CN107475219B

CN107475219B - 三种重组糖化酶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN107475219B
Application number: CN201710903102.8A
Authority: CN
Inventors: 黎明; 袁颢瑜; 路福平
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2037-09-29
Also published as: CN107475219A

Abstract

本发明通过将GATE(GenBank ID：AJ304803.1)和GAA1(GenBank ID:HQ537427.1)两种糖化酶基因的结构域重组及突变缺失，提供至少三种热稳定性好且酶活力高的重组糖化酶、制备方法与应用。本发明三种重组糖化酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示。本发明还提供了包括编码本发明糖化酶的核苷酸序列与表达载体连接而成的进行功能性表达的重组表达载体，以及包含有本发明重组表达载体的重组菌株及其后代。

Description

三种重组糖化酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及到由两种糖化酶结构域重组及突变获得的三种重组糖化酶及其制备方法与应用。

背景技术

糖化酶(EC.3.2.1.3.)，又称葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase,GA)，是一种具有外切酶活性的单链酸性糖苷水解酶，是水解淀粉产生葡萄糖的主要酶类，它能把淀粉从非还原性末端水解α-1,4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解α-1,6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖，同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。糖化酶有Ⅰ型(GAⅠ)和Ⅱ型(GAⅡ)2种类型，Ⅰ型有三个功能区催化结构域(CD)、O-糖基化连接域(Linker)及结合域(SBD)组成，Ⅱ型缺少SBD区域，少数甚至缺少O-糖基化连接域。

糖化酶是最早实现工业化生产的一种重要酶类，并且迄今为止仍是用途最广、产量最大的酶制剂之一，被广泛地应用于食品、医药、发酵等工业，具有很高的应用价值，受到国内外学者的高度重视。我国对于糖化酶的需求量呈逐年上升趋势，糖化酶生产菌株产糖化酶的活力及耐受性有待进一步提高。

随着研究的深入，对其酶学结构、作用机理、结构-功能相关性等问题有了一定的了解。近年来，越来越多的学者在分子水平上通过定点突变等方法对糖化酶结构域进行了研究，分析糖化酶的结构与功能的关系。本发明利用两株产糖化酶菌种埃墨森篮状菌(Talaromyces emersonii)和黑曲霉(Aspergillus niger)。前者产糖化酶的比活力较高，但酶的热稳定性较差；后者的稳定性较好，但产糖化酶的比活力不高。

发明内容

本发明的目的是针对两株产糖化酶菌种埃墨森篮状菌(Talaromyces emersonii)和黑曲霉(Aspergillus niger)，前者产糖化酶的比活力较高，但酶的热稳定性较差；后者的稳定性较好，但产糖化酶的比活力不高的现有问题，通过将两种糖化酶基因的结构域重组及突变缺失，提供至少三种热稳定性较好且酶活力较高的重组糖化酶、制备方法与应用。

本发明技术方案概述如下：

由亲本埃墨森篮状菌糖化酶GATE(GenBank ID：AJ304803.1)和黑曲霉糖化酶GAA1(GenBank ID:HQ537427.1)出发，通过PCR技术分别扩增两种糖化酶基因的三个结构域CD、Linker和SBD，得到GATE和GAA1的六个结构域片段GATECD、GATEL、GATESBD、GAA1CD、GAA1L、GAA1SBD(核苷酸序列依次如SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：9所示)；通过重叠PCR技术，将上述结构域重组，获得六种重组糖化酶GA1～GA6，筛选出其中酶活力较高的重组糖化酶GA1、GA2(氨基酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示)，再以重组糖化酶GA2为模板，通过PCR技术，扩增得到SBD区缺失突变的重组糖化酶GA7(氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)，构建三种重组糖化酶的重组菌株，重组菌发酵高效表达重组糖化酶。

用于表达重组糖化酶的表达载体为pJ912-19；用于所述的表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母X-33。

本发明重组糖化酶GA1、GA2或GA7的制备步骤概述如下：

(1)根据菌种黑曲霉(Aspergillus niger)和埃墨森篮状菌(Talaromycesemersonii)的糖化酶结构域分析，通过PCR技术扩增获得其糖化酶GAA1和GATE的结构域CD、Linker和SBD基因片段；

(2)通过重叠PCR技术，将GATE的CD、Linker及GAA1的SBD基因片段重组，在序列的5’端加上XHoⅠ酶切位点，3’端加上NotⅠ酶切位点和His-tag标签，得到重组糖化酶GA1基因；将GATE的CD及GAA1的Linker、SBD基因片段重组，在序列的5’端加上XHoⅠ酶切位点，3’端加上NotⅠ酶切位点和His-tag标签，得到重组糖化酶GA2基因；

(3)以GA2为模板，通过PCR方法，3’端加上NotⅠ酶切位点和His-tag标签，扩增得到SBD片段缺失突变的糖化酶GA7基因；

(4)重组糖化酶GA1、GA2、GA7基因分别与表达载体pJ912-19连接，得到重组表达载体；

(5)将重组表达载体电转入宿主细胞毕赤酵母X-33，得到重组菌株；

(6)将重组菌株转接培养，甲醇诱导表达96h，大量分泌表达重组糖化酶；

(7)分离纯化重组糖化酶，测定酶活及酶学性质。

本发明有益效果如下：

本发明获得三种重组糖化酶在毕赤酵母中得到高效表达，重组糖化酶GA1、GA2酶活分别为22041.3U/mL、17962.9U/mL，突变糖化酶GA7酶活为20163.8U/mL，耐温性好，pH稳定性高，可广泛应用于催化可溶性淀粉水解生产葡萄糖工业中。

附图说明

图1为本发明两种糖化酶GATE和GAA1的结构域重组方式。

图2为本发明构建的表达载体质粒图谱。

图3为本发明重组糖化酶GA1～GA7的酶活测定。

图4为毕赤酵母工程菌发酵上清液和分离纯化后的SDS-PAGE电泳图。

图5为本发明重组糖化酶不同作用温度下相对酶活折线图。

图6为本发明重组糖化酶不同pH下相对酶活折线图。

图7为本发明重组糖化酶GA7双倒数曲线图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实验条件：

1)菌株与质粒

菌株：大肠杆菌(Escherichia coli)JM109、毕赤酵母(Pichia pastoris)X-33；

质粒：pJ912-19(https://www.atum.bio/eCommerce/catalog/datasheet/56)，pYPGE15-GAA1、pYPGE15-GATE(由黑曲霉和埃墨森篮状菌基因组cDNA扩增出糖化酶基因GAA1和GATE，然后分别连接到pYPGE15载体得到)。

2)酶类及其他生化试剂均为本领域常规制剂。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：基因克隆及表达载体的构建

1.1糖化酶重组基因的获得

1.1.1糖化酶各结构域的扩增

根据NCBI报道的糖化酶GATE(GenBank ID：AJ304803.1)和GAA1(GenBank ID:HQ537427.1)序列，设计引物P912GA1SF，P912GA1R，P912TESF，P912TER，GATE1F，GATE1R，GATE2F，GATE2R，GAA1F，GAA1R，GAA2F，GAA2R，按照表1所示组合方法将GAA1和GATE的CD区域、Linker区域与SBD区域分别独立扩增出来(见下表1)，并将各部分产物切胶回收，得到两种糖化酶的六个结构域片段GAA1CD、GAA1L、GAA1SBD、GATECD、GATEL、GATESBD。

P912GA1SF：5’-ATActcgagAAAAGGATGTCGTTCCGATCTCTACTCGCCCTG-3’

P912GA1R：5’-ATAAGAATgcggccgcTCAATGGTGATGGTGATGATGCACAGTGACATACCAGAGCGGGTCGC-3’

P912TESF：5’-AAActcgagAAAAGGATGGCGTCCCTCGTTGCTGGCG-3’

P912TER：5’-ATAAGAATgcggccgcTCAATGGTGATGGTGATGATGCTGCCAACTATCGTCAAGAATGGCGGTA-3’

GAA1F：5’-GCTACCAACACCGTCTGGCCAAGCATCGTGGCTACTGGCGGCACCACTA-3’

GAA1R：5’-GGTTGTTGAGCTGCCAGAGCCAGAACTCGGCCACGAGGTGACAGTCAC-3’

GAA2F：5’-GTCAGCACCAGTTACGGGGAGACATGTACCACTCCCACCGCCGTGGCTG-3’

GAA2R：5’-GGGGATCGAGCCGGCCAGGTAGATGGAGGTTGATGACGTACTGGTGCTG-3’

GATE1F：5’-GTGACTGTCACCTCGTGGCCGAGTTCTGGCTCTGGCAGCTCAACAACC-3’

GATE1R：5’-TAGTGGTGCCGCCAGTAGCCACGATGCTTGGCCAGACGGTGTTGGTAGC-3’

GATE2F：5’-CAGCACCAGTACGTCATCAACCTCCATCTACCTGGCCGGCTCGATCCCC-3’

GATE2R：5’-CAGCCACGGCGGTGGGAGTGGTACATGTCTCCCCGTAACTGGTGCTGAC-3’

表1

用PCR方法分别扩增GATE的CD区域、CD+Linker区域及GAA1的CD区域、CD+Linker区域。PCR反应体系(50μL)：ddH₂O 36μL，模板2μL，10×buffer 5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，dNTP 4μL，pfu酶1μL。PCR反应条件：94℃2min；94℃45s，57℃45s，72℃3min，30个循环；72℃10min；4℃1h。经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的基因。

用PCR法分别扩增GATE的SBD区域、Linker+SBD区域及GAA1的SBD区域、Linker+SBD区域。PCR反应体系(50μL)：ddH₂O 37.4μL，模板2μL，10×buffer 5μL，上游引物0.6μL，下游引物2.4μL，dNTP 2μL，pyrobest酶0.6μL。PCR反应条件：94℃2min；94℃40s，55℃40s，72℃20s，10个循环；94℃40s，65℃40s，72℃20s，30个循环；72℃10min；4℃1h。经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的基因。

1.1.2基因GAA1与GATE的结构域重组

通过重叠PCR技术，将糖化酶GAA1和GATE的CD、Linker及SBD基因片段进行重新组合，根据糖化酶基因序列，在序列的5’端加上XHoⅠ酶切位点，3’端加上NotⅠ酶切位点和His-tag标签，获得六种重组糖化酶GA1～GA6基因(见表1)。PCR反应体系(50μL)：ddH₂O36μL，模板各2μL，10×buffer 5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，dNTP 2μL，pfu酶1μL。PCR反应条件：94℃5min，94℃40s，72℃3min，6个循环；94℃40s，55℃40s，72℃3min45s，6个循环；94℃40s，60℃40s，72℃3min45s，6个循环；94℃40s，56℃40s，72℃3min45s，20个循环；72℃10min；4℃1h。经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的基因。

1.1.3糖化酶基因GAA1、GATE的克隆

表2

糖化酶	模板	引物	产物
				GATE	pYPGE15-GATE	P912TESF/P912TER	GATE
GAA1	pYPGE15-GAA1	P912GA1SF/P912GA1R	GAA1

在糖化酶GAA1、GATE基因序列的5’端加上XHoⅠ酶切位点，3’端加上NotⅠ酶切位点和His-tag标签，PCR反应体系(50μL)：ddH₂O 39μL，模板1.5μL，10×buffer 5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，dNTP 2μL，pyrobest酶0.5μL。PCR反应条件：94℃3min；94℃30s，59℃30s，72℃1min50s，30个循环；72℃10min；4℃1h。经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的基因。

1.1.4基因GA2的SBD结构域缺失突变

引物GA1605R：5’-tcacagtgacataccagagcgggtcgtggtgctggtcttgctagcagt-3’

引物P912GA11605R：

5’-GGactagtTCAGTGATGATGGTGATGATGcagtgacataccagagcgggtcgtgg-3’

以GA2重组基因为模板，以P912TESF/GA1605R为上下游引物，通过PCR方法，克隆出SBD区缺失突变的糖化酶GA7基因。PCR反应体系：PCR反应体系(50μL)：ddH₂O 39μL，模板1.5μL，10×buffer 5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，dNTP 2μL，pyrobest酶0.5μL。PCR反应条件：94℃3min；94℃40s，55℃40s，72℃1min40s，5个循环；94℃40s，72℃40s，72℃1min40s，25个循环；72℃10min；4℃1h。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的基因。再将PCR产物3’端加上NotⅠ酶切位点和His-tag标签，以回收目的基因为模板，以P912TESF/P912GA11605R为引物，克隆出SBD结构域缺失的糖化酶GA7基因。PCR反应体系(50μL)：ddH₂O39.5μL，模板1μL，10×buffer 5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，dNTP 2μL，pyrobest酶0.5μL。PCR反应条件：94℃3min；94℃40s，60℃40s，72℃1min40s，30个循环；72℃10min；4℃1h。经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的基因。

1.2重组质粒的构建

将重组糖化酶GA1～GA7基因及原始糖化酶GAA1、GATE基因进行XHoⅠ和NotⅠ双酶切，目的条带切胶回收，并将表达载体pJ912-19质粒也进行XHoⅠ和NotⅠ双酶切，纯化回收，用DNA连接酶将糖化酶基因与表达载体16℃连接过夜。次日，把连接产物转化入大肠杆菌JM109中，挑选出阳性转化子。构建出9种不同的重组表达载体pJ912-19-GAA1、pJ912-19-GATE、pJ912-19-GA1～pJ912-19-GA7，重组质粒图谱如图2所示。

实施例2：毕赤酵母工程菌的构建

将重组表达载体pJ912-19-GAA1、pJ912-19-GATE、pJ912-19-GA1～pJ912-19-GA7电转入宿主细胞毕赤酵母X-33中，菌落PCR验证得到阳性转化子，各重组糖化酶分别选择8个阳性转化子用48孔板发酵，甲醇诱导表达96h，测酶活，筛选高表达重组糖化酶GA1～GA6及突变糖化酶GA7毕赤酵母工程菌。

实施例3：发酵及酶活测定

3.1将原始糖化酶GAA1和GATE菌株及重组糖化酶GA1～GA6重组菌株和突变糖化酶GA7菌株置于30℃摇床，以BMD1、BMM2和BMM10为培养基进行甲醇诱导发酵，诱导96h分别取发酵液上清测酶活，各糖化酶的酶活如图3所示，筛选出酶活力较高的GA1和GA2重组糖化酶菌株及GA7突变糖化酶菌株。结果显示，GAA1酶活为8955.8U/mL，GATE酶活为27212.8U/mL，GA1、GA2、GA7酶活分别为22041.3U/mL、17962.9U/mL，20163.8U/mL，与GAA1相比酶活分别提高了146.1％、100.6％、125.2％。

培养基组成如下：

BMD1：0.2M磷酸钾，13.4g/L YNB，0.4mg/L生物素，1.1％葡萄糖。

BMM2：0.2M磷酸钾，13.4g/L YNB，0.4mg/L生物素，1％甲醇。

BMM10：0.2M磷酸钾，13.4g/L YNB，0.4mg/L生物素，5％甲醇。

3.2酶活测定方法

3.2.1葡萄糖标准曲线的制备

将100mg/mL的储备液分别稀释成0mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、12.5mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL葡萄糖稀释液；取8只1.5ml EP管分别加入100μL去离子水，再加入50μL不同浓度的葡萄糖稀释液，最后加入200μL DNS溶液；沸水浴准确反应5min，迅速冰浴2min；每只管中取出20μL，加入到96孔板内，再加250μL去离子水混匀；用酶标仪测540nm处OD值，建立关系曲线。

3.2.2糖化酶活力测定

在1.5ml EP管中加入500μL 2％可溶性淀粉和0.05M pH4.6的醋酸钠缓冲液100μL，震荡混匀，40℃温水浴预热10min；加入待测酶液40μL，另设置一个不加待测酶液的对照管，立即计时，混匀；30min后立即加入1mol/L NaOH 20μL，混匀后，迅速放入冰水浴；向对照管补加热变性的酶液40μL，作为空白对照；吸取各管溶液各50μL加入新的EP管中，加入100μL去离子水和200μL DNS溶液，沸水浴准确反应5min，立即冰水浴2min；从每只反应管内取出20μL，加入到96孔板内，再加入250μL去离子水，吹打混匀；用酶标仪测520nm处OD值。

本发明酶活定义：1g固体酶粉(或1mL液体酶)在40℃、pH 4.6条件下，1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个酶活力单位，以U/g(或U/mL)表示。

酶活力计算公式：

其中，C_glu表示由葡萄糖标准曲线得出的葡萄糖浓度；

V表示测吸光度时酶标板中液体的体积；

N表示稀释倍数；

t表示反应时间，单位为h；

v表示反应体系中酶液的量，单位为mL。

实施例4：糖化酶的分离纯化

用镍柱亲和层析法将原始糖化酶GAA1、GATE及重组糖化酶GA1、GA2、GA7分离纯化，然后用pH 7.2的PBS缓冲液等体积置换，使糖化酶溶解在PBS缓冲液中，用BCA试剂盒测酶的浓度。糖化酶分离纯化后的SDS-PAGE电泳图，如图4所示。

实施例5：重组糖化酶的酶学性质分析

5.1重组糖化酶的最适温度

在不同温度(35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃)，pH 4.6下测定重组酶的相对酶活，结果如图5所示。GA1和GA2最适温度为60℃，GA7最适温度为55℃。

5.2重组糖化酶的温度稳定性

将重组酶置于不同温度(45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃)下保存2h、4h、6h，然后在40℃下测定其酶活性，并以各自未放置时的酶活为对照。结果显示，GAA1和GATE在60℃放置4h，残余酶活分别为75％和34％，GA1、GA2、GA7分别为60％、46％、61％，与GATE相比温度稳定性分别提高了76.5％、35.3％、79.4％。

5.3重组糖化酶的最适pH

在不同pH值(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)，40℃下测定重组酶的相对酶活，结果如图6所示。GA1、GA2、GA7最适pH分别为4.0、3.5和3.5。

5.4重组糖化酶的pH稳定性

将重组酶置于不同pH值(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5)下保存6h，然后分别置于最适pH 4.5温度40℃下测定酶活，并以未放置时的酶活为对照。结果显示，GAA1和GATE在pH4.0放置6h，残余酶活分别为97％和63％，GA1、GA2、GA7分别为74％、70％、82％，与GATE相比pH稳定性分别提高了17.5％、11.1％、30.2％。

5.5酶的动力学

配制不同浓度梯度的可溶性淀粉，其倒数为0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，取250ul与醋酸钠缓冲液(pH4.6)50ul涡旋混匀，加入96孔板中，40℃预热10min；加入20ul酶液，反应3min后，取出20ul于提前混匀的100ul DNS和50ul水中，终止反应，反应6min后，取出20ul于另一个提前混匀的100ul DNS和50ul水中，沸水浴5min；取25ul沸水浴后产物于150ul水中，在波长520nm处测吸光度；计算3min和6min时的反应速率，利用双倒数法作图，GA7结果如图7所示。结果显示，Vmax为43.2g/L·min，Km为28.6g/L。

虽然上述已公开了本发明较佳的实施方式，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所限定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 三种重组糖化酶及其制备方法与应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 591

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Ala Ser Leu Val Ala Gly Ala Leu Cys Ile Leu Gly Leu Thr Pro

1 5 10 15

Ala Ala Phe Ala Arg Ala Pro Val Ala Ala Arg Ala Thr Gly Ser Leu

20 25 30

Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Gln Gly Val Leu

35 40 45

Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala Gly Ala Ser Ala Gly

50 55 60

Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser

65 70 75 80

Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr Leu Val Asp Ala Phe

85 90 95

Ile Ala Gly Asn Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile Gln Gln Tyr Ile Ser

100 105 110

Ala Gln Ala Lys Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser

115 120 125

Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asn Glu Thr Ala Phe

130 135 140

Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala

145 150 155 160

Thr Ala Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Asp Asn Gly Glu Ala

165 170 175

Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val Gln Asn Asp Leu Ser

180 185 190

Tyr Ile Thr Gln Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu

195 200 205

Val Glu Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu

210 215 220

Val Glu Gly Asn Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn His Thr Cys Ser Asn

225 230 235 240

Cys Val Ser Gln Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp

245 250 255

Thr Gly Ser Tyr Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly Ser Gly Arg Ser Gly

260 265 270

Lys Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala

275 280 285

Gly Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu

290 295 300

Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile

305 310 315 320

Asn Ser Gly Ile Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro

325 330 335

Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Ala Ala

340 345 350

Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys Lys Ile Gly

355 360 365

Ser Ile Ser Ile Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe Phe Gln Asp Ile Tyr

370 375 380

Pro Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly Ser Thr Thr Phe Asn

385 390 395 400

Asp Ile Ile Ser Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp Gly Tyr Leu Ser Ile

405 410 415

Val Glu Lys Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu Thr Glu Gln Phe Ser

420 425 430

Arg Thr Asp Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Tyr

435 440 445

Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln Ser Val Val Pro Ala

450 455 460

Ser Trp Gly Glu Ser Ser Ala Ser Ser Val Pro Ala Val Cys Ser Ala

465 470 475 480

Thr Ser Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr Asn Thr Val Trp Pro

485 490 495

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ser Ala Pro Cys Thr

500 505 510

Thr Pro Thr Ser Val Ala Val Thr Phe Asp Glu Ile Val Ser Thr Ser

515 520 525

Tyr Gly Glu Thr Cys Thr Thr Pro Thr Ala Val Ala Val Thr Phe Asp

530 535 540

Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu Asn Ile Tyr Leu Val Gly Ser

545 550 555 560

Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu Thr Ser Asp Gly Ile Ala Leu Ser

565 570 575

Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro Leu Trp Tyr Val Thr Val

580 585 590

<210> 2

<211> 596

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Met Ala Ser Leu Val Ala Gly Ala Leu Cys Ile Leu Gly Leu Thr Pro

1 5 10 15

Ala Ala Phe Ala Arg Ala Pro Val Ala Ala Arg Ala Thr Gly Ser Leu

20 25 30

Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Gln Gly Val Leu

35 40 45

Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala Gly Ala Ser Ala Gly

50 55 60

Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser

65 70 75 80

Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr Leu Val Asp Ala Phe

85 90 95

Ile Ala Gly Asn Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile Gln Gln Tyr Ile Ser

100 105 110

Ala Gln Ala Lys Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser

115 120 125

Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asn Glu Thr Ala Phe

130 135 140

Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala

145 150 155 160

Thr Ala Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Asp Asn Gly Glu Ala

165 170 175

Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val Gln Asn Asp Leu Ser

180 185 190

Tyr Ile Thr Gln Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu

195 200 205

Val Glu Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu

210 215 220

Val Glu Gly Asn Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn His Thr Cys Ser Asn

225 230 235 240

Cys Val Ser Gln Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp

245 250 255

Thr Gly Ser Tyr Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly Ser Gly Arg Ser Gly

260 265 270

Lys Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala

275 280 285

Gly Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu

290 295 300

Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile

305 310 315 320

Asn Ser Gly Ile Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro

325 330 335

Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Ala Ala

340 345 350

Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys Lys Ile Gly

355 360 365

Ser Ile Ser Ile Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe Phe Gln Asp Ile Tyr

370 375 380

Pro Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly Ser Thr Thr Phe Asn

385 390 395 400

Asp Ile Ile Ser Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp Gly Tyr Leu Ser Ile

405 410 415

Val Glu Lys Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu Thr Glu Gln Phe Ser

420 425 430

Arg Thr Asp Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Tyr

435 440 445

Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln Ser Val Val Pro Ala

450 455 460

Ser Trp Gly Glu Ser Ser Ala Ser Ser Val Pro Ala Val Cys Ser Ala

465 470 475 480

Thr Ser Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr Asn Thr Val Trp Pro

485 490 495

Ser Ile Val Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly

500 505 510

Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys

515 520 525

Thr Ser Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ser Cys Thr Thr Pro Thr Ala Val

530 535 540

Ala Val Thr Phe Asp Leu Thr Ala Thr Thr Thr Tyr Gly Glu Asn Ile

545 550 555 560

Tyr Leu Val Gly Ser Ile Ser Gln Leu Gly Asp Trp Glu Thr Ser Asp

565 570 575

Gly Ile Ala Leu Ser Ala Asp Lys Tyr Thr Ser Ser Asp Pro Leu Trp

580 585 590

Tyr Val Thr Val

595

<210> 3

<211> 539

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Met Ala Ser Leu Val Ala Gly Ala Leu Cys Ile Leu Gly Leu Thr Pro

1 5 10 15

Ala Ala Phe Ala Arg Ala Pro Val Ala Ala Arg Ala Thr Gly Ser Leu

20 25 30

Asp Ser Phe Leu Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Gln Gly Val Leu

35 40 45

Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala Gly Ala Ser Ala Gly

50 55 60

Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser

65 70 75 80

Trp Thr Arg Asp Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr Leu Val Asp Ala Phe

85 90 95

Ile Ala Gly Asn Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile Gln Gln Tyr Ile Ser

100 105 110

Ala Gln Ala Lys Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser

115 120 125

Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asn Glu Thr Ala Phe

130 135 140

Thr Gly Pro Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala

145 150 155 160

Thr Ala Leu Ile Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Asp Asn Gly Glu Ala

165 170 175

Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val Gln Asn Asp Leu Ser

180 185 190

Tyr Ile Thr Gln Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu

195 200 205

Val Glu Gly Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu

210 215 220

Val Glu Gly Asn Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn His Thr Cys Ser Asn

225 230 235 240

Cys Val Ser Gln Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp

245 250 255

Thr Gly Ser Tyr Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly Ser Gly Arg Ser Gly

260 265 270

Lys Asp Val Asn Ser Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala

275 280 285

Gly Gly Cys Asp Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu

290 295 300

Ala Asn His Lys Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile

305 310 315 320

Asn Ser Gly Ile Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro

325 330 335

Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Ala Ala

340 345 350

Ala Ala Glu Gln Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys Lys Ile Gly

355 360 365

Ser Ile Ser Ile Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe Phe Gln Asp Ile Tyr

370 375 380

Pro Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly Ser Thr Thr Phe Asn

385 390 395 400

Asp Ile Ile Ser Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp Gly Tyr Leu Ser Ile

405 410 415

Val Glu Lys Tyr Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu Thr Glu Gln Phe Ser

420 425 430

Arg Thr Asp Gly Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Tyr

435 440 445

Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln Ser Val Val Pro Ala

450 455 460

Ser Trp Gly Glu Ser Ser Ala Ser Ser Val Pro Ala Val Cys Ser Ala

465 470 475 480

Thr Ser Ala Thr Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr Asn Thr Val Trp Pro

485 490 495

Ser Ile Val Ala Thr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly

500 505 510

Ser Gly Ser Val Thr Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys

515 520 525

Thr Ser Thr Thr Thr Arg Ser Gly Met Ser Leu

530 535

<210> 4

<211> 1491

<212> DNA

<213> 埃墨森篮状菌（Talaromyces emersonii）

<400> 4

atggcgtccc tcgttgctgg cgctctctgc atcctgggcc tgacgcctgc tgcatttgca 60

cgagcgcccg ttgcagcgcg agccaccggt tccctggact cctttctcgc aaccgaaact 120

ccaattgccc tccaaggcgt gctgaacaac atcgggccca atggtgctga tgtggcagga 180

gcaagcgccg gcattgtggt tgccagtccg agcaggagcg acccaaatta tttctactcc 240

tggacacgtg acgcagcgct cacggccaaa tacctcgtcg acgccttcat cgcgggcaac 300

aaggacctag agcagaccat ccagcagtac atcagcgcgc aggcgaaggt gcaaactatc 360

tccaatccgt ccggagattt atccaccggt ggcttaggtg agcccaagtt caatgtgaat 420

gagacggctt ttaccgggcc ctggggtcgt ccacagaggg acggaccagc gttgagagcg 480

acggccctca ttgcgtatgc gaactatctc atcgacaacg gcgaggcttc gactgccgat 540

gagatcatct ggccgattgt ccagaatgat ctgtcctaca tcacccaata ctggaactca 600

tccaccttcg acctctggga agaagtagaa ggatcctcat tcttcacaac cgccgtgcaa 660

caccgcgccc tggtcgaagg caatgcactg gcaacaaggc tgaaccacac gtgctccaac 720

tgcgtctctc aggcccctca ggtcctgtgt ttcctgcagt catactggac cggatcgtat 780

gttctggcca actttggtgg cagcggtcgt tccggcaagg acgtgaattc gattctgggc 840

agcatccaca cctttgatcc cgccggaggc tgtgacgact cgaccttcca gccgtgttcg 900

gcccgtgcct tggcaaatca caaggtggtc accgactcgt tccggagtat ctatgcgatc 960

aactcaggca tcgcagaggg atctgccgtg gcagtcggcc gctaccctga ggatgtctac 1020

cagggcggga acccctggta cctggccaca gcagcggctg cagagcagct ttacgacgcc 1080

atctaccagt ggaagaagat cggctcgata agtatcacgg acgttagtct gccatttttc 1140

caggatatct acccttctgc cgcggtgggc acctataact ctggctccac gactttcaac 1200

gacatcatct cggccgtcca gacgtatggt gatggatatc tgagtattgt cgagaaatat 1260

actccctcag acggctctct taccgaacaa ttctcccgta cagacggcac tccgctttct 1320

gcctctgccc tgacttggtc gtacgcttct ctcctaaccg cttcggcccg cagacagtcc 1380

gtcgtccctg cttcctgggg cgaaagctcc gcaagcagcg tccctgccgt ctgctctgcc 1440

acctctgcca cgggcccata cagcacggct accaacaccg tctggccaag c 1491

<210> 5

<211> 105

<212> DNA

<213> 埃墨森篮状菌（Talaromyces emersonii）

<400> 5

tctggctctg gcagctcaac aaccaccagt agcgccccat gcaccactcc tacctctgtg 60

gctgtgacct tcgacgaaat cgtcagcacc agttacgggg agaca 105

<210> 6

<211> 261

<212> DNA

<213> 埃墨森篮状菌（Talaromyces emersonii）

<400> 6

atctacctgg ccggctcgat ccccgagctg ggcaactggt ccacggccag cgcgatcccc 60

ctccgcgcgg atgcttacac caacagcaac ccgctctggt acgtgaccgt caatctgccc 120

cctggcacca gcttcgagta caagttcttc aagaaccaga cggacgggac catcgtctgg 180

gaagacgacc cgaaccggtc gtacacggtc ccagcgtact gtgggcagac taccgccatt 240

cttgacgata gttggcagtg a 261

<210> 7

<211> 1476

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）

<400> 7

atgtcgttcc gatctctact cgccctgagc ggcctcgtct gcacagggtt ggcaaatgtg 60

atttccaagc gcgcgacctt ggattcatgg ttgagcaacg aagcgaccgt ggctcgtact 120

gccatcctga ataacatcgg ggcggacggt gcttgggtgt cgggcgcgga ctctggcatt 180

gtcgttgcta gtcccagcac ggataacccg gactacttct acacctggac tcgcgactct 240

ggtctcgtcc tcaagaccct cgtcgatctc ttccgaaatg gagataccag tctcctctcc 300

accattgaga actacatctc cgcccaggca attgtccagg gtatcagtaa cccctctggt 360

gatctgtcca gcggcgctgg tctcggtgaa cccaagttca atgtcgatga gactgcctac 420

actggttctt ggggacggcc gcagcgagat ggtccggctc tgagagcaac tgctatgatc 480

ggcttcgggc agtggctgct tgacaatggc tacaccagca ccgcaacgga cattgtttgg 540

cccctcgtta ggaacgacct gtcgtatgtg gctcaatact ggaaccagac aggatatgat 600

ctctgggaag aagtcaatgg ctcgtctttc tttacgattg ctgtgcaaca ccgcgccctt 660

gtcgaaggta gtgccttcgc gacggccgtc ggctcgtcct gctcctggtg tgattctcag 720

gcacccgaaa ttctctgcta cctgcagtcc ttctggaccg gcagcttcat tctggccaac 780

ttcgatagca gccgttccgg caaggacgca aacaccctcc tgggaagcat ccacaccttt 840

gatcctgagg ccgcatgcga cgactccacc ttccagccct gctccccgcg cgcgctcgcc 900

aaccacaagg aggttgtaga ctctttccgc tcaatctata ccctcaacga tggtctcagt 960

gacagcgagg ctgttgcggt gggtcggtac cctgaggaca cgtactacaa cggcaacccg 1020

tggttcctgt gcaccttggc tgccgcagag cagttgtacg atgctctata ccagtgggac 1080

aagcaggggt cgttggaggt cacagatgtg tcgctggact tcttcaaggc actgtacagc 1140

gatgctgcta ctggcaccta ctcttcgtcc agttcgactt atagtagcat tgtagatgcc 1200

gtgaagactt tcgccgatgg cttcgtctct attgtggaaa ctcacgccgc aagcaacggc 1260

tccatgtccg agcaatacga caagtctgat ggcgagcagc tttccgctcg cgacctgacc 1320

tggtcttatg ctgctctgct gaccgccaac aaccgtcgta actccgtcgt gcctgcttct 1380

tggggcgaga cctctgccag cagcgtgccc ggcacctgtg cggccacatc tgccattggt 1440

acctacagca gtgtgactgt cacctcgtgg ccgagt 1476

<210> 8

<211> 120

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）

<400> 8

atcgtggcta ctggcggcac cactacgacg gctaccccca ctggatccgg cagcgtgacc 60

tcgaccagca agaccaccgc gactgctagc aagaccagca ccagtacgtc atcaacctcc 120

<210> 9

<211> 180

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）

<400> 9

tgtaccactc ccaccgccgt ggctgtgact ttcgatctga cagctaccac cacctacggc 60

gagaacatct acctggtcgg atcgatctct cagctgggtg actgggaaac cagcgacggc 120

atagctctga gtgctgacaa gtacacttcc agcgacccgc tctggtatgt cactgtgtaa 180

<210> 10

<211> 1776

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

atggcgtccc tcgttgctgg cgctctctgc atcctgggcc tgacgcctgc tgcatttgca 60

cgagcgcccg ttgcagcgcg agccaccggt tccctggact cctttctcgc aaccgaaact 120

ccaattgccc tccaaggcgt gctgaacaac atcgggccca atggtgctga tgtggcagga 180

gcaagcgccg gcattgtggt tgccagtccg agcaggagcg acccaaatta tttctactcc 240

tggacacgtg acgcagcgct cacggccaaa tacctcgtcg acgccttcat cgcgggcaac 300

aaggacctag agcagaccat ccagcagtac atcagcgcgc aggcgaaggt gcaaactatc 360

tccaatccgt ccggagattt atccaccggt ggcttaggtg agcccaagtt caatgtgaat 420

gagacggctt ttaccgggcc ctggggtcgt ccacagaggg acggaccagc gttgagagcg 480

acggccctca ttgcgtatgc gaactatctc atcgacaacg gcgaggcttc gactgccgat 540

gagatcatct ggccgattgt ccagaatgat ctgtcctaca tcacccaata ctggaactca 600

tccaccttcg acctctggga agaagtagaa ggatcctcat tcttcacaac cgccgtgcaa 660

caccgcgccc tggtcgaagg caatgcactg gcaacaaggc tgaaccacac gtgctccaac 720

tgcgtctctc aggcccctca ggtcctgtgt ttcctgcagt catactggac cggatcgtat 780

gttctggcca actttggtgg cagcggtcgt tccggcaagg acgtgaattc gattctgggc 840

agcatccaca cctttgatcc cgccggaggc tgtgacgact cgaccttcca gccgtgttcg 900

gcccgtgcct tggcaaatca caaggtggtc accgactcgt tccggagtat ctatgcgatc 960

aactcaggca tcgcagaggg atctgccgtg gcagtcggcc gctaccctga ggatgtctac 1020

cagggcggga acccctggta cctggccaca gcagcggctg cagagcagct ttacgacgcc 1080

atctaccagt ggaagaagat cggctcgata agtatcacgg acgttagtct gccatttttc 1140

caggatatct acccttctgc cgcggtgggc acctataact ctggctccac gactttcaac 1200

gacatcatct cggccgtcca gacgtatggt gatggatatc tgagtattgt cgagaaatat 1260

actccctcag acggctctct taccgaacaa ttctcccgta cagacggcac tccgctttct 1320

gcctctgccc tgacttggtc gtacgcttct ctcctaaccg cttcggcccg cagacagtcc 1380

gtcgtccctg cttcctgggg cgaaagctcc gcaagcagcg tccctgccgt ctgctctgcc 1440

acctctgcca cgggcccata cagcacggct accaacaccg tctggccaag ctctggctct 1500

ggcagctcaa caaccaccag tagcgcccca tgcaccactc ctacctctgt ggctgtgacc 1560

ttcgacgaaa tcgtcagcac cagttacggg gagacatgta ccactcccac cgccgtggct 1620

gtgactttcg atctgacagc taccaccacc tacggcgaga acatctacct ggtcggatcg 1680

atctctcagc tgggtgactg ggaaaccagc gacggcatag ctctgagtgc tgacaagtac 1740

acttccagcg acccgctctg gtatgtcact gtgtaa 1776

<210> 11

<211> 1791

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

atggcgtccc tcgttgctgg cgctctctgc atcctgggcc tgacgcctgc tgcatttgca 60

cgagcgcccg ttgcagcgcg agccaccggt tccctggact cctttctcgc aaccgaaact 120

ccaattgccc tccaaggcgt gctgaacaac atcgggccca atggtgctga tgtggcagga 180

gcaagcgccg gcattgtggt tgccagtccg agcaggagcg acccaaatta tttctactcc 240

tggacacgtg acgcagcgct cacggccaaa tacctcgtcg acgccttcat cgcgggcaac 300

aaggacctag agcagaccat ccagcagtac atcagcgcgc aggcgaaggt gcaaactatc 360

tccaatccgt ccggagattt atccaccggt ggcttaggtg agcccaagtt caatgtgaat 420

gagacggctt ttaccgggcc ctggggtcgt ccacagaggg acggaccagc gttgagagcg 480

acggccctca ttgcgtatgc gaactatctc atcgacaacg gcgaggcttc gactgccgat 540

gagatcatct ggccgattgt ccagaatgat ctgtcctaca tcacccaata ctggaactca 600

tccaccttcg acctctggga agaagtagaa ggatcctcat tcttcacaac cgccgtgcaa 660

caccgcgccc tggtcgaagg caatgcactg gcaacaaggc tgaaccacac gtgctccaac 720

tgcgtctctc aggcccctca ggtcctgtgt ttcctgcagt catactggac cggatcgtat 780

gttctggcca actttggtgg cagcggtcgt tccggcaagg acgtgaattc gattctgggc 840

agcatccaca cctttgatcc cgccggaggc tgtgacgact cgaccttcca gccgtgttcg 900

gcccgtgcct tggcaaatca caaggtggtc accgactcgt tccggagtat ctatgcgatc 960

aactcaggca tcgcagaggg atctgccgtg gcagtcggcc gctaccctga ggatgtctac 1020

cagggcggga acccctggta cctggccaca gcagcggctg cagagcagct ttacgacgcc 1080

atctaccagt ggaagaagat cggctcgata agtatcacgg acgttagtct gccatttttc 1140

caggatatct acccttctgc cgcggtgggc acctataact ctggctccac gactttcaac 1200

gacatcatct cggccgtcca gacgtatggt gatggatatc tgagtattgt cgagaaatat 1260

actccctcag acggctctct taccgaacaa ttctcccgta cagacggcac tccgctttct 1320

gcctctgccc tgacttggtc gtacgcttct ctcctaaccg cttcggcccg cagacagtcc 1380

gtcgtccctg cttcctgggg cgaaagctcc gcaagcagcg tccctgccgt ctgctctgcc 1440

acctctgcca cgggcccata cagcacggct accaacaccg tctggccaag catcgtggct 1500

actggcggca ccactacgac ggctaccccc actggatccg gcagcgtgac ctcgaccagc 1560

aagaccaccg cgactgctag caagaccagc accagtacgt catcaacctc ctgtaccact 1620

cccaccgccg tggctgtgac tttcgatctg acagctacca ccacctacgg cgagaacatc 1680

tacctggtcg gatcgatctc tcagctgggt gactgggaaa ccagcgacgg catagctctg 1740

agtgctgaca agtacacttc cagcgacccg ctctggtatg tcactgtgta a 1791

<210> 12

<211> 1620

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

atggcgtccc tcgttgctgg cgctctctgc atcctgggcc tgacgcctgc tgcatttgca 60

cgagcgcccg ttgcagcgcg agccaccggt tccctggact cctttctcgc aaccgaaact 120

ccaattgccc tccaaggcgt gctgaacaac atcgggccca atggtgctga tgtggcagga 180

gcaagcgccg gcattgtggt tgccagtccg agcaggagcg acccaaatta tttctactcc 240

tggacacgtg acgcagcgct cacggccaaa tacctcgtcg acgccttcat cgcgggcaac 300

aaggacctag agcagaccat ccagcagtac atcagcgcgc aggcgaaggt gcaaactatc 360

tccaatccgt ccggagattt atccaccggt ggcttaggtg agcccaagtt caatgtgaat 420

gagacggctt ttaccgggcc ctggggtcgt ccacagaggg acggaccagc gttgagagcg 480

acggccctca ttgcgtatgc gaactatctc atcgacaacg gcgaggcttc gactgccgat 540

gagatcatct ggccgattgt ccagaatgat ctgtcctaca tcacccaata ctggaactca 600

tccaccttcg acctctggga agaagtagaa ggatcctcat tcttcacaac cgccgtgcaa 660

caccgcgccc tggtcgaagg caatgcactg gcaacaaggc tgaaccacac gtgctccaac 720

tgcgtctctc aggcccctca ggtcctgtgt ttcctgcagt catactggac cggatcgtat 780

gttctggcca actttggtgg cagcggtcgt tccggcaagg acgtgaattc gattctgggc 840

agcatccaca cctttgatcc cgccggaggc tgtgacgact cgaccttcca gccgtgttcg 900

gcccgtgcct tggcaaatca caaggtggtc accgactcgt tccggagtat ctatgcgatc 960

aactcaggca tcgcagaggg atctgccgtg gcagtcggcc gctaccctga ggatgtctac 1020

cagggcggga acccctggta cctggccaca gcagcggctg cagagcagct ttacgacgcc 1080

atctaccagt ggaagaagat cggctcgata agtatcacgg acgttagtct gccatttttc 1140

caggatatct acccttctgc cgcggtgggc acctataact ctggctccac gactttcaac 1200

gacatcatct cggccgtcca gacgtatggt gatggatatc tgagtattgt cgagaaatat 1260

actccctcag acggctctct taccgaacaa ttctcccgta cagacggcac tccgctttct 1320

gcctctgccc tgacttggtc gtacgcttct ctcctaaccg cttcggcccg cagacagtcc 1380

gtcgtccctg cttcctgggg cgaaagctcc gcaagcagcg tccctgccgt ctgctctgcc 1440

acctctgcca cgggcccata cagcacggct accaacaccg tctggccaag catcgtggct 1500

actggcggca ccactacgac ggctaccccc actggatccg gcagcgtgac ctcgaccagc 1560

aagaccaccg cgactgctag caagaccagc accacgaccc gctctggtat gtcactgtga 1620

Claims

1.重组糖化酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3所示。

2.权利要求1所述重组糖化酶的用途，其特征在于，用于催化可溶性淀粉生产葡萄糖。

3.如权利要求2所述重组糖化酶的用途，其特征在于，所述重组糖化酶的酶活为22041.3U/mL或17962.9U/mL或20163.8U/mL，和/或所述重组糖化酶在60℃放置4h残余酶活为60%或46%或61%，和/或所述重组糖化酶在pH4.0放置6h残余酶活为74%或70%或82%。

4.包含权利要求1所述重组糖化酶基因的表达载体。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pJ912-19。

6.包含权利要求1所述重组糖化酶基因的宿主细胞。

7.如权利要求6所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为毕赤酵母X-33。

8.权利要求1所述重组糖化酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的重组糖化酶基因经过酶切、纯化，连接到pJ912-19载体，得到重组表达载体；

（2）所述的重组表达载体转化至毕赤酵母X-33，得到重组菌株；

（3）表达所述的重组菌株，纯化获得重组糖化酶。

9.如权利要求8所述的重组糖化酶的制备方法，其特征在于，所述重组糖化酶的酶活为22041.3U/mL或17962.9U/mL或20163.8U/mL，和/或所述重组糖化酶在60℃放置4h残余酶活为60%或46%或61%，和/或所述重组糖化酶在pH4.0放置6h残余酶活为74%或70%或82%。

10.权利要求1所述重组糖化酶的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列：

（a）：如SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示；

或（b）：与（a）的核苷酸序列互补。