CN115838696A - 普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用，本发明的改造方法通过组合突变设计出最佳突变体，对PtDAPDH的蛋白质进行改造，克服了之前野生型酶催化活性低的局限，最终得到最佳突变体T5(PtDAPDH^{N13E/S90R/P254A})，其催化半衰期和D‑对羟基苯甘氨酸产量分别为野生型的1.10倍和2.67倍，以L‑对羟基苯甘氨酸为底物，转化后0.1L摇瓶产量为3.2g/L，转化率为32％，高催化效率和生产强度，大大降低了之前的高菌体量以及昂贵的底物成本，为D‑对羟基苯甘氨酸的工业化生产奠定了基础。

Description

普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

D-对羟基苯甘氨酸(D-p-hydroxyphenylglycine，D-HPG)，又名4-羟基苯甘氨酸，是一种具有手性中心的非天然氨基酸。D-HPG是氨基酸生物合成的重要中间体，被广泛用于合成肽类激素和农药。特别是作为医药中间体，广泛用于制备β-内酰胺类抗生素，如阿莫西林、氨羟苄头孢菌素和头孢哌酮等。该类抗生素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、致病螺旋体等均有良好的杀灭作用，并且具有副作用小、口服效果佳等优点。在临床上，β-内酰胺类抗生素可用于治疗敏感菌引起的肺炎、菌血症、尿道炎等器官软组织感染。

目前，D-HPG的主要生产方法为化学合成法和海因酶转化法，其中化学合成法主要为不对称转化法和化学拆分法，但是这些方法在不同程度上都存在反应条件苛刻、环境污染大、生产效率低以及生产成本高的问题；并且会对环境产生毒害作用，不符合绿色生产、安全生产和可持续发展的要求。目前酶转化法主要是海因酶法，由于酶催化剂具有特异性高、种类多样以及绿色环保的特点，酶转化法成为合成D-HPG的重要技术手段；因此，越来越多的研究人员寻求利用酶转化法来合成D-HPG。其中通过酮酸一步还原胺化制备手性D-对羟基苯甘氨酸具有生产工艺条件温和、高效、环保等特点，可以减轻环境和资源压力，因此迫切需要一种高效制备D-对羟基苯甘氨酸的生物法。

酮酸的一步还原胺化法生产D-对羟基苯甘氨酸涉及到一个关键的酶内消旋二氨基庚二酸脱氢酶(meso-DAPDH,meso-Diaminopimelate Dehydrogenase，EC 1.4.1.16)，它具有较宽泛的底物谱，能够催化脂肪族酮酸和部分芳香族酮酸的还原胺化，使得在酮酸的α-羰基还原胺化，形成对应的D-氨基酸。

此外，多酶级联反应也是酶生物转化中的重要手段，具有许多优点。例如，它可以避开反应中间体的积累，利用廉价易得的原料作为反应的起始底物，并且多酶反应间的协同性可以通过调控酶之间的表达比例得以调节，从而解决了底物酮酸的昂贵或者不易获得的问题。常用的级联路径是将内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(DAPDH)、L-氨基酸氧化酶和葡萄糖脱氢酶偶联，L-氨基酸氧化酶可以利用L-对羟基苯甘氨酸为底物，催化L-对羟基苯甘氨酸脱氨生成酮酸，再进一步经过DAPDH的还原胺化作用最终生成D-对羟基苯甘氨酸，同时通过引入辅酶再生系统实现还原型辅酶NADPH的再生。

近几十年来，蛋白质工程已经成为在分子水平改善酶的性质的有效策略，如扩大底物范围、提高酶的活性和改善酶的稳定性的最有效的方法。因此，通过蛋白质工程设计PtDAPDH，可能解决其催化活性低的问题。蛋白质工程改造主要可以分四类：传统的定向进化(即非理性设计)、半理性设计、理性设计(基于结构与计算机技术)和多种策略的组合应用。目前，关于利用蛋白质工程改造PtDAPDH已经取得了一定的研究进展，然而，催化活性的改善效果仍然有限，远不能满足实际的工业化需求。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种可以高效制备D-对羟基苯甘氨酸的PtDAPDH突变体及其改造方法，并利用该突变体蛋白催化对羟基苯乙醛酸制备D-对羟基苯甘氨酸，以及进一步将得到的突变体与L-氨基酸氧化酶和葡萄糖脱氢酶偶联，以廉价底物L-对羟基苯甘氨酸制备D-对羟基苯甘氨酸。本发明所构建的菌株在D-对羟基苯甘氨酸制备中具有高生产强度，高催化稳定性，减少了转化中的投菌量，极大节约了工业化的生产成本。

本发明的第一个目的是提供一种普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶(PtDAPDH)突变体，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第13位、第90位、第254位的氨基酸中的一个或多个进行突变。

进一步地，所述的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第13位天冬酰胺突变为谷氨酸，突变体命名为N13E。

进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第90位丝氨酸突变为精氨酸，突变体命名为S90R。

进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第254位脯氨酸突变为丙氨酸，突变体命名为P254A。

进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第13位天冬酰胺突变为谷氨酸，并将第90位丝氨酸突变为精氨酸，突变体命名为N13E/S90R。

进一步地，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第13位天冬酰胺突变为谷氨酸、第90位丝氨酸突变为精氨酸，及第254位脯氨酸突变为丙氨酸，突变体命名为N13E/S90R/P254A。

本发明的第二个目的是提供一种编码所述的普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶(PtDAPDH)突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供一种包含所述的基因的表达载体。

进一步地，所述的表达载体以pRSFDuet为载体。

进一步地，所述的表达载体上还包含PmLAAD编码基因和BmGDH编码基因。

进一步地，所述的PmLAAD编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，所述的BmGDH编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第四个目的是提供一种表达所述载体的重组菌。

进一步地，所述的重组菌是以大肠杆菌为宿主。

进一步地，所述的重组菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

本发明的第五个目的是提供所述的重组菌在制备D-对羟基苯甘氨酸中的应用。

进一步地，所述的应用是以L-对羟基苯甘氨酸为反应底物，以所述的重组菌细胞为催化剂催化生产D-对羟基苯甘氨酸。

进一步地，在催化反应中，反应条件为在pH8.0～8.5、30～37℃条件下反应12～24h。

进一步地，在催化反应中，重组菌细胞的添加量为终浓度10～60g/L。进一步优选为10～30g/L。

本发明的有益效果是：

本发明构建了一种普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH的突变体，用于催化生产D-对羟基苯甘氨酸。本发明突变体的催化半衰期和D-对羟基苯甘氨酸产量分别为野生型的1.10倍和2.67倍，提高了单位催化剂的生产能力，有效降低了生产成本，并且反应中仅以水为催化介质，具有反应条件温和、操作简便、收率高等优点。本发明得到的突变体在0.5L摇瓶中以L-对羟基苯甘氨酸为底物时，D-对羟基苯甘氨酸的产量可达3.2g/L，转化率为32％，加快了酶转化法生产D-对羟基苯甘氨酸的工业化进程。

附图说明

图1为三酶重组载体的连接方式。

图2为全细胞催化浓度和D-对羟基苯甘氨酸生产量的关系。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

基因来源：本专利所涉及到的生物酶PtDAPDH基因来源于Prevotellatimonensis，pRSFDuet质粒购自Novagen(Madison,WI,U.S.A.)，限制性内切酶、T4 DNA连接酶、primeSTAR等购自TaKaRa(Dalian,China)。benzeneacetic acid和标样购自SIGMA。PtDAPDH突变体均为分子改造所得，其余试剂均为市场购买所得。

配制LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，在121℃灭菌20min。

配置发酵培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母提取物(安琪酵母粉802)24g/L，甘油4mL/L，KH₂PO₄ 2.31g/L和K₂HPO₄ 12.31g/L。

HPLC法测定D-对羟基苯甘氨酸：具体步骤参见文献：宋慧敏,屠春燕,欧阳平凯.高效液相色谱法测定D-对羟基苯甘氨酸[J].南京工业大学学报(自然科学版),2002(04):97-99。

比酶活测定方法：采用吸光值法测DAPDH的酶活。1个单位的DAPDH酶活被定义为氧化1μmol NADPH所需的酶量(U)。通过测定NADPH消耗量即可计算酶活力。

比酶活定义为每毫克蛋白质所含的酶活力单位数(U/mg蛋白)。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：单突突变体的构建和筛选

(1)单突突变体构建：设计PtDAPDH^N13E、PtDAPDH^S90R和PtDAPDH^P254A突变位点的引物，如表1所示，通过全质粒PCR进行突变体构建。

表1单突变体突变引物序列

构建反应PCR扩增体系：PrimSTAR酶0.5μL、5×PrimeSTAR Buffer 10μL、dNTP 4μL每个突变位点的两条引物各1μL、，模板(PtDAPDH^WT)4μL、水32.5μL；反应条件为：①94℃3min；②98℃10s；③55℃30s；④72℃3min；⑤将②～④三个步骤循环29次；⑥72℃5min；⑦12℃保温。

将上述反应体系在37℃孵育3h以消化质粒模板(消化体系为：DpnI 0.5μL、上述反应PCR产物45μL、10×T Buffer 5μL)，消化结束后得到的消化产物通过化学转化方法导入大肠杆菌BL21感受态细胞，化学转化法具体步骤：

(1)将10μl同源重组产物导入100μl BL21感受态细胞；

(2)冰浴15-30min；

(3)42℃水浴热激90s，取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min；

(4)加入800μl无抗性LB培养基混匀，于37℃，200rpm培养1h；

(5)5000rpm离心2min收菌；

(6)移去上清，剩余100-200μl吹吸混匀涂布至含0.05mg/mL卡那霉素抗性平板上，37℃恒温培养12h左右。

(7)挑取单克隆于含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB中，200rpm、37℃恒温培养12h后，送去公司测序，测序正确的即为阳性转化子。

实施例2：双突和三突突变体的构建和筛选

(1)双突突变体构建：在突变体PtDAPDH^N13的基础上，利用突变引物S90R-S和S90R-A(表1)，通过全质粒PCR进行双突突变体构建，具体实施方式参见实施例2中步骤(1)，制备得到双突突变体PtDAPDH^N13E/S90R。

(2)三突突变体的构建：在突变体PtDAPDH^N13E/S90R的基础上，利用突变引物P254A-S和P254A-A(表1)，通过全质粒PCR进行三突变体的构建，具体实施方式参见实施例1，制备得到三突突变体PtDAPDH^{N13E/S90R/P254A}。

(3)多突变体的筛选：将测序正确的的突变体菌株接种至LB种子培养基，200rpm、37℃培养培养10h左右，分别以5％接种量接种至摇瓶发酵培养基，在200rpm、37℃培养至OD₆₀₀＝0.8左右，加入终浓度为5g/L的乳糖诱导，诱导条件为200rpm、25℃诱导16h。将诱导表达后的菌液。

转化条件为：转化温度37℃，反应pH为8.5，转化时间为24h，转速为550rpm。

将转化结束后的转化液用HPLC方法进行测定D-对羟基苯甘氨酸的产量，结果如表2所示，最终三突变体PtDAPDH^{N13E/S90R/254A}效果最好。

表2不同突变体摇瓶筛选结果

实施例3：突变体酶的表达纯化方法

将实施例2制备得到的突变体重组菌株阳性转化子接种至LB培养基，37℃培养至OD₆₀₀为0.6～1.0时加入终浓度5g/L乳糖诱导酶的表达，诱导温度为25℃，诱导时间16h，得到发酵液。发酵液于4℃、6000rpm离心10min，取菌体。加入10mL结合液A(20mM磷酸钠、0.5mMNaCl、20mM咪唑、1％甘油，用HCl调pH至8.5)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间4s，间隔时间4s，共计10min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、8000rpm离心30min，得粗酶液。用0.22μm微孔滤膜过滤，备用。

准备镍离子亲和层析柱，首先，在4℃环境下利用恒流泵，向柱子里泵入超纯水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用10mL结合液A平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用结合液A冲洗杂蛋白至基线平衡，再用洗脱液B(20mM磷酸钠、0.5mM NaCl、250mM咪唑)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，测定酶活，获得达到电泳纯的目的蛋白。

实施例4：亲本酶和突变体的动力学参数测定

为了对突变体进行评价，本发明测定了突变亲本T0及突变体T1至T5在37℃下的动力学参数。

k_cat/K_m通过在37℃条件下测定不同浓度的L-对羟基苯甘氨酸所产生的D-对羟基苯甘氨酸的初始利率计算。通过转化过程中的残留酶活实验测定亲本酶和突变体的催化半衰期(在全细胞体系中进行)。分别将PtDAPDH亲本酶菌株和突变体菌株各以20g/L终浓度的湿细胞加入反应液中。以L-对羟基苯甘氨酸为底物，在整个转化过程中每隔1h测定它们的残留酶活(反应0h时的初始酶活设为100％)，共测定12h。

如表3所示，所有的突变体与Q0相比，催化半衰期均变长，其中T5为10.1h，比Q0的4.8h变长了110％。与之一致的是各突变体的总转化数(TTN)与T0相比均得到提高。T5的TTN是29200为T0的11200的2.59倍。

表3PtDAPDH亲本酶及其突变体的动力学参数

实施例5：构建PtDAPDH、EcLAAD和BsGDH共表达菌株

将PtDAPDH^{N13E/S90R/P254A}突变体基因以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的PmLAAD基因和SEQ ID NO.4所示的BmGDH基因按顺序串联于pRSFDuet载体(图1)从而得到共表达载体。采用片段和载体双酶切连接的方式，将PtDAPDH^{N13E/S90R/P254A}突变体基因连接至pRSFDuet载体，最后将PmLAAD基因和BmGDH基因连接至pRSFDuet载体。具体引物如表4所示，下划线处为酶切位点。

表4引物序列

将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，具体转化步骤参见实施例1用化学转化法导入大肠杆菌BL21感受态细胞，最终构建成BL21-LAAD-DAPDH-GDH菌株(突变体T5菌株)。

实施例6：0.5L摇瓶水平优化L-对羟基苯甘氨酸生产D-对羟基苯甘氨酸

将平板上测序正确的突变体T5菌株接种至含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB中，200rpm、37℃培养10-12h，以体积比5％的接种量接种至TB培养基中，200rpm、37℃培养至OD₆₀₀为3时加入5g/L终浓度乳糖诱导，诱导温度为25℃，诱导时间14h后以6,000×g离心8min收集细胞，37℃放置16h后用于转化。

(1)不同全细胞催化剂浓度对D-对羟基苯甘氨酸浓度的影响

在摇瓶中配制转化反应体系：20g/L的L-对羟基苯甘氨酸，用NaOH调至pH为8.5，装液量为0.1L，向反应体系中分别添加1g、2g、3g、4g、5g突变体湿菌体细胞(即为全细胞催化剂)，使得全细胞催化剂的浓度分别为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L。

在37℃、550rpm条件下进行转化反应，在反应过程添加L-对羟基苯甘氨酸固体粉末使转化液中以维持pH在8.5左右，粉末补加时间从转化开始后持续11h后，再进行1h转化，此期间停止补加粉末，用氢氧化钠调节pH为8.5，转化反应后总体积为0.1L。

转化反应结束后取部分转化液12,000×g离心15min，上清液用0.22μm的微滤膜过滤后进行HPLC分析。结果如图2所示，当催化剂的浓度从10g/L提高至50g/L，D-对羟基苯甘氨酸的浓度从1.3g/L提高至3.2g/L。且在20g/L的全细胞催化剂浓度条件下，提高全细胞催化剂浓度转化率并未提高。考虑到工业对高产量以及低催化剂(菌体)用量，20g/L的全细胞催化剂浓度同时具备较高D-对羟基苯甘氨酸浓度及高产物/催化剂比例(即单位菌体生产D-对羟基苯甘氨酸能力)被用于转化实验。

(2)不同转化反应pH对D-对羟基苯甘氨酸浓度的影响

具体步骤同(1)，将全细胞化剂浓度控制为20g/L，且将转化反应过程中的pH分别控制为7.5、8.0、8.5、9.0。结果如表5所示，在微碱性的条件更适合D-对羟基苯甘氨酸的合成，因此选择转化pH控制在8.5左右，此时D-对羟基苯甘氨酸浓度为3.2g/L。

表5pH优化转化结果

(3)不同转化时长对D-对羟基苯甘氨酸浓度的影响

具体步骤同(1)，将转化pH控制为8.5，全细胞化剂浓度控制为20g/L，在不同转化时间取样测定D-对羟基苯甘氨酸产量(12-24h)(结果见表6)，随着转化时间的延长，产量不断增加，但24h之后，增加不明显，考虑到工业运转成本，控制转化时间为24h，最终D-对羟基苯甘氨酸产量到达3.2g/L，转化率为32％。

表6发酵时间优化结果

对比例1：

具体实施方式参见实施例6，不同之处在于，将突变体T5菌株替换为野生型T0菌株去进行发酵与转化实验。转化结束后，取部分转化液12,000×g离心15min，上清液用0.22μm的微滤膜过滤后进行HPLC分析。HPLC色谱图结果显示：D-对羟基苯甘氨酸产量为1.2g/L，转化率为12％。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH突变体，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第13位、第90位、第254位的氨基酸中的一个或多个进行突变。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本进行了如下突变：

(1)第13位天冬酰胺突变为谷氨酸；或，

(2)第90位丝氨酸突变为精氨酸；或，

(3)第254位脯氨酸突变为丙氨酸；或，

(4)第13位天冬酰胺突变为谷氨酸，并将第90位丝氨酸突变为精氨酸；或，

(5)第13位天冬酰胺突变为谷氨酸、第90位丝氨酸突变为精氨酸，及第254位脯氨酸突变为丙氨酸。

3.一种编码权利要求1或2所述的普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH突变体的基因。

4.一种包含权利要求3所述的基因的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体上还包含PmLAAD编码基因和BmGDH编码基因。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述的PmLAAD编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的BmGDH编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.一种含有权利要求4～6所述的表达载体的重组菌。

8.权利要求7所述的重组菌在制备D-对羟基苯甘氨酸中的应用。

9.权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用是以L-对羟基苯甘氨酸为反应底物，以所述的重组菌细胞为催化剂催化生产D-对羟基苯甘氨酸。

10.权利要求8所述的应用，其特征在于，在催化反应中，反应条件为在pH8.0～8.5、30～37℃条件下反应12～24h，重组菌细胞的添加量为终浓度10～60g/L。

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