CN115960879A - 一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法及获得的突变体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法及获得的突变体，属于酶工程技术领域。本发明所提供的高通量筛选方法是基于在酸性Si(IV)–Mo(Ⅵ)显色液中，D‑果糖可将黄色钼酸盐Mo(Ⅵ)还原，生成蓝色钼酸盐Mo(V/Ⅵ)，其颜色深浅在一定范围内与D‑果糖的含量成正比，且在相同浓度水平下，D‑阿洛酮糖不会干扰D‑果糖的测定。同时，本发明还提供了D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶四点突变体，与该酶野生型相比，其在60℃下孵育1h后的残余酶活提升69.8％，最适温度提高5℃，在60℃下的半衰期值由0.64h增加到7.30h，因此其工业应用潜力得到明显提升。

Description

一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法及获得的突变体

技术领域

本发明涉及一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法及获得的突变体，属于酶工程技术领域。

背景技术

D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体，是当前研究最热的稀少糖。D-阿洛酮糖甜度约为蔗糖的70％，能量值却只有蔗糖的10％，是理想的蔗糖替代品。此外，D-阿洛酮糖具有多种优良的生理学功能，包括预防肥胖症、降低血糖、降低血脂、抗龋齿、抗氧化、治疗糖尿病和动脉粥样硬化疾病等。此外，在食品中添加D-阿洛酮糖还可以提高凝胶特性，并且通过美拉德反应改善食品的风味。目前，D-阿洛酮糖已被美国食品药品监督管理局(FDA)认证为普遍公认安全类食品(GRAS)，并且FDA在2019年允许D-阿洛酮糖在食品标签中不计入总糖和添加糖含量。

D-阿洛酮糖可以通过化学法合成，但存在反应条件苛刻、产物分离困难、化学污染等问题。相对于化学合成，生物转化法具有反应条件温和、环境友好、高度特异性等优点，D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAEase)能够催化D-果糖发生C-3位置的差向异构化反应，直接生成D-阿洛酮糖，是目前最为高效和常见的D-阿洛酮糖生产方法。

由于已报道的大多数DAEase热稳定性较差，难以满足工业实际应用的需求，国内外已开展针对DAEase热稳定性提升的分子改造研究，主要是基于蛋白融合技术和理性设计手段，包括温度因子(B-factor)分析、二硫键设计、亚基界面相互作用分析和计算机辅助折叠自由能(ΔΔG_Fold)计算等。

定向进化技术是酶功能强化的有效方法，但其在DAEase分子改造中的应用潜力还没有被充分挖掘，其主要瓶颈在于缺少快速高效的筛选方法。现有的DAEase高通量筛选方法，存在操作复杂、筛选成本高等问题。

发明内容

本发明利用D-果糖和D-阿洛酮糖在酸性Si(IV)–Mo(Ⅵ)显色液中还原能力的差异，建立了基于比色定量的高通量筛选方法，有效偶联DAEase突变体基因型与表型。本发明还提供了利用所述筛选方法，以来源于微生物Clostridium cellulolyticum的D-阿洛酮糖3-差向异构酶为亲本，经过多轮定向筛选获得的D-阿洛酮糖3-差向异构酶四点突变体，其热稳定性和酶活性都得到了增强。

本发明内容的目的是提供一种D阿洛酮糖3差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法以及热稳定性和酶活性增强的D-阿洛酮糖3-差向异构酶四点突变体、编码基因、重组载体和基因工程菌。

本发明采用的技术方案是：

本发明的第一个目的是提供一种基于比色定量的D阿洛酮糖3差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法，具体步骤如下：

1)以DAEase编码基因作为突变模板，基于易错PCR方法，使用低保真DNA聚合酶(rTaq，同时加入Mn²⁺(0.1mM)和Mg²⁺(6mM)产生和调节突变率，获得DAEase的随机突变文库，然后将待筛选的单菌落接种到96孔深孔板中，进行重组DAEase的诱导表达后得到发酵液；

2)将步骤1)得到的发酵液离心获取菌体沉淀，然后加入裂解液(含1mg/mL溶菌酶和1μL/mL DNase I)破碎细胞，将破碎后的细胞液离心取上清作为粗酶液，经60℃热处理10min后进行酶反应；所述酶反应为，将所述粗酶液添加至含有D-果糖的反应体系中，催化D果糖生成D阿洛酮糖；

3)酶反应10min后，加入4倍体积的Si(IV)–Mo(Ⅵ)显色液，在70℃下加热30min显色，冷却至室温后，于750nm波长下测定吸光度值。将野生型或出发型DAEase的平均酶活设为相对酶活100％，认定相对酶活大于120％的突变体为正向突变体。

本发明的第二个目的是提供一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的亲本酶D-阿洛酮糖3-差向异构酶的第38，42，70，119位氨基酸一个或多个进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶来源于Clostridiumcellulolyticum。

在本发明的一种实施方式中，编码所述亲本酶D-阿洛酮糖3-差向异构酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体为在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的基础上，将第38位丝氨酸突变为苯丙氨酸，第42位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第70位丙氨酸突变为脯氨酸和第119位苏氨酸突变为脯氨酸，命名为S38F/F42N/A70P/T119P。

在本发明的一种实施方式中，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体S38F/F42N/A70P/T119P的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体S38F/F42N/A70P/T119P的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的第三个目的是提供编码所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体S38F/F42N/A70P/T119P的基因。

本发明的第四个目的是提供携带所述突变体基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pET28a为表达载体。

本发明的第五个目的是提供表达所述突变体S38F/F42N/A70P/T119P的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述的基因工程菌以大肠杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述的基因工程菌以pET28a质粒为表达载体。

本发明的第六个目的是提供一种表达上述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，或携带上述基因，或携带上述重组载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以细菌或真菌为宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述的基因工程菌以大肠杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述的基因工程菌以pET28a质粒为表达载体。

本发明的第七个目的是提供一种提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶热稳定性的方法，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的第38位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，第42位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第70位的丙氨酸突变为脯氨酸，同时将第119位的苏氨酸突变为脯氨酸。

本发明的第八个目的是提供一种制备阿洛酮糖的方法，所述方法为，采用上述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体或上述重组细胞，以D-果糖为底物，反应制备得到阿洛酮糖。

本发明的第九个目的是提供所述高通量筛选方法在D-阿洛酮糖3-差向异构酶分子改造或所述的基因工程菌在D-阿洛酮糖工业生产的应用。

本发明的第十个目的提供上述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体或上述重组细胞在制备阿洛酮糖或含有阿洛酮糖的产品中的应用。

本发明还提供了所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体S38F/F42N/A70P/T119P的制备方法，所述方法为基于比色定量的高通量筛选方法，按照上述一种基于比色定量的D阿洛酮糖3差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法筛选得到所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体S38F/F42N/A70P/T119P。

有益效果

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

本发明提供了一种高效快速的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体文库的高通量筛选方法。同时，本发明还提供了利用所述筛选方法，筛选获得的D-阿洛酮糖3-差向异构酶四点突变体S38F/F42N/A70P/T119P，该突变体与该酶野生型相比，其在60℃下孵育1h后的残余酶活提升69.8％，最适温度提高5℃，5min热处理的半失活温度(T₅₀ ⁵)值从54.76℃上升至60.96℃，在60℃下的半衰期(t_1/2)值由0.64h增加到7.30h，同时其比酶活是野生型酶的1.23倍，在阿洛酮糖工业化生产中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1：酮糖与显色液反应的标准曲线。

图2：四点突变体酶与野生型酶的最适温度比较。

图3：四点突变体酶与野生型酶的半失活温度比较。

图4：四点突变体酶与野生型酶的半衰期比较。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB培养基(1L)：10g NaCl，10g胰蛋白胨和5g酵母提取物，121℃灭菌20min。使用前加入终浓度为50μg/mL的硫酸卡那霉素(Kan)。若要配制成固体培养基，则需在灭菌前加入1.5％(w/v)的琼脂粉。

ZYM-5052培养基(1L)：在712mL ZYM-A(8g胰蛋白胨，4g酵母提取物)中加入40mLZYP-B(20X)，40mL ZYP-C(20X)和8mL MgSO₄(100X)。

其中20X ZYP-B(400mL)：54g KH₂PO₄，143g Na₂HPO₄和26.4g(NH₄)₂SO₄；

20X ZYP-C(400mL)：40g甘油，4.4g葡萄糖和16g乳糖；

100X MgSO₄:(400mL)：2.46g MgSO₄。

ZYM-A，ZYP-B(20X)，ZYP-C(20X)和MgSO₄(100X)单独灭菌，用前混合。

下述实施例中所涉及的溶液的配制方法：

Si(IV)–Mo(Ⅵ)显色液：Si(IV)-Mo(Ⅵ)显色液的组成为：600mM Na₂MoO₄和50mMNa₂SiO₃，并调节pH至4.5～5.5。显色液使用前应清澈透明，如浑浊应重新配制。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

D-阿洛酮糖3-差向异构酶酶活的检测方法：

酶反应体系：以50g/L的D-果糖(50mM Tris HCl缓冲液，pH 7.5，含1mM Co²⁺)为底物，加入适当浓度的DAEase野生型酶或突变体酶。酶反应总体积为1mL。

酶活定义(U)：每分钟催化合成1μmol D-阿洛酮糖所需的酶量。

比酶活检测方法：在60℃下反应5min，煮沸10min终止酶反应。利用HPLC测定产物D阿洛酮糖的含量，从而计算DAEase野生型酶或突变体酶的比酶活，结果如表1所示。

残余酶活检测方法：将DAEase野生型酶或突变体酶置于60℃水浴中孵育60min，然后加至上述测定酶反应体系中测定酶活力。将未进行热处理的各重组酶活力定义为100％，计算热处理后的残余酶活。

实施例1：D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的制备

具体步骤如下：

1、D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变文库高通量筛选方法的建立

在酸性Si(IV)–Mo(Ⅵ)显色液中，D-果糖可将黄色钼酸盐Mo(Ⅵ)还原，生成蓝色钼酸盐Mo(V/Ⅵ)，其颜色深浅在一定范围内与D-果糖的含量成正比，且在相同浓度水平下，D-阿洛酮糖不会干扰D-果糖的测定。

(1)配置系列不同浓度的D-果糖和D阿洛酮糖标准溶液(浓度为0-20mM，具体为0,2,4,6,8,10,12,16,20mM)，分别取40μL D-果糖或D阿洛酮糖标准溶液，加入160μL新鲜配制的Si(IV)–Mo(Ⅵ)显色液，混合后在70℃下加热30min，加热结束后于室温放置10min，然后以纯水与显色液的反应液为空白对照，利用酶标仪测定其在750nm波长下的吸光值(OD₇₅₀)。

(2)以D-果糖或D阿洛酮糖浓度(mM)为横坐标，以OD₇₅₀为纵坐标绘制标准曲线。D-果糖和D阿洛酮糖与显色液反应的标准曲线见图1。经线性拟合，获得D-果糖的计算公式为y＝0.0374x-0.0059，R²为0.9987，表明该显色法可以作为高通量筛选的检测方法。

2、D-阿洛酮糖3-差向异构酶随机突变文库的构建

具体步骤如下：

(1)pET28a-Ptac-Cred的构建

以质粒pAGM22082_cRed(Addgene#117225)为模板，以T7_tac_F/T7_tac_R为引物，构建pET28a-Ptac-CRed。具体如下：

①引物设计，所用引物如下：

T7_tac_F：5’-ATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAA-3’；

T7_tac_R：5’-CGAGCCGATGATTAATTGTCAACCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGCG-3’；

②PCR扩增：

PCR反应体系，总体积为20μL，具体组成如下：10μL PrimeSTAR Max Premix(2×)，10ng模板质粒pAGM22082_cRed，以及正反向引物各0.2μM。

PCR反应程序如下：95℃预变性2min；95℃变性15s；56℃退火15s；72℃延伸7min；循环30次；72℃终延伸10min；4℃保存。

③PCR产物核酸电泳验证及模板消化：

通过琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物条带大小是否正确，验证无误后向PCR产物体系中加入1μL的Q.cut Dpn I和2μL的Q.cut Buffer(10×)，于37℃进行2h的酶切反应，以去除体系中的模板质粒，然后将消化产物转入E.coli DH5α感受态中，进行质粒提取后获得质粒pET28a-Ptac-CRed。

(2)pET28a-Ptac-CCDPE质粒的构建

合成编码来源于Clostridium cellulolyticum的DAEase的基因片段，并在合成过程中将6个组氨酸标签添加到目的基因片段的C末端，随后利用Bsa I限制性内切酶，将该重组基因片段引入E.coli表达载体pET28a-Ptac-CRed中，获得重组质粒pET28a-Ptac-CCDPE。重组基因片段的合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

(3)以含有Clostridium cellulolyticum来源的DAEase(SEQ ID NO.2)的编码基因(SEQ ID NO.1)的pET28a-Ptac-CCDPE质粒为模板，基于易错PCR方法，使用低保真DNA聚合酶(rTaq)，同时加入不同浓度的Mn²⁺和Mg²⁺产生和调节突变率。

所用引物如下，下划线处为Bsa I酶切位点：

正向引物F：5’-TTGGTCTCAAATGAAACATGGTATATACTACGCATATTGGG-3’；

反向引物R：5’-TTGGTCTCTAAGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGAGTGTTTAT-3’；

易错PCR反应体系，总体积为50μL，具体组成如下：2.5U rTaq DNA聚合酶，50ng质粒模板，6mM MgCl₂，0.1mM MnCl₂，0.2mM dATP，0.2mM dGTP，1mM dCTP，1mM dTTP，以及正反向引物各0.2μM。

易错PCR反应程序如下：95℃预变性2min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸60s；循环30次；72℃终延伸10min；4℃保存。

经过1％琼脂糖电泳后，使用胶回收试剂盒回收易错PCR产物，然后通过GoldenGate克隆方法将所回收易错PCR产物连接至pET28a-Ptac-CRed表达载体，并转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞中，得到随机突变文库。

3、D-阿洛酮糖3-差向异构酶随机突变文库的高通量筛选

(1)用无菌牙签或高通量挑菌机挑取突变体文库单克隆以及3个野生型或出发型DAEase单克隆(作为对照)，接种到每孔含有200μL LB培养基(含50μg/mL Kan)的96孔深孔板中，封膜后在37℃，200rpm，培养过夜；

(2)转接20μL过夜培养菌液至含1mL ZYM-5052培养基(含100μg/mL Kan)的96孔深孔板中，20℃，200rpm，培养24h，表达重组酶；

(3)将96孔深孔板放置于冷冻孔板离心机，4℃，4000rpm离心10min，弃去上清液，将菌体沉淀重悬于150μL裂解液(含1mg/mL溶菌酶和1μL/mL DNase I)，并放置于恒温摇床中(30℃，200rpm)，孵育1h以裂解细胞；

(4)4℃，4000rpm离心30min，取上清作为粗酶液，经60℃热处理10min后进行酶反应，酶反应10min后，加入4倍体积的Si(IV)–Mo(Ⅵ)显色液，在70℃下加热30min显色，冷却至室温后，于750nm波长下测定吸光度值。

由于DAEase酶活力越高，反应剩余D-果糖的含量越低，根据D-果糖与显色液反应的标准曲线，获得酶反应液中D-果糖的含量，进而确定重组酶活力。将野生型或出发型DAEase的平均酶活设为相对酶活100％，认定相对酶活大于120％的突变体为正向突变体，并进一步通过高效液相色谱分析进行复筛。测序结果显示，经最终复筛确认得到的以Clostridium cellulolyticum DAEase为出发模板的热稳定性和酶活力得到增强的突变体含S38F、F42N、A70P和T119P四点突变。

即得到含有突变体的重组菌：大肠杆菌TOP10/pET28a-Ptac-S38F/F42N/A70P/T119P、大肠杆菌TOP10/pET28a-Ptac-S38F、大肠杆菌TOP10/pET28a-Ptac-F42N、大肠杆菌TOP10/pET28a-Ptac-A70P、大肠杆菌TOP10/pET28a-Ptac-T119P及含有野生型的重组菌大肠杆菌TOP10/pET28a-Ptac-CCDPE。

实施例2：突变体酶和野生型酶的表达纯化

具体步骤如下：

(1)将实施例1得到的野生型重组菌和突变体重组菌分别接种至装有4mL含Kan抗性(终浓度为50μg/mL)的LB培养基中，于37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中培养12-14h，分别制备得到种子液。

(2)再按2％(v/v)的接种量，分别将种子液转接4mL～200mL含Kan抗性(终浓度为50μg/mL)的LB培养基中，于37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中培养2-3h，培养期间监测OD₆₀₀值，当OD₆₀₀值达到0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG作为诱导剂，于28℃，200rpm的恒温振荡培养箱中低温培养6-8h，诱导重组酶过量表达。

将诱导表达后的菌液，在4℃，8000rpm条件下离心10min，弃去上清液，收集菌体沉淀。

(3)向得到的菌体沉淀加入20mL Lysis buffer(100mM的NaCl，50mM的Tris，pH7.5)，轻柔吹吸，充分重悬后，置于冰盒中固定。将冰盒放入超声细胞破碎仪中进行超声破碎，程序设定为：功率200W，时间15min(开2s、关3s)。

将获得的细胞破碎液，在4℃，8000rpm条件下离心10min。离心结束后，用0.45μm水系滤膜过滤，分别得到粗酶液。

(4)纯化：

连接纯酶系统中恒流泵、Ni²⁺亲和层析柱、紫外检测器等装置之间的管路，设置恒流泵的流速为1mL/min，用去离子水进行检漏。纯酶系统准备就绪后，先用两个柱体积的Binding Buffer(50mM的Tris，500mM的NaCl，pH 7.5)平衡Ni²⁺亲和层析柱，再以0.5mL/min流速将粗酶液泵入层析柱。

待粗酶液全部进入层析柱后，继续用Binding Buffer洗去未吸附的蛋白和其他杂质。待检测器读数稳定后，泵入Washing Buffer(50mM的咪唑，50mM的Tris、500mM的NaCl，pH7.5)洗去结合能力较弱的杂蛋白。待检测器读数再次稳定后，泵入Elution Buffer(500mM的咪唑，50mM的Tris，500mM的NaCl，pH 7.5)将吸附的重组酶洗脱下来，并根据紫外检测器的信号值收集流出液，获得重组酶。

将得到的重组酶溶液转移至截留分子量为10kDa的透析袋中，用透析夹夹紧后放入Dialysis buffer I中，置于4℃的层析柜，透析18h，每次6h更换一次新鲜的Dialysisbuffer I(10mM的EDTA·2Na，50mM的Tris，pH 7.5)，以除去重组酶溶液中的咪唑以及其他金属离子。再将透析袋转移至Dialysis buffer II(50mM的Tris，pH 7.5)中，同样透析18h，每次6h更换一次新鲜的Dialysis buffer II。透析结束后，获得纯酶液，收集至10mL EP管中，于4℃冰箱保存，备用。

分别制备得到：S38F/F42N/A70P/T119P纯酶液、S38F纯酶液、F42N纯酶液、A70P纯酶液、T119P纯酶液及野生型CCDPE纯酶液。

实施例3：突变体酶和野生型酶的比酶活和残余酶活比较。

具体步骤如下：

(1)分别检测S38F/F42N/A70P/T119P纯酶液、S38F纯酶液、F42N纯酶液、A70P纯酶液、T119P纯酶液及野生型CCDPE纯酶液的比酶活，结果如表1所示。

(2)分别检测S38F/F42N/A70P/T119P纯酶液、S38F纯酶液、F42N纯酶液、A70P纯酶液、T119P纯酶液及野生型CCDPE纯酶液在60℃条件下的残余酶活；

检测方法：将DAEase野生型酶或突变体酶置于60℃水浴中孵育60min，然后加至上述测定酶反应体系中测定酶活力。将未进行热处理的各重组酶活力定义为100％，计算热处理后的残余酶活，结果如表1所示。

表1：突变体酶和野生型酶的比酶活和残余酶活比较

结果显示，4个单点突变体和四点突变体的比酶活和残余酶活较野生型酶均有一定提升，其中四点突变体S38F/F42N/A70P/T119P的残余酶活较野生型酶提升69.8％，说明其热稳定性得到提升显著。

实施例4：四点突变体酶和野生型酶的热稳定性比较。

通过最适温度、半失活温度(T₅₀ ⁵)以及半衰期(t_1/2)等指标来比较野生型酶及突变体酶的热稳定性。具体操作步骤如下：

1.最适温度比较

将实施例2中的野生型CCDPE纯酶和突变体酶S38F/F42N/A70P/T119P纯酶在50-80℃的温度区间内(每隔5℃设置一个温度点)进行酶反应。

除改变反应温度外，其他反应及检测条件同实施例3中的比酶活检测方法。将最适反应温度下的酶活力设定为100％相对酶活力，以计算其他温度下的相对酶活力。最适反应温度即为最高酶活力所对应的温度。

结果如图2所示，四点突变体S38F/F42N/A70P/T119P(MT4)的最适温度上升为70℃，与野生型酶相比提高了5℃。

2.半失活温度比较

将实施例2中的野生型CCDPE纯酶和突变体酶S38F/F42N/A70P/T119P纯酶在45-70℃的温度区间内孵育5min后测定酶活。

将未经热处理的初始酶活力设定为100％相对酶活力，以计算野生型酶和突变体酶在各个温度下经过5min热处理后的残余酶活力。

通过Boltzmann函数进行非线性拟合，获得当残余酶活降低到初始酶活的一半时所对应的温度，即为半失活温度(T₅₀ ⁵)值。

结果如图3所示，四点突变体S38F/F42N/A70P/T119P(MT4)的半失活温度(T₅₀ ⁵)值从54.76℃上升至60.96℃，与野生型酶相比提高了6.2℃。

3.半衰期比较

将实施例2中的野生型CCDPE纯酶和突变体酶S38F/F42N/A70P/T119P纯酶置于60℃水浴中进行恒温孵育，每隔一定的时间取出测定酶活。

将未经热处理的初始酶活力设定为100％相对酶活力，以计算野生型酶和突变体酶在经过不同热处理时间后的残余酶活力。

以热处理时间(h)为横坐标，以野生型酶和突变体酶残余酶活力的对数值为纵坐标作图。经线性拟合，获得失活速率常数(k_d)值。再根据以下方程计算半衰期(t_1/2)值：

t_1/2＝Ln2/k_d。

结果如图4所示，四点突变体S38F/F42N/A70P/T119P(MT4)在60℃下的半衰期(t_1/2)值由0.64h增加到7.30h，是野生型酶的11.4倍。

综上可见，四点突变体S38F/F42N/A70P/T119P(MT4)的热稳定性得到显著增强，与野生型酶相比具有更强的工业化应用前景。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，其特征在于，所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的第38位丝氨酸突变为苯丙氨酸，第42位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第70位丙氨酸突变为脯氨酸，同时将第119位苏氨酸突变为脯氨酸得到的。

2.权利要求1所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的制备方法，其特征在于，所述方法为基于比色定量的高通量筛选方法，包括以下步骤：

(1)以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的编码基因为突变模板，通过易错PCR方法构建DAEase的随机突变文库；然后将待筛选的单菌落接种到96孔深孔板中，进行重组DAEase的诱导表达后得到发酵液；

(2)将步骤(1)得到的发酵液离心获取菌体沉淀，然后加入裂解液破碎细胞，将破碎后的细胞液离心取上清作为粗酶液，经60℃热处理后进行酶反应；所述酶反应为，将所述粗酶液添加至含有D-果糖的反应体系中，催化D果糖生成D阿洛酮糖；

(3)酶反应结束后，加入Si(IV)–Mo(Ⅵ)显色液，在70℃下加热显色，冷却至室温后，于750nm波长下测定吸光度值；将野生型D-阿洛酮糖3-差向异构酶的平均酶活设为相对酶活100％，认定相对酶活大于120％的突变体为正向突变体；筛选得到权利要求1所述的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体。

3.编码权利要求1所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是以pET28a质粒为表达载体。

6.表达权利要求1所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，或携带权利要求3所述基因，或携带权利要求3或4所述重组载体的重组细胞。

7.根据权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以细菌或真菌为宿主细胞。

8.一种提高D-阿洛酮糖3-差向异构酶热稳定性的方法，其特征在于，所述方法为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的第38位的丝氨酸突变为苯丙氨酸，第42位的苯丙氨酸突变为天冬酰胺，第70位的丙氨酸突变为脯氨酸，同时将第119位的苏氨酸突变为脯氨酸。

9.一种制备阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述方法为，采用权利要求1所述的突变体或权利要求6或7所述的重组细胞，以D果糖为底物，反应制备得到阿洛酮糖。

10.权利要求1所述的突变体或权利要求6或7所述的重组细胞在制备阿洛酮糖或含有阿洛酮糖的产品中的应用。

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