수행하여 CBCA 생성을 확인하였다. 2차 스크린에 대한 실험 프로토콜은 균주당 추가 생물학적 복제물이 포함되었고 각 균주에 대한 복제물 생산 배양물에 1 mM 올리베톨산 또는 1 mM 디바르산을 별도로 공급했다는 것을 제외하고는 1차 스크리닝과 동일하였다. 모든 균주를 4중으로 스크리닝하였다.
1차 스크린과 일치하게, 2차 스크린은 이 균주에 의해 생성된 CBCA의 역가에 의해 나타난 바와 같이 균주 t619896에 대한 CBCAS 활성을 나타냈다(표 5 및 도 6).
표 5: 에스 . 세레비지아에에서 CBCAS 후보 효소의 2차 스크리닝으로부터의 CBCA 역가
Figure pct00185
놀랍게도, 균주 t619896은 또한 이 균주에 의해 생성된 CBCVA의 역가에 의해 나타난 바와 같이 CBCVAS 활성을 나타냈다(표 6 및 도 7). 2차 스크린에서 CBCA의 생성을 위한 양성 대조군으로 사용된 균주 t616315는 CBCVAS 활성을 나타내지 않았다(표 6 및 도 7).
표 6: 에스 . 세레비지아에에서 CBCAS 후보 효소의 2차 스크리닝으로부터의 CBCVA 역가
Figure pct00186
균주 t619896은 또한 89.60% CBCA, 5.67% CBDA, 및 4.73% THCA로 이루어진 말단 칸나비노이드 생성물 프로파일을 생성하는 THCA 및 CBDA의 생성을 나타냈다(표 7).
표 7: 에스. 세레비지아에에서 CBCAS 후보 효소의 2차 스크리닝으로부터의 CBCA, THCA, 및 CBDA 역가
Figure pct00187
따라서, 약 3000개의 후보 유전자 중에서, 하나의 CBCAS가 에스. 세레비지아에 숙주 세포서 발현될 때 측정 가능한 양의 CBCA 및 CBCVA를 생성할 수 있는 것으로 놀랍게도 확인되었다. 이러한 스크린에서 확인된 CBCAS는 칸나비노이드 생합성에 유용할 수 있다.
실시예 2: 에이. 니제르 CBCAS 의 단백질 조작
실시예 1에서 확인된 에이. 니제르 CBCAS(서열번호 29(신호 펩티드를 가짐); 서열번호 27(신호 펩티드를 갖지 않으며 N-말단 메티오닌(UniProt 수탁 번호 A0A254UC34)를 포함함); 또는 서열번호 25(신호 펩티드를 갖지 않고 N-말단 메티오닌을 갖지 않음)에 상응함)의 조작이 CBCAS 기질 특이성, 생성물 특이성 및/또는 생성된 생성물의 양을 변경할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 점 돌연변이는 에이. 니제르 CBCAS에서 생성되었고 단백질의 돌연변이체 버전은 에스. 세레비지아에에서 발현되었다. 1047개 에이. 니제르 CBCAS 돌연변이체를 포함하는 라이브러리가 생성되었고 스크리닝되었다. 실시예 1에서와 같이, 라이브러리의 각 CBCAS 돌연변이체뿐만 아니라 양성 대조군 균주에 의해 발현된 효소는 N-말단 MF알파2 신호 펩티드(서열번호 16) (MF알파2 신호 펩티드의 N-말단에 부가된 메티오닌 잔기를 가짐) 및 C-말단 HDEL 신호 펩티드(서열번호 17)를 포함하였다.
에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이된 버전을 균주 발현함으로써 화학식 (9a), (10a), 및/또는 (11a)의 화합물을 포함한 화학식 (9), (10), 및/또는 (11)의 생성을 정량화하여 야생형 에이. 니제르 CBCAS를 발현하는 균주, 씨. 사티바 THCAS를 발현하는 균주 및 씨. 사티바 CBDAS를 발현하는 균주에 의한 동일한 화합물의 생성과 비교하였다. 균주는 실시예 1에 기재된 것과 동일한 검정을 사용하여 스크리닝하였다. 샘플에서 CBCA, THCA 및/또는 CBDA의 생성은 LC-MS를 통해 정량화하였다.
원래의 1047개의 라이브러리 구성원 중, 55개 균주가 2차 스크리닝으로 상승되어 CBCA 생성을 확인하였다. 2차 스크린에 대한 실험 프로토콜은 균주당 추가 생물학적 복제물이 포함되었고 각 균주에 대한 복제물 생성 배양물에 1 mM 올리베톨산 또는 1 mM 디바르산을 별도로 공급했다는 것을 제외하고는 1차 스크리닝과 동일하였다. 모든 균주를 4중으로 스크리닝하였다.
2차 스크린에서 평가된 55개 균주 중에서, 21개는 다음을 포함하여 에이. 니제르 양성 대조군보다 더 높은 평균 CBCA 역가를 나타냈다: 서열번호 27에 비해 A57Q 및 G61A 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t878470; 서열번호 27에 비해 V260M 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이 변이체를 발현하는 균주 t865743; 서열번호 27에 비해 V62I 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865737; 서열번호 27에 비해 V386A 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865746; 서열번호 27에 비해 V260F 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865744; 서열번호 27에 비해 E112V 및 N122S 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865717; 서열번호 27에 비해 A57E 및 I126A 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865694; 서열번호 27에 비해 T33D 및 N257S 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865726; 서열번호 27에 비해 N202S 및 P472A 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t878465; 서열번호 27에 비해 D410N 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865771; 서열번호 27에 비해 R450K 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865739; 서열번호 27에 비해 S180T 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865750; 서열번호 27에 비해 R183T 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t878464; 서열번호 27에 비해 N122G 및 I126R 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865689; 서열번호 27에 비해 N122A 및 I126T 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865690; 서열번호 27에 비해 Y71I 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865749; 서열번호 27에 비해 H287R 및 A341S 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865728; 서열번호 27에 비해 T55S 및 I126T 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865805; 서열번호 27에 비해 N122G 및 V398F 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865711; 서열번호 27에 비해 M394T 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865714; 및 서열번호 27에 비해 A57E 및 N131S 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865729. (도 8a; 표 8)
놀랍게도, 이러한 21개의 돌연변이체 CBCAS 히트는 또한 CBCA에 대한 향상된 생성물 특이성을 나타냈다. 예를 들어, 에이. 니제르 양성 대조군은 73.74% CBCA, 21.55% CBDA, 및 4.72% THCA로 이루어진 말단 칸나비노이드 생성물 프로파일을 생성하는 반면, 80% 초과(CBCA (80-83% CBCA, 13-14% CBDA 및 3-5% THCA)를 생성하는 특정 CBCAS 돌연변이체가 확인되었다.
2차 스크린에서 평가된 55개 균주 중에서, 24개는 다음을 포함하여 에이. 니제르 양성 대조군보다 더 높은 평균 CBCVA 역가를 나타냈다: 서열번호 27에 비해 V63I 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865745; 서열번호 27에 비해 N122G 및 I126R 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865689; 서열번호 27에 비해 P472R 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865718; 서열번호 27에 비해 S180T 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865750; 서열번호 27에 비해 V398A 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865747; 서열번호 27에 비해 R183T 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t878464; 서열번호 27에 비해 V260M 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865743; 서열번호 27에 비해 V386A 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865746; 서열번호 27에 비해 H426Y 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865732; 서열번호 27에 비해 Y256M 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865741; 서열번호 27에 비해 N202S 및 P472A 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t878465; 서열번호 27에 비해 N122G 및 I126K 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865720; 서열번호 27에 비해 V62I 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865737; 서열번호 27에 비해 R450K 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865739; 서열번호 27에 비해 Y129W 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865723; 서열번호 27에 비해 S423A 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865751; 서열번호 27에 비해 H287R 및 A341S 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865728; 서열번호 27에 비해 N295S 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865736; 서열번호 27에 비해 Y39F 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865748; 서열번호 27에 비해 V260F 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865744; 서열번호 27에 비해 L392H 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865755; 서열번호 27에 비해 A57E 및 N131S 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865729; 서열번호 27에 비해 E112V 및 N122S 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865717; 및 서열번호 27에 비해 T33D 및 N257S 점 돌연변이를 포함하는 에이. 니제르 CBCAS의 돌연변이체 버전을 발현하는 균주 t865726. (도 9a; 표 9) 올리베톨산에서 확인된 히트와는 달리, 디바르산으로부터 생성된 말단 칸나비노이드 사이에서는 생성물 프로파일의 변화가 관찰되지 않았다. 오히려, 이러한 생성물 프로파일은 에이. 니제르 대조군 및 돌연변이체 히트 둘 모두에 대해 67-70% CBCVA 및 30-33% THCVA였다. 놀랍게도, CBDVA는 이 스크린에서 평가된 CBCAS 후보에 의해 생성된 생성물 중에서 관찰되지 않았다.
다중 라이브러리 균주가 THCA 및 THCVA를 생성하는 것으로 관찰되었다. 에이. 니제르 CBCAS를 발현하는 균주 t865768은 양성 대조군 THCAS 균주보다 더 높은 평균 THCA 역가를 생성하였다 (도 8b; 표 8). 추가로, 에이. 니제르 CBCAS 돌연변이체를 발현하는 33개의 라이브러리 균주는 양성 대조군 THCAS 균주보다 더 높은 평균 THCA 역가를 생성하였다 (도 8b; 표 8). 추가로, 에이. 니제르 CBCAS를 발현하는 균주 t865768, 및 에이. 니제르 CBCAS 돌연변이체를 발현하는 대부분의 시험된 라이브러리 균주는 양성 대조군 THCAS 균주보다 더 많은 THCVA를 생성하였다 (도 9b; 표 9).
다중 라이브러리 균주가 CBDA를 생성하는 것으로 관찰되었다. 에이. 니제르 CBCAS를 발현하는 균주 t865768, 및 대마초 CBDAS를 발현하는 에이. 니제르 CBCAS 돌연변이체를 발현하는 대부분의 시험된 라이브러리 균주는 양성 대조군 CBDAS 균주(t876607)보다 더 많은 CBDA를 생성하였다. 이전 보고서(Luo et al. Nature, 2019 Mar;567(7746):123-126)와 일치하게, 대마초 CBDAS는 에스. 세레비지아에 숙주 세포에서 활성이 낮거나 활성이 전혀 없다: (도 8c; 표 8). 시험된 어떠한 라이브러리 균주도 CBDVA를 생성하는 것으로 발견되지 않았다 (도 9c; 표 9).
표 8: 에스 . 세레비지아에에서 CBCAS 후보 효소의 단백질 조작으로부터의 CBCA, THCA, 및 CBDA 역가
Figure pct00188
Figure pct00189
Figure pct00190
표 9: 에스 . 세레비지아에에서 CBCAS 후보 효소의 단백질 조작으로부터의 CBCVA, THCVA, 및 CBDVA 역가
Figure pct00191
Figure pct00192
Figure pct00193
실시예 3: 메타게놈 칸나비크로멘산 신타제(CBCAS)를 확인하기 위한 고처리량 스크린
우리가 아는 한, 실시예 1에서 확인된 에이. 니제르로부터의 CBCAS는 대마초 속 외부에서 발견된 이러한 활성을 가진 제1 효소를 나타낸다. 더 넓은 메타게놈에 다른 추정 CBCAS가 존재할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 1072개의 후보 CBCAS 유전자의 라이브러리는 실시예 1에서 확인된 에이. 니제르 CBCAS 효소를 참조로 사용하여 설계되었다. 단백질 서열은 에스. 세레비지아에에서의 발현을 위해 인 실리코로 기록되었고 도 5에 나타낸 통합 효모 발현 벡터에서 합성되었다. 각각의 후보 효소 발현 작제물을 도 2에서 반응 R4를 촉매할 수 있는 프레닐트랜스퍼라제 효소를 또한 발현하는 에스. 세레비지아에 CEN.PK 균주로 형질전환시켰다. GFP를 발현하는 균주 t616313은 효소 활성에 대한 음성 대조군으로서 라이브러리 스크린에 포함되었다. 실시예 1에서 확인된 에이. 니제르 효소를 발현하는 균주 t807925는 효소 활성에 대한 양성 대조군으로 라이브러리 스크린에 포함되었다. 라이브러리의 모든 후보 효소뿐만 아니라 양성 대조군 균주 t807925에 의해 발현된 효소는 N-말단 MF알파2 신호 펩티드(서열번호 16) (MF알파2 신호 펩티드의 N-말단에 부가된 메티오닌 잔기 포함) 및 C-말단 HDEL 신호 펩티드(서열번호 17)를 포함하였다.
후보 CBCAS 효소의 라이브러리는 실시예 1에 기재된 검정을 사용하여 1차 고처리량 스크린에서 활성에 대해 검정하였다. 샘플에서 CBCA, THCA 및/또는 CBDA의 생성은 LC-MS를 통해 정량화하였다.
1차 스크린의 결과에 기초하여, 70개의 균주를 2차 스크린으로 넘겨 1차 스크린에서 관찰된 활성을 확인하였다. 2차 스크린에 대한 실험 프로토콜은 균주당 추가 기술 복제물이 포함되었고 각 균주에 대한 복제물 생성 배양물에 1 mM 올리베톨산 또는 1 mM 디바르산을 별도로 공급했다는 것을 제외하고는 1차 스크린과 동일하였다. 모든 균주를 4중 스크리닝하였다 (도 10a-10c, 표 10 및 11). 균주 ID 및 이들의 상응하는 서열을 표 15에 나타낸다.
이러한 결과는 놀랍게도 CBCA 및/또는 CBCVA를 생성할 수 있는 다중 균주를 확인하였다. 구체적으로, 17개의 균주는 양성 대조군(균주 t807925의 평균 CBCA 역가의 적어도 표준 편차 1 내에서 평균 CBCA 역가에 상응함)에 의해 생성된 양에 필적하는 양의 CBCA를 생성한 반면, 2개의 균주(t808223 및 t808199)는 균주 t807925의 평균 CBCA 역가의 표준 편차 1 초과의 역가로 CBCA를 생성하였다(도 10a). 28개의 균주는 양성 대조군에 필적하는 CBCVAS 활성을 나타내었다(도 11a). 이러한 17개의 균주 중, t807854 - 서열번호 112, t807933 - 서열번호 130, t808225 - 서열번호 166, t808026 - 서열번호 144, 및 t8082001 - 서열번호 164를 포함하는 다중 균주는 에이. 니제르 양성 대조군보다 CBCA의 백분율이 더 높은 말단 칸나비노이드 생성물 프로파일을 생성했으며, 1개의 균주(t807854 - 서열번호 112)는 97% 초과의 CBCA 프로파일을 갖는 말단 칸나비노이드 생성물을 생성하였다.
실시예 1에서 확인된 에이. 니제르 CBCAS와 > 95% 서열 동일성을 나타내는 후보 CBCAS의 서브세트가 확인되었다 (도 13).
CBCA 및/또는 CBCVA를 생성하는 여러 균주가 이들의 각각의 기질(예를 들어, CBGA 또는 CBGVA)을 완전히 고갈시킨 것으로 관찰되었다 (도 12a-12b, 표 12). 따라서, CBCA 및/또는 CBCVA를 생성할 수 있는 다중 균주가 확인되었지만, 관찰된 기질 고갈은 CBCA의 생성에 기반하여 균주 간의 효과적인 순위를 배제한다.
표 10: 에스 . 세레비지아에에서 CBCAS 후보 효소의 메타게놈 스크리닝으로부터의 CBCA, THCA, 및 CBDA 역가
Figure pct00194
Figure pct00195
Figure pct00196
Figure pct00197
Figure pct00198
* 표에 제공된 TS 서열번호는 각 TS의 완전한 단백질 서열에 상응한다. 스크린과 관련하여, 2개의 신호 펩티드가 각각의 TS 서열에 부착되었다. N-말단에서, N-말단 메티오닌이 각각의 TS 서열로부터 제거되고, TS 서열이 서열번호 16에 상응하는 신호 펩티드에 연결되고, 메티오닌 잔기가 서열번호 16의 N-말단에 부가되었다. C-말단에서, 각각의 TS 서열이 서열번호 17에 상응하는 신호 펩티드에 연결되었다.
표 11: 에스. 세레비지아에에서 CBCAS 후보 효소의 메타게놈 스크리닝으로부터의 CBCVA, THCVA, 및 CBDVA 역가
Figure pct00199
Figure pct00200
Figure pct00201
Figure pct00202
Figure pct00203
* 표에 제공된 TS 서열번호는 각 TS의 완전한 단백질 서열에 상응한다. 스크린과 관련하여, 2개의 신호 펩티드가 각각의 TS 서열에 부착되었다. N-말단에서, N-말단 메티오닌이 각각의 TS 서열로부터 제거되고, TS 서열이 서열번호 16에 상응하는 신호 펩티드에 연결되고, 메티오닌 잔기가 서열번호 16의 N-말단에 부가되었다. C-말단에서, 각각의 TS 서열이 서열번호 17에 상응하는 신호 펩티드에 연결되었다.
표 12: 에스. 세레비지아에에서 CBCAS 후보 효소의 메타게놈 스크리닝으로부터의 CBGA 및 CBGVA 잔류 기질
Figure pct00204
Figure pct00205
* 표에 제공된 TS 서열번호는 각 TS의 완전한 단백질 서열에 상응한다. 스크린과 관련하여, 2개의 신호 펩티드가 각각의 TS 서열에 부착되었다. N-말단에서, N-말단 메티오닌이 각각의 TS 서열로부터 제거되고, TS 서열이 서열번호 16에 상응하는 신호 펩티드에 연결되고, 메티오닌 잔기가 서열번호 16의 N-말단에 부가되었다. C-말단에서, 각각의 TS 서열이 서열번호 17에 상응하는 신호 펩티드에 연결되었다.
실시예 4: CBCAS 활성에 대한 신호 펩티드에 대한 요건 평가
번역 후 변형(예를 들어, 분자내 이황화 브릿지 형성, 번역 후 글리코실화 등)은 대마초 말단 신타제의 활성에 중요한 것으로 공지되어 있다. 말단 신타제 효소 상의 신호 펩티드의 존재는 번역 후 변형을 촉진하는 데 도움이 될 수 있다. 그러나, 실시예 1에서 확인된 에이. 니제르 CBCAS 또는 실시예 3에서 확인된 추가 CBCAS가 신호 펩티드가 활성화되어야 하는지 여부는 공지되어 있지 않았다.
N-말단 MF알파2 신호 펩티드(서열번호 16) 및 C-말단 HDEL 신호 펩티드(서열번호 17)를 갖거나 갖지 않는 CBCAS 효소의 버전을 포함하는, 실시예 1 및 3으로부터 선택된 20개의 CBCAS 효소의 라이브러리가 합성되었다. 각각의 후보 효소 발현 작제물을 도 2에서 반응 R4를 촉매할 수 있는 프레닐트랜스퍼라제 효소를 또한 발현하는 에스. 세레비지아에 CEN.PK 균주로 형질전환시켰다. 실시예 1에서 확인된 에이. 니제르 CBCAS를 발현하는 균주 t861555는 Mf알파2 및 HDEL 신호 펩티드를 둘 모두 보유하고 효소 활성에 대한 양성 대조군으로서 라이브러리 스크린에 포함되었다. 균주 t861565는 Mf알파2 및 HDEL 신호 펩티드를 갖지 않는 동일한 에이. 니제르 CBCAS를 발현하였다.
다음을 제외하고 실시예 1에 기재된 검정을 사용하여 균주를 스크리닝하였다: 4일 차에 샘플을 pH 조정하지 않고 20℃에서 추가로 2일 동안 인큐베이션하였다.
12개의 균주는 t861555 양성 대조군보다 더 큰 평균 CBCAS 활성을 나타내었다(도 14, 표 13). 놀랍게도, 2개의 신호 펩티드의 영향은 CBCAS 후보의 실체에 따라 달라지는 것으로 밝혀졌다: 일부 경우에, 2개의 신호 펩티드의 존재가 CBCAS 활성을 향상시키는 것으로 관찰된 반면, 다른 경우에는 활성을 감소시키는 것으로 관찰되었다. 에이. 니제르 CBCAS로부터의 2개의 신호 펩티드의 부재는 CBCAS 활성에 상당한 긍정적인 영향을 미쳤다. 신호 펩티드 없이 에이. 니제르 CBCAS를 발현하는 t861565 균주는 신호 펩티드를 갖는 에이. 니제르 CBCAS를 발현하는 t861555 균주보다 약 4배 더 높은 CBCA 역가를 나타냈다.
표 13: 에스 . 세레비지아에에서 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않는 CBCAS 후보 효소의 스크리닝으로부터의 CBCA 역가
Figure pct00206
Figure pct00207
* 표에 제공된 TS 서열번호는 각 TS의 완전한 단백질 서열에 상응한다. 스크린과 관련하여, 신호 펩티드로 TS 서열을 발현하기 위해 "Y"로 표시된 균주의 경우, 2개의 신호 펩티드가 각각의 TS 서열에 부착되었다. N-말단에서, N-말단 메티오닌이 각각의 TS 서열로부터 제거되고, TS 서열이 서열번호 16에 상응하는 신호 펩티드에 연결되고, 메티오닌 잔기가 서열번호 16의 N-말단에 부가되었다. C-말단에서, 각각의 TS 서열이 서열번호 17에 상응하는 신호 펩티드에 연결되었다.
**단일 생체복제, 표준 편차 해당 없음
실시예 5: 실시예 1-4에서 확인된 CBCAS 효소가 풍부한 서열 모티프의 확인
실시예 4로부터의 CBCAS 효소의 분석은 에이. 니제르 CBCAS보다 더 큰 평균 CBCA 역가를 생성하는 CBCAS 효소가 풍부한 다중 서열 모티프를 확인하였다. 표 14는 확인된 모티프에 대한 서열 정보를 제공한다.
TS 효소의 3차원 구조 내에서 서열 모티프가 어디에 위치하는지를 결정하기 위해 관련 단백질로부터의 결정 구조를 사용하여 구조 모델을 생성하였다. 도 15 및 16은 몇몇 확인된 서열 모티프의 예측된 국소화를 나타내는 리본 다이어그램을 도시한다. 도 15에서 화살표로 나타낸 서열 모티프 KVQARSGGH(서열번호 174), CPTI[KR]TGGH(서열번호 181), 및 P[IV]S[DQE]TTY[EDG]F[TA]DGLYDVLA[RQK]AVPES[VA]GHAYLGCPDP[RK]M(서열번호 186)은 보조인자 결합 부위와 접촉할 것으로 예측되고 따라서 보조인자 결합에 영향을 미칠 수 있다.
도 16에서 화살표로 나타낸 모티프 RT[EQ][PQ]APGLAVQYSY(서열번호 207)는 기질 결합 포켓 근처에 있을 것으로 예측된다. 도 16에서 화살표로 나타낸 모티프 WQ[SA]FI[SA][AQ][KE]NLT[RW][QK]FY[NST]NM(서열번호 211)은 활성 부위의 공동에 라인을 형성할 것으로 예측되며 잠재적으로 기질 또는 생성물 특이성에 영향을 미칠 수 있다.
표 14. 후보 CBCAS에서 확인된 모티프 서열
Figure pct00208
Figure pct00209
Figure pct00210
Figure pct00211
Figure pct00212
* 표는 실시예 4에 제시된 데이터를 기반으로 모든 TS에 대한 2개의 균주를 포함한다. 각각의 TS에 대해, 하나의 균주는 신호 펩티드를 갖는 TS를 발현하고(각 균주에 대한 상단 행), 하나의 균주는 신호 펩티드가 없이 TS를 발현하였다(각 균주에 대한 하단 행).
** 표에 제공된 TS 서열번호는 각 TS의 완전한 단백질 서열에 상응한다. 스크린과 관련하여, 신호 펩티드로 TS를 발현하는 균주(각 균주에 대한 상단 행)에 대해, 2개의 신호 펩티드가 각 TS 서열에 부착되었다. N-말단에서, N-말단 메티오닌이 각각의 TS 서열로부터 제거되고, TS 서열이 서열번호 16에 상응하는 신호 펩티드에 연결되고, 메티오닌 잔기가 서열번호 16의 N-말단에 부가되었다. C-말단에서, 각각의 TS 서열이 서열번호 17에 상응하는 신호 펩티드에 연결되었다.
실시예 6: 조작된 에스. 세레비지아에 숙주 세포에서 칸나비노이드의 생합성
CoA-티오에스테르에 대한 유기산의 활성화, 및 이 티오에스테르와 다수의 말로닐-CoA 분자 또는 기타 유사한 폴리케타이드 증량제 단위의 후속 축합은 공지된 모든 칸나비노이드의 생합성에서 처음 두 단계를 나타낸다. CBGA(도 1, 화학식 8a), CBDA(도 1, 화학식 9a), THCA(도 1, 화학식 10a), 및/또는 CBCA(도 1, 화학식 11a)의 생합성을 입증하기 위해, 도 1 에 나타낸 칸나비노이드 생합성 경로는 원시영양 에스. 세레비지아에 CEN.PK 숙주 세포의 게놈에서 어셈블리되며, 여기서 각각의 효소(R1a-R5a)는 하나 이상의 카피로 존재할 수 있다. 예를 들어, 에스. 세레비지아에 숙주 세포는 AAE, OLS, OAC, PT, 및 TS 중 하나 이상의 하나 이상의 카피를 발현할 수 있다.
사용된 AAE 효소는 헥산산에 대한 활성을 갖는 에스. 세레비지아에 또는 이의 변이체에서 기능적으로 발현되는 자연 발생 또는 합성 AAE일 수 있다. OLS 효소는 에스. 세레비지아에에서 기능적으로 발현되는 자연 발생 또는 합성 OLS일 수 있다. OAC 효소는 에스. 세레비지아에에서 기능적으로 발현되는 자연 발생 또는 합성 OLS일 수 있다. 이기능성 OLS가 사용되는 경우, 별도의 OAC 효소를 생략하거나 생략하지 않을 수 있다. PT 효소는 에스. 세레비지아에에서 기능적으로 발현되는 자연 발생 또는 합성 PT일 수 있다.
TS 효소는 씨. 사티바로부터의 TS, 씨. 사티바로부터의 TS의 변이체 및/또는 비-대마초 종으로부터의 TS를 포함하는, 에스. 세레비지아에 또는 이의 변이체에서 기능적으로 발현되는 자연 발생 또는 합성 TS일 수 있다. TS 효소는 CBCA, CBCVA, THCA, THCVA, CBDA, 및 CBDVA 중 하나 이상을 주요 생성물로 생성하는 TS일 수 있다. TS 효소는 본 개시내용에 제공된 하나 이상의 TS 효소를 포함할 수 있다.
칸나비노이드 발효 절차는 생성 배양물의 인큐베이션을, 예를 들어, 48-144시간 동안 지속할 수 있고 생성 배양물을, 예를 들어, 24시간마다 4% 갈락토스 및 1 mM 헥사노산나트륨으로 보충할 수 있다는 것을 제외하고는 상기 실시예에 기재된 검정과 유사할 수 있다. CBCA, CBCVA, THCA, THCVA, CBDA, 및 CBDVA의 역가는 LC-MS를 통해 정량화된다.
개시내용과 관련된 서열
표 15. 실시예 3* 및 실시예 4**에 기재된 후보 CBCAS의 서열
* 실시예 3의 라이브러리 스크린의 경우, N-말단 MF알파2 신호 펩티드(서열번호 16) 및 C-말단 HDEL 신호 펩티드(서열번호 17)를 갖는 표 15에 제공된 TS 서열이 발현되었다. 메티오닌 잔기는 도 15에 제공된 TS 서열의 N-말단으로부터 제거되었다. 메티오닌 잔기는 서열번호 16의 N-말단에 대신에 부가되었다.
** 실시예 4의 라이브러리 스크린의 경우, N-말단 및 C-말단 신호 펩티드를 갖거나 갖지 않은 TS 서열이 발현되었다. 신호 펩티드를 갖는 TS 서열이 발현되는 경우, 실시예 3에 대해 상기 기재된 것과 동일한 접근법을 사용하였다.
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본 출원에 개시된 서열은 신호 서열을 포함하거나 포함하지 않을 수 있음을 인식해야 한다. 본 출원에 개시된 서열은 신호 서열이 있거나 없는 버전을 포함한다. 또한, 본 출원에 개시된 단백질 서열은 개시 코돈(M)이 있거나 없는 것으로 도시될 수 있음을 이해해야 한다. 본 출원에 개시된 서열은 개시 코돈이 있거나 없는 버전을 포함한다. 따라서, 일부 경우에 아미노산 넘버링은 개시 코돈을 포함하는 단백질 서열에 상응할 수 있는 반면, 다른 경우에 아미노산 넘버링은 개시 코돈을 포함하지 않는 단백질 서열에 상응할 수 있다. 또한, 본 출원에 개시된 서열은 정지 코돈이 있거나 없는 것으로 도시될 수 있음을 이해해야 한다. 본 출원에 개시된 서열은 정지 코돈이 있거나 없는 버전을 포함한다. 본 개시내용의 양태는 본 출원에 기재된 임의의 서열 및 이의 단편을 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
등가물
당업자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 통상적인 실험만 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포함되도록 의도된다.
특허 문서를 포함한 모든 참조문헌은 그 전체가 참조로 포함된다.
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tactggggta aagatgtgac tcaaaagaat aaggaagaag ggtacactca catagttgag 180 gtaacatttg agagtgtgga gactattcag gactacatta ttcatcctgc ccatgttgga 240 tttggagatg tctatcgttc tttctgggaa aaacttctca tttttgacta cacaccacga 300 aag 303 <210> 3 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 aattgctcag cattttcctt ttggtttgtt tgcaaaataa tatttttctt tctctcattc 60 aatatccaaa tttcaata 78 <210> 4 <211> 27 <212> PRT <213> C. sativa <400> 4 Asn Cys Ser Ala Phe Ser Phe Trp Phe Val Cys Lys Ile Ile Phe Phe 1 5 10 15 Phe Leu Ser Phe Asn Ile Gln Ile Ser Ile Ala 20 25 <210> 5 <211> 719 <212> PRT <213> C. sativa <400> 5 Met Gly Lys Asn Tyr Lys Ser Leu Asp Ser Val Val Ala Ser Asp Phe 1 5 10 15 Ile Ala Leu Gly Ile Thr Ser Glu Val Ala Glu Thr Leu His Gly Arg 20 25 30 Leu Ala Glu Ile Val Cys Asn Tyr Gly Ala Ala Thr Pro Gln Thr Trp 35 40 45 Ile Asn Ile Ala Asn His Ile Leu Ser Pro Asp Leu Pro Phe Ser Leu 50 55 60 His Gln Met Leu Phe Tyr Gly Cys Tyr Lys Asp Phe Gly Pro Ala Pro 65 70 75 80 Pro Ala Trp Ile Pro Asp Pro Glu Lys Val Lys Ser Thr Asn Leu Gly 85 90 95 Ala Leu Leu Glu Lys Arg Gly Lys Glu Phe Leu Gly Val Lys Tyr Lys 100 105 110 Asp Pro Ile Ser Ser Phe Ser His Phe Gln Glu Phe Ser Val Arg Asn 115 120 125 Pro Glu Val Tyr Trp Arg Thr Val Leu Met Asp Glu Met Lys Ile Ser 130 135 140 Phe Ser Lys Asp Pro Glu Cys Ile Leu Arg Arg Asp Asp Ile Asn Asn 145 150 155 160 Pro Gly Gly Ser Glu Trp Leu Pro Gly Gly Tyr Leu Asn Ser Ala Lys 165 170 175 Asn Cys Leu Asn Val Asn Ser Asn Lys Lys Leu Asn Asp Thr Met Ile 180 185 190 Val Trp Arg Asp Glu Gly Asn Asp Asp Leu Pro Leu Asn Lys Leu Thr 195 200 205 Leu Asp Gln Leu Arg Lys Arg Val Trp Leu Val Gly Tyr Ala Leu Glu 210 215 220 Glu Met Gly Leu Glu Lys Gly Cys Ala Ile Ala Ile Asp Met Pro Met 225 230 235 240 His Val Asp Ala Val Val Ile Tyr Leu Ala Ile Val Leu Ala Gly Tyr 245 250 255 Val Val Val Ser Ile Ala Asp Ser Phe Ser Ala Pro Glu Ile Ser Thr 260 265 270 Arg Leu Arg Leu Ser Lys Ala Lys Ala Ile Phe Thr Gln Asp His Ile 275 280 285 Ile Arg Gly Lys Lys Arg Ile Pro Leu Tyr Ser Arg Val Val Glu Ala 290 295 300 Lys Ser Pro Met Ala Ile Val Ile Pro Cys Ser Gly Ser Asn Ile Gly 305 310 315 320 Ala Glu Leu Arg Asp Gly Asp Ile Ser Trp Asp Tyr Phe Leu Glu Arg 325 330 335 Ala Lys Glu Phe Lys Asn Cys Glu Phe Thr Ala Arg Glu Gln Pro Val 340 345 350 Asp Ala Tyr Thr Asn Ile Leu Phe Ser Ser Gly Thr Thr Gly Glu Pro 355 360 365 Lys Ala Ile Pro Trp Thr Gln Ala Thr Pro Leu Lys Ala Ala Ala Asp 370 375 380 Gly Trp Ser His Leu Asp Ile Arg Lys Gly Asp Val Ile Val Trp Pro 385 390 395 400 Thr Asn Leu Gly Trp Met Met Gly Pro Trp Leu Val Tyr Ala Ser Leu 405 410 415 Leu Asn Gly Ala Ser Ile Ala Leu Tyr Asn Gly Ser Pro Leu Val Ser 420 425 430 Gly Phe Ala Lys Phe Val Gln Asp Ala Lys Val Thr Met Leu Gly Val 435 440 445 Val Pro Ser Ile Val Arg Ser Trp Lys Ser Thr Asn Cys Val Ser Gly 450 455 460 Tyr Asp Trp Ser Thr Ile Arg Cys Phe Ser Ser Ser Gly Glu Ala Ser 465 470 475 480 Asn Val Asp Glu Tyr Leu Trp Leu Met Gly Arg Ala Asn Tyr Lys Pro 485 490 495 Val Ile Glu Met Cys Gly Gly Thr Glu Ile Gly Gly Ala Phe Ser Ala 500 505 510 Gly Ser Phe Leu Gln Ala Gln Ser Leu Ser Ser Phe Ser Ser Gln Cys 515 520 525 Met Gly Cys Thr Leu Tyr Ile Leu Asp Lys Asn Gly Tyr Pro Met Pro 530 535 540 Lys Asn Lys Pro Gly Ile Gly Glu Leu Ala Leu Gly Pro Val Met Phe 545 550 555 560 Gly Ala Ser Lys Thr Leu Leu Asn Gly Asn His His Asp Val Tyr Phe 565 570 575 Lys Gly Met Pro Thr Leu Asn Gly Glu Val Leu Arg Arg His Gly Asp 580 585 590 Ile Phe Glu Leu Thr Ser Asn Gly Tyr Tyr His Ala His Gly Arg Ala 595 600 605 Asp Asp Thr Met Asn Ile Gly Gly Ile Lys Ile Ser Ser Ile Glu Ile 610 615 620 Glu Arg Val Cys Asn Glu Val Asp Asp Arg Val Phe Glu Thr Thr Ala 625 630 635 640 Ile Gly Val Pro Pro Leu Gly Gly Gly Pro Glu Gln Leu Val Ile Phe 645 650 655 Phe Val Leu Lys Asp Ser Asn Asp Thr Thr Ile Asp Leu Asn Gln Leu 660 665 670 Arg Leu Ser Phe Asn Leu Gly Leu Gln Lys Lys Leu Asn Pro Leu Phe 675 680 685 Lys Val Thr Arg Val Val Pro Leu Ser Ser Leu Pro Arg Thr Ala Thr 690 695 700 Asn Lys Ile Met Arg Arg Val Leu Arg Gln Phe Ser His Phe Glu 705 710 715 <210> 6 <211> 543 <212> PRT <213> C. sativa <400> 6 Met Glu Lys Ser Gly Tyr Gly Arg Asp Gly Ile Tyr Arg Ser Leu Arg 1 5 10 15 Pro Pro Leu His Leu Pro Asn Asn Asn Asn Leu Ser Met Val Ser Phe 20 25 30 Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ser Tyr Pro Gln Lys Pro Ala Leu Ile Asp 35 40 45 Ser Glu Thr Asn Gln Ile Leu Ser Phe Ser His Phe Lys Ser Thr Val 50 55 60 Ile Lys Val Ser His Gly Phe Leu Asn Leu Gly Ile Lys Lys Asn Asp 65 70 75 80 Val Val Leu Ile Tyr Ala Pro Asn Ser Ile His Phe Pro Val Cys Phe 85 90 95 Leu Gly Ile Ile Ala Ser Gly Ala Ile Ala Thr Thr Ser Asn Pro Leu 100 105 110 Tyr Thr Val Ser Glu Leu Ser Lys Gln Val Lys Asp Ser Asn Pro Lys 115 120 125 Leu Ile Ile Thr Val Pro Gln Leu Leu Glu Lys Val Lys Gly Phe Asn 130 135 140 Leu Pro Thr Ile Leu Ile Gly Pro Asp Ser Glu Gln Glu Ser Ser Ser 145 150 155 160 Asp Lys Val Met Thr Phe Asn Asp Leu Val Asn Leu Gly Gly Ser Ser 165 170 175 Gly Ser Glu Phe Pro Ile Val Asp Asp Phe Lys Gln Ser Asp Thr Ala 180 185 190 Ala Leu Leu Tyr Ser Ser Gly Thr Thr Gly Met Ser Lys Gly Val Val 195 200 205 Leu Thr His Lys Asn Phe Ile Ala Ser Ser Leu Met Val Thr Met Glu 210 215 220 Gln Asp Leu Val Gly Glu Met Asp Asn Val Phe Leu Cys Phe Leu Pro 225 230 235 240 Met Phe His Val Phe Gly Leu Ala Ile Ile Thr Tyr Ala Gln Leu Gln 245 250 255 Arg Gly Asn Thr Val Ile Ser Met Ala Arg Phe Asp Leu Glu Lys Met 260 265 270 Leu Lys Asp Val Glu Lys Tyr Lys Val Thr His Leu Trp Val Val Pro 275 280 285 Pro Val Ile Leu Ala Leu Ser Lys Asn Ser Met Val Lys Lys Phe Asn 290 295 300 Leu Ser Ser Ile Lys Tyr Ile Gly Ser Gly Ala Ala Pro Leu Gly Lys 305 310 315 320 Asp Leu Met Glu Glu Cys Ser Lys Val Val Pro Tyr Gly Ile Val Ala 325 330 335 Gln Gly Tyr Gly Met Thr Glu Thr Cys Gly Ile Val Ser Met Glu Asp 340 345 350 Ile Arg Gly Gly Lys Arg Asn Ser Gly Ser Ala Gly Met Leu Ala Ser 355 360 365 Gly Val Glu Ala Gln Ile Val Ser Val Asp Thr Leu Lys Pro Leu Pro 370 375 380 Pro Asn Gln Leu Gly Glu Ile Trp Val Lys Gly Pro Asn Met Met Gln 385 390 395 400 Gly Tyr Phe Asn Asn Pro Gln Ala Thr Lys Leu Thr Ile Asp Lys Lys 405 410 415 Gly Trp Val His Thr Gly Asp Leu Gly Tyr Phe Asp Glu Asp Gly His 420 425 430 Leu Tyr Val Val Asp Arg Ile Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Phe 435 440 445 Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Gly Leu Leu Val Ser His Pro Glu 450 455 460 Ile Leu Asp Ala Val Val Ile Pro Phe Pro Asp Ala Glu Ala Gly Glu 465 470 475 480 Val Pro Val Ala Tyr Val Val Arg Ser Pro Asn Ser Ser Leu Thr Glu 485 490 495 Asn Asp Val Lys Lys Phe Ile Ala Gly Gln Val Ala Ser Phe Lys Arg 500 505 510 Leu Arg Lys Val Thr Phe Ile Asn Ser Val Pro Lys Ser Ala Ser Gly 515 520 525 Lys Ile Leu Arg Arg Glu Leu Ile Gln Lys Val Arg Ser Asn Met 530 535 540 <210> 7 <211> 385 <212> PRT <213> C. sativa <400> 7 Met Asn His Leu Arg Ala Glu Gly Pro Ala Ser Val Leu Ala Ile Gly 1 5 10 15 Thr Ala Asn Pro Glu Asn Ile Leu Leu Gln Asp Glu Phe Pro Asp Tyr 20 25 30 Tyr Phe Arg Val Thr Lys Ser Glu His Met Thr Gln Leu Lys Glu Lys 35 40 45 Phe Arg Lys Ile Cys Asp Lys Ser Met Ile Arg Lys Arg Asn Cys Phe 50 55 60 Leu Asn Glu Glu His Leu Lys Gln Asn Pro Arg Leu Val Glu His Glu 65 70 75 80 Met Gln Thr Leu Asp Ala Arg Gln Asp Met Leu Val Val Glu Val Pro 85 90 95 Lys Leu Gly Lys Asp Ala Cys Ala Lys Ala Ile Lys Glu Trp Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ser Lys Ile Thr His Leu Ile Phe Thr Ser Ala Ser Thr Thr 115 120 125 Asp Met Pro Gly Ala Asp Tyr His Cys Ala Lys Leu Leu Gly Leu Ser 130 135 140 Pro Ser Val Lys Arg Val Met Met Tyr Gln Leu Gly Cys Tyr Gly Gly 145 150 155 160 Gly Thr Val Leu Arg Ile Ala Lys Asp Ile Ala Glu Asn Asn Lys Gly 165 170 175 Ala Arg Val Leu Ala Val Cys Cys Asp Ile Met Ala Cys Leu Phe Arg 180 185 190 Gly Pro Ser Glu Ser Asp Leu Glu Leu Leu Val Gly Gln Ala Ile Phe 195 200 205 Gly Asp Gly Ala Ala Ala Val Ile Val Gly Ala Glu Pro Asp Glu Ser 210 215 220 Val Gly Glu Arg Pro Ile Phe Glu Leu Val Ser Thr Gly Gln Thr Ile 225 230 235 240 Leu Pro Asn Ser Glu Gly Thr Ile Gly Gly His Ile Arg Glu Ala Gly 245 250 255 Leu Ile Phe Asp Leu His Lys Asp Val Pro Met Leu 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tctctaacga tccaacattg 720 gttccatctt cagatgaagg tgatatcgaa aagtttcata actacgctac taaagcacca 780 tatgcttacg ttggtgaaaa gagaacatta gtttatggtt tgactttatc accaaaggaa 840 gaatactaca agttgggtgc ttactaccac attaccgacg tacaaagagg tttattgaaa 900 gcattcgata gtttagaaga ctaa 924 <210> 10 <211> 395 <212> PRT <213> C. sativa <400> 10 Met Gly Leu Ser Ser Val Cys Thr Phe Ser Phe Gln Thr Asn Tyr His 1 5 10 15 Thr Leu Leu Asn Pro His Asn Asn Asn Pro Lys Thr Ser Leu Leu Cys 20 25 30 Tyr Arg His Pro Lys Thr Pro Ile Lys Tyr Ser Tyr Asn Asn Phe Pro 35 40 45 Ser Lys His Cys Ser Thr Lys Ser Phe His Leu Gln Asn Lys Cys Ser 50 55 60 Glu Ser Leu Ser Ile Ala Lys Asn Ser Ile Arg Ala Ala Thr Thr Asn 65 70 75 80 Gln Thr Glu Pro Pro Glu Ser Asp Asn His Ser Val Ala Thr Lys Ile 85 90 95 Leu Asn Phe Gly Lys Ala Cys Trp Lys Leu Gln Arg Pro Tyr Thr Ile 100 105 110 Ile Ala Phe Thr Ser Cys Ala Cys Gly Leu Phe Gly Lys Glu Leu Leu 115 120 125 His Asn Thr Asn Leu Ile Ser Trp Ser Leu Met Phe Lys Ala Phe Phe 130 135 140 Phe Leu 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gtgtcgcctt tccatcggat gccttatacc aggctgcttg ggtcaagcca 780 tataacttgg acgtacctgt taccccaata gctgtgttta agcctagttc cacggaggat 840 gttgctggtg ccattaagtg tgctgtcgct tctaacgttc acgtgcaagc caagtctggt 900 ggtcattcgt acgctaactt cggattgggt ggacaagatg gtgaactaat gattgatttg 960 gcaaatttac aggacttcca catggacaaa acatcctggc aagctacttt cggtgccggt 1020 tacagattgg gtgatttaga taaaaagtta caagcaaatg gcaacagagc tatcgcacac 1080 ggcacatgtc caggtgttgg tattggaggt catgccacta tcggcggtct aggcccaatg 1140 agccgtatgt ggggttccgc tttggaccac gtcttgtctg tccaagttgt caccgctgac 1200 ggtagtatca aaaacgcctc tgaatcagaa aactctgatc tgttttgggc cttgagaggt 1260 gctggtgctt catttggagt tattactaag ttcactgtta agacccatcc agctccaggt 1320 tccgttgtac aatatacata caaaatctct ttgggtagcc aggcacaaat ggcccctgtt 1380 tacgctgcct ggcaagcttt agctggtgac cccaagctgg acagaagatt ttccacattg 1440 ttcatcgcag aacctcttgg tgctctgatt accggaactt tctatggtac taaagctgag 1500 tacgaagcta ctggtatagc tgctagattg ccttctggtg gtaccttgga tttgaagctt 1560 ttagattggt tgggtagttt 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RAO-2017 <400> 118 Met Gly Ser Gly His Ser Ser Gly Leu Ala Thr Cys Leu Asp Ala Val 1 5 10 15 Cys Asn Gly Arg His Ala Cys Val Ala Tyr Pro Asp His Leu Leu Tyr 20 25 30 Gln Ala Ser Trp Val Asp Arg Tyr Asn Leu Asp Ile Pro Val His Pro 35 40 45 Ile Ala Val Thr Arg Pro Ser Asn Ala Asp Asp Val Ser Gly Phe Val 50 55 60 Lys Cys Ala Ala Ala Asn Asn Val Arg Val Gln Ala Lys Ser Gly Gly 65 70 75 80 His Ser Tyr Ala Asn Tyr Gly Leu Gly Gly Glu Asp Gly Glu Leu Val 85 90 95 Ile Asp Leu Arg His Leu Gln His Phe Ser Met Asp Thr Asn Thr Trp 100 105 110 Gln Ala Thr Ile Gly Ala Gly His Arg Leu Trp Asp Val Thr His Lys 115 120 125 Leu His Glu Asn Gly Lys Arg Ala Val Ser His Gly Thr Cys Pro Gly 130 135 140 Val Gly Ile Gly Gly His Ala Thr Ile Gly Gly Leu Gly Pro Ser Ser 145 150 155 160 Arg Met Trp Gly Ser Cys Leu Asp His Val Val Glu Val Glu Val Val 165 170 175 Thr Ala Asp Gly Ser Ile Arg Arg Ala Ser Glu Arg Glu Asn Ala Asp 180 185 190 Leu Phe Phe Ala Leu Lys Gly Ala Gly Ala Gly Phe Gly Val Ile Thr 195 200 205 Glu 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Aspergillus ruber <400> 122 Met Ser Asn Asn Thr Leu Ile Gln Ala Cys Leu Leu Ala Ala Leu Gly 1 5 10 15 Phe Asn Ser Thr Arg Val Lys Phe Pro Glu Ala Gly Thr Ile Asp Ala 20 25 30 Asp Pro Tyr Asn Leu Asp Leu Pro Ile Val Pro Ala Ala Ile Thr Val 35 40 45 Pro Arg Ser Thr Ala Gln Val Ala Asn Val Val Lys Cys Ala Ala Ser 50 55 60 Asn Gly Tyr Lys Val Gln Ser Arg Ser Gly Gly His Ser Tyr Gly Asn 65 70 75 80 His Gly Leu Gly Gly Thr Asp Gly Ala Ile Val Val Asp Leu Lys Asp 85 90 95 Leu Lys Gln Phe Ser Met Asp Glu Ser Thr Tyr Ile Ala Ser Ile Gly 100 105 110 Ser Gly Met Leu Leu Asp Glu Val Thr His Lys Leu Tyr Asp Asn Gly 115 120 125 Lys Arg Ala Met Ala His Gly Val Cys Pro Gln Val Gly Val Gly Gly 130 135 140 His Phe Thr Ile Gly Gly Leu Gly Pro Thr Ala Arg Gln Trp Gly Ser 145 150 155 160 Ser Leu Asp His Val Glu Glu Val Glu Val Val Leu Ala Asn Ser Ser 165 170 175 Ile Val Arg Ala Ser Asn Thr Gln Asn Gln Asp Val Leu Phe Ala Ile 180 185 190 Lys Gly Ala Ala Ala Ser Phe Gly Ile Val Thr Glu Phe Lys Val Arg 195 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chrysogenum <400> 148 Met Gly Asn Thr Thr Ser Ile Ala Ala Gly Arg Asp Cys Leu Val Ser 1 5 10 15 Ala Val Gly Pro Ala His Val Thr Phe Gln Asp Ala Leu Leu Tyr Gln 20 25 30 Thr Thr Ala Val Asp Pro Tyr Asn Leu Asn Ile Pro Val Thr Pro Ala 35 40 45 Ala Val Thr Tyr Pro Gln Ser Ala Glu Glu Ile Ala Ala Val Val Lys 50 55 60 Cys Ala Ser Asp Tyr Asp Tyr Lys Val Gln Ala Arg Ser Gly Gly His 65 70 75 80 Ser Phe Gly Asn Tyr Gly Leu Gly Gly Gln Asn Gly Ala Ile Val Val 85 90 95 Asp Met Lys His Phe Ser Gln Phe Ser Met Asp Glu Ser Thr Phe Val 100 105 110 Ala Thr Ile Gly Pro Gly Thr Thr Leu Gly Asp Leu Asp Thr Glu Leu 115 120 125 Tyr Asn Ala Gly Gly Arg Ala Met Ala His Gly Ile Cys Pro Thr Ile 130 135 140 Arg Thr Gly Gly His Leu Thr Val Gly Gly Leu Gly Pro Thr Ala Arg 145 150 155 160 Gln Trp Gly Leu Ala Leu Asp His Ile Glu Glu Val Glu Val Val Leu 165 170 175 Ala Asn Ser Ser Ile Val Arg Ala Ser Asn Thr Gln Asn Gln Asp Ile 180 185 190 Leu Phe Ala Val Lys Gly Ala Ala Ala Ser Phe Gly Ile Val Thr Glu 195 200 205 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Ser Gly Gly 145 150 155 160 Gly Tyr Gly Ala Leu Met Arg Asn Tyr Gly Leu Ala Ala Asp Asn Ile 165 170 175 Ile Asp Ala His Leu Val Asn Val Asp Gly Lys Val Leu Asp Arg Lys 180 185 190 Ser Met Gly Glu Asp Leu Phe Trp Ala Ile Arg Gly Gly Gly Gly Glu 195 200 205 Asn Phe Gly Ile Ile Ala Ala Trp Lys Ile Lys Leu Val Ala Val Pro 210 215 220 Ser Lys Ser Thr Ile Phe Ser Val Lys Lys Asn Met Glu Ile His Gly 225 230 235 240 Leu Val Lys Leu Phe Asn Lys Trp Gln Asn Ile Ala Tyr Lys Tyr Asp 245 250 255 Lys Asp Leu Val Leu Met Thr His Phe Ile Thr Lys Asn Ile Thr Asp 260 265 270 Asn His Gly Lys Asn Lys Thr Thr Val His Gly Tyr Phe Ser Ser Ile 275 280 285 Phe His Gly Gly Val Asp Ser Leu Val Asp Leu Met Asn Lys Ser Phe 290 295 300 Pro Glu Leu Gly Ile Lys Lys Thr Asp Cys Lys Glu Phe Ser Trp Ile 305 310 315 320 Asp Thr Thr Ile Phe Tyr Ser Gly Val Val Asn Phe Asn Thr Ala Asn 325 330 335 Phe Lys Lys Glu Ile Leu Leu Asp Arg Ser Ala Gly Lys Lys Thr Ala 340 345 350 Phe Ser Ile Lys Leu Asp Tyr Val Lys Lys Pro Ile Pro Glu Thr Ala 355 360 365 Met Val Lys Ile Leu Glu Lys Leu Tyr Glu Glu Asp Val Gly Ala Gly 370 375 380 Met Tyr Val Leu Tyr Pro Tyr Gly Gly Ile Met Glu Glu Ile Ser Glu 385 390 395 400 Ser Ala Ile Pro Phe Pro His Arg Ala Gly Ile Met Tyr Glu Leu Trp 405 410 415 Tyr Thr Ala Ser Trp Glu Lys Gln Glu Asp Asn Glu Lys His Ile Asn 420 425 430 Trp Val Arg Ser Val Tyr Asn Phe Thr Thr Pro Tyr Val Ser Gln Asn 435 440 445 Pro Arg Leu Ala Tyr Leu Asn Tyr Arg Asp Leu Asp Leu Gly Lys Thr 450 455 460 Asn His Ala Ser Pro Asn Asn Tyr Thr Gln Ala Arg Ile Trp Gly Glu 465 470 475 480 Lys Tyr Phe Gly Lys Asn Phe Asn Arg Leu Val Lys Val Lys Thr Lys 485 490 495 Val Asp Pro Asn Asn Phe Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu 500 505 510 Pro Pro His His His 515 <210> 215 <211> 516 <212> PRT <213> C. sativa <400> 215 Asn Pro Arg Glu Asn Phe Leu Lys Cys Phe Ser Gln Tyr Ile Pro Asn 1 5 10 15 Asn Ala Thr Asn Leu Lys Leu Val Tyr Thr Gln Asn Asn Pro Leu Tyr 20 25 30 Met Ser Val Leu Asn Ser Thr Ile His Asn Leu Arg Phe Thr Ser Asp 35 40 45 Thr Thr Pro Lys Pro Leu Val Ile Val Thr Pro Ser His Val Ser His 50 55 60 Ile Gln Gly Thr Ile Leu Cys Ser Lys Lys Val Gly Leu Gln Ile Arg 65 70 75 80 Thr Arg Ser Gly Gly His Asp Ser Glu Gly Met Ser Tyr Ile Ser Gln 85 90 95 Val Pro Phe Val Ile Val Asp Leu Arg Asn Met Arg Ser Ile Lys Ile 100 105 110 Asp Val His Ser Gln Thr Ala Trp Val Glu Ala Gly Ala Thr Leu Gly 115 120 125 Glu Val Tyr Tyr Trp Val Asn Glu Lys Asn Glu Asn Leu Ser Leu Ala 130 135 140 Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Val Cys Ala Gly Gly His Phe Gly Gly Gly 145 150 155 160 Gly Tyr Gly Pro Leu Met Arg Asn Tyr Gly Leu Ala Ala Asp Asn Ile 165 170 175 Ile Asp Ala His Leu Val Asn Val His Gly Lys Val Leu Asp Arg Lys 180 185 190 Ser Met Gly Glu Asp Leu Phe Trp Ala Leu Arg Gly Gly Gly Ala Glu 195 200 205 Ser Phe Gly Ile Ile Val Ala Trp Lys Ile Arg Leu Val Ala Val Pro 210 215 220 Lys Ser Thr Met Phe Ser Val Lys Lys Ile Met Glu Ile His Glu Leu 225 230 235 240 Val Lys Leu Val Asn Lys Trp Gln Asn Ile Ala Tyr Lys Tyr Asp Lys 245 250 255 Asp Leu Leu Leu Met Thr His Phe Ile Thr Arg Asn Ile Thr Asp Asn 260 265 270 Gln Gly Lys Asn Lys Thr Ala Ile His Thr Tyr Phe Ser Ser Val Phe 275 280 285 Leu Gly Gly Val Asp Ser Leu Val Asp Leu Met Asn Lys Ser Phe Pro 290 295 300 Glu Leu Gly Ile Lys Lys Thr Asp Cys Arg Gln Leu Ser Trp Ile Asp 305 310 315 320 Thr Ile Ile Phe Tyr Ser Gly Val Val Asn Tyr Asp Thr Asp Asn Phe 325 330 335 Asn Lys Glu Ile Leu Leu Asp Arg Ser Ala Gly Gln Asn Gly Ala Phe 340 345 350 Lys Ile Lys Leu Asp Tyr Val Lys Lys Pro Ile Pro Glu Ser Val Phe 355 360 365 Val Gln Ile Leu Glu Lys Leu Tyr Glu Glu Asp Ile Gly Ala Gly Met 370 375 380 Tyr Ala Leu Tyr Pro Tyr Gly Gly Ile Met Asp Glu Ile Ser Glu Ser 385 390 395 400 Ala Ile Pro Phe Pro His Arg Ala Gly Ile Leu Tyr Glu Leu Trp Tyr 405 410 415 Ile Cys Ser Trp Glu Lys Gln Glu Asp Asn Glu Lys His Leu Asn Trp 420 425 430 Ile Arg Asn Ile Tyr Asn Phe Met Thr Pro Tyr Val Ser Lys Asn Pro 435 440 445 Arg Leu Ala Tyr Leu Asn Tyr Arg Asp Leu Asp Ile Gly Ile Asn Asp 450 455 460 Pro Lys Asn Pro Asn Asn Tyr Thr Gln Ala Arg Ile Trp Gly Glu Lys 465 470 475 480 Tyr Phe Gly Lys Asn Phe Asp Arg Leu Val Lys Val Lys Thr Leu Val 485 490 495 Asp Pro Asn Asn Phe Phe Arg Asn Glu Gln Ser Ile Pro Pro Leu Pro 500 505 510 Arg His Arg His 515

Claims (74)

  1. 말단 신타제(TS)를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포로서, TS는 서열번호 27 또는 25와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고, 숙주 세포는 적어도 하나의 칸나비노이드를 생성할 수 있는 것인 숙주 세포.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 27의 서열에 비해, TS는 서열번호 27의 위치 33, 39, 55, 57, 61, 62, 63, 71, 112, 122, 126, 129, 131, 180, 183, 202, 256, 257, 260, 287, 295, 341, 386, 392, 394, 398, 410, 423, 426, 450, 및/또는 472에 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 숙주 세포.
  3. 제2항에 있어서, TS는 다음을 포함하는 것인 숙주 세포:
    (i) 서열번호 27의 위치 33에 상응하는 잔기에서 아미노산 D;
    (ii) 서열번호 27의 위치 39에 상응하는 잔기에서 아미노산 F;
    (iii) 서열번호 27의 위치 55에 상응하는 잔기에서 아미노산 S;
    (iv) 서열번호 27의 위치 57에 상응하는 잔기에서 아미노산 Q 또는 E;
    (v) 서열번호 27의 위치 61에 상응하는 잔기에서 아미노산 A;
    (vi) 서열번호 27의 위치 62에 상응하는 잔기에서 아미노산 I;
    (vii) 서열번호 27의 위치 63에 상응하는 잔기에서 아미노산 I;
    (viii) 서열번호 27의 위치 71에 상응하는 잔기에서 아미노산 I;
    (ix) 서열번호 27의 위치 112에 상응하는 잔기에서 아미노산 V 또는 T;
    (x) 서열번호 27의 위치 122에 상응하는 잔기에서 아미노산 S, G, A 또는 E;
    (xi) 서열번호 27의 위치 126에 상응하는 잔기에서 아미노산 A, R, T, K, 또는 D;
    (xii) 서열번호 27의 위치 129에 상응하는 잔기에서 아미노산 W;
    (xiii) 서열번호 27의 위치 131에 상응하는 잔기에서 아미노산 S;
    (xiv) 서열번호 27의 위치 180에 상응하는 잔기에서 아미노산 T;
    (xv) 서열번호 27의 위치 183에 상응하는 잔기에서 아미노산 T;
    (xvi) 서열번호 27의 위치 202에 상응하는 잔기에서 아미노산 S 또는 G;
    (xvii) 서열번호 27의 위치 256에 상응하는 잔기에서 아미노산 F 또는 M;
    (xviii) 서열번호 27의 위치 257에 상응하는 잔기에서 아미노산 S;
    (xix) 서열번호 27의 위치 260에 상응하는 잔기에서 아미노산 M 또는 F;
    (xx) 서열번호 27의 위치 287에 상응하는 잔기에서 아미노산 R;
    (xxi) 서열번호 27의 위치 295에 상응하는 잔기에서 아미노산 S;
    (xxii) 서열번호 27의 위치 341에 상응하는 잔기에서 아미노산 S;
    (xxiii) 서열번호 27의 위치 386에 상응하는 잔기에서 아미노산 A;
    (xxiv) 서열번호 27의 위치 392에 상응하는 잔기에서 아미노산 H;
    (xxv) 서열번호 27의 위치 394에 상응하는 잔기에서 아미노산 T;
    (xxvi) 서열번호 27의 위치 398에 상응하는 잔기에서 아미노산 F, T, A, 또는 L;
    (xxvii) 서열번호 27의 위치 410에 상응하는 잔기에서 아미노산 N;
    (xxviii) 서열번호 27의 위치 423에 상응하는 잔기에서 아미노산 A;
    (xxix) 서열번호 27의 위치 426에 상응하는 잔기에서 아미노산 Y;
    (xxx) 서열번호 27의 위치 450에 상응하는 잔기에서 아미노산 K; 및/또는
    (xxxi) 서열번호 27의 위치 472에 상응하는 잔기에서 아미노산 R 또는 A.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, TS는 서열번호 27의 서열에 비해 하기 아미노산 치환: T33D; Y39F; T55S; A57Q; A57E; G61A; V62I; V63I; Y71I; E112V; E112T; N122S; N122G; N122A; N122E; I126A; I126R; I126T; I126K; I126D; Y129W; N131S; S180T; R183T; N202S; N202G; Y256F; Y256M; N257S; V260M; V260F; H287R; N295S; A341S; V386A; L392H; M394T; V398F; V398T; V398A; V398L; D410N; S423A; H426Y; R450K; P472R; 및/또는 P472A 중 하나 이상을 포함하는 것인 숙주 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 칸나비노이드는 CBC 유형 칸나비노이드인 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서, 칸나비노이드는 칸나비크로멘산(CBCA) 및/또는 칸나비크로메바린산(CBCVA)인 숙주 세포.
  7. 제6항에 있어서, 숙주 세포는 테트라하이드로칸나비놀산(THCA), 칸나비디올산(CBDA) 및/또는 테트라하이드로칸나비바린산(THCVA) 중 하나 이상을 추가로 생성하는 것인 숙주 세포.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, TS는 대조군 TS보다 더 높은 비율의 CBCA:CBDA, CBCA:THCA, 및/또는 CBCVA:THCVA를 생성하는 것인 숙주 세포.
  9. 제8항에 있어서, 대조군 TS는 서열번호 20, 23, 25 또는 27의 서열을 포함하는 TS인 숙주 세포.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, TS는 서열번호 27에 비해 하기 아미노산 치환: A57Q 및 G61A; Y71I; 및/또는 V260F 중 하나 이상을 포함하는 것인 숙주 세포.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, TS는 대조군 TS보다 CBC 유형 칸나비노이드에 대해 더 높은 생성물 특이성을 갖는 것인 숙주 세포.
  12. 제11항에 있어서, 대조군 TS는 서열번호 20, 23, 25 또는 27의 서열을 포함하는 TS인 숙주 세포.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, TS는 서열번호 27의 서열에 비해 Y39F 및/또는 V63I를 포함하는 것인 숙주 세포.
  14. 제1항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, TS는 서열번호 25, 27, 105, 126, 134, 155, 162, 164, 또는 165 중 어느 하나의 서열을 포함하고, 임의로 서열번호 27의 서열에 비해, TS는 서열번호 27의 위치 33, 39, 55, 57, 61, 62, 63, 71, 112, 122, 126, 129, 131, 180, 183, 202, 256, 257, 260, 287, 295, 341, 386, 392, 394, 398, 410, 423, 426, 450, 및/또는 472에 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 숙주 세포.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, TS의 서열은 하기 모티프 중 하나 이상을 포함하는 것인 숙주 세포:
    (i) KVQARSGGH(서열번호 174);
    (ii) RASNTQNQD[VI][FL]FA[VI]K(서열번호 176);
    (iii) CPTI[KR]TGGH(서열번호 181);
    (iv) WFVTLSLEGGAINDV[AP]EDATAY[AG]H(서열번호 184);
    (v) P[IV]S[DQE]TTY[EDG]F[TA]DGLYDVLA[RQK]AVPES[VA]GHAYLGCPDP[RK]M(서열번호 186);
    (vi) MKHF[TNS]QFSM(서열번호 189);
    (vii) P[EQ][TS]A[EAD][QE]IA[GA][VI]VKC(서열번호 193);
    (viii) RDCL[IV]SA[LV]GGN[SA]A[LH][AV][AV]F[PQ][ND][QE]LL[WY](서열번호 200);
    (ix) RT[EQ][PQ]APGLAVQYSY(서열번호 207); 및/또는
    (x) WQ[SA]FI[SA][AQ][KE]NLT[RW][QK]FY[NST]NM(서열번호 211).
  16. 칸나비노이드를 생성하기 위한 숙주 세포로서, 숙주 세포는 말단 신타제(TS)를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고, TS의 서열은 하기 모티프 중 하나 이상을 포함하고:
    (i) KVQARSGGH(서열번호 174);
    (ii) RASNTQNQD[VI][FL]FA[VI]K(서열번호 176);
    (iii) CPTI[KR]TGGH(서열번호 181);
    (iv) WFVTLSLEGGAINDV[AP]EDATAY[AG]H(서열번호 184);
    (v) P[IV]S[DQE]TTY[EDG]F[TA]DGLYDVLA[RQK]AVPES[VA]GHAYLGCPDP[RK]M(서열번호 186);
    (vi) MKHF[TNS]QFSM(서열번호 189);
    (vii) P[EQ][TS]A[EAD][QE]IA[GA][VI]VKC(서열번호 193);
    (viii) RDCL[IV]SA[LV]GGN[SA]A[LH][AV][AV]F[PQ][ND][QE]LL[WY](서열번호 200);
    (ix) RT[EQ][PQ]APGLAVQYSY(서열번호 207); 및/또는
    (x) WQ[SA]FI[SA][AQ][KE]NLT[RW][QK]FY[NST]NM(서열번호 211);
    숙주 세포는 적어도 하나의 칸나비노이드를 생성할 수 있는 것인 숙주 세포.
  17. 제16항에 있어서,
    (i) 모티프 KVQARSGGH(서열번호 174)는 서열번호 27의 잔기 72-80에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고;
    (ii) 모티프 RASNTQNQD[VI][FL]FA[VI]K(서열번호 176)는 서열번호 27의 잔기 183-197에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고;
    (iii) 모티프 CPTI[KR]TGGH(서열번호 181)는 서열번호 27의 잔기 141-149에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고;
    (iv) 모티프 WFVTLSLEGGAINDV[AP]EDATAY[AG]H(서열번호 184)는 서열번호 27의 잔기 360-383에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고;
    (v) 모티프 P[IV]S[DQE]TTY[EDG]F[TA]DGLYDVLA[RQK]AVPES[VA]GHAYLGCPDP[RK]M(서열번호 186)은 서열번호 27의 잔기 400-436에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고;
    (vi) 모티프 MKHF[TNS]QFSM(서열번호 189)은 서열번호 27의 잔기 98-106에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고;
    (vii) 모티프 P[EQ][TS]A[EAD][QE]IA[GA][VI]VKC(서열번호 193)는 서열번호 27의 잔기 53-65에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고;
    (viii) 모티프 RDCL[IV]SA[LV]GGN[SA]A[LH][AV][AV]F[PQ][ND][QE]LL[WY](서열번호 200)는 서열번호 27의 잔기 10-32에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고;
    (ix) 모티프 RT[EQ][PQ]APGLAVQYSY(서열번호 207)는 서열번호 27의 잔기 212-225에 상응하는 TS의 잔기에 위치하고/하거나;
    (x) 모티프 WQ[SA]FI[SA][AQ][KE]NLT[RW][QK]FY[NST]NM(서열번호 211)은 서열번호 27의 잔기 242-259에 상응하는 TS의 잔기에 위치하는 것인 숙주 세포.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, TS는 진균 TS 또는 이의 보존적으로 치환된 버전인 숙주 세포.
  19. 제18항에 있어서, TS는 아스페르길루스 TS 또는 이의 보존적으로 치환된 버전인 숙주 세포.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인 숙주 세포.
  21. 제20항에 있어서, 서열번호 27의 서열에 비해, TS는 서열번호 27의 위치 33, 39, 55, 57, 61, 62, 63, 71, 112, 122, 126, 129, 131, 180, 183, 202, 256, 257, 260, 287, 295, 341, 386, 392, 394, 398, 410, 423, 426, 450, 및/또는 472에 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, TS는 하기를 포함하는 것인 숙주 세포:
    (i) 서열번호 27의 위치 33에 상응하는 잔기에서 아미노산 D;
    (ii) 서열번호 27의 위치 39에 상응하는 잔기에서 아미노산 F;
    (iii) 서열번호 27의 위치 55에 상응하는 잔기에서 아미노산 S;
    (iv) 서열번호 27의 위치 57에 상응하는 잔기에서 아미노산 Q 또는 E;
    (v) 서열번호 27의 위치 61에 상응하는 잔기에서 아미노산 A;
    (vi) 서열번호 27의 위치 62에 상응하는 잔기에서 아미노산 I;
    (vii) 서열번호 27의 위치 63에 상응하는 잔기에서 아미노산 I;
    (viii) 서열번호 27의 위치 71에 상응하는 잔기에서 아미노산 I;
    (ix) 서열번호 27의 위치 112에 상응하는 잔기에서 아미노산 V 또는 T;
    (x) 서열번호 27의 위치 122에 상응하는 잔기에서 아미노산 S, G, A 또는 E;
    (xi) 서열번호 27의 위치 126에 상응하는 잔기에서 아미노산 A, R, T, K, 또는 D;
    (xii) 서열번호 27의 위치 129에 상응하는 잔기에서 아미노산 W;
    (xiii) 서열번호 27의 위치 131에 상응하는 잔기에서 아미노산 S;
    (xiv) 서열번호 27의 위치 180에 상응하는 잔기에서 아미노산 T;
    (xv) 서열번호 27의 위치 183에 상응하는 잔기에서 아미노산 T;
    (xvi) 서열번호 27의 위치 202에 상응하는 잔기에서 아미노산 S 또는 G;
    (xvii) 서열번호 27의 위치 256에 상응하는 잔기에서 아미노산 F 또는 M;
    (xviii) 서열번호 27의 위치 257에 상응하는 잔기에서 아미노산 S;
    (xix) 서열번호 27의 위치 260에 상응하는 잔기에서 아미노산 M 또는 F;
    (xx) 서열번호 27의 위치 287에 상응하는 잔기에서 아미노산 R;
    (xxi) 서열번호 27의 위치 295에 상응하는 잔기에서 아미노산 S;
    (xxii) 서열번호 27의 위치 341에 상응하는 잔기에서 아미노산 S;
    (xxiii) 서열번호 27의 위치 386에 상응하는 잔기에서 아미노산 A;
    (xxiv) 서열번호 27의 위치 392에 상응하는 잔기에서 아미노산 H;
    (xxv) 서열번호 27의 위치 394에 상응하는 잔기에서 아미노산 T;
    (xxvi) 서열번호 27의 위치 398에 상응하는 잔기에서 아미노산 F, T, A, 또는 L;
    (xxvii) 서열번호 27의 위치 410에 상응하는 잔기에서 아미노산 N;
    (xxviii) 서열번호 27의 위치 423에 상응하는 잔기에서 아미노산 A;
    (xxix) 서열번호 27의 위치 426에 상응하는 잔기에서 아미노산 Y;
    (xxx) 서열번호 27의 위치 450에 상응하는 잔기에서 아미노산 K; 및/또는
    (xxxi) 서열번호 27의 위치 472에 상응하는 잔기에서 아미노산 R 또는 A.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, TS는 서열번호 27의 서열에 비해 하기 아미노산 치환: T33D; Y39F; T55S; A57Q; A57E; G61A; V62I; V63I; Y71I; E112V; E112T; N122S; N122G; N122A; N122E; I126A; I126R; I126T; I126K; I126D; Y129W; N131S; S180T; R183T; N202S; N202G; Y256F; Y256M; N257S; V260M; V260F; H287R; N295S; A341S; V386A; L392H; M394T; V398F; V398T; V398A; V398L; D410N; S423A; H426Y; R450K; P472R; 및/또는 P472A 중 하나 이상을 포함하는 것인 숙주 세포.
  24. 제20항에 있어서, TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 143, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나의 서열 또는 이의 보존적으로 치환된 버전을 포함하는 것인 숙주 세포.
  25. 말단 신타제(TS)를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포로서, TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하고, 숙주 세포는 적어도 하나의 칸나비노이드를 생성할 수 있는 것인 숙주 세포.
  26. 제25항에 있어서, 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열은 하나 이상의 신호 펩티드에 연결된 것인 숙주 세포.
  27. 제26항에 있어서, 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열은 서열번호 16, 또는 서열번호 16의 서열에 비해 2개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가 또는 결실을 갖는 서열을 포함하는 신호 펩티드에 연결된 것인 숙주 세포.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 신호 펩티드는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열의 N-말단에 연결된 것인 숙주 세포.
  29. 제28항에 있어서, N-말단 메티오닌이 서열번호 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172로부터 제거되고, 메티오닌 잔기가 신호 펩티드의 N-말단에 부가된 것인 숙주 세포.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열은 서열번호 17, 또는 서열번호 17의 서열에 비해 1개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 갖는 서열을 포함하는 신호 펩티드에 연결된 것인 숙주 세포.
  31. 제30항에 있어서, 서열번호 17, 또는 서열번호 17의 서열에 비해 1개 이하의 아미노산 치환, 삽입, 부가, 또는 결실을 갖는 서열을 포함하는 신호 펩티드는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열의 C-말단에 연결된 것인 숙주 세포.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 27의 서열에 비해, TS는 서열번호 27의 위치 33, 39, 55, 57, 61, 62, 63, 71, 112, 122, 126, 129, 131, 180, 183, 202, 256, 257, 260, 287, 295, 341, 386, 392, 394, 398, 410, 423, 426, 450, 및/또는 472에 상응하는 잔기에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 숙주 세포.
  33. 제32항에 있어서, TS는 다음을 포함하는 것인 숙주 세포:
    (i) 서열번호 27의 위치 33에 상응하는 잔기에서 아미노산 D;
    (ii) 서열번호 27의 위치 39에 상응하는 잔기에서 아미노산 F;
    (iii) 서열번호 27의 위치 55에 상응하는 잔기에서 아미노산 S;
    (iv) 서열번호 27의 위치 57에 상응하는 잔기에서 아미노산 Q 또는 E;
    (v) 서열번호 27의 위치 61에 상응하는 잔기에서 아미노산 A;
    (vi) 서열번호 27의 위치 62에 상응하는 잔기에서 아미노산 I;
    (vii) 서열번호 27의 위치 63에 상응하는 잔기에서 아미노산 I;
    (viii) 서열번호 27의 위치 71에 상응하는 잔기에서 아미노산 I;
    (ix) 서열번호 27의 위치 112에 상응하는 잔기에서 아미노산 V 또는 T;
    (x) 서열번호 27의 위치 122에 상응하는 잔기에서 아미노산 S, G, A 또는 E;
    (xi) 서열번호 27의 위치 126에 상응하는 잔기에서 아미노산 A, R, T, K, 또는 D;
    (xii) 서열번호 27의 위치 129에 상응하는 잔기에서 아미노산 W;
    (xiii) 서열번호 27의 위치 131에 상응하는 잔기에서 아미노산 S;
    (xiv) 서열번호 27의 위치 180에 상응하는 잔기에서 아미노산 T;
    (xv) 서열번호 27의 위치 183에 상응하는 잔기에서 아미노산 T;
    (xvi) 서열번호 27의 위치 202에 상응하는 잔기에서 아미노산 S 또는 G;
    (xvii) 서열번호 27의 위치 256에 상응하는 잔기에서 아미노산 F 또는 M;
    (xviii) 서열번호 27의 위치 257에 상응하는 잔기에서 아미노산 S;
    (xix) 서열번호 27의 위치 260에 상응하는 잔기에서 아미노산 M 또는 F;
    (xx) 서열번호 27의 위치 287에 상응하는 잔기에서 아미노산 R;
    (xxi) 서열번호 27의 위치 295에 상응하는 잔기에서 아미노산 S;
    (xxii) 서열번호 27의 위치 341에 상응하는 잔기에서 아미노산 S;
    (xxiii) 서열번호 27의 위치 386에 상응하는 잔기에서 아미노산 A;
    (xxiv) 서열번호 27의 위치 392에 상응하는 잔기에서 아미노산 H;
    (xxv) 서열번호 27의 위치 394에 상응하는 잔기에서 아미노산 T;
    (xxvi) 서열번호 27의 위치 398에 상응하는 잔기에서 아미노산 F, T, A, 또는 L;
    (xxvii) 서열번호 27의 위치 410에 상응하는 잔기에서 아미노산 N;
    (xxviii) 서열번호 27의 위치 423에 상응하는 잔기에서 아미노산 A;
    (xxix) 서열번호 27의 위치 426에 상응하는 잔기에서 아미노산 Y;
    (xxx) 서열번호 27의 위치 450에 상응하는 잔기에서 아미노산 K; 및/또는
    (xxxi) 서열번호 27의 위치 472에 상응하는 잔기에서 아미노산 R 또는 A.
  34. 제25항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, TS는 서열번호 27의 서열에 비해 하기 아미노산 치환: T33D; Y39F; T55S; A57Q; A57E; G61A; V62I; V63I; Y71I; E112V; E112T; N122S; N122G; N122A; N122E; I126A; I126R; I126T; I126K; I126D; Y129W; N131S; S180T; R183T; N202S; N202G; Y256F; Y256M; N257S; V260M; V260F; H287R; N295S; A341S; V386A; L392H; M394T; V398F; V398T; V398A; V398L; D410N; S423A; H426Y; R450K; P472R; 및/또는 P472A 중 하나 이상을 포함하는 것인 숙주 세포.
  35. 제25항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드는 서열번호 26, 28, 35, 42, 56, 60, 64, 74, 85, 89, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 및 102 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인 숙주 세포.
  36. 제25항 내지 제31항 및 제35항 중 어느 한 항에 있어서, TS 서열은 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167 및 172 중 어느 하나를 포함하는 것인 숙주 세포.
  37. 말단 신타제(TS)를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포로서, TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나, 숙주 세포는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나의 보존적으로 치환된 버전을 포함하는 것인 숙주 세포.
  38. 말단 신타제(TS)를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포로서, 숙주 세포는 적어도 하나의 칸나비노이드를 생성할 수 있고, TS는 진균 TS 또는 이의 보존적으로 치환된 버전인 숙주 세포.
  39. 제38항에 있어서, 진균 TS는 아스페르길루스 TS 또는 이의 보존적으로 치환된 버전인 숙주 세포.
  40. 제16항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 칸나비노이드는 CBC 유형 칸나비노이드인 숙주 세포.
  41. 제40항에 있어서, 칸나비노이드는 칸나비크로멘산(CBCA) 및/또는 칸나비크로메바린산(CBCVA)인 숙주 세포.
  42. 제41항에 있어서, 숙주 세포는 테트라하이드로칸나비놀산(THCA), 칸나비디올산(CBDA) 및/또는 테트라하이드로칸나비바린산(THCVA) 중 하나 이상을 추가로 생성하는 것인 숙주 세포.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 식물 세포, 조류 세포, 효모 세포, 박테리아 세포, 또는 동물 세포인 숙주 세포.
  44. 제43항에 있어서, 숙주 세포는 효모 세포인 숙주 세포.
  45. 제44항에 있어서, 효모 세포는 사카로마이세스(Saccharomyces) 세포, 야로위아(Yarrowia) 세포, 코마가타엘라(Komagataella) 세포, 또는 피키아(Pichia) 세포인 숙주 세포.
  46. 제45항에 있어서, 사카로마이세스 세포는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 세포인 숙주 세포.
  47. 제43항에 있어서, 숙주 세포는 박테리아 세포인 숙주 세포.
  48. 제47항에 있어서, 박테리아 세포는 이. 콜라이(E. coli) 세포인 숙주 세포.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포는 아실 활성화 효소(AAE), 폴리케타이드 신타제(PKS), 폴리케타이드 사이클라제(PKC), 프레닐트랜스퍼라제(PT), 및/또는 추가 말단 신타제(TS) 중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 숙주 세포.
  50. 제49항에 있어서, PKS는 올리베톨 신타제(OLS) 또는 디바리놀 신타제인 숙주 세포.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  52. CBG 유형 칸나비노이드를 말단 신타제(TS)와 접촉시키는 단계를 포함하는 칸나비노이드의 생성 방법으로서, TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, CBG 유형 칸나비노이드를 TS와 접촉시키는 단계는 시험관내에서 발생하는 것인 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, CBG 유형 칸나비노이드를 TS와 접촉시키는 단계는 생체내에서 발생하는 것인 방법.
  55. 제54항에 있어서, CBG 유형 칸나비노이드를 TS와 접촉시키는 단계는 숙주 세포에서 발생하는 것인 방법.
  56. 칸나비노이드의 생성 방법으로서, CBD 유형 칸나비노이드, THC 유형 칸나비노이드 또는 둘 모두와 비교하여 CBG 유형 칸나비노이드를 CBC 유형 칸나비노이드로 우선적으로 전환하도록 적응된 산화적 고리화 촉매와 CBG 유형 칸나비노이드를 생체내에서 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  57. 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 칸나비노이드는 CBG 유형 칸나비노이드의 고리화된 생성물인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 칸나비노이드는 고리화된 프레닐 모이어티를 갖는 칸나비노이드인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 칸나비노이드는 CBC 유형 칸나비노이드, CBD 유형 칸나비노이드, 또는 THC 유형 칸나비노이드인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 칸나비노이드는 CBC 유형 칸나비노이드인 방법.
  61. 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, CBG 유형 칸나비노이드는 칸나비게롤산인 방법.
  62. 제60항에 있어서, CBC 유형 칸나비노이드는 CBCA인 방법.
  63. 제52항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나의 서열 또는 이의 보존적으로 치환된 버전을 포함하는 것인 방법.
  64. CBG 유형 칸나비노이드, 및 CBG 유형 칸나비노이드, THC 유형 칸나비노이드, 또는 둘 모두와 비교하여 CBG 유형 칸나비노이드를 CBC 유형 칸나비노이드로 우선적으로 전환시키기 위해 CBG 유형 칸나비노이드의 산화적 고리화를 촉매하는 수단을 포함하는 숙주 세포.
  65. CBG 유형 칸나비노이드, 및 CBG 유형 칸나비노이드, THC 유형 칸나비노이드, 또는 둘 모두와 비교하여 CBG 유형 칸나비노이드를 CBC 유형 칸나비노이드로 우선적으로 전환되도록 적응된 산화적 고리화 촉매를 포함하는 숙주 세포.
  66. 제65항에 있어서, CBC 유형 칸나비노이드를 생성하기 위해 CBG 유형 칸나비노이드의 산화적 고리화를 촉매하는 수단은 말단 신타제(TS)를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드이며, TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열 또는 이의 보존적으로 치환된 버전을 포함하는 것인 숙주 세포.
  67. 제66항에 있어서, TS는 또한 THCA, THCVA 또는 CBDA를 생성할 수 있는 것인 숙주 세포.
  68. 말단 신타제(TS)를 코딩하는 비-자연 발생 핵산으로서, 비-자연 발생 핵산은 서열번호 26, 28, 35, 42, 56, 60, 64, 74, 85, 89, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 및 102 중 어느 하나와 적어도 90% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 핵산.
  69. 제68항의 비-자연 발생 핵산을 포함하는 벡터.
  70. 제68항의 비-자연 발생 핵산을 포함하는 발현 카세트.
  71. 제68항의 비-자연 발생 핵산, 제69항의 벡터, 또는 제70항의 발현 카세트로 형질전환된 숙주 세포.
  72. 칸나비노이드를 생성하기 위한 생물반응기로서, 생물반응기는 CBG 유형 칸나비노이드 및 말단 신타제(TS)를 포함하고, TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하거나, TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나의 보존적으로 치환된 버전을 포함하는 것인 생물반응기.
  73. 비-자연 발생 말단 신타제(TS)로서, TS는 서열번호 25, 27, 105, 112, 126, 130, 134, 144, 155, 159, 162-167, 또는 172 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 것인 비-자연 발생 말단 신타제(TS).
  74. THC 유형 화합물 또는 CBD 유형 화합물과 비교하여 생체내에서 CBG 유형 칸나비노이드를 CBC 유형 화합물로 우선적으로 전환하도록 적응된 산화적 고리화 촉매.
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