CN115838696A - 普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents
普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115838696A CN115838696A CN202211084151.0A CN202211084151A CN115838696A CN 115838696 A CN115838696 A CN 115838696A CN 202211084151 A CN202211084151 A CN 202211084151A CN 115838696 A CN115838696 A CN 115838696A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mutant
- hydroxyphenylglycine
- ptdapdh
- mutated
- meso
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用,本发明的改造方法通过组合突变设计出最佳突变体,对PtDAPDH的蛋白质进行改造,克服了之前野生型酶催化活性低的局限,最终得到最佳突变体T5(PtDAPDHN13E/S90R/P254A),其催化半衰期和D‑对羟基苯甘氨酸产量分别为野生型的1.10倍和2.67倍,以L‑对羟基苯甘氨酸为底物,转化后0.1L摇瓶产量为3.2g/L,转化率为32%,高催化效率和生产强度,大大降低了之前的高菌体量以及昂贵的底物成本,为D‑对羟基苯甘氨酸的工业化生产奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用,属于生物工程技术领域。
背景技术
D-对羟基苯甘氨酸(D-p-hydroxyphenylglycine,D-HPG),又名4-羟基苯甘氨酸,是一种具有手性中心的非天然氨基酸。D-HPG是氨基酸生物合成的重要中间体,被广泛用于合成肽类激素和农药。特别是作为医药中间体,广泛用于制备β-内酰胺类抗生素,如阿莫西林、氨羟苄头孢菌素和头孢哌酮等。该类抗生素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、致病螺旋体等均有良好的杀灭作用,并且具有副作用小、口服效果佳等优点。在临床上,β-内酰胺类抗生素可用于治疗敏感菌引起的肺炎、菌血症、尿道炎等器官软组织感染。
目前,D-HPG的主要生产方法为化学合成法和海因酶转化法,其中化学合成法主要为不对称转化法和化学拆分法,但是这些方法在不同程度上都存在反应条件苛刻、环境污染大、生产效率低以及生产成本高的问题;并且会对环境产生毒害作用,不符合绿色生产、安全生产和可持续发展的要求。目前酶转化法主要是海因酶法,由于酶催化剂具有特异性高、种类多样以及绿色环保的特点,酶转化法成为合成D-HPG的重要技术手段;因此,越来越多的研究人员寻求利用酶转化法来合成D-HPG。其中通过酮酸一步还原胺化制备手性D-对羟基苯甘氨酸具有生产工艺条件温和、高效、环保等特点,可以减轻环境和资源压力,因此迫切需要一种高效制备D-对羟基苯甘氨酸的生物法。
酮酸的一步还原胺化法生产D-对羟基苯甘氨酸涉及到一个关键的酶内消旋二氨基庚二酸脱氢酶(meso-DAPDH,meso-Diaminopimelate Dehydrogenase,EC 1.4.1.16),它具有较宽泛的底物谱,能够催化脂肪族酮酸和部分芳香族酮酸的还原胺化,使得在酮酸的α-羰基还原胺化,形成对应的D-氨基酸。
此外,多酶级联反应也是酶生物转化中的重要手段,具有许多优点。例如,它可以避开反应中间体的积累,利用廉价易得的原料作为反应的起始底物,并且多酶反应间的协同性可以通过调控酶之间的表达比例得以调节,从而解决了底物酮酸的昂贵或者不易获得的问题。常用的级联路径是将内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶(DAPDH)、L-氨基酸氧化酶和葡萄糖脱氢酶偶联,L-氨基酸氧化酶可以利用L-对羟基苯甘氨酸为底物,催化L-对羟基苯甘氨酸脱氨生成酮酸,再进一步经过DAPDH的还原胺化作用最终生成D-对羟基苯甘氨酸,同时通过引入辅酶再生系统实现还原型辅酶NADPH的再生。
近几十年来,蛋白质工程已经成为在分子水平改善酶的性质的有效策略,如扩大底物范围、提高酶的活性和改善酶的稳定性的最有效的方法。因此,通过蛋白质工程设计PtDAPDH,可能解决其催化活性低的问题。蛋白质工程改造主要可以分四类:传统的定向进化(即非理性设计)、半理性设计、理性设计(基于结构与计算机技术)和多种策略的组合应用。目前,关于利用蛋白质工程改造PtDAPDH已经取得了一定的研究进展,然而,催化活性的改善效果仍然有限,远不能满足实际的工业化需求。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供了一种可以高效制备D-对羟基苯甘氨酸的PtDAPDH突变体及其改造方法,并利用该突变体蛋白催化对羟基苯乙醛酸制备D-对羟基苯甘氨酸,以及进一步将得到的突变体与L-氨基酸氧化酶和葡萄糖脱氢酶偶联,以廉价底物L-对羟基苯甘氨酸制备D-对羟基苯甘氨酸。本发明所构建的菌株在D-对羟基苯甘氨酸制备中具有高生产强度,高催化稳定性,减少了转化中的投菌量,极大节约了工业化的生产成本。
本发明的第一个目的是提供一种普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶(PtDAPDH)突变体,所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第13位、第90位、第254位的氨基酸中的一个或多个进行突变。
进一步地,所述的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
进一步地,所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第13位天冬酰胺突变为谷氨酸,突变体命名为N13E。
进一步地,所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第90位丝氨酸突变为精氨酸,突变体命名为S90R。
进一步地,所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第254位脯氨酸突变为丙氨酸,突变体命名为P254A。
进一步地,所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第13位天冬酰胺突变为谷氨酸,并将第90位丝氨酸突变为精氨酸,突变体命名为N13E/S90R。
进一步地,所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第13位天冬酰胺突变为谷氨酸、第90位丝氨酸突变为精氨酸,及第254位脯氨酸突变为丙氨酸,突变体命名为N13E/S90R/P254A。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述的普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶(PtDAPDH)突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供一种包含所述的基因的表达载体。
进一步地,所述的表达载体以pRSFDuet为载体。
进一步地,所述的表达载体上还包含PmLAAD编码基因和BmGDH编码基因。
进一步地,所述的PmLAAD编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地,所述的BmGDH编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第四个目的是提供一种表达所述载体的重组菌。
进一步地,所述的重组菌是以大肠杆菌为宿主。
进一步地,所述的重组菌是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。
本发明的第五个目的是提供所述的重组菌在制备D-对羟基苯甘氨酸中的应用。
进一步地,所述的应用是以L-对羟基苯甘氨酸为反应底物,以所述的重组菌细胞为催化剂催化生产D-对羟基苯甘氨酸。
进一步地,在催化反应中,反应条件为在pH8.0~8.5、30~37℃条件下反应12~24h。
进一步地,在催化反应中,重组菌细胞的添加量为终浓度10~60g/L。进一步优选为10~30g/L。
本发明的有益效果是:
本发明构建了一种普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH的突变体,用于催化生产D-对羟基苯甘氨酸。本发明突变体的催化半衰期和D-对羟基苯甘氨酸产量分别为野生型的1.10倍和2.67倍,提高了单位催化剂的生产能力,有效降低了生产成本,并且反应中仅以水为催化介质,具有反应条件温和、操作简便、收率高等优点。本发明得到的突变体在0.5L摇瓶中以L-对羟基苯甘氨酸为底物时,D-对羟基苯甘氨酸的产量可达3.2g/L,转化率为32%,加快了酶转化法生产D-对羟基苯甘氨酸的工业化进程。
附图说明
图1为三酶重组载体的连接方式。
图2为全细胞催化浓度和D-对羟基苯甘氨酸生产量的关系。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施,但所举实施例不作为对本发明的限定。
基因来源:本专利所涉及到的生物酶PtDAPDH基因来源于Prevotellatimonensis,pRSFDuet质粒购自Novagen(Madison,WI,U.S.A.),限制性内切酶、T4 DNA连接酶、primeSTAR等购自TaKaRa(Dalian,China)。benzeneacetic acid和标样购自SIGMA。PtDAPDH突变体均为分子改造所得,其余试剂均为市场购买所得。
配制LB培养基:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,氯化钠10g/L,在121℃灭菌20min。
配置发酵培养基:胰蛋白胨12g/L,酵母提取物(安琪酵母粉802)24g/L,甘油4mL/L,KH2PO4 2.31g/L和K2HPO4 12.31g/L。
HPLC法测定D-对羟基苯甘氨酸:具体步骤参见文献:宋慧敏,屠春燕,欧阳平凯.高效液相色谱法测定D-对羟基苯甘氨酸[J].南京工业大学学报(自然科学版),2002(04):97-99。
比酶活测定方法:采用吸光值法测DAPDH的酶活。1个单位的DAPDH酶活被定义为氧化1μmol NADPH所需的酶量(U)。通过测定NADPH消耗量即可计算酶活力。
比酶活定义为每毫克蛋白质所含的酶活力单位数(U/mg蛋白)。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1:单突突变体的构建和筛选
(1)单突突变体构建:设计PtDAPDHN13E、PtDAPDHS90R和PtDAPDHP254A突变位点的引物,如表1所示,通过全质粒PCR进行突变体构建。
表1单突变体突变引物序列
构建反应PCR扩增体系:PrimSTAR酶0.5μL、5×PrimeSTAR Buffer 10μL、dNTP 4μL每个突变位点的两条引物各1μL、,模板(PtDAPDHWT)4μL、水32.5μL;反应条件为:①94℃3min;②98℃10s;③55℃30s;④72℃3min;⑤将②~④三个步骤循环29次;⑥72℃5min;⑦12℃保温。
将上述反应体系在37℃孵育3h以消化质粒模板(消化体系为:DpnI 0.5μL、上述反应PCR产物45μL、10×T Buffer 5μL),消化结束后得到的消化产物通过化学转化方法导入大肠杆菌BL21感受态细胞,化学转化法具体步骤:
(1)将10μl同源重组产物导入100μl BL21感受态细胞;
(2)冰浴15-30min;
(3)42℃水浴热激90s,取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min;
(4)加入800μl无抗性LB培养基混匀,于37℃,200rpm培养1h;
(5)5000rpm离心2min收菌;
(6)移去上清,剩余100-200μl吹吸混匀涂布至含0.05mg/mL卡那霉素抗性平板上,37℃恒温培养12h左右。
(7)挑取单克隆于含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB中,200rpm、37℃恒温培养12h后,送去公司测序,测序正确的即为阳性转化子。
实施例2:双突和三突突变体的构建和筛选
(1)双突突变体构建:在突变体PtDAPDHN13的基础上,利用突变引物S90R-S和S90R-A(表1),通过全质粒PCR进行双突突变体构建,具体实施方式参见实施例2中步骤(1),制备得到双突突变体PtDAPDHN13E/S90R。
(2)三突突变体的构建:在突变体PtDAPDHN13E/S90R的基础上,利用突变引物P254A-S和P254A-A(表1),通过全质粒PCR进行三突变体的构建,具体实施方式参见实施例1,制备得到三突突变体PtDAPDHN13E/S90R/P254A。
(3)多突变体的筛选:将测序正确的的突变体菌株接种至LB种子培养基,200rpm、37℃培养培养10h左右,分别以5%接种量接种至摇瓶发酵培养基,在200rpm、37℃培养至OD600=0.8左右,加入终浓度为5g/L的乳糖诱导,诱导条件为200rpm、25℃诱导16h。将诱导表达后的菌液。
转化条件为:转化温度37℃,反应pH为8.5,转化时间为24h,转速为550rpm。
将转化结束后的转化液用HPLC方法进行测定D-对羟基苯甘氨酸的产量,结果如表2所示,最终三突变体PtDAPDHN13E/S90R/254A效果最好。
表2不同突变体摇瓶筛选结果
实施例3:突变体酶的表达纯化方法
将实施例2制备得到的突变体重组菌株阳性转化子接种至LB培养基,37℃培养至OD600为0.6~1.0时加入终浓度5g/L乳糖诱导酶的表达,诱导温度为25℃,诱导时间16h,得到发酵液。发酵液于4℃、6000rpm离心10min,取菌体。加入10mL结合液A(20mM磷酸钠、0.5mMNaCl、20mM咪唑、1%甘油,用HCl调pH至8.5)充分重悬菌体,然后将离心管置于冰浴中,放入超声波细胞破碎仪中,超声破碎的条件为:工作时间4s,间隔时间4s,共计10min。将获得的破碎液进行低温高速离心,4℃、8000rpm离心30min,得粗酶液。用0.22μm微孔滤膜过滤,备用。
准备镍离子亲和层析柱,首先,在4℃环境下利用恒流泵,向柱子里泵入超纯水冲洗柱子(约6~12倍柱体积),然后用10mL结合液A平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液),将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用结合液A冲洗杂蛋白至基线平衡,再用洗脱液B(20mM磷酸钠、0.5mM NaCl、250mM咪唑)洗脱。收集吸收峰的洗脱液,测定酶活,获得达到电泳纯的目的蛋白。
实施例4:亲本酶和突变体的动力学参数测定
为了对突变体进行评价,本发明测定了突变亲本T0及突变体T1至T5在37℃下的动力学参数。
kcat/Km通过在37℃条件下测定不同浓度的L-对羟基苯甘氨酸所产生的D-对羟基苯甘氨酸的初始利率计算。通过转化过程中的残留酶活实验测定亲本酶和突变体的催化半衰期(在全细胞体系中进行)。分别将PtDAPDH亲本酶菌株和突变体菌株各以20g/L终浓度的湿细胞加入反应液中。以L-对羟基苯甘氨酸为底物,在整个转化过程中每隔1h测定它们的残留酶活(反应0h时的初始酶活设为100%),共测定12h。
如表3所示,所有的突变体与Q0相比,催化半衰期均变长,其中T5为10.1h,比Q0的4.8h变长了110%。与之一致的是各突变体的总转化数(TTN)与T0相比均得到提高。T5的TTN是29200为T0的11200的2.59倍。
表3PtDAPDH亲本酶及其突变体的动力学参数
实施例5:构建PtDAPDH、EcLAAD和BsGDH共表达菌株
将PtDAPDHN13E/S90R/P254A突变体基因以及核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的PmLAAD基因和SEQ ID NO.4所示的BmGDH基因按顺序串联于pRSFDuet载体(图1)从而得到共表达载体。采用片段和载体双酶切连接的方式,将PtDAPDHN13E/S90R/P254A突变体基因连接至pRSFDuet载体,最后将PmLAAD基因和BmGDH基因连接至pRSFDuet载体。具体引物如表4所示,下划线处为酶切位点。
表4引物序列
将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,具体转化步骤参见实施例1用化学转化法导入大肠杆菌BL21感受态细胞,最终构建成BL21-LAAD-DAPDH-GDH菌株(突变体T5菌株)。
实施例6:0.5L摇瓶水平优化L-对羟基苯甘氨酸生产D-对羟基苯甘氨酸
将平板上测序正确的突变体T5菌株接种至含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB中,200rpm、37℃培养10-12h,以体积比5%的接种量接种至TB培养基中,200rpm、37℃培养至OD600为3时加入5g/L终浓度乳糖诱导,诱导温度为25℃,诱导时间14h后以6,000×g离心8min收集细胞,37℃放置16h后用于转化。
(1)不同全细胞催化剂浓度对D-对羟基苯甘氨酸浓度的影响
在摇瓶中配制转化反应体系:20g/L的L-对羟基苯甘氨酸,用NaOH调至pH为8.5,装液量为0.1L,向反应体系中分别添加1g、2g、3g、4g、5g突变体湿菌体细胞(即为全细胞催化剂),使得全细胞催化剂的浓度分别为10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L。
在37℃、550rpm条件下进行转化反应,在反应过程添加L-对羟基苯甘氨酸固体粉末使转化液中以维持pH在8.5左右,粉末补加时间从转化开始后持续11h后,再进行1h转化,此期间停止补加粉末,用氢氧化钠调节pH为8.5,转化反应后总体积为0.1L。
转化反应结束后取部分转化液12,000×g离心15min,上清液用0.22μm的微滤膜过滤后进行HPLC分析。结果如图2所示,当催化剂的浓度从10g/L提高至50g/L,D-对羟基苯甘氨酸的浓度从1.3g/L提高至3.2g/L。且在20g/L的全细胞催化剂浓度条件下,提高全细胞催化剂浓度转化率并未提高。考虑到工业对高产量以及低催化剂(菌体)用量,20g/L的全细胞催化剂浓度同时具备较高D-对羟基苯甘氨酸浓度及高产物/催化剂比例(即单位菌体生产D-对羟基苯甘氨酸能力)被用于转化实验。
(2)不同转化反应pH对D-对羟基苯甘氨酸浓度的影响
具体步骤同(1),将全细胞化剂浓度控制为20g/L,且将转化反应过程中的pH分别控制为7.5、8.0、8.5、9.0。结果如表5所示,在微碱性的条件更适合D-对羟基苯甘氨酸的合成,因此选择转化pH控制在8.5左右,此时D-对羟基苯甘氨酸浓度为3.2g/L。
表5pH优化转化结果
(3)不同转化时长对D-对羟基苯甘氨酸浓度的影响
具体步骤同(1),将转化pH控制为8.5,全细胞化剂浓度控制为20g/L,在不同转化时间取样测定D-对羟基苯甘氨酸产量(12-24h)(结果见表6),随着转化时间的延长,产量不断增加,但24h之后,增加不明显,考虑到工业运转成本,控制转化时间为24h,最终D-对羟基苯甘氨酸产量到达3.2g/L,转化率为32%。
表6发酵时间优化结果
对比例1:
具体实施方式参见实施例6,不同之处在于,将突变体T5菌株替换为野生型T0菌株去进行发酵与转化实验。转化结束后,取部分转化液12,000×g离心15min,上清液用0.22μm的微滤膜过滤后进行HPLC分析。HPLC色谱图结果显示:D-对羟基苯甘氨酸产量为1.2g/L,转化率为12%。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例,本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换,均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH突变体,其特征在于,所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本的第13位、第90位、第254位的氨基酸中的一个或多个进行突变。
2.根据权利要求1所述的突变体,其特征在于,所述的突变体是将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH亲本进行了如下突变:
(1)第13位天冬酰胺突变为谷氨酸;或,
(2)第90位丝氨酸突变为精氨酸;或,
(3)第254位脯氨酸突变为丙氨酸;或,
(4)第13位天冬酰胺突变为谷氨酸,并将第90位丝氨酸突变为精氨酸;或,
(5)第13位天冬酰胺突变为谷氨酸、第90位丝氨酸突变为精氨酸,及第254位脯氨酸突变为丙氨酸。
3.一种编码权利要求1或2所述的普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶PtDAPDH突变体的基因。
4.一种包含权利要求3所述的基因的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体,其特征在于,所述的表达载体上还包含PmLAAD编码基因和BmGDH编码基因。
6.根据权利要求5所述的表达载体,其特征在于,所述的PmLAAD编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示,所述的BmGDH编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.一种含有权利要求4~6所述的表达载体的重组菌。
8.权利要求7所述的重组菌在制备D-对羟基苯甘氨酸中的应用。
9.权利要求8所述的应用,其特征在于,所述的应用是以L-对羟基苯甘氨酸为反应底物,以所述的重组菌细胞为催化剂催化生产D-对羟基苯甘氨酸。
10.权利要求8所述的应用,其特征在于,在催化反应中,反应条件为在pH8.0~8.5、30~37℃条件下反应12~24h,重组菌细胞的添加量为终浓度10~60g/L。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211084151.0A CN115838696A (zh) | 2022-09-06 | 2022-09-06 | 普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211084151.0A CN115838696A (zh) | 2022-09-06 | 2022-09-06 | 普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115838696A true CN115838696A (zh) | 2023-03-24 |
Family
ID=85575423
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211084151.0A Pending CN115838696A (zh) | 2022-09-06 | 2022-09-06 | 普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115838696A (zh) |
-
2022
- 2022-09-06 CN CN202211084151.0A patent/CN115838696A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11535839B2 (en) | Encoding genes of nitrilase mutants and application thereof | |
CN111269900B (zh) | 一种l-氨基酸脱氨酶突变体的制备及其应用 | |
CN108467860B (zh) | 一种高产γ-氨基丁酸的方法 | |
CN111254129B (zh) | 一种多聚磷酸激酶突变体及其应用 | |
CN102277338A (zh) | 双羰基还原酶突变体及其应用 | |
CN112877307B (zh) | 一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用 | |
CN112359036B (zh) | 一种催化活力和反应专一性提高的腈水解酶突变体及应用 | |
CN104152506A (zh) | 醛酮还原酶的重组菌粗酶体系催化合成(s)-n,n-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺的方法 | |
CN110964708A (zh) | 一种枯草芽孢杆菌L-天冬氨酸α-脱羧酶突变体及其应用 | |
CN113337495B (zh) | 一种提高唾液酸产量的方法与应用 | |
CN111004787B (zh) | 一种链霉菌磷脂酶d突变体、改造方法及其应用 | |
CN112746061A (zh) | 内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用 | |
CN110904088B (zh) | 耐高温d-阿洛酮糖3-差向异构酶、突变体及其应用 | |
CN110577940B (zh) | 马克斯克鲁维酵母醛酮还原酶KmAKR突变体及其应用 | |
CN109593739B (zh) | 重组酮酸还原酶突变体、基因、工程菌及其应用 | |
CN108060203B (zh) | 一种全细胞混合转化甘油生产1,3-丙二醇的方法 | |
CN114350631B (zh) | 草铵膦脱氢酶突变体、工程菌、固定化细胞及应用 | |
CN115838696A (zh) | 普雷沃氏菌内消旋—二氨基庚二酸脱氢酶突变体及其应用 | |
CN112481320B (zh) | 一种催化效率高的制备(-)γ-内酰胺的方法 | |
CN110951717B (zh) | 一种l-阿拉伯糖异构酶异构体及其应用 | |
CN114196659B (zh) | 酰胺酶突变体、编码基因、工程菌及其应用 | |
CN115261367B (zh) | 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用 | |
CN111057698B (zh) | L-阿拉伯糖异构酶、突变体及其应用 | |
CN108034649A (zh) | 一种葡萄糖异构酶突变体及其应用 | |
CN114231507B (zh) | 一种胆分节杆菌胆碱氧化酶突变体及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |