CN111154736B - 用于制备奥利司他中间体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体地，涉及一种(R)‑β‑羟基十四烷酸酯类化合物的合成方法。该方法是将β‑羰基十四烷酸酯在酮还原酶、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、NADP+和缓冲液中反应得到(R)‑β‑羟基十四烷酸酯类。该方法为酶催化生物合成方法，操作简单，使用设备为常规设备，工艺环保，制得的产品纯度高、产率高、ee值高。

Description

用于制备奥利司他中间体的方法
技术领域
本发明属于本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体地，涉及一种(R)-β-羟基十四烷酸酯类化合物的生物合成方法。
背景技术
肥胖症治疗药物主要分为两大类，即中枢神经作用减肥药和非中枢神经作用减肥药。中枢神经作用减肥药的减肥效果明显，但是副作用较大，临床应用受到较大限制。其中芬氟拉明由于会引起肺动脉高压和肥厚性心脏瓣膜病变于1997年退市。西布曲明由于可能增加严重心血管风险于2010年被国家食品药品监督管理局宣布停止生产、销售和使用。绿卡色林(locaserin，商品名Belviq)2012年6月由FDA批准上市，尚存在增加心瓣膜病和不良心血管事件的风险，临床应用的安全性还有待进一步验证。奥利司他(Orlistat)是第一个非中枢神经作用的减肥药物，且是目前全球唯一一种OTC减肥药物。自1998年上市以来，因疗效确切、安全性高，已成为减肥治疗的首选药物。奥利司他直接作用于胃肠道脂肪酶，抑制脂肪吸收效果显著，其靶点高度专一，对其他胃肠道酶没有影响，且无需通过全身吸收而发挥药效，其体内系统药物暴露量很低，主要副作用为胃肠道反应，安全性优异。奥利司他全球销售已超过20年，目前已在超过145个国家获得批准上市，其优异的疗效和安全性已被大量的临床应用验证。
奥利司他的市场需求量大，而找寻高效的奥利司他及其中间物的合成方法是极其重要的。而(R)-β-羟基十四烷酸酯是合成药物奥利司他的重要中间体，该中间体的光学纯度极为关键。如何高效的获得光学纯的(R)-β-羟基十四烷酸酯呢？
如中国专利CN101538285B报道了一种利用制备的(R)-金属催化剂[(R)-Ru(MeOBIPHEP)Cl2]2·NEt3催化不对称氢化反应，但该化学催化反应需要在强酸且60bar高压条件下反应才能得到ee值>98.5％的产品。此类方法的不足之处在于：1)需要使用昂贵的(R)-配体与贵金属催化剂；2)催化剂需要现做现用，工艺稳定性难以保证；3)需要高压氢化设备；4)需要耐酸设备；5)反应控制得不好会影响ee值。针对上述缺点，我们用生物酶法进行系统的改进，解决奥利司他关键中间体的规模化生产。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种制备奥利司他中间体的生物酶，该生物酶能够有效地作用底物β-羰基十四烷酸酯。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
用于制备奥利司他中间体(终物)的生物酶，所述生物酶作用的底物为β-羰基十四烷酸酯(原料)，结构式如I所示；所述奥利司他中间体为(R)-β-羟基十四烷酸酯，结构式如II所示；结构式I中的R指含有1-3个碳原子的饱和烷基，结构式II中R指含有1-3个碳原子的饱和烷基。
Figure BDA0002358724830000021
所述生物酶为酮还原酶，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示及其同源性大于90％的氨基酸序列，来源于Singulisphaera acidiphila，NCBI数据库中的编码为WP_015245403.1，属于短链脱氢酶家族；和/或如SEQ ID N0:2所示及其同源性大于90％的氨基酸序列，来源于Sphingomonas echinoides，NCBI数据库中的编码为WP_010403640.1，属于短链脱氢酶家族。我们惊奇的发现，天然的或者经过基因/蛋白工程改造后的所述生物酶对所述底物有很好的催化作用，并得到光学纯度高的所述终物。当同一性/同源性≥90％的生物酶，我们希望视为等同侵权。
进一步，所述生物酶为酶粉和/或酶液和/或固定化酶。
进一步，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示及其同源性大于95％的氨基酸序列，和/或如SEQ ID N0:2所示及其同源性大于95％的氨基酸序列。当同一性/同源性≥95％的生物酶，我们希望视为等同侵权。
进一步，结构式I中的R为甲基、乙基、正丙基或异丙基中任一种，结构式II中的R为甲基、乙基、正丙基或异丙基中任一种。
本发明的目的之二在于提供一种组合物，该组合物中两者能形成酶和底物的协同关系，并得到如结构式II所示的产物。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
含有上面任一所述的生物酶和底物的组合物，所述底物为所述β-羰基十四烷酸酯。
进一步，所述的组合物中，所述生物酶与所述底物的重量比为1:1.1-150。
进一步，所述的组合物中，所述生物酶与所述底物的重量比为1:20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100、1：110、1：120、1：130、1：140和/或1：150。
本发明的目的之三在于提供一种用于制备(R)-β-羟基十四烷酸酯的反应体系，该反应体系无需借助高温高压严苛条件即可得到(R)-β-羟基十四烷酸酯。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
含有所述的生物酶的反应体系，所述反应体系由结构式如I所示的底物、所述生物酶、葡萄糖，葡萄糖脱氢酶、NADP+和缓冲液组成。
进一步，所述的反应体系的pH值为6.0-8.0。
进一步，所述的反应体系中所述缓冲溶液为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
进一步，所述的反应体系中所述底物的浓度为20g/L-150g/L。
进一步，所述的反应体系，其特征在于，所述NADP+的浓度为0.1-0.5g/L。
进一步，所述的反应体系，结构式如I所示的化合物与所述葡萄糖的摩尔比为1:(1.2-4)。
进一步，反应体系中，所述缓冲液的浓度为0.01-0.5mol/L。
进一步，所述反应体系的反应时间不超过15小时，得反应液。
本发明的目的之四在于提供奥利司他中间体的制备方法，该方法适用于工业化大规模生产。
(R)-β-羟基十四烷酸酯的生物合成方法，反应式如下所示：
Figure BDA0002358724830000041
化合物I和化合物II中R指含有1-3个碳原子的饱和烷基，优选地，为甲基、乙基、正丙基或异丙基；
所述的生物合成方法包括，将化合物I在酮还原酶、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶以及NADP+中反应，得到化合物II。
在本发明的实施方案中，所述的生物合成方法包括如下步骤：取化合物I置于缓冲溶液中，再向其中加入酮还原酶，葡萄糖，葡萄糖脱氢酶以及NADP+，得到混合溶液，所述混合溶液在20-40℃下搅拌反应，全程用NaOH水溶液调节pH，利用液相色谱监测反应的转化率，至转化率达99％以上反应结束，加入萃取溶剂萃取，合并有机相并减压浓缩，降温结晶，产物析出得到白色固体即化合物II，任选地，进一步用正己烷重结晶得到更高纯度的产品。
在本发明的一些实施方案中，所述NaOH水溶液的浓度可以是2M。
在本发明的一些实施方案中，所述缓冲溶液为pH值为6.0-8.0；优选地，所述缓冲溶液为PBS(即磷酸盐)缓冲液或Tris-HCl缓冲液；更优选地，所述缓冲液的浓度为0.01-0.5mol/L的PBS磷酸缓冲液或0.01-0.5mol/L的Tris-HCl缓冲液。
在本发明的实施方案中，在所述反应过程中pH范围控制在7.0-7.5。
在本发明的实施方案中，所述酮还原酶的氨基酸序列如本申请的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述酮还原酶的形式可以是酶粉、酶液、或固定化酶；所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如本申请的SEQ ID NO:3所示，所述葡萄糖脱氢酶的形式可以是酶粉、酶液、或固定化酶。
在本发明的实施方案中，所述NADP+是指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，即还原型辅酶II(NADPH)的氧化形式；在所述混合溶液中NADP+的浓度为0.1-0.5g/L。
在本发明的实施方案中，化合物I在所述混合溶液中的浓度为20g/L-150g/L。
在本发明的实施方案中，在所述混合溶液中化合物I与葡萄糖的摩尔比为1:(1.2-4)。
在本发明的一些实施方案中，优选地，所述反应的温度维持在35℃。
在本发明的一些实施方案中，所述萃取溶剂萃取两次；所述萃取溶剂为无水乙醇或乙酸乙酯。
对上述内容的技术方案进行概括，具体为：
基于所述的反应体系制备奥利司他中间体的方法，将所述反应体系在20-40℃条件下搅拌反应，得所述奥利司他中间体的反应液，所述奥利司他中间体的中间体为(R)-β-羟基十四烷酸酯，结构式如II所示。
进一步，所述的方法中，用NaOH水溶液作为pH值调节剂。
进一步，所述的方法中，所述反应时间不超过15小时。
进一步，所述的方法中，在所得反应液中用溶剂萃取所述奥利司他中间体。
进一步，所述的方法中，所述溶剂为无水乙醇或乙酸乙酯。
进一步，所述的方法中，所得萃取物进行减压浓缩，并降温结晶，白色结晶固体即化合物II。
所述的奥利司他中间体制备的奥利司他。
本发明的有益效果在于
本发明中使用的所述生物酶可以耐受高达150g/L的底物浓度，酶活性不受底物或产物的抑制作用。
本发明制备奥利司他中间体方法为生物酶法，该方法条件温和、设备要求简单，且操作简单，且该方法产生的三废量较少，没有重金属污染，对环境友好，有利于工业化生产。
本发明中的酶催化工艺转化率高达99％以上，手性ee值可达到99％以上，15个小时以内可以反应完全，产物浓度高，而且底物近乎完全转化可以简化对反应液后处理的步骤，只需要通过简单的萃取结晶步骤即可得到高纯度的产品，大幅降低了生产成本。
附图说明
图1为实施例5中测得转化率的HPLC图谱。
图2为实施例5中产品纯度HPLC图谱。
图3为实施例5中产品手性纯度HPLC图谱。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明的酮还原酶JR3789来源于Singulisphaera acidiphila，NCBI数据库中的编码为WP_015245403.1，属于短链脱氢酶家族，该酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，大小为249个氨基酸。
氨基酸序列SEQ ID NO:1:
“MGKLDNKVAVITGGNSGMGLATAQRFVSEGAYVFITGRRQAELDKAVDLIGKNVTGVQGDVSNLADLDRLYATVKEQKGRVDVLFANAGVGELAPLGSITEEQFDKVFNINVRGLLFTVQKALPLFQDGGSIILNASIASIKGMPAFSVYSASKAAVRSFARSWTVDLKGRKIRINTLSPGPIDTPILSGLASTEEELKQVKADLAAQVPLGRMGTSDEIANVALFLASDDSSYVTGIELFVDGGMAQI”
本发明的酮还原酶JR37150来源于Sphingomonas echinoides，NCBI数据库中的编码为WP_010403640.1，属于短链脱氢酶家族，该酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，大小为259个氨基酸。
氨基酸序列SEQ ID.NO:2:
“MARLAGKVALVTGGASVPGLGSATAIRFAQEGATVYLTDRDLAGAQAVAAQITAAGGRATALEHDVTSEADWDRVLAAIDAAEGRLDILVNNAGIAVLGPLEDVTAADFLRQNDVNLNSVFHGSKRALVMMRRPGDGGTARGGSIINISSVAGLIGVPGCGSYAASKGGVRLFSKVVALEGAADGVRCNSVHPGMIATNIQGVALEDNAANFDAVMALIPMVRMGEPEDIANMNLFLASDESRYITGAEFVVDGGMTAR”
本发明的葡萄糖脱氢酶GDH来源于Bacillus subtilis QB928，NCBI数据库中的编码为AFQ56330.1，属于短链脱氢酶家族，该脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，大小为263个氨基酸。
氨基酸序列SEQ ID NO:3:
“MYMYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAVVVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHEVIPWPLFVHYAASKGGIKLMTETLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTQYPSFQAGRG”
HPLC检测条件：OD-H色谱柱；流动相为正己烷∶异丙醇＝98∶2；流速1.0mL/min。检测仪器规格为：DAD1C,Sig＝210,4Ref＝360,100。
所述生物酶(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2)以及葡萄糖脱氢酶(SEQ ID NO:3)均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，且商品化。
实施例1
称取β-羰基十四烷酸甲酯1g、葡萄糖1.5g置于100mL的三口烧瓶中，再向其中加入50mL的浓度50mM的pH值为7.0的PBS缓冲液；将三口烧瓶放入恒温水浴锅，搅拌转速调至800rpm，温度35℃，然后分别加入10mg NADP+、25mg葡萄糖脱氢酶GDH酶粉(SEQ ID NO:3所示)，以及100mg酮还原酶JR3789酶粉(SEQ ID NO:1所示)，得到混合反应液，用2M浓度的NaOH溶液调节pH维持在7.0-7.5之间，温度维持在35℃，采用HPLC监测反应进程，9h反应结束，并测得转化率＞99％。
反应结束后先升温到60℃保温15min，然后降温到20～25℃，加入80mL乙酸乙酯萃取搅拌20min，过滤，滤液分层取有机相。水相再用50mL乙酸乙酯萃取一次，分层，取有机相。合并有机相，减压浓缩后，缓慢降温，析出产物，收得粗产品，纯度98.10％，光学纯度98.45％。粗产品加入2倍体积正己烷加热溶解，冷却结晶，收集晶体，室温晾干，收得白色结晶产品0.89g，测得纯度99.99％，ee值99.91％，总收率89％。
实施例2
称取β-羰基十四烷酸乙酯1g、葡萄糖1.5g置于100mL的三口烧瓶中，再向其中加入50mL的浓度50mM的pH值为7.0的PBS缓冲液；将三口烧瓶放入恒温水浴锅，搅拌转速调至900rpm，温度35℃，然后分别加入10mg NADP+、35mg葡萄糖脱氢酶GDH酶粉(SEQ ID NO:3所示)，以及150mg酮还原酶JR3789酶粉(SEQ ID NO:1所示)，得到混合反应液，用2M浓度的NaOH溶液调节pH维持在7.0-7.5之间，温度维持在35℃，采用HPLC监测反应进程，10h反应结束，并测得转化率＞99％。
反应结束后先升温到60℃保温15min，然后降温到20-25℃，加入80mL乙酸乙酯萃取搅拌20min，过滤，滤液分层取有机相。水相再用50mL乙酸乙酯萃取一次，分层，取有机相。合并有机相，减压浓缩后，缓慢降温，析出产物，收得白色产品0.84g，纯度98.42％，ee值98.15％，总收率84％。
实施例3
称取β-羰基十四烷酸甲酯5g、葡萄糖7.5g置于100mL的三口烧瓶中，再向其中加入50mL的浓度50mM的pH值为7.0的PBS缓冲液；将三口烧瓶放入恒温水浴锅，搅拌转速调至800rpm，温度35℃，然后分别加入50mg NADP+、125mg葡萄糖脱氢酶GDH酶粉(SEQ ID NO:3所示)，以及500mg酮还原酶JR3789酶粉(SEQ ID NO:1所示)，得到混合反应液，用2M浓度的NaOH溶液调节pH维持在7.0-7.5之间，温度维持在35℃，采用HPLC监测反应进程，13h反应结束，并测得转化率＞99％。
反应结束后先升温到60℃保温15min，然后降温到20-25℃，加入80mL乙酸乙酯萃取搅拌20min，过滤，滤液分层取有机相。水相再用50mL乙酸乙酯萃取一次，分层，取有机相。合并有机相，减压浓缩后，缓慢降温，析出产物，收得白色产品4.65g，纯度98.12％，ee值98.45％，总收率93％。
实施例4
称取β-羰基十四烷酸甲酯5g、葡萄糖7.5g置于100mL的三口烧瓶中，再向其中加入50mL的浓度50mM的pH值为7.0的PBS缓冲液；将三口烧瓶放入恒温水浴锅，搅拌转速调至800rpm，温度35℃，然后分别加入50mg NADP+、300mg葡萄糖脱氢酶GDH酶粉(SEQ ID NO:3所示)，以及800mg酮还原酶JR37150酶粉(SEQ ID NO:2所示)，得到混合反应液，用2M浓度的NaOH溶液调节pH维持在7.0-7.5之间，温度维持在35℃，采用HPLC监测反应进程，35h反应结束，并测得转化率＞99％。
反应结束后先升温到60℃保温15min，然后降温到20-25℃，加入100mL乙酸乙酯萃取搅拌20min，过滤，滤液分层取有机相。水相再用60mL乙酸乙酯萃取一次，分层，取有机相。合并有机相，减压浓缩后，缓慢降温，析出产物，收得白色产品4.55g，纯度98.62％，光学纯度99.66％，总收率91％。
实施例5
称取β-羰基十四烷酸甲酯7.5g、葡萄糖11.25g置于100mL的三口烧瓶中，再向其中加入50mL的浓度50mM的pH值为7.0的PBS缓冲液；将三口烧瓶放入恒温水浴锅，搅拌转速调至800rpm，温度35℃，然后分别加入150mg NADP+、200mg葡萄糖脱氢酶GDH酶粉(SEQ ID NO:3所示)，以及750mg酮还原酶JR3789酶粉(SEQ ID NO:1所示)，得到混合反应液，用2M浓度的NaOH溶液调节pH维持在7.0-7.5之间，温度维持在35℃，采用HPLC监测反应进程，15h反应结束，并测得转化率＞99％。检测结果如下表1，HPLC图谱如图1。
反应结束后先升温到60℃保温15min，然后降温到20-25℃，加入100mL乙酸乙酯萃取搅拌20min，过滤，滤液分层取有机相。水相再用80mL乙酸乙酯萃取一次，分层，取有机相。合并有机相，减压浓缩后，缓慢降温，析出产物，收得粗产品，纯度99.60％，ee值98.68％。粗产品加入2倍体积正己烷加热溶解，冷却结晶，过滤，室温晾干，收得白色晶体产品6.53g，测得纯度99.99％，ee值99.86％，总收率87％。检测到的产品的纯度数据如表2，HPLC图谱如图2，产品的手性纯度数据如表3，HPLC图谱如图3。
表1测得的转化率的数据表
RT(min) Type Width(min) Area Height Area％
12.431 BB 1.86 3001.36 142.52 99.06
15.684 BBA 0.79 28.40 1.48 0.94
Sum 3029.76
表2测得的产品纯度的数据表
RT(min) Type Width(min) Area Height Area％
12.410 BB 1.36 3062.49 145.21 100.00
Sum 3062.49
表3测得的产品手性纯度数据表
RT(min) Type Width(min) Area Height Area％
6.189 BBA 0.52 2944.36 298.07 99.93
7.639 BB 0.30 2.00 0.23 0.07
Sum 2946.336
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 重庆植恩药业有限公司
<120> 用于制备奥利司他中间体的方法
<130> 2020.1.6
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 249
<212> PRT
<213> Singulisphaera acidiphila
<400> 1
Met Gly Lys Leu Asp Asn Lys Val Ala Val Ile Thr Gly Gly Asn Ser
1 5 10 15
Gly Met Gly Leu Ala Thr Ala Gln Arg Phe Val Ser Glu Gly Ala Tyr
20 25 30
Val Phe Ile Thr Gly Arg Arg Gln Ala Glu Leu Asp Lys Ala Val Asp
35 40 45
Leu Ile Gly Lys Asn Val Thr Gly Val Gln Gly Asp Val Ser Asn Leu
50 55 60
Ala Asp Leu Asp Arg Leu Tyr Ala Thr Val Lys Glu Gln Lys Gly Arg
65 70 75 80
Val Asp Val Leu Phe Ala Asn Ala Gly Val Gly Glu Leu Ala Pro Leu
85 90 95
Gly Ser Ile Thr Glu Glu Gln Phe Asp Lys Val Phe Asn Ile Asn Val
100 105 110
Arg Gly Leu Leu Phe Thr Val Gln Lys Ala Leu Pro Leu Phe Gln Asp
115 120 125
Gly Gly Ser Ile Ile Leu Asn Ala Ser Ile Ala Ser Ile Lys Gly Met
130 135 140
Pro Ala Phe Ser Val Tyr Ser Ala Ser Lys Ala Ala Val Arg Ser Phe
145 150 155 160
Ala Arg Ser Trp Thr Val Asp Leu Lys Gly Arg Lys Ile Arg Ile Asn
165 170 175
Thr Leu Ser Pro Gly Pro Ile Asp Thr Pro Ile Leu Ser Gly Leu Ala
180 185 190
Ser Thr Glu Glu Glu Leu Lys Gln Val Lys Ala Asp Leu Ala Ala Gln
195 200 205
Val Pro Leu Gly Arg Met Gly Thr Ser Asp Glu Ile Ala Asn Val Ala
210 215 220
Leu Phe Leu Ala Ser Asp Asp Ser Ser Tyr Val Thr Gly Ile Glu Leu
225 230 235 240
Phe Val Asp Gly Gly Met Ala Gln Ile
245
<210> 2
<211> 259
<212> PRT
<213> Sphingomonas echinoides
<400> 2
Met Ala Arg Leu Ala Gly Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Gly Ala Ser
1 5 10 15
Val Pro Gly Leu Gly Ser Ala Thr Ala Ile Arg Phe Ala Gln Glu Gly
20 25 30
Ala Thr Val Tyr Leu Thr Asp Arg Asp Leu Ala Gly Ala Gln Ala Val
35 40 45
Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Gly Gly Arg Ala Thr Ala Leu Glu His
50 55 60
Asp Val Thr Ser Glu Ala Asp Trp Asp Arg Val Leu Ala Ala Ile Asp
65 70 75 80
Ala Ala Glu Gly Arg Leu Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala
85 90 95
Val Leu Gly Pro Leu Glu Asp Val Thr Ala Ala Asp Phe Leu Arg Gln
100 105 110
Asn Asp Val Asn Leu Asn Ser Val Phe His Gly Ser Lys Arg Ala Leu
115 120 125
Val Met Met Arg Arg Pro Gly Asp Gly Gly Thr Ala Arg Gly Gly Ser
130 135 140
Ile Ile Asn Ile Ser Ser Val Ala Gly Leu Ile Gly Val Pro Gly Cys
145 150 155 160
Gly Ser Tyr Ala Ala Ser Lys Gly Gly Val Arg Leu Phe Ser Lys Val
165 170 175
Val Ala Leu Glu Gly Ala Ala Asp Gly Val Arg Cys Asn Ser Val His
180 185 190
Pro Gly Met Ile Ala Thr Asn Ile Gln Gly Val Ala Leu Glu Asp Asn
195 200 205
Ala Ala Asn Phe Asp Ala Val Met Ala Leu Ile Pro Met Val Arg Met
210 215 220
Gly Glu Pro Glu Asp Ile Ala Asn Met Asn Leu Phe Leu Ala Ser Asp
225 230 235 240
Glu Ser Arg Tyr Ile Thr Gly Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Met
245 250 255
Thr Ala Arg
<210> 3
<211> 263
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 3
Met Tyr Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly
1 5 10 15
Ala Ala Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu
20 25 30
Gln Ala Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn
35 40 45
Glu Val Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val
50 55 60
Gln Gly Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ile Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly
85 90 95
Leu Glu Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp
100 105 110
Lys Val Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu
115 120 125
Ala Ile Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn
130 135 140
Met Ser Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr
145 150 155 160
Ala Ala Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu
165 170 175
Glu Tyr Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala
180 185 190
Ile Asn Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys
195 200 205
Ala Asp Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu
210 215 220
Glu Ile Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr
225 230 235 240
Val Thr Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro
245 250 255
Ser Phe Gln Ala Gly Arg Gly
260

Claims (18)

1.一种生物酶在制备奥利司他中间体中的用途，其特征在于，所述生物酶作用的底物为β-羰基十四烷酸酯，结构式如I所示,所述奥利司他中间体为(R)-β-羟基十四烷酸酯，结构式如II所示,结构式I中的R指含有1-3个碳原子的饱和烷基，结构式II中R指含有1-3个碳原子的饱和烷基；结构式I中的R为甲基、乙基、正丙基或异丙基中任一种，结构式II中的R为甲基、乙基、正丙基或异丙基中任一种；
Figure FDA0003165417270000011
所述生物酶为酮还原酶，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述生物酶为酶粉和/或酶液和/或固定化酶。
3.一种含有生物酶和底物的组合物，其特征在于，所述底物为β-羰基十四烷酸酯，结构式如I所示；所述生物酶为酮还原酶，所述生物酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或如SEQ IDNO:2所示；所述生物酶与所述底物的重量比为1:1.1-150；结构式I中的R为甲基、乙基、正丙基或异丙基中任一种；
Figure FDA0003165417270000021
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述生物酶与所述底物的重量比为1:20、1：30、1：40、1：50、1：60、1：70、1：80、1：90、1：100、1：110、1：120、1：130、1：140或1：150。
5.含有权利要求3-4任一所述的组合物的反应体系，其特征在于，所述反应体系由I所示的底物、所述生物酶、葡萄糖，葡萄糖脱氢酶、NADP+和缓冲液组成，所述葡萄糖脱氢酶的序列如SEQ ID NO:3所示；结构式I中的R为甲基、乙基、正丙基或异丙基中任一种，
Figure FDA0003165417270000022
6.根据权利要求5所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系的pH值为6.0-8.0。
7.根据权利要求5所述的反应体系，其特征在于，所述缓冲溶液为PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
8.根据权利要求5所述的反应体系，其特征在于，所述底物的浓度为20g/L-150g/L。
9.根据权利要求5所述的反应体系，其特征在于，所述NADP+的浓度为0.1-0.5g/L。
10.根据权利要求5所述的反应体系，其特征在于，化合物I与所述葡萄糖的摩尔比为1:1.2-4。
11.根据权利要求5所述的反应体系，其特征在于，所述缓冲液的浓度为0.01-0.5mol/L。
12.根据权利要求5所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系的反应时间不超过15小时，得反应液。
13.基于权利要求5-12中任一项所述的反应体系制备奥利司他中间体的方法，其特征在于，将所述反应体系在20-40℃条件下搅拌反应，得所述奥利司他中间体的反应液，所述奥利司他中间体的中间体为(R)-β-羟基十四烷酸酯，结构式如II所示，结构式II中的R为甲基、乙基、正丙基或异丙基中任一种，
Figure FDA0003165417270000031
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，用NaOH水溶液作为pH值调节剂。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述反应时间不超过15小时。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，在所得反应液中用溶剂萃取所述奥利司他中间体。
17.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述溶剂为无水乙醇或乙酸乙酯。
18.根据权利要求17所述的方法，所得萃取物进行减压浓缩，并降温结晶，白色结晶固体即化合物II，结构式II中的R为甲基、乙基、正丙基或异丙基中任一种，
Figure FDA0003165417270000041
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109097344B (zh) * 2018-08-07 2021-10-22 浙江海洋大学 一种海洋新鞘脂菌短链醇脱氢酶突变体及其应用
CN109022473B (zh) * 2018-08-13 2021-09-17 浙江海洋大学 一种酶法制备奥利司他中间体的方法
CN111154736B (zh) * 2020-01-07 2021-09-14 重庆植恩药业有限公司 用于制备奥利司他中间体的方法
CN114854704B (zh) * 2021-01-20 2023-10-10 合肥大禹制药有限公司 一种用于制备奥利司他中间体的生物酶及其应用
CN115851642A (zh) * 2022-09-14 2023-03-28 杭州鑫富科技有限公司 一种酮基泛解酸内酯还原酶及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101348475A (zh) * 2007-07-20 2009-01-21 重庆人本药物研究院 一种新的奥利司他合成方法、中间体化合物及其制备方法
US20090124681A1 (en) * 2007-10-31 2009-05-14 Burnham Institute For Medical Research Beta-lactone compounds
CN102976940A (zh) * 2012-11-27 2013-03-20 山东师范大学 合成(R)-β-羟基十四烷酸酯的方法
CN109022473A (zh) * 2018-08-13 2018-12-18 浙江海洋大学 一种酶法制备奥利司他中间体的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1931633A2 (en) * 2005-09-05 2008-06-18 Ranbaxy Laboratories Limited Derivatives of 3-azabicyclo[3.1.0]hexane as dipeptidyl peptidase-iv inhibitors
CN101538285B (zh) 2008-03-21 2011-12-28 重庆植恩药业有限公司 钌-手性双膦配体络合物及制备方法以及在β-羰基十四烷酸甲酯的催化氢化反应中的应用
CN102634546B (zh) * 2012-03-16 2013-10-16 苏州汉酶生物技术有限公司 一种手性β-羟基酯类化合物的酶催化合成方法
CN107058251B (zh) * 2017-04-19 2020-10-09 浙江工业大学 重组羰基还原酶突变体、基因、载体、工程菌及其应用
CN108484536B (zh) * 2018-05-22 2021-02-02 东莞理工学院 一种减肥药奥利司他中间体的合成方法
CN111154736B (zh) * 2020-01-07 2021-09-14 重庆植恩药业有限公司 用于制备奥利司他中间体的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101348475A (zh) * 2007-07-20 2009-01-21 重庆人本药物研究院 一种新的奥利司他合成方法、中间体化合物及其制备方法
US20090124681A1 (en) * 2007-10-31 2009-05-14 Burnham Institute For Medical Research Beta-lactone compounds
CN102976940A (zh) * 2012-11-27 2013-03-20 山东师范大学 合成(R)-β-羟基十四烷酸酯的方法
CN109022473A (zh) * 2018-08-13 2018-12-18 浙江海洋大学 一种酶法制备奥利司他中间体的方法

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"AFQ56330.1";匿名;《GenBank》;20140731;"Region"和"ORIGIN"部分 *
"WP_010403640.1";匿名;《GenBank》;20190618;"Region"和"ORIGIN" *
"WP_015245403.1";匿名;《GenBank》;20190620;"Region"和"ORIGIN"部分 *
"WP_074317782.1";匿名;《GenBank》;20190618;"Region"和"ORIGIN"部分 *
"奥利司他中间体酯环酮的制备";孙若兰等;《上海医药》;20041231;第25卷(第6期);第266-267页 *
"奥利司他合成路线图解";卞红平等;《中国医药工业杂志》;20061231;第37卷(第10期);第716-720页 *
匿名."WP_010403640.1".《GenBank》.2019,"Region"和"ORIGIN". *
匿名."WP_015245403.1".《GenBank》.2019,"Region"和"ORIGIN"部分. *

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