CN114891710B - 一种通过重构辅酶再生系统强化重组大肠杆菌催化合成胆绿素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过重构辅酶再生系统强化重组大肠杆菌催化合成胆绿素的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过从Clostridium tetani中获得血红素加氧酶，以E.coliBL21(DE3)作为底盘细胞，pETDuet为表达载体构建重组大肠杆菌，实现该酶的表达。强化大肠杆菌中谷氨酸脱氢酶的表达，引入辅酶NADPH再生系统，成功构建重组菌株E.coliBL21/pETDuet‑gdhAEc‑hoCt，实现E.coli来源的GdhA和C.tetani来源的HO共表达。该重组菌在无需额外添加辅酶NADPH条件下，即可进行全细胞催化血红素合成胆绿素，转化率高达71.5％，为胆绿素的高效生产提供了新途径。

Description

一种通过重构辅酶再生系统强化重组大肠杆菌催化合成胆绿 素的方法

技术领域

本发明涉及一种通过重构辅酶再生系统强化重组大肠杆菌催化合成胆绿素的方法，具体涉及一株共表达谷氨酸脱氢酶和血红素加氧酶的重组大肠杆菌，以及该菌株在全细胞转化氯化血红素制备胆绿素的技术，属于生物工程技术领域。

背景技术

胆绿素(biliverdin，BV)，又称去氢胆红素，分子量584.66，分子式C₃₃H₃₄N₄O₆，暗绿色片状或柱状晶体，无熔点，300℃变黑分解而不熔化，溶于甲醇、乙醚、氯仿、二硫化碳，苯，难溶于水，是一种四吡咯色素，是血红素分解代谢的产物，由BVIXα，BVIXβ，BVIXγ，BVIXδ等异构体组成。在动物体内，血红素在HO-1的作用下会特异性地在α-亚甲基处开环，从而产生生理相关性最高的胆绿素IXα异构体。所以“胆绿素”一词通常特指胆绿素IXα。

胆绿素作为胆绿素-胆红素循环系统的一个组成部分，可以保护脂质免受活性氧(ROS)的伤害，更重要的是作为一种新型的可回收利用的抗氧化剂，被广泛应用于医学领域，包括抗病毒药物的制备，炎症调节剂，以及治疗肺移植损伤或肝脏缺血再灌注损伤的药物。此外，它还被认为是材料科学、光遗传学和合成生物学中用于光敏色素的各种发色基团的重要前体。

目前，商业胆绿素是将从哺乳动物胆汁中提取的胆红素通过化学氧化的方法获得。这些方法存在污染环境、杂质过多和产生异构体等问题。与传统的化学合成不同，利用微生物细胞工厂的生物生产方法一直被认为是生产药品、材料、燃料和各种化学品的最佳来源。此前也报道了相关的利用微生物发酵生产胆绿素的方法，在专利CN109182232A中公开了一株重组大肠杆菌，其能够200mg/L血红素转化为胆绿素，摩尔转化率为34.5％；在美国专利US20200377915A1中的重组谷氨酸棒杆菌通过分批补料、对发酵条件优化后，72h发酵生产了70mg/L的胆绿素IX-α。但仍然存在着发酵时间长、转化率较低的问题。因此，亟需开发一种高效的生产胆绿素的方法。

发明内容

血红素加氧酶HO是血红素代谢必不可少的裂解酶，血红素加氧酶能够将血红素水解开环，得到胆绿素，但是目前的血红素加氧酶的酶活均比较低，仍然不能实现高效转化生产胆绿素。发明人从来源于破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)，集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、人(Homo sapiens)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC 13032)的血红素加氧酶中筛选到一种来源于破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)的血红素加氧酶，此酶能够具备较高的酶活，能够提升胆绿素的转化效率。此外，发明人在前期试验中尝试通过在大肠杆菌中只表达血红素加氧酶，但发现并不能实现胆绿素的合成，而在外源添加NADPH时能顺利实现胆绿素的合成，究其原因在于大肠杆菌本身的谷氨酸脱氢酶GdhA并未能够正常表达，从而难以实现反应过程中辅酶循环系统的正常运行，因此，发明人尝试将表达谷氨酸脱氢酶GdhA的表达载体导入大肠杆菌中，以期实现辅酶循环系统的再生。

本发明的第一个目的是提供一种大肠杆菌，表达了来源于Clostridium tetani的血红素加氧酶，并游离表达了大肠杆菌自身的谷氨酸脱氢酶；所述血红素加氧酶为GenBank：AAO36942.1所示的第14～224位氨基酸；谷氨酸脱氢酶的GenBank：AAC74831.1。

在一种实施方式中，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主。

以pETDuet为表达载体，同时表达所述谷氨酸脱氢酶和血红素加氧酶。

在一种实施方式中，在pETDuet上依次连接编码所述谷氨酸脱氢酶和血红素加氧酶的基因；所述编码所述血红素加氧酶和谷氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示。

本发明的第二个目的是提供一种全细胞生产胆绿素的方法，其特征在于，利用权利要求1～4所述的重组大肠杆菌，在含有血红素和谷氨酸为反应底物的反应体系中反应合成胆绿素。

在一种实施方式中，所述方法具体为：

(1)将所述重组大肠杆菌在LB培养基中培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8，加入终浓度为0.1～0.5mmol/L的IPTG在28～30℃诱导培养10～14h；

(2)离心收集诱导培养后的菌体；

(3)反应体系中含有80～150mg/L的氯化血红素水溶液、浓度为8～15g/L的谷氨酸和OD₆₀₀为25±1的菌体，在30～35℃，100～150rpm/min，pH 7.0±0.2进行全细胞转化。

在一种实施方式中，发酵时间0～40h。

优选地，发酵时间15～40h。

更优选地，发酵时间为20～35h。

在一种实施方式中，所述氯化血红素以1g/L氯化血红素水溶液的形式加入，所述1g/L氯化血红素水溶液的配置方法为：100mg/L的氯化血红素溶解在100mL质量浓度0.25％的Na₂CO₃水溶液，即得1g/L氯化血红素水溶液。

本发明提供了所述重组大肠杆菌在制备胆绿素或含有胆绿素的产品中的应用。

有益效果：

本发明筛选到了酶活较高的来源于Clostridium tetani的血红素加氧酶，在大肠杆菌中异源表达了所述血红素加氧酶，并强化了大肠杆菌中谷氨酸脱氢酶的表达，重构了大肠杆菌辅酶循环系统，无需外源添加NADPH即可实现胆绿素的高效合成，在摇瓶条件下反应32h，胆绿素产量达到71.5mg/L。

附图说明

图1为血红素转化为胆绿素的反应示意图。

图2为重组菌BL21/pETDuet-hoCt菌落PCR验证图(M：Marker；1：hoCt)。

图3为重组菌BL21/pETDuet-hoCt SDS-PAGE电泳图(M：Marker；1：空白对照；2：BL/21pETDuet-hoCt)。

图4为纯化后的HO SDS-PAGE电泳图(M：Marker；1：纯化后的HO)。

图5为重组菌BL21/pETDuet-gdhAEc-hoCt菌落PCR验证图(M：Marker；1：gdhAEc-hoCt)。

图6为重组菌BL21/pETDuet-gdhAEc-hoCt SDS-PAGE电泳图(M：Marker；1：空白对照；2：BL/21pETDuet-gdhAEc-hoCt)。

图7为重组菌全细胞转化血红素为胆绿素的HPLC分析图谱。

具体实施方式

根据权利要求所包含的内容举例说明

本发明所用到的培养基如下：

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉2g/L。

GY培养基：甘油20g/L，酵母粉20g/L，(NH4)₂SO₄ 5g/L，NaCl 5g/L，Na₂HPO₄ 15g/L，KH₂PO4 3g/L，MgSO4 0.5g/L。

HO酶活测定方法：反应体系包含100mg/L血红素，E.coli BL21(DE3)细胞裂解液60mL，除去咪唑的纯酶20mL，反应温度35℃，搅拌转速150rpm/min，45μmol/L NADPH，pH7.0，定容至100mL，转化1h，沸水浴5min终止反应，使用HPLC法检测酶活。酶活力单位定义：每小时生成1nmol胆绿素所需要的酶量。

HPLC液相检测方法：UV检测器，C18柱(Agilent 5μm,4.6mm×250mm)，流动相为(甲醇：乙腈：水：乙酸＝40：40：19：1)，流速1mL/min，检测波长370nm，柱温35℃，进样量10μL。

本发明中高保真PCR酶、同源重组酶克隆试剂盒、PBS磷酸盐试剂均购自南京诺维赞生物科技有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒、细菌DNA基因组提取试剂盒均购于上海捷瑞生物工程有限公司；氨苄霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，氯化血红素购自西安雅图生物科技有限公司，Desalting重力脱盐柱购自武汉晶诚生物科技股份有限公司。

所述HO分离纯化方法，按以下步骤

将经诱导处理后的重组菌BL21/pETDuet-hoCt的培养液，于4℃、8000rpm/min离心5min，收集菌体，使用PBS磷酸盐缓冲液(pH 7.4)重悬菌体，再次离心收集菌体，该步骤重复2次。

每100mL培养液的菌体使用10mL PBS缓冲液悬浮，冰浴条件下超声破碎细胞(工作1s，间隔3s，工作时间30min)。细胞裂解液4℃、12000rpm/min离心20min，上清经0.22μm滤膜过滤处理后即得粗酶液。

使用AKTA蛋白纯化仪按照操作说明书对上述粗酶液进行纯化处理。

蛋白分离纯化缓冲液：A液：2.422g Tris，29.22g氯化钠，溶于700mL去离子水中，用50％的HCl调节pH至7.4，使用去离子水定容至1L，抽滤后超声脱气；B液：2.422g Tris，29.22g氯化钠，47.88g咪唑，溶于700mL去离子水中，用50％的HCl调节pH至7.4，使用去离子水定容至1L，抽滤后超声脱气。

使用Desalting重力脱盐柱按照说明书对上述HO进行脱盐处理后，即得纯化的HO酶液。

实施例1：重组菌BL21/pETDuet-hoCt的构建

通过从NCBI上检索的C.tetani来源的HO基因序列(GenBank：AAO36942.1，将其前13个氨基酸截去)，交至苏州金唯智生物科技有限公司合成，同时根据大肠杆菌中密码子的偏好性进行了优化得到了序列如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，连接至载体pETDuet的NdeⅠ-XhoⅠ位点，构建了表达质粒pETDuet-hoCt，所述的基因ho的核苷酸序列见SEQ ID NO：1。

将质粒pETDuet-hoCt通过化学转化的方法转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，37℃孵育2h，涂布于氨苄抗性的LB固体平板，37℃过夜培养。

菌落PCR鉴定，结果如图2。挑取阳性转化子至氨苄抗性的LB液体培养基中培养10-12h。

按照1％(V/V)的接种量转接至相同浓度抗生素的100mL GY培养基中继续培养2–3h，待OD₆₀₀达到0.6～0.8时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，30℃过夜诱导培养。

收集菌体，破细胞后经SDS-PAGE蛋白电泳分析，重组菌株在25kDa有明显的条带，与HO分子量大小一致，结果如图3；经分离纯化，经脱盐柱处理获得HO，结果如图4，酶活测定表明重组菌具有催化血红素为胆绿素的能力，比活力为90.2U/mg，说明表达C.tetani来源的HO的重组大肠杆菌构建成功。

实施例2：重组菌BL21/pETDuet-gdhAEc-hoCt的构建

以E.coli BL21(DE3)基因组为模板，使用引物mcs1-gdhAEc-F、mcs1-gdhAEc-R扩增gdhA基因。所述的基因gdhA的核苷酸序列见SEQ ID NO：2。

所述的引物mcs1-gdhAEc-F和mcs1-gdhAEc-R，

mcs1-gdhAEc-F：

5’-ATCACCACAGCCAGGATCCAATGGATCAGACATATTCTCTGGAGTCATTCC-3’；

mcs1-gdhAEc-R：

5’-AAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTTTAAATCACACCCTGCGCCAGC-3’。

以质粒pETDuet-hoCt为模板，使用反向PCR引物mcs1-F和mcs1-R对其进行线性化，扩增结束后用DpnⅠ消化PCR产物中的模板之后回收备用。所述的引物mcs1-F和mcs1-R分别为：5’-AAGCTTGCGGCCGCATAAT-3’和5’-TGGATCCTGGCTGTGGTGAT-3’。

将线性化的载体pETDuet-hoCt和gdhA基因根据同源重组试剂盒说明书按照比例混合，于37℃连接，将连接产物转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，37℃孵育2h，涂布于氨苄抗性的LB固体平板，37℃过夜培养。

菌落PCR鉴定，结果如图5。挑取阳性转化子至氨苄抗性的LB液体培养基中培养10-12h，提取质粒，送至苏州金唯智生物科技有限公司测序验证，成功构建表达载体pETDuet-gdhAEc-hoCt。

重组菌株BL/21pETDuet-gdhAEc-hoCt，于氨苄抗性的LB固体培养平板划线活化，37℃恒温过夜培养，挑取单菌落接入含有氨苄霉素(50μg/mL)抗性的10mL LB液体培养基中，培养10-12h，按照1％(V/V)的接种量转接至相同浓度抗生素的50mL LB培养基中继续培养2–3h，待OD600达到0.6–0.8时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG、30℃过夜诱导培养。

收集菌体，经SDS-PAGE蛋白电泳分析，结果如图6。重组菌株在25kDa和45kDa都明显的条带，分别与HO和GdhA的分子量大小一致，表明GdhA和HO成功在大肠杆菌中实现共表达。

实施例3：重组菌BL21/pETDuet-gdhAEc-hoCt全细胞催化血红素合成胆绿素

从-80℃冰箱取出重组菌BL21/pETDuet-gdhAEc-hoCt，于氨苄抗性的LB平板划线，37℃恒温过夜培养以活化菌株。

挑取单菌落接入含有氨苄霉素(50μg/mL)抗性的10mL LB液体培养基中，培养10-12h。

按照1％(V/V)的接种量转接至相同浓度抗生素的100mL LB培养基中继续培养2-3h，待OD₆₀₀达到0.6-0.8时加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，30℃过夜诱导培养12h。

将经诱导处理后的重组菌BL21/pETDuet-gdhAEc-hoCt的培养液，于4℃、8000rpm/min离心5min，收集菌体，使用PBS磷酸盐缓冲液(pH 7.4)重悬菌体，再次离心收集菌体，该步骤重复2次。

上述所得菌体使用PBS磷酸盐缓冲液(pH 7.4)重悬，控制菌体在反应体系中的OD₆₀₀为25，加入终浓度为100mg/L的氯化血红素水溶液，及终浓度为15g/L的谷氨酸，定容至100mL，于35℃，150rpm/min，pH 7.0进行全细胞转化。

按照上述方法，重组菌BL21/pETDuet-gdhAEc-hoCt催化血红素合成胆绿素，胆绿素产量为71.5mg/L，摩尔转化率为79.73％。胆绿素样品HPLC分析图谱见图7。

表1

对比例1

具体实施方式参见实施例1，将来源于集胞藻(Synechocystis sp.PCC6803)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、人(Homo sapiens)和谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032)的血红素加氧酶分别构建成重组大肠杆菌，培养、诱导重组大肠杆菌产酶，比酶活分别如表2所示。

表2

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种通过重构辅酶再生系统强化重组大肠杆菌催化合成胆绿素的方法

<130> BAA220589A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 636

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggagaata cctttctgaa cgaaatccgt ctgaacagca gcaagctgca cgatatggcg 60

gaacacaccg gcttcatcaa acgtctgatc gaaggcaatg ccaacgtgac gacctacgcg 120

gagtacatct acaatctgta ccacatctac aacgccatcg agagcaatct ggaaaaaaac 180

aaaggcaaca aatacatcaa ggacttcgcg ctgccggaag tttaccgtgc cgaggccatc 240

atgaaggacg tgaaatatct gctgaaggac aagctggaca gcatggagcc gctgatcagc 300

accaaagtgt tcgtgaaccg catcaaccac atcggcgaaa agaacaagga gctgctgatc 360

gcccatgcct acacccgtta tctggcggat ctgttcggtg gtcgcaccat ctaccagatc 420

gtgaaggaaa actacaaaat tgatgataaa ggtctgaact actatatctt ccacgagatc 480

aacgatctga agaacttcgt gatgggctac cacgagaaac tgaacaatat caaatttgat 540

gaaacgctga aaaaagattt cattaatgaa attagcatca gctacatcta taacatcagc 600

attagcaatg agctggagtt cgaccgcttt aagtaa 636

<210> 2

<211> 1344

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggatcaga catattctct ggagtcattc ctcaaccatg tccaaaagcg cgacccgaat 60

caaaccgagt tcgcgcaagc cgttcgtgaa gtaatgacca cactctggcc ttttcttgaa 120

caaaatccaa aatatcgcca gatgtcatta ctggagcgtc tggttgaacc ggagcgcgtg 180

atccagtttc gcgtggtatg ggttgatgat cgcaaccaga tacaggtcaa ccgtgcatgg 240

cgtgtgcagt tcagctctgc catcggcccg tacaaaggcg gtatgcgctt ccatccgtca 300

gttaaccttt ccattctcaa attcctcggc tttgaacaaa ccttcaaaaa tgccctgact 360

actctgccga tgggcggtgg taaaggcggc agcgatttcg atccgaaagg aaaaagcgaa 420

ggtgaagtga tgcgtttttg ccaggcgctg atgactgaac tgtatcgcca cctgggcgcg 480

gataccgacg ttccggcagg tgatatcggg gttggtggtc gtgaagtcgg ctttatggcg 540

gggatgatga aaaagctctc caacaatacc gcctgcgtct tcaccggtaa gggcctttca 600

tttggcggca gtcttattcg cccggaagct accggctacg gtctggttta tttcacagaa 660

gcaatgctaa aacgccacgg tatgggtttt gaagggatgc gcgtttccgt ttctggctcc 720

ggcaacgtcg cccagtacgc tatcgaaaaa gcgatggaat ttggtgctcg tgtgatcact 780

gcgtcagact ccagcggcac tgtagttgat gaaagcggat tcacgaaaga gaaactggca 840

cgtcttatcg aaatcaaagc cagccgcgat ggtcgagtgg cagattacgc caaagaattt 900

ggtctggtct atctcgaagg ccaacagccg tggtctctac cggttgatat cgccctgcct 960

tgcgccaccc agaatgaact ggatgttgac gccgcgcatc agcttatcgc taatggcgtt 1020

aaagccgtcg ccgaaggggc aaatatgccg accaccatcg aagcgactga actgttccag 1080

caggcaggcg tactatttgc accgggtaaa gcggctaatg ctggtggcgt cgctacatcg 1140

ggcctggaaa tggcacaaaa cgctgcgcgc ctgggctgga aagccgagaa agttgacgca 1200

cgtttgcatc acatcatgct ggatatccac catgcctgtg ttgagcatgg tggtgaaggt 1260

gagcaaacca actacgtgca gggcgcgaac attgccggtt ttgtgaaggt tgccgatgcg 1320

atgctggcgc agggtgtgat ttaa 1344

Claims (5)

1.一种全细胞生产胆绿素的方法，其特征在于，利用重组大肠杆菌，在含有血红素和谷氨酸为反应底物的反应体系中反应合成胆绿素；

所述重组大肠杆菌以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，在表达载体pETDuet上依次连接编码大肠杆菌自身的谷氨酸脱氢酶和来源于Clostridium tetani的血红素加氧酶的基因，所述血红素加氧酶为GenBank：AAO36942.1所示的第14～224位氨基酸；谷氨酸脱氢酶的GenBank：AAC74831.1；所述编码所述血红素加氧酶和谷氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系中含有80～150mg/L的氯化血红素水溶液、浓度为8～15g/L的谷氨酸和OD₆₀₀为25±1的菌体，在30～35℃，100～150rpm/min，pH 7.0±0.2进行全细胞转化。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，加入终浓度为0.1～0.5mmol/L的IPTG在28～30℃诱导培养。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵时间0～40h。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，将所述重组大肠杆菌在LB培养基或GY培养基中诱导培养10～14h。