CN115261367B - 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用 - Google Patents

一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115261367B
CN115261367B CN202210646849.0A CN202210646849A CN115261367B CN 115261367 B CN115261367 B CN 115261367B CN 202210646849 A CN202210646849 A CN 202210646849A CN 115261367 B CN115261367 B CN 115261367B
Authority
CN
China
Prior art keywords
enzyme
lactulose
mutant
chce
cellobiose epimerase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210646849.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115261367A (zh
Inventor
贾东旭
柳志强
金利群
王番
余海
郑裕国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University of Technology ZJUT
Original Assignee
Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University of Technology ZJUT filed Critical Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority to CN202210646849.0A priority Critical patent/CN115261367B/zh
Publication of CN115261367A publication Critical patent/CN115261367A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115261367B publication Critical patent/CN115261367B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/03—Racemaces and epimerases (5.1) acting on carbohydrates and derivatives (5.1.3)
    • C12Y501/03011—Cellobiose epimerase (5.1.3.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第335位或第271位进行突变获得。本发明筛选得到一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体，增强了70℃下的酶半衰期，提高了酶对合成乳果糖所用底物乳糖的底物亲和力和转化效率。运用含有改造酶的基因工程菌进行生物转化，产物乳果糖得率显著增加。本发明展示了纤维二糖差向异构酶在合成乳果糖绿色环保、毒性低，副产物少和产物得率高的技术优势，经过分子改造获得的纤维二糖差向异构酶突变体扩展了相对稀少的乳果糖异构酶酶库，展示了重要的工业应用前景。

Description

一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在催化乳糖异构化制备乳果糖中的应用。
(二)背景技术
乳果糖(4-O-β-半乳糖苷-D-果糖)，是由一分子半乳糖和一分子果糖经β-1,4糖苷键缩合而成的二糖。乳果糖因其对双歧杆菌增殖因子的作用，可用作食品添加剂添加在婴儿奶粉、酸奶中；乳果糖口服液可有效治疗高血氨疾病和慢性便秘，在100多个国家作为常见非处方药使用，需求量巨大。乳果糖制备可分为化学法和生物法，传统的化学法制备乳果糖的过程中需要加入大量的化学试剂，对反应条件要求苛刻，因此生物法制备乳果糖成为最近的研究热点。
生物合成法是指利用酶或者含有该酶的细胞作为生物催化剂转化底物生成相关产物。生物合成法具备独特的优势：生物酶自身无毒，环境压力小；催化具有高立体选择性和区域选择性，适用于结构复杂物质的相互转化；反应条件温和，能耗负担小。目前，利用生物合成法异构化制备多种糖类化合物，已成为制糖工业绿色化的突破点。
生物法可分为β-半乳糖苷酶法和纤维二糖差向异构酶法，β-半乳糖苷酶法需要添加乳糖和果糖作为底物，副产物种类繁多，产物得率低(7.5～30％)，不适宜开展工业化。相比之下，纤维二糖差向异构酶(cellobiose 2-epimerase，EC 5.1.3.11，简称CE)能够直接利用乳糖为底物合成乳果糖，反应后只存在唯一副产物依匹乳糖，产物得率相较于β-半乳糖苷酶更具优势。目前，已有Caldicellulosiruptor saccharolyticus CE(CsCE)、Caldicellulosiruptor obsidiansis CE(CoCE)、Dictyoglomus turgidum CE(DtCE)和Dictyoglomus thermophilum CE(DitCE)等酶具备合成乳果糖的能力。其中CsCE报道最多，使用最为广泛。
然而，CE仍然受到以下限制：高温有利于提高异构化反应速率、降低副产物依匹乳糖生成，而天然CE酶往往对长时间高温的耐受力较差；但各国药典乳果糖溶液中对依匹乳糖含量均有严格限制，因此合成乳果糖的反应中需要降低依匹乳糖含量。
蛋白质工程可对天然生物酶的不足进行针对性改造，以达到预期的优良特性。本发明通过开发新型纤维二糖差向异构酶，对其实施分子改造，获得高效制备乳果糖的生物催化剂，对于满足人民群众日益增长的摄糖需求具有重要意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种纤维二糖差向异构酶突变体、编码基因、工程菌及其在微生物催化乳糖异构化制备乳果糖中的应用，特别是突变体ChCE/K335Q，为乳果糖制备工艺提供一种绿色高效的生物制备方法。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种纤维二糖差向异构酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第335位或第271位进行突变获得的；优选将第335位赖氨酸突变为谷氨酰胺(K335Q)，编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；或第271位缬氨酸变为亮氨酸(V271L)，编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明还涉及一种所述纤维二糖差向异构酶突变体的编码基因，包含所述编码基因的重组载体，以及包含所述重组载体的重组基因工程菌；所述重组载体以pET28b为载体，插入位点Xba I和Xho I，所述重组基因工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主菌。
本发明还提供一种所述纤维二糖差向异构酶突变体在催化乳糖制备乳果糖中的应用，所述的应用为：以含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌(优选E.coli BL21(DE3)/ChCE/K335Q)经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶作为生物催化剂，以乳糖为底物，以pH 6-8的缓冲液为反应介质构成反应体系，在50-80℃、100-200r/min条件下反应，反应液分离纯化，获得乳果糖。
优选，所述湿菌体按如下方法制备：将含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌划线至LB固体培养基，37℃倒置培养12h，接种于含终浓度50μg/mL的卡那霉素抗性的10mL LB液体培养基中，37℃培养8h；培养液以2％(v/v)转接量转接至含终浓度50μg/mL的卡那霉素抗性的100mL LB培养基中，在37℃，150r/min的条件下培养OD600＝0.6-0.8，添加终浓度为0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，在28℃，150r/min条件下，诱导发酵12h，离心弃上清液，收集湿菌体。
优选，所述纯酶按如下方法制备：将含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌发酵培养的湿菌体按1g湿菌体用20mL的50mM HEPES(pH 7.5)缓冲液重悬，在50W条件下超声破碎30min，工作1s间隔2s，破碎混合液在8000r/min离心10min，收集上清液即为粗酶液，作为上样液；采用nickel-NTA亲和层析柱(Bio-Scale Mini Profinity IMAC预装柱，40mm长×12.6mm内径)进行纯化，先用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mMNaCl，20mM咪唑，pH 8.0)平衡层析柱，上样液以1mL/min的速度上样(优选4个柱体积)，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)以1mL/min的速度进行洗脱，根据紫外检测器和电导率检测器的信号响应，当紫外检测器的信号和电导率检测器信号同时上升时收集相应的洗脱液，当电导率检测器信号不变且紫外检测器的信号下降时停止收集，即为纯酶。
优选的，所述反应液分离纯化制备乳果糖的方法为：将反应液，以10000rpm离心10min，收取上清液，再以1.5mL/min的速率通过DOWEX MONOSPHERE 77阴离子交换树脂和DOWEX MONOSPHERE 88阳离子交换树脂柱洗脱盐离子，待溶液电导响应值趋近于零，停止脱盐；收集富含乳果糖的洗脱液；洗脱液减压蒸馏浓缩至糖浓度约为85％，加入200目的一水乳糖粉作为晶种进行结晶，晶种添加量与溶液占比为0.002-0.004％％(w/w)，再以6℃/h的速度降温冷却结晶出乳糖晶体，10000rpm离心10min，得到乳果糖糖浆。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明筛选获得了新型纤维二糖差向异构酶，扩展了相对稀少的酶库，克服了高产乳果糖纤维二糖差向异构酶酶库中酶数量相对稀缺的问题。同时，创制了纤维二糖差向异构酶突变体，突变体70℃下的半衰期为85.3min，为原始酶的2.2倍。突变体底物亲和力和催化效率都优于原始酶。通过突变改善野生酶高温下半衰期过短问题，突变酶相对作用时间长，产物得率提高了9.2％。本发明展示了纤维二糖差向异构酶在合成乳果糖绿色环保、毒性低，副产物少和产物得率高的技术优势，所获得的突变酶具有重要的工业应用前景。
(四)附图说明
图1为原始酶ChCE、CaCE和RbCE的SDS-PAGE电泳图。
图2为实施例1中催化乳糖转化乳果糖反应的高效液相色谱检测图。
图3为原始酶ChCE(A)及突变酶ChCE/K335Q(B)的最适反应温度。
图4为原始酶ChCE(A)及突变酶ChCE/K335Q(B)的半衰期。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：纤维二糖差向异构酶的选择与活力测定
1、原始酶(简称CE)的筛选与重组菌的构建
以报道的纤维二糖差向异构酶Caldicellulosiruptor saccharolyticus CE(GenBank编号WP_011915904.1)核心催化区域为探针，从NCBI数据库中获得三株未被研究的异构酶，分别为来源于热水热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor hydrothermalis，GenBank编号WP_013402241.1)、醋酸热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor acetigenus，GenBank编号WP_013433378.1)及瘤胃球细菌(Ruminococcus bicirculans，GenBank编号WP_186490421.1)，并分别命名为ChCE、CaCE和RbCE。依据大肠杆菌密码子偏好性对上述酶的氨基酸序列进行密码子优化，通过基因工程常规操作以全合成的方法合成核苷酸序列，其中，ChCE的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；CaCE的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4；RbCE的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。各个原始酶编码基因的两端加入酶切位点Xba I和Xho I，将该基因克隆至pET28b(+)对应的Xba I和Xho I位点，获得重组表达质粒pET28b/ChCE、pET28b/CaCE和pET28b/RbCE。
2、原始酶重组菌的转化与诱导表达
将步骤1获得的重组表达质粒pET28b/ChCE、pET28b/CaCE和pET28b/RbCE分别转化至E.coli BL21(DE3)受体菌，涂布于含终浓度100mM卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃下培养12h后，于平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒分别进行琼脂糖凝胶电泳鉴定和核苷酸序列测定，获得含ChCE、CaCE及RbCE基因的基因工程菌，即为E.coli BL21(DE3)/pET28b/ChCE、E.coli BL21(DE3)/pET28b/CaCE、E.coli BL21(DE3)/pET28b/RbCE。同时以表达质粒pET28b为对照，构建E.coli BL21(DE3)/pET28b。
将上述基因工程菌分别接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃、150r/min培养8h，获得种子液；将种子液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、150r/min培养OD600至0.6-0.8，再向培养液中加入终浓度1mM的IPTG，于28℃下诱导表达12h后，4℃、8000r/min离心10min，弃去上清液，并收集湿菌体，备用。所得菌体的可溶表达SDS-PAGE结果见图1。
3、CE酶活检测
反应体系：50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)、200mM乳糖及25g/L湿菌体，共1mL体系。反应条件：70℃条件下反应20min，冰浴10min终止反应。取反应液采用HPLC检测乳果糖含量，其中乳果糖(Lactulose)、乳糖(Lactose)和依匹乳糖(Epilactose)三者标样混合进行液相检测后各物质的保留时间及分辨率见图2。
HPLC检测条件：Agilent 1260HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，ShodexVG-50-4E色谱柱，Agilent示差检测器，流动相采用75％(v/v)乙腈、20％(v/v)的甲醇和5％超纯水的混合溶液，柱温设定为40℃，流速为1mL/min，采用外标法，根据峰的保留时间和峰面积来确定乳果糖的产量。酶活定义：70℃和pH 7.5下，每分钟将乳糖异构化生成1μmol乳果糖所需酶量定义为一个酶活单位(U)。3株筛选的潜在CE的酶活计算结果见表1。
表1：CE酶活测定
由表1结果可知E.coli BL21(DE3)/pET28b以及E.coli BL21(DE3)/pET28b/RbCE的酶活均为0，E.coli BL21(DE3)/pET28b/ChCE为26.4U/g，E.coli BL21(DE3)/pET28b/CaCE为13.2U/g，E.coli BL21(DE3)/pET28b/ChCE的酶活表现最佳。
实施例2：原始酶ChCE的分子改造
1、选择突变位点
选择酶活最高的ChCE为研究对象，利用计算机软件FoldX(http://foldxsuite.crg.eu/)模拟野生酶位点突变前后热稳定性的变化，通过网络计算给出候选突变位点K335Q、E250M和V271L。
2、突变体构建
根据原始酶ChCE的基因序列(氨基酸序列为SEQ ID NO.2，核苷酸序列为SEQ IDNO.1)设计定点突变的突变引物，利用快速PCR技术，以重组载体pET28b/ChCE为模板，分别对第335、250和271位引入单突变，设计引物为：
正向引物K335Q：CAGCGATTCAAACCTGGGAATTTATTAAAG(下划线为突变碱基)
反向引物K335Q：TCCCAGGTTTGAATCGCTGCGTCCAGATAT(下划线为突变碱基)
正向引物E250M：ATGACATAATGGCAAGCTGGTTACTGGATG(下划线为突变碱基)
反向引物E250M：CAGCTTGCCATTATGTCATGTCCATAGCTC(下划线为突变碱基)
正向引物V271L：AGAAGCAATTGGAAAAACTGAGCCTGGAAG(下划线为突变碱基)
反向引物V271L：AGTTTTTCCAATTGCTTCTTCAGTTTTTCA(下划线为突变碱基)
PCR反应体系：2×Phanta Max Buffer 10μL，dNTPs 0.4μL，正向引物0.4μL(5pmol/μL)，反向引物0.4μL(5pmol/μL)，模板DNA0.4μL(20ng/μL)，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polym erase 0.4μL，加入ddH2O至20μL。
PCR扩增条件为95℃5min；(95℃15s，54℃15s，72℃6min)30×循环；72℃10min。
3、突变体转化表达
取5μL的PCR产物，加入100μL冰浴的E.coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中，冰上静置30min，将转化产物于42℃热击90s，迅速置于冰上冷却5min，向管中加入600μL的LB液体培养基，37℃，150r/min培养60min，4000r/min离心1min，弃去400μL上清液并重悬菌液。取200μL上述重悬液涂布于含终浓度50μg/mL卡那霉素抗性LB固体培养基板，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12h，挑取菌落接种于含终浓度50μg/mL的卡那霉素抗性的10mLLB液体培养基中，37℃培养12h，获得各自的菌液。菌液送至测序公司检测核苷酸序列且测序结果比对正确，即为含突变酶重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28b/ChCE/K335Q、E.coliBL21(DE3)/pET28b/ChCE/E250M、E.coli BL21(DE3)/pET28b/ChCE/V271L。
4、上述突变体热稳定性初筛
将步骤3含酶重组菌液以2％(v/v)转接量转接至含终浓度50μg/mL的卡那霉素抗性的100mL LB培养基中，在37℃，150r/min的条件下培养OD600＝0.6-0.8，添加终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达，在28℃，150r/min条件下，诱导12h，离心弃上清液收集菌体。1g湿菌体用20mL的50mM HEPES(pH 7.5)缓冲液重悬，在80℃下孵育15min，取培养液按实施例1方法检测(残余)酶活，以各酶的初始酶活为100％，孵育之后的酶活与之相比，所得结果见表2。其中，ChCE/K335Q、ChCE/E250M和ChCE/V271L的残余酶活分别为60.3％、2.3％和30.2％，说明在导入K335Q对ChCE的热稳定性提升最为显著，明显优于原始酶ChCE。
表2：各CE的残余酶活测定
实施例3：原始酶ChCE与突变酶ChCE/K335Q的纯化
1、重组酶培养与细胞破碎
将实施例1构建的E.coli BL21(DE3)/pET28b/ChCE，实施例2构建的E.coli BL21(DE3)/pET28b/ChCE/K335Q分别划线至LB固体培养基，37℃倒置培养12h，挑取单菌落接种于10mL LB液体培养基，37℃下培养8h，接着以2％(v/v)转接量转接至100mL LB培养基中，在37℃、150r/min的条件下培养OD600＝0.6-0.8，添加终浓度为0.1mM的IPTG诱导表达，在28℃、150r/min条件下，诱导12h，离心弃上清液收集菌体。
将1g湿菌体用20mL的50mM HEPES(pH 7.5)缓冲液重悬，在50W条件下超声破碎30min，期间工作1s，间隔2s，破碎混合液在8000r/min离心10min，收集上清液即为粗酶液，作为上样液。
2、纯化重组酶
采用nickel-NTA亲和层析柱(Bio-Scale Mini Profinity IMAC预装柱，40mm长×12.6mm内径)进行纯化，先用平衡缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，20mM咪唑，pH8.0)平衡层析柱，上样液以1mL/min的速度上样20mL(4个柱体积)，再使用洗脱液(50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)以1mL/min的速度进行洗脱，根据紫外检测器和电导率检测器的信号响应，当紫外检测器信号和电导率检测器信号同时上升时收集相应的洗脱液，当电导率检测器信号不变且紫外检测器的信号下降时停止收集，即为各自纯酶液。采用BCA试剂盒分别测试纯酶液的蛋白浓度，结果分别为2.7mg/mL和2.9mg/mL，后续实施例所用纯酶液均以蛋白含量计量。
实施例4：原始酶ChCE及突变酶ChCE/K335Q的最适反应温度测定
将实施例3制备的纯酶液作为转化用酶，测定酶的最适反应温度。反应体系：200mM的乳糖和0.4mg/mL纯酶液，再加入50mM HEPES(pH 7.5)缓冲液至总体系1mL。于不同温度(40、50、60、65、70、75、80、85、90℃)条件下反应20min，其他条件同实施例1的酶活检测方法，结果见图3所示。由图可知，原始酶ChCE和突变酶ChCE/K335Q的最适反应温度均为70℃。
实施例5：原始酶ChCE及突变酶ChCE/K335Q的热稳定性测定
将实施例3制备的原始酶ChCE及突变酶ChCE/K335Q纯酶液分别放置在70℃的水浴锅中保温120min，每隔15min取样，采用实施例1方法测定(残余)酶活，结果见图4。其中，原始酶ChCE在70℃下的半衰期为52min，突变体酶ChCE/K335Q在70℃下的半衰期为85.3min，是野生型酶ChCE的1.6倍。
实施例6：原始酶ChCE及突变体酶ChCE/K335Q的动力学参数计算
选择不同浓度乳糖(50、100、150、200、300、400、600和800mM)和0.4mg/mL实施例3制备的纯酶液，加入50mM HEPES(pH 7.5)缓冲液至总体系1mL。于70℃条件下反应20min，冰浴10min终止反应。采用实施例1所述方法计算酶活，采用计算机软件Origin拟合得到ChCE及其突变体K335Q的动力学参数，结果见表3。其中，ChCE的Km为80.32mM、kcat为82.63min-1、kcat/Km为1.03min-1·mM-1；ChCE/K335Q的Km为66.73mM、kcat为78.69min-1、kcat/Km为1.18min-1·mM-1。从该结果可知，突变酶ChCE/K335Q对底物乳糖的亲和力更好、催化效率更高。
表3：酶动力学参数测定
实施例7：E.coli BL21(DE3)/pET28b/ChCE与E.coli BL21(DE3)/pET28b/ChCE/K335Q转化乳果糖进程对比
按照实施例1中的方法制备E.coli BL21(DE3)/pET28b/ChCE和E.coli BL21(DE3)/pET28b/ChCE/K335Q重组菌湿菌体，将其作为生物催化剂，以乳糖为底物，生物转化制备乳果糖。催化体系：150g/L或者250g/L的乳糖、50g/L湿菌体，再加入适量50mM HEPES缓冲液(pH 7.5)至总体系100mL。反应体系于70℃、150r/min条件下反应240min，反应液用0.22μm膜过滤后，取滤液采用实施例1所述HPLC检测乳糖(Lactose)、乳果糖(Lactulose)和依匹乳糖(Epilactose)浓度。最终绘制转化进程表，见表4和表5。
表4以150g/L乳糖为底物的反应过程
表5以250g/L乳糖为底物的反应过程
由表4和表5可知，当底物浓度分别为150g/L和250g/L，反应240min后，E.coliBL21(DE3)/ChCE/K335Q生成乳果糖68.5g/L和78.2g/L，产物得率(即乳果糖终浓度与初始浓度之比)为45.7％和31.3％。相比之下，E.coli BL21(DE3)/pET28b/ChCE生成乳果糖分别为52.5g/L和57.4g/L，产物得率为35.0％和22.9％，突变体ChCE/K335Q的产物得率明显高于野生型。另外，无论以150g/L还是250g/L底物进行反映，突变体E.coli BL21(DE3)/ChCE/K335Q生成的依匹乳糖浓度显著低于原始酶。以上结果说明突变体E.coli BL21(DE3)/ChCE/K335Q在热力学和动力学两方面对乳果糖得率产生了促进作用，具有重要的工业应用价值。
实施例8：乳果糖产物分离纯化
将实施例7中，分别收集以E.coli BL21(DE3)/pET28b/ChCE与E.coli BL21(DE3)/pET28b/ChCE/K335Q为催化剂，250g/L底物、100mL量反应体系的反应液，以10000rpm离心10min，收取上清液，再以1.5mL/min的速率通过DOWEX MONOSPHERE 77阴离子交换树脂和DOWEX MONOSPHERE 88阳离子交换树脂柱洗脱盐离子，待溶液电导响应值趋近于零，停止脱盐。收集富含乳果糖的洗脱液；洗脱液减压蒸馏浓缩至糖浓度约为85％，加入200目的一水乳糖粉作为晶种进行结晶，晶种添加量与溶液占比为0.002％(w/w)，再以6℃/h的速度降温冷却结晶出乳糖晶体，10000rpm离心10min，得到乳果糖糖浆。经过计算，E.coli BL21(DE3)/pET28b/ChCE反应体系回收乳果糖49.4g，回收率86％；E.coli BL21(DE3)/pET28b/ChCE/K335Q反应体系回收乳果糖含量69.6.g，总回收率达到89％。SEQ ID NO.1热水热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor hydrothermalis)
SEQ ID NO.2热水热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor hydrothermalis)
SEQ ID NO.3醋酸热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor acetigenus)
SEQ ID NO.4醋酸热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor acetigenus)
SEQ ID NO.5瘤胃球细菌(Ruminococcus bicirculans)
SEQ ID NO.6瘤胃球细菌(Ruminococcus bicirculans)
SEQ ID NO.7热水热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor hydrothermalis)
SEQ ID NO.8热水热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor hydrothermalis)
SEQ ID NO.9热水热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor hydrothermalis)
/>
SEQ ID NO.10热水热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor hydrothermalis)
/>

Claims (7)

1.一种纤维二糖差向异构酶突变体，其特征在于，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第335位赖氨酸突变为谷氨酰胺；或第271位缬氨酸变为亮氨酸。
2.一种权利要求1所述纤维二糖差向异构酶突变体的编码基因。
3.一种包含权利要求2所述编码基因的重组基因工程菌。
4.一种权利要求1所述纤维二糖差向异构酶突变体在催化乳糖制备乳果糖中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶作为生物催化剂，以乳糖为底物，以pH 6-8的缓冲液为反应介质构成反应体系，在50-80℃、100-200r/min条件下反应，获得乳果糖。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述湿菌体按如下方法制备：将含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌划线至LB固体培养基，37℃倒置培养12h，接种于含终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养8h；培养液以体积浓度2％的转接量转接至含终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB培养基中，在37℃，150r/min的条件下培养OD600＝0.6-0.8，添加终浓度为0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷，在28℃，150r/min条件下，诱导发酵12h，离心弃上清液，收集湿菌体。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述纯酶按如下方法制备：将含纤维二糖差向异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌发酵培养的湿菌体用pH 7.5、50mM HEPES缓冲液重悬，在50W条件下超声破碎30min，期间工作1s间隔2s，破碎混合液在8000r/min离心10min，收集上清液即为粗酶液，作为上样液；采用nickel-NTA亲和层析柱进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，上样液以1mL/min的速度上样，再使用洗脱液以1mL/min的速度进行洗脱，收集含目标蛋白的流出液，即为纯酶；所述平衡缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液，300mMNaCl，20mM咪唑，pH 8.0；所述洗脱液：50mM磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0。
CN202210646849.0A 2022-06-08 2022-06-08 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用 Active CN115261367B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210646849.0A CN115261367B (zh) 2022-06-08 2022-06-08 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210646849.0A CN115261367B (zh) 2022-06-08 2022-06-08 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115261367A CN115261367A (zh) 2022-11-01
CN115261367B true CN115261367B (zh) 2023-10-20

Family

ID=83760218

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210646849.0A Active CN115261367B (zh) 2022-06-08 2022-06-08 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115261367B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112852796A (zh) * 2021-03-30 2021-05-28 南京朗奈生物技术有限公司 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在制备乳果糖中的应用
CN113699087A (zh) * 2021-08-23 2021-11-26 齐鲁工业大学 一种转化乳糖生成乳果糖的植物乳杆菌工程菌株及其构建方法与应用
CN114317509A (zh) * 2021-12-30 2022-04-12 江南大学 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112852796A (zh) * 2021-03-30 2021-05-28 南京朗奈生物技术有限公司 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其在制备乳果糖中的应用
CN113699087A (zh) * 2021-08-23 2021-11-26 齐鲁工业大学 一种转化乳糖生成乳果糖的植物乳杆菌工程菌株及其构建方法与应用
CN114317509A (zh) * 2021-12-30 2022-04-12 江南大学 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN115261367A (zh) 2022-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112375750B (zh) 一种糖基转移酶突变体及其催化合成莱鲍迪苷a的方法
CN111500566B (zh) 一种海藻糖合成酶突变体及其制备方法和应用
CN110862980B (zh) 一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体及其应用
CN110904088B (zh) 耐高温d-阿洛酮糖3-差向异构酶、突变体及其应用
CN115786319A (zh) 一种热稳定性提高的d-阿洛酮糖3-差向异构酶及突变体
CN115261367B (zh) 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用
CN114317509B (zh) 一种纤维二糖差向异构酶突变体及其应用
CN114277043B (zh) 一种耐热甘露糖苷酶基因及其表达蛋白和应用
CN115960879A (zh) 一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法及获得的突变体
CN113564151B (zh) 一种提高ce酶结构异构催化活性的方法及其突变体
CN115261366B (zh) 一种耐高温纤维二糖差向异构酶突变体、工程菌及其应用
CN114836406A (zh) 一种催化活力提高的琼胶酶突变体及其应用
CN110804602B (zh) 一种L-天冬氨酸β-脱羧酶突变体及其应用
CN108034649B (zh) 一种葡萄糖异构酶突变体及其应用
CN108251406B (zh) L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶及其在催化合成稀有糖d-阿洛酮糖中的应用
CN111057697A (zh) 耐高温TIM barrel蛋白突变体及其应用
CN110452899B (zh) 一种葡萄糖异构酶、突变体及其在制备d-果糖中的应用
CN110904087B (zh) L-阿拉伯糖差向异构酶突变体及其应用
CN117778354B (zh) 昆布多糖降解酶OUC-ScLam39突变体及其编码基因与应用
CN114015735B (zh) 一种蔗糖磷酸化酶和葡萄糖异构酶级联催化合成黑曲霉二糖的方法
CN111057698B (zh) L-阿拉伯糖异构酶、突变体及其应用
CN110951717B (zh) 一种l-阿拉伯糖异构酶异构体及其应用
CN117778364A (zh) 一种纤维二糖差向异构酶突变体、工程菌及应用
CN116640740A (zh) 肠道微生物来源的岩藻糖基转移酶及其应用
CN117660429A (zh) 一种阿拉伯糖异构酶突变体及其构建方法、应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant