CN105087533B - 一种青霉素g酰化酶的突变体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种青霉素g酰化酶的突变体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种青霉素G酰化酶的突变体及其制备方法和应用。通过非理性及半理性设计的酶工程改造技术对大肠埃希氏菌ATCC 11105来源的青霉素G酰化酶进行突变，获得了一种反应活性更高，反应速率更快，转化率更好，青霉素G浓度耐受性更强，底物残留更少，苯乙酸浓度耐受性更高的PGA突变体，同时对该突变体进行了重组表达、菌种构建、发酵培养以及固定化和应用制备6‑APA。本发明获得的PGA‑6突变体活力提高了102倍，底物青霉素G耐受浓度提高到30％，苯乙酸耐受浓度提高到20mmol/L。同时，固定化突变体PGA‑6应用于pH8.0，25℃条件下裂解25％浓度的青霉素G制备6‑APA的反应时间缩短到55分钟，底物转化率在98％以上，且连续使用600批次以上，活力无明显的损失，具有很好的操作稳定性。

Description

一种青霉素G酰化酶的突变体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程及酶工程领域，具体内容涉及青霉素G酰化酶的突变体及其制备方法和应用。
背景技术
青霉素是世界上第一只应用于临床的抗感染类药物。长期以来，青霉素在抗生素市场上长盛不衰，已成为全球广泛应用的一线抗菌药物。6-氨基青霉烷酸(6-amino-penicillanic acid，6-APA)是合成氨苄西林和阿莫西林的一种重要中间体。工业上生产6-APA的方法有化学裂解法和酶法两种方法，其中化学裂解法由于成本较高、工艺步骤多、三废严重和条件苛刻等缺点已逐步被淘汰；而酶法具有成本较低、工艺简单、绿色无污染及反应条件温和等优点，因此日益受到重视。
当前，β-内酰胺类抗生素工业生产6-APA主要是利用青霉素G酰化酶(penicillinG acylase，PGA，EC 3.5.1.11)水解青霉素来获得，其反应原理是：青霉素G酰化酶将青霉素G水解为6-APA和苯乙酸，具体反应如下所示。
青霉素G酰化酶来源十分广泛，许多微生物来源的PGA被国内外科研工作者筛选、克隆并表达出其编码的基因，如中国专利CN1464055中，姜卫红、赵国屏等从黄杆菌(Flavobacterium sp.650)中克隆并表达出一种新型青霉素G酰化酶，在生成6-APA实验中测定其比活力达到48.5U/mg；中国专利CN1544635中，袁中一、杨志建等从粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)中克隆出AfPGA基因并进行重组表达，发酵活性达到3500U/L；中国专利CN103184182中，何冰芳、孔佳佳等筛选到一株产青霉素G酰化酶的木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)K18，其发酵活性达到200U/L；欧洲专利EP2109672中，发明人从Achromobacter sp.CCM 4824中克隆出长为2646bp编码青霉素G酰化酶基因，并成功的在大肠杆菌中进行了重组表达等。
随着基因工程和蛋白工程技术的发展，对青霉素G酰化酶的突变改造有很多报道，但是它们的改造目的都集中在提高PGA的合成活力以及合成水解比(S/H)，而对青霉素G的催化水解活性的改造提高鲜有报道。到目前为止，仅有一篇文献对青霉素G酰化酶水解活性进行改造的报道，即Huseyin Balci，Merve Tuzlakoglu Ozturk等(Applied Microbiologyand Biotechnology，Volume 98，Issue 10，pp 4467-4477)利用易错PCR技术结合高通量筛选方法，对大肠埃希氏菌ATCC 11105来源的PGA进行突变，其突变体M2234仅有一个氨基酸(K297I)发生改变，其比活力就比野生型PGA提高了4倍同时该突变体在pH10.0的条件下表现出更好的稳定性。
目前，在原料药企业应用酶法生产6-APA的过程中发现，由于青霉素G酰化酶催化活性低、苯乙酸抑制强、反应时间长、底物抑制等缺点，导致6-APA产量不能迅速提升，因此开发高活性，高反应速率，高转化率，高浓度底物耐受性，高浓度苯乙酸耐受性，低底物残留的“五高一低”的新型青霉素G酰化酶已迫在眉睫。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种高活性青霉素G酰化酶突变体，其在SEQ ID NO.2的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上，有如下六个位点中的一个点突变或多点组合突变：第748位氨基酸由D突变为V，第209位氨基酸由T突变为S，第179位氨基酸由L突变为F，第206位氨基酸由N突变为D，第506位氨基酸由N突变为D，第602位氨基酸由T突变为Q。
所述的青霉素G酰化酶突变体，优选在SEQ ID NO.2的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上对第748位和/或第209位上的氨基酸进行取代。第748位和第209位上的氨基酸同时进行取代得到的PGA-2更好。此外，第748位氨基酸还能由D突变为E。
所述的青霉素G酰化酶突变体，进一步优选在PGA-2的氨基酸序列基础上对第179位和/或第206位上的氨基酸进行取代得到，PGA-2是在SEQ ID NO.2的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上对第748位和第209位上的氨基酸同时进行取代得到，其由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列组成。第179位和第206位上的氨基酸同时进行取代得到的PGA-4更好。此外，第206位氨基酸还能由N突变为Q或K，优选第206位氨基酸由N突变为K。
所述的青霉素G酰化酶突变体，更进一步优选在PGA-4的氨基酸序列基础上对第506位和/或第602位上的氨基酸进行取代得到，PGA-4是在SEQ ID NO.2的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上对第748位、第209位、第179位和第206位上的氨基酸同时进行取代得到，其是由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列组成。第602位氨基酸还能由T突变为D或G，优选第602位氨基酸由T突变为G。
所述的青霉素G酰化酶突变体，最优选是在SEQ ID NO.2的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上，有如下六个位点组合突变：第748位氨基酸由D突变为V，第209位氨基酸由T突变为S，第179位氨基酸由L突变为F，第206位氨基酸由N突变为D，第506位氨基酸由N突变为D，第602位氨基酸由T突变为Q，其是由SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列组成。
本发明的第二个目的是提供上述的青霉素G酰化酶突变体的核苷酸序列，为以下的任一种：
1)上述青霉素G酰化酶突变体中的任一种的核苷酸序列；
2)在严格条件下与1)中任一项限定的核苷酸序列杂交且编码具有青霉素G酰化酶活性的蛋白质的核苷酸序列；
3)与1)或2)中任一项限定的基因序列具有90％以上的同源性且编码具有青霉素G酰化酶活性的蛋白质的核苷酸序列。
本发明的第三个目的是提供上述的青霉素G酰化酶的突变体的应用，用于将青霉素G水解为6-APA和苯乙酸。
本发明的第四个目的是提供上述的突变型青霉素G酰化酶的制备方法，包括以下步骤：
a)将具有序列表中SEQ ID NO.1的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶核苷酸序列进行随机突变、饱和突变、迭代饱和突变等步骤得到编码上述任一种青霉素G酰化酶的突变体的基因序列；
b)将突变体基因序列插入到质粒中得到表达载体；
c)将表达载体转化进入菌株中得到重组基因工程菌；
d)将重组基因工程菌用乳糖诱导进行发酵得到青霉素G酰化酶。
本发明涉及的突变型青霉素G酰化酶的制备方法，进一步地，还包括纯化步骤，纯化步骤为将产青霉素G酰化酶重组菌破碎、离心、收集后通过固定化金属螯合亲和层析法进行纯化得到青霉素G酰化酶纯酶。
进一步地，还包括酶的固定化步骤，固定化步骤为将上述纯化后的酶液，用磷酸盐缓冲液(pH 8.0、0.1mol/L)溶解，然后加入50g经活化处理后的载体，于25℃、120rpm条件下低速搅拌固定化48h，将所得固定化酶用去离子水反复清洗3～5遍，真空滤干后即得固定化酶终产品。
进一步地，固定化载体为环氧基载体ECEP或氨基载体ECHA/S。
进一步地，质粒为pET30a(+)，菌株为E.coli BL21(DE3)。
本发明的另一方面还提供了一种由固定化青霉素G酰化酶裂解青霉素G制备6-APA的方法，其转化条件为：底物青霉素G浓度(W/V)为8％～30％，优选为15％～30％，更优选为25％，转化温度为20～25℃，pH为8.0～8.2。
本发明优势：
本发明通过随机突变、饱和突变、迭代饱和突变等非理性及半理性设计的酶工程改造技术对大肠埃希氏菌ATCC 11105来源的PGA进行突变，获得了反应活性更高，反应速率更快，转化率更好，青霉素G浓度耐受性更强，底物残留更少，苯乙酸浓度耐受性进一步提高的PGA突变体，可以更有效，快速地将青霉素G转化为6-APA。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明优选实施例中的青霉素G酰化酶突变体的制备流程图；
图2是本发明优选实施例的SDS-PAGE图谱；
图3是本发明实施例3的PGA裂解青霉素G制备6-APA的HPLC图，具体为突变型PGA-6固定化酶制备6-APA的HPLC图，其中青霉素G的转化率可达98％以上。
具体实施方式
实施例
1、下述实施例中所使用的方法如无特殊说明均为常规方法，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。引物、全基因合成以及序列测序均为泰和永昌(长沙)生物技术有限公司完成。大肠杆菌宿主菌为E.coli BL21(DE3)购于Merck公司，大肠杆菌宿主菌还可以是E.coli BL21(DE3)plys，购于天根公司，原核表达载体pET30a(+)购于Merck公司。DNA内切酶Hind III、Xho I和Dpn I均购于Fermentas公司，T4DNA连接酶购于Takara公司。全自动电位滴定仪购于瑞士万通公司，型号为8系列购于梅特勒-托利多公司，其余材料均为市售。同时，本发明中的氨基酸无特别说明外均用其缩写或代号标明(氨基酸中英文名称及其缩写和代号见表1)。
表1氨基酸中英文名称及其缩写和代号
本发明人根据GeneBank提供的大肠杆菌ATCC11105青霉素G酰化酶的核苷酸及氨基酸序列(GeneBank登录号：X04114.1)，通过人工剪切其前26个氨基酸前导信号肽，得到一个完整胞内表达PGA的成熟肽的基因，并对该优化后的基因进行全基因合成(大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶核苷酸序列
SEQ ID NO：1和大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列SEQ ID NO：2)。
2、青霉素G酰化酶酶活力的检测
(1)滴定法
原理：青霉素G在青霉素G酰化酶作用下转化成6-APA和苯乙酸，用NaOH溶液中和苯乙酸，根据NaOH的消耗量计算青霉素G酰化酶活力。
具体操作方法：在1.5ml离心管中预先加入玻璃珠，当玻璃珠达到离心管刻度1.0ml处停止，精确量取0.5ml实施例1～3中的青霉素G酰化酶于离心管中，在振荡频率为1500/min的MS3振荡器上振荡10min后，将样品连同玻璃珠一起，加至已装有预热至25℃的30ml的1％青霉素G钾盐底物溶液的反应器中，调节水浴恒温25℃，用0.1mol/L的氢氧化钠滴定液调pH至8.00时开始计时，保持pH为8.00的条件搅拌反应5分钟，用全自动电位滴定仪检测氢氧化钠滴定液的消耗量。滴定法中酶活力的计算公式为：
其中VNaOH：氢氧化钠滴定液的消耗量，ml。
CNaOH：氢氧化钠滴定液的摩尔浓度为0.1mol/L。
T：反应时间，min。
V样：酶液样品体积，ml。
W样：固定化酶样品重量，g。
1000：由mmol转为μmol。
酶活力单位(U)定义为：在25℃，pH8.0条件下，在1min内催化底物青霉素G生成1μmol苯乙酸时所需的酶量为1U。
(2)高效液相色谱(HPLC)法
精确量取20μl的实施例1～3中的青霉素G酰化酶进行离心过滤取上清液。将上清液与含有1.5％(W/V)的青霉素G的0.01mol/L、pH8.00磷酸盐缓冲液混合至终体积200μl，得到反应初始时体系。将反应初始时体系在25℃反应10min后，加入200μl的40％的冰醋酸终止反应，得反应结束时体系。将反应初始时体系和反应结束时体系分别进行HPLC分析。
溶样相配制：称取1.542g乙酸铵加950ml超纯水溶解后，用3mol/L的氨水调pH至7.0，0.45μm水系滤膜过滤，混合均匀后备用。
流动相配制：称取1.542g乙酸铵加965ml超纯水溶解后，用3mol/L的氨水调pH至7.0，0.45μm水系滤膜过滤，加入50ml色谱纯的乙腈，混合均匀后脱气30min。
检测波长：254nm。
柱子类型：BDS C18 200mm×4.6mm。
总流速：1.0ml/min。
进样量：20μl。
酶活力单位(U)定义为：在25℃，pH8.0条件下，在1min内催化底物青霉素G生成1μmol产物6-APA的所需的酶量为1U。
实施例1：野生型PGA基因的克隆、表达及重组蛋白的纯化和固定化
1-1野生型PGA基因的获得
本发明人根据GeneBank提供的大肠杆菌ATCC11105青霉素G酰化酶的氨基酸及核苷酸序列(GeneBank登录号：X04114.1)，通过人工剪切其前26个氨基酸前导信号肽，得到一个完整胞内表达PGA的成熟肽(SEQ ID NO：2)，并对该优化后的氨基酸进行全基因合成(SEQID NO：1)。
1-2野生型PGA原核表达载体的构建
根据原核表达载体pET30a(+)与全基因合成的野生型PGA基因设计引物，具体引物序列如下：
P1：5’-CCCAAGCTTATGGAGCAGTCGTCAAGT-3’(其中下划线中的碱基为Hind III酶切位点)
P2：5’-CCGCTCGAGTTATCTCTGAACGTGCAA-3’(其中下划线中的碱基为Xho I酶切位点)
以全基因合成的野生型PGA为模板，用P1和P2引物通过PCR的方式使该PGA基因前后两端分别添加Hind III和Xho I酶切位点。其中PCR所用的KOD-Plus-Neo高保真DNA聚合酶及相应PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs溶液均购买于TOYOBO公司，并参照其说明书进行PCR反应体系的配置及PCR反应条件的设定。
将经PCR得到的产物进行电泳并切胶回收纯化，将纯化后的PCR产物与原核表达载体pET30a(+)分别进行Hind III和Xho I双酶切，酶切3小时分别进行切胶回收，将回收产物按照产物：载体为3：1的摩尔比例进行混合，加入T4DNA ligase于16℃过夜连接。将连接产物5μl转入50μl的DH5α感受态中，涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基平板于37℃中进行过夜培养。挑选单菌落进行菌落PCR验证，将阳性克隆接种于含50μg/ml卡那霉素的LB培养基过夜培养，提质粒，进行Hind III和Xho I双酶切验证，将大小正确的克隆子送往测序公司进行DNA测序验证，序列比对正确后，将该克隆命名为PGA-WT，这样就得到了在N端带有一个His-tag的质粒，其表达的野生型PGA蛋白带有一个组氨酸标签，可用固定化金属螯合亲和层析(IMAC)的方式进行蛋白纯化。
1-3、重组野生型PGA基因工程菌的构建
通过化学转化的方法将PGA-WT基因转化入E.coli BL21(DE3)或者E.coli BL21(DE3)plys感受态细胞，转化细胞涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基平板于37℃中进行过夜培养即获得重组野生型PGA基因工程菌。
1-4、重组野生型PGA蛋白的分离纯化及固定化
(1)重组野生型PGA蛋白的分离纯化
由于在表达载体构建过程中引入了原核表达载体pET30a(+)中的C端的6个His，因此，本发明人利用该组氨酸标签进行固定化金属螯合亲和层析(IMAC)来纯化重组蛋白，具体方法如下。
取100mL过夜诱导后的野生型PGA发酵液，离心后弃上清收集菌体(10 000rpm、4℃、10min)，用磷酸盐缓冲液(pH 8.0、0.1mol/L)反复洗涤菌体两次，离心收集菌体，浓缩5倍重悬于20ml磷酸盐缓冲液(pH 8.0、0.1mol/L)中。将上述处理后的菌液置于冰水中进行超声破碎直至澄清，其中的超声破碎条件为：工作2s，间隔5s。将上述破碎后的裂解液置于低温高速离心机中离心(12,000rpm、4℃、20min)，收集上清，得到重组野生型PGA蛋白，将该粗重组蛋白进样到已活化并结合Ni+的IDA树脂上，用梯度浓度的咪唑进行梯度洗脱，利用蛋白层析系统(Bio-Rad)进行实时监控，当计算机中出现稳定的蛋白峰时，开始收集直到该峰消失为止。
重组酶蛋白经过分离纯化后密封于无菌袋中放置于4℃冰箱以备后续实验，同时对该纯化后酶蛋白用SDS-PAGE蛋白电泳进行纯度分析，结果见图2。由图可知，该重组青霉素G酰化酶由α、β两个亚基组成，大小分别约为24kD和63kD。
(2)重组野生型PGA蛋白的固定化
A、固定化载体的活化
准确量取60％的戊二醛30ml、磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O)4.76g溶解于600ml去离子水中，最后用去离子水定容至1000ml，同时用磷酸溶液调节其PH为8.0，灭菌后备用；将环氧基载体ECEP或氨基载体ECHA/S(意大利Resindion S.r.l公司)250g投入到上述溶液中，并于25℃低速搅拌活化2h，过滤收集载体，并用无菌去离子水反复冲洗2～3次后真空滤干备用。
B、酶的固定化
取一定量上述纯化后的酶液，用磷酸盐缓冲液(pH 8.0、0.1mol/L)溶解，然后加入50g经活化处理后的载体，于25℃、120rpm条件下低速搅拌固定化48h，将所得固定化酶用去离子水反复清洗3～5遍，真空滤干后即得固定化酶终产品。精确称取1g上述固定化酶进行活力测定，以ECEP和ECHA/S为载体的固定化酶酶活分别为122U/g和101U/g，环氧基载体ECEP固定化酶活力明显高于氨基载体ECHA/S固定化酶，因此选择环氧基载体ECEP作为青霉素G酰化酶的固定化载体。
实施例2：PGA突变体的制备
2-1制备高活性的PGA突变体
2-1-1PGA随机突变体文库的构建
为了提高野生型PGA对青霉素G的活力，本发明人以PGA-WT为模板，其中引物为T7通用引物(SEQ ID NO：23和24)，通过易错PCR的方法构建一个随机突变体文库，并通过调整易错PCR反应体系中Mg2+和Mn2+浓度以及dCTP和dTTP寡核苷酸浓度，使该突变体文库的碱基错配率仅为千分之二，即保证一个突变体仅有1到2个氨基酸发生突变。构建突变体文库的具体过程如下。
易错PCR反应体系：
易错PCR反应条件是：先95℃预变性5min；然后94℃变性30s，56℃退火1min，72℃1.5min，共25个循环；最后72℃延伸10min。
将上述得到的易错PCR产物进行电泳并切胶回收纯化，将纯化后的产物与原核表达载体pET30a(+)分别进行Hind III和Xho I双酶切，酶切3小时分别进行切胶回收，将回收产物按照产物：载体为3：1的摩尔比例进行混合，加入T4DNA ligase于16℃过夜连接。第二天，按照实施例1-3的方法构建工程菌，即可得到一个库容量大的随机突变体文库。
2-1-2突变体文库的高通量筛选方法
用高温灭菌后的牙签，小心挑取突变体文库中的单菌落接种于装有LB培养基的96孔细胞培养板中，其中LB培养基体积为200μL/孔且含有50μg/ml的卡那霉素，于37℃，250rmp的恒温摇床中培养8个小时，1％的乳糖，25℃，250rmp的恒温摇床中诱导培养8小时。诱导完毕后，将96孔细胞培养板放入-86℃的超低温冰箱中冻融2个小时，取出放置于室温中半个小时，后置于96孔细胞培养板离心机中于4,000rmp，4℃离心20分钟。
取10μL上清加入含有100μL浓度(W/V)为1％青霉素G的96孔酶标板中，放置于25℃的恒温恒湿培养箱中反应2个小时，加入终止液160μL，后置于96孔细胞培养板离心机中于4,000rmp，4℃离心20分钟。
取50μL上清液加入含有100μL显色液的酶标板中进行显色3分钟，后置于酶标仪中，于波长405nm处测定反应混合液的吸光度，读取数值。
终止液：先分别配置100mmol/L NaOH和40％醋酸，按照1:2的比例混合。
显色液:0.5％(W/V)的对二甲氨基苯甲醛(PDAB)溶液。
从上述突变子文库中筛选了约20000个克隆，得到10个颜色变化明显且数值比野生型PGA高的突变子。接着对这10个突变子进行复筛，具体过程为：将这10个突变子接种于含100ml LB培养基的500ml摇瓶中进行发酵及诱导，并通过滴定法测定活力，得到2个比对照活力高6倍和4倍的克隆子，分别命名为PGA-1A和PGA-1B，经过测序结果显示PGA-1A在第748位点氨基酸发生了改变，由D突变成了E，而PGA-1B在第209位点氨基酸发生了改变，由T突变成了S。
2-1-3高活性PGA突变体的制备
由于PGA-1A和PGA-1B都是随机突变产生的，该氨基酸的改变不一定是最适合氨基酸，因此，本发明人以野生型PGA为模板，对748和209这2个氨基酸位点分别进行定点饱和突变，具体方法如下。
748点饱和突变引物
P3：ACAGAAAACNNKATGATTGTTTTCTCACCAACG(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T 或C或G，K是G或T)
P4：AACAATCATMNNGTTTTCTGTTCCACGGTTTTG(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T 或C或G，M是A或C)
209点饱和突变引物
P5：AACTCGCAANNKGCAGCTCTGTTGCCACGCTAC(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T 或C或G，K是G或T)
P6：CAGAGCTGCMNNTTGCGAGTTTTGCTGATTAAA(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T 或C或G，M是A或C)
以野生型PGA为模板，分别以P3/P4和P5/P6为突变引物，运用全质粒PCR技术对这2个点进行定点饱和突变，其中PCR所用的KOD-Plus-Neo高保真DNA聚合酶及相应PCR缓冲液、Mg2+、dNTPs溶液均购买于TOYOBO公司，并参照其说明书进行PCR反应体系的配置及PCR反应条件的设定。
按照上述实施例2-1-2的方法，对突变体文库各筛选了200个克隆子，其中第748位点突变体酶活为8.4U/ml，第209位点突变体酶活为6U/ml，并对这2个突变体分别命名为PGA-1C和PGA-1D，经过测序结果显示第748位点氨基酸发生了改变，由D突变成了V，而第209位点氨基酸与PGA-1B一致，只是碱基由TCG变为大肠杆菌更偏爱的AGT。
制备高活性的双点PGA突变体
以PGA-1C为模板，P5/P6为突变引物，运用全质粒PCR技术对其第209位点进行迭代饱和突变。经过对突变体文库进行筛选，得到了一个酶活力为25.8U/ml的突变体，经过测序结果验证，该双点PGA突变体的第748位点氨基酸由D突变成了V，209位点氨基酸由T突变成了S，并将其命名为PGA-2，其编码基因序列为SEQ ID NO.3，氨基酸序列为SEQ ID NO.4。
同时按照实施例1-4的方法对上述所有突变子进行蛋白纯化及性质分析，具体比较结果见表2。
表2高活力PGA突变体与野生型PGA初步比较
2-2制备高浓度青霉素G耐受性的PGA突变体
由于在工业化生产6-APA过程中，青霉素G的浓度最高只能达到8％，如果增加浓度，目前的商业型PGA活力会下降同时青霉素G不能转化完全，转化率和6-APA收率都会下降，因此，工业生产中急需开发一种对高浓度青霉素G耐受性更强PGA。
本发明人，沿着这一目标设定开发路线，对上述PGA突变体进行进一步改造。以PGA-2基因为模板，加入T7通用引物进行易错PCR，按照实施例2-1-1方法得到一个随机突变体文库，同时按照实施例2-1-2方法进行突变体文库筛选，只是将底物青霉素G的浓度(W/V)由1％提高到10％。在所述随机突变体文库中共筛选了约20000个克隆子，得到2个活力比PGA-2有显著提升的突变子，通过摇瓶发酵复筛选，测定其活力分别为58.7U/ml和55.8U/ml，并分别命名为PGA-3A和PGA-3B，经测序后，显示PGA-3A在第179位点氨基酸由L突变为F，PGA-3B在第206位点氨基酸由N突变为Q。
由于PGA-3A和PGA-3B都是随机突变产生的，该氨基酸的改变不一定是最适氨基酸，因此，本发明人以PGA-2为模板，对179和206这2个氨基酸位点分别进行饱和突变，具体方法如下。
179点饱和突变引物
P7：TTTAATCAGNNKAAATGGCTGGTAAACCCATCA(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T 或C或G，K是G或T)
P8：CAGCCATTTMNNCTGATTAAATACCGCCATGCC(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T 或C或G，M是A或C)
206点饱和突变引物
P9：AATCAGCAANNKTCGCAAAGTGCAGCTCTGTTG(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T 或C或G，K是G或T)
P10：ACTTTGCGAMNNTTGCTGATTAAATTTAAGTGG(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T 或C或G，M是A或C)
按照实施例2-1-3的方法，对突变体文库各筛选了200个克隆子，其中第179位点突变体酶活为60.5U/ml，第206位点突变体的酶活力为67.4U/ml，并对这2个突变体分别命名为PGA-3C和PGA-3D，经过测序结果显示第179位点氨基酸与PGA-3A一致，而第206位点氨基酸发生了改变，由N突变为K。
制备高底物浓度耐受性的四点PGA突变体
以PGA-3C为模板，P7/P8为突变引物，运用全质粒PCR技术对其206位点进行迭代饱和突变。经过对突变体文库进行筛选，得到了一个酶活力为78.9U/ml的突变体，经过测序结果验证，该四点PGA突变体相对于野生型PGA来说，第748位点氨基酸由D突变成了V，第209位点氨基酸由T突变成了S，第179位点氨基酸由L突变为F，第206位点氨基酸由N变为D，并将其命名为PGA-4，其编码基因序列为SEQ ID NO.5，氨基酸序列为SEQ ID NO.6。
同时按照实施例1-4的方法对上述所有突变子进行蛋白纯化及性质分析，具体比较结果见表3。
表3高底物浓度耐受性的PGA突变体与野生型PGA初步比较
将上述野生型及突变型PGA按照实施例1-4的方法制备固定化酶，并将所得到的固定化酶以相同酶量(1000U)分别置于一定浓度(8％、15％、20％和25％)的青霉素G溶液中，于37℃温育1个小时，后取出固定化酶用无菌去离子水反复冲洗4～5遍，以确保固定化酶中不存在青霉素G残留，将处理后的固定化酶用滴定法测定其残余活力，具体数据如表4所示。
表4野生型PGA与PGA突变体固定化酶对底物浓度耐受性比较
2‐3制备高浓度苯乙酸耐受性的PGA突变体
在6-APA生产过程中，随着反应的进行，副产物苯乙酸逐渐累积，引起反应pH下降，同时由于苯乙酸作为酶反应的底物竞争性抑制剂，使水解反应不能进行彻底，底物残留增多，而且低PH值及高浓度的苯乙酸导致PGA易失活，因此急需开发一种耐受高浓度苯乙酸的新型PGA。
为了解决工业生产中的这一难题，本发明人设定新的开发路线，对上述PGA突变体进行更进一步改造。具体为：以PGA-4为模板，加入T7通用引物进行易错PCR，按照实施例2-1-1方法得到一个随机突变体文库，同时按照实施例2-1-2方法进行突变体文库筛选，只是将底物青霉素G浓度(W/V)由1％提高到10％，同时加入5mmol/L的苯乙酸钠作为抑制剂。在所述随机突变体文库中筛选了约20000个克隆子，得到2个活力比PGA-4有显著提升的突变子，通过摇瓶发酵复筛，测定其活力分别为88.9U/ml和94.1U/ml，并分别命名为PGA-5A和PGA-5B，经测序后，显示PGA-5A在第506位点氨基酸由N突变为D，PGA-5B在第602位点氨基酸由T突变为D。
由于PGA-5A和PGA-5B都是随机突变产生的，该氨基酸的改变不一定是最适氨基酸，因此，本发明人以PGA-4为模板，对506和602这2个氨基酸位点分别进行饱和突变，具体方法如下。
506点饱和突变引物
P11：AACTGGAACNNKTCTCCCCAAAAAGATTATCCC(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T 或C或G，K是G或T)
P12：TTGGGGAGAMNNGTTCCAGTTAGCAATATATCC(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T 或C或G，M是A或C)
602点饱和突变引物
P13：GATGGTAAANNKTGGCAGCAGCCAGGCTCTGCC(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T 或C或G，K是G或T)
P14：CTGCTGCCAMNNTTTACCATCATCATTAAGCAA(下划线处为饱和突变位点)(N为A或T 或C或G，M是A或C)
按照实施例2-1-3的方法，对突变体文库各筛选了200个克隆子，其中第506位点突变体的酶活力为93.5U/ml，第602位点突变体的酶活力为105.7U/ml，并对这2个突变体分别命名为PGA-5C和PGA-5D，经过测序结果显示第506位点氨基酸与PGA-5A一致，而第602位点氨基酸发生了改变，由T突变为G。
制备高浓度苯乙酸耐受性的六点PGA突变体
以PGA-5C为模板，P11/P12为突变引物，运用全质粒PCR技术对其602位点进行迭代饱和突变。经过对突变体文库进行筛选，得到了一个酶活力为122.5U/ml的突变体，经过测序结果验证，该六点PGA突变体相对于野生型PGA来说，第748位点氨基酸由D突变成了V，第209位点氨基酸由T突变成了S，第179位点氨基酸由L突变为F，第206位点氨基酸由N变为D，第506位点氨基酸由N突变为D，第602位点氨基酸由T变为Q，并将其命名为PGA-6，其编码基因序列为SEQ ID NO.7，氨基酸序列为SEQ ID NO.8。
表5高浓度苯乙酸浓度耐受性的PGA突变体与野生型PGA初步比较
将上述野生型及突变型PGA按照实施例1-4的方法制备固定化酶，并将所得到的固定化酶以相同酶量(1000U)分别置于一定浓度(5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L和20mmol/L)的苯乙酸钠溶液中，于37℃温育1个小时，后取出固定化酶用无菌去离子水反复冲洗4～5遍，以确保固定化酶中不存在苯乙酸残留，将处理后的固定化酶用滴定法测定其残余活力，具体数据如表6所示。
表6野生型PGA与突变型PGA固定化酶对苯乙酸浓度耐受性比较
实施例3突变体PGA-6固定化酶的应用
3-1野生型PGA与PGA-6固定化酶裂解青霉素G制备6-APA实验
(1)裂解反应
将上述野生型PGA及PGA-6固定化酶，以相同酶量(8000U)分别置于一定浓度(8％、15％、20％、25％和30％)的青霉素G溶液中，于25℃，pH8.00条件下反应，反应过程中不断滴加3mol/L的浓氨水中和反应过程中产生的酸，使pH恒定在8.00，并记录氨水的加量，当反应达到终点后(判定终点的方法是：氨水自动停止补加，pH值维持在3min以上不变)，记录下总反应时间。将上述裂解液过滤，固定化酶用无菌去离子水反复冲洗4～5遍，备用。
(2)6-APA结晶反应
将上述过滤后的裂解液置于温度为0～8℃水浴锅中，按体积的80％加入预冷的无水甲醇于裂解溶液中，开启搅拌并缓慢滴加6mol/L的浓HCl；在30～45min内滴加HCl至pH4.20；在0～4℃水浴中继续结晶1.5h；将结晶液过滤，先用预冷去离子水洗涤一次，再用丙酮洗涤3次，用真空抽干后置于干燥器中过夜干燥，称重装袋后，检测6-APA水分、含量以及青霉素G残留并计算青霉素G的转化率，具体实验对比数据见表7。
表7野生型PGA与PGA-6固定化酶转化应用实验对比
3-2突变体PGA-6固定化酶操作稳定性批次实验
由表7可知，PGA-6固定化酶反应的最佳底物浓度为25％，因此，为了更好地反映该突变体的稳定性，本发明人实验过程中将其反应条件设定如下：青霉素G浓度为25％，PGA-6固定化酶(522U/g)总投量为8000U，反应pH为8.0，反应温度为25℃，反应体积为1000ml，具体实验结果如表8所示。
表8突变体PGA-6固定化酶操作稳定性批次实验
通过PGA-6固定化酶操作稳定性批次实验可知，本发明制备的PGA-6固定化酶经过连续600批次转化实验，其反应时间没有明显延长，固定化酶活力没有明显下降，显示出本发明制备的PGA-6固定化酶具有良好的操作稳定性。

Claims (4)

1.一种青霉素G酰化酶突变体，其特征在于，其在SEQ ID NO.2的埃希氏大肠杆菌ATCC11105野生型青霉素G酰化酶氨基酸序列基础上，有如下任意一种情况的突变：
(1)第748位氨基酸由D突变为V；
(2)第748位氨基酸由D突变为V，第209位氨基酸由T突变为S；
(3)第748位氨基酸由D突变为V，第209位氨基酸由T突变为S，第179位氨基酸由L突变为F；
(4)第748位氨基酸由D突变为V，第209位氨基酸由T突变为S，第206位氨基酸由N突变为Q；
(5)第748位氨基酸由D突变为V，第209位氨基酸由T突变为S，第206位氨基酸由N突变为K；
(6)第748位氨基酸由D突变为V，第209位氨基酸由T突变为S，第179位氨基酸由L突变为F，第206位氨基酸由N突变为D；
(7)第748位氨基酸由D突变为V，第209位氨基酸由T突变为S，第179位氨基酸由L突变为F，第206位氨基酸由N突变为D，第602位氨基酸由T突变为D；
(8)第748位氨基酸由D突变为V，第209位氨基酸由T突变为S，第179位氨基酸由L突变为F，第206位氨基酸由N突变为D，第506位氨基酸由N突变为D；
(9)第748位氨基酸由D突变为V，第209位氨基酸由T突变为S，第179位氨基酸由L突变为F，第206位氨基酸由N突变为D，第602位氨基酸由T突变为G；
(10)第748位氨基酸由D突变为V，第209位氨基酸由T突变为S，第179位氨基酸由L突变为F，第206位氨基酸由N突变为D，第506位氨基酸由N突变为D，第602位氨基酸由T突变为Q。
2.一种青霉素G酰化酶突变体的核苷酸序列，其特征在于，为权利要求1所述的青霉素G酰化酶突变体中的任一种的核苷酸序列；
3.权利要求1所述的青霉素G酰化酶的突变体的应用，其特征在于，用于将青霉素G水解为6-APA和苯乙酸。
4.一种突变型青霉素G酰化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)将权利要求1所述的青霉素G酰化酶的突变体的基因序列插入到质粒中得到表达载体；
b)将表达载体转化进入菌株中得到重组基因工程菌；
c)将重组基因工程菌用乳糖诱导进行发酵得到青霉素G酰化酶。
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