CN116731989B - 漆酶突变体、基因工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及漆酶突变体、基因工程菌及其应用，属于基因工程领域。本发明对来源于短小芽孢杆菌的野生型漆酶BpLac进行点饱和突变，所得漆酶单位点或双位点突变体的比酶活比野生型漆酶BpLac的比酶活提高了41.77～288.23％，确认了本发明提供的漆酶单位点或双位点突变体具有更高的催化活性，对于提高其他漆酶的分子改造提供了参考。漆酶单位点或双位点突变体的催化活性大幅提升，并且具有较好的热稳定性，可应用于食品加工、制浆造纸、环境修复、饲料加工、医药、生物质加工等行业，应用前景广阔。

Description

漆酶突变体、基因工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及漆酶突变体、基因工程菌及其应用，具体涉及利用点饱和突变技术获得催化活性或热稳定性提高的漆酶突变体、基因工程菌及其应用，属于基因工程领域。

背景技术

漆酶(EC 1.10.3.2)是一种含4个铜离子的多酚氧化酶，对不同的底物均具有优良的氧化能力。它可对酚类、芳胺类及其衍生物、甾体激素、生物色素、羧酸及其衍生物等化合物进行催化氧化分解，并且以氧原子为最终电子受体，最终生成的副产物只有水，被看作是一种绿色、环保、环境友好的生物催化剂。此外，在存在氧化还原介质的条件下，漆酶可进一步催化氧化还原电位更高的非酚类底物，如多环芳烃、偶氮染料、非酚类木质素大分子等化合物。在食品工业、环境修复、制浆造纸、染料降解、毒素降解、药物合成等领域有重要应用价值。

漆酶来源丰富，包括细菌、真菌、植物以及昆虫等。其中，细菌漆酶相对于真菌漆酶，能够耐高温。来源于短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的漆酶就是一种有广泛应用潜力的细菌漆酶。但是天然漆酶的酶学性质仍不足以满足制浆造纸、食品加工、脱毒等高温工业环境，因此，天然漆酶在工业应用中存在的缺陷亟待改进。除了通过从自然界中大量筛选获得催化活性高的天然漆酶外，利用基因工程和蛋白质工程手段对蛋白质进行分子改造是获得性质优良的漆酶的有效手段。

中国专利文献CN 104087560A(申请号201310655726.4)公开了一种细菌漆酶突变体蛋白，该突变体蛋白氨基酸序列由SEQ ID No.1所示的细菌漆酶氨基酸序列第323位甘氨酸至332位甘氨酸进行缺失突变获得。该发明通过基因工程改造方法获得稳定性提高的细菌漆酶蛋白编码基因、其表达质粒及工程菌，并可在将工程菌大规模发酵及诱导表达后，获得稳定性提高的细菌漆酶蛋白。该发明以海洋未培养微生物来源的细菌漆酶Lac15为基础，通过基因工程改造，获得突变基因；同时利用重组大肠杆菌进行高密度培养的方法，高效表达细菌漆酶突变体蛋白，大幅提高了细菌漆酶的稳定性和产量。

点饱和突变技术(site-saturation mutagenesis)，是通过对目的蛋白的编码基因进行改造，短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种天然氨基酸所替代的突变子。它不是定点突变技术的简单延伸，而是蛋白质设计理念的全面升华，广泛地应用于蛋白质改造及结构与功能关系研究中，并取得了一系列令人瞩目的成绩。如利用点饱和突变技术鉴定蛋白质功能位点，提高酶比活力，改善酶热稳定性、底物结合特异性及立体异构特异性等多方面性质。

中国专利文献CN 114891757 A(申请号202210661906.2)公开了一种漆酶定向进化方法及突变漆酶基因、表达载体、重组菌株及其脱毒黄曲霉毒素应用，所述漆酶的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，所述SEQ ID No:1中第235位氨基酸由Ser变为Pro得到突变漆酶，所述突变漆酶的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。该发明以在Pichia pastoris中异源表达的漆酶为基础，通过定点饱和突变，并在P.pastoris中异源表达突变漆酶基因，构建了一个“小而精”的饱和突变体文库；最终通过筛选获得了一株重组毕赤酵母突变菌株，其发酵产生的酶蛋白脱毒AFB1的效率提升至1.34倍，突变体蛋白可应用于生物乙醇制备过程中干酒糟及其可溶物(DDGS)中AFB1的同步脱毒。

针对不同来源的漆酶进行定向进化改造，以获得性质更加优良的漆酶突变体，仍然具有重大研究意义和实际应用价值。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了漆酶突变体、基因工程菌及其应用。本发明主要是利用点饱和突变技术获得催化活性或热稳定性提高的漆酶突变体，构建基因工程菌，表达性质更加优良的漆酶突变体，主要应用于木质素的降解。

本发明的技术方案如下：

一种漆酶突变体，是在氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的野生型漆酶的下述任一一种位点突变后所得到的突变体：A347H、A347S、N368L、N368Q、N368A、N368M、N368T、N368K、N368L/I509S。

本发明中，漆酶单位点突变体“N368L”表示将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型漆酶的第368位氨基酸由天冬酰胺(N)突变为亮氨酸(L)；双位点突变体“N368L/I509S”表示同时将氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的野生型漆酶的第368位的天冬酰胺(N)突变为亮氨酸(L)，第509位的异亮氨酸(I)突变为丝氨酸(S)。本发明中其余位点突变体的表述以此类推。

根据本发明优选的，所述野生型漆酶来源于短小芽孢杆菌。

一种漆酶突变体的编码基因，其编码上述漆酶突变体。

本发明中，上述漆酶突变体的编码基因是在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列及其简并序列的基础上突变得到的。

根据本发明优选的，所述漆酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：11所示。

一种含有上述漆酶突变体的编码基因的重组表达载体。

根据本发明优选的，所述重组表达载体的载体质粒为pET-28a(+)。

一种含有上述重组表达载体或上述漆酶突变体的编码基因的基因工程菌。

根据本发明优选的，所述基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌。

上述基因工程菌在制备漆酶突变体中的应用。

上述漆酶突变体或上述基因工程菌在降解木质素中的应用。

上述漆酶突变体降解木质素的方法，包括如下步骤：在含有木质素的体系中，加入介体和漆酶突变体，调节反应体系的pH为3.0～5.0，在50～90℃下进行反应，降解木质素。

根据本发明优选的，所述介体为ABTS。

根据本发明优选的，所述反应体系的pH为4.0。

根据本发明优选的，所述反应的温度为80℃。

有益效果：

本发明对来源于短小芽孢杆菌的野生型漆酶BpLac进行点饱和突变，所得漆酶单位点或双位点突变体的比酶活比野生型漆酶BpLac的比酶活提高了41.77～288.23％，确认了本发明提供的漆酶单位点或双位点突变体具有更高的催化活性，对于提高其他漆酶的分子改造提供了参考。漆酶单位点或双位点突变体的催化活性大幅提升，并且具有较好的热稳定性，可应用于食品加工、制浆造纸、环境修复、饲料加工、医药、生物质加工等行业，应用前景广阔。

附图说明

图1为野生型漆酶BpLac的三维结构图。

图2为漆酶单位点突变体和双位点突变体的SDS-PAGE图。

图3为野生型漆酶BpLac和漆酶单位点突变体及双位点突变体的比酶活比较图。

图4为野生型漆酶BpLac在不同pH条件下的相对酶活力变化曲线。

图5为野生型漆酶BpLac在不同温度条件下的相对酶活力变化曲线。

图6为野生型漆酶BpLac和漆酶单位点突变体及双位点突变体的热稳定性比较图。

图7为碱木质素浓度标准曲线。

图8为野生型漆酶BpLac和漆酶单位点突变体及双位点突变体对碱木质素降解率柱状图。

具体实施方式

本发明的技术方案将通过结合具体实施方式进一步说明。但应理解本发明所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。实施例中涉及的试剂及材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。

实施例1：野生型漆酶BpLac的制备

野生型漆酶BpLac编码基因lac来自短小芽孢杆菌，首先提取短小芽孢杆菌基因组，然后利用芽孢杆菌来源的漆酶编码基因的保守序列设计简并引物，利用PCR扩增从短小芽孢杆菌基因组中克隆得到野生型漆酶BpLac编码基因lac全长，所得编码基因lac的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，其编码的野生型漆酶BpLac的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

其中，设计的简并引物如下(下划线位置为同源臂序列)：

上游引物：5’-GAAGGAGATATACCATGGGCATGAACCTAGAAAAATTTGTTGACGA G-3’，

下游引物：5’-GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCTGGATGATATCCATCGGCC-3’。

将编码基因lac连接pET-28a(+)质粒上，得到野生型质粒pET-28a(+)-lac，并在大肠杆菌JM109中保存。提取野生型质粒pET-28a(+)-lac，并将野生型质粒pET-28a(+)-lac热激转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。

漆酶酶液的制备：将携带野生型质粒pET-28a(+)-lac的大肠杆菌BL21(DE3)接种于含有50μg/mL卡那霉素的250mL液体LB培养基中，于37℃、220rpm培养至OD₆₀₀为0.8，然后将异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)添加到培养基中，终浓度为0.5mM，在16℃诱导表达20h。诱导结束后8000rpm离心10min收集细胞沉淀，将细胞沉淀重新悬浮在20mL的20mMTris/HCl缓冲液(pH＝8.0)中，于冰上对细胞进行超声破碎，在4℃条件下以12000rpm离心30min，收集超声破碎后的上清，将上清使用镍柱纯化后得漆酶酶液，测定漆酶活性并制备SDS-PAGE样品。

漆酶酶活力的定义：

在一定条件下，每分钟氧化1μmol的底物所需要的酶量为一个酶活力单位，记为U/mL。比酶活为酶活力与蛋白浓度的比值。

漆酶酶活力的测定方法：

选取ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)为底物，测定漆酶酶活力。96孔板中加入200μL含5mmol/L Cu²⁺的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.0)，加入30μL浓度为50mmol/L的ABTS底物，在80℃下保温1min。向上述体系中加入10μL稀释适当倍数的酶液，混匀，80℃下进行反应，记录反应初始以及反应10min后体系在420nm波长下的OD值。酶活力计算公式如下：

式中：

ΔOD表示反应初始以及反应10min后体系OD值的变化量；

V₁为反应体系的总体积；

Δt为反应时间；

V₂为反应体系中所加酶液的体积；

以ABTS为底物时，ε表示其产物在420nm波长下的摩尔吸光系数，为36mM^-1cm^-1；

d表示光程厚度。

SDS-PAGE及酶活测定结果发现，野生型漆酶BpLac的分子量约为58kDa，对底物ABTS的比酶活为6.2U/mg。

实施例2：漆酶单位点突变体或双位点突变体的制备

利用Alphafold 2构建了野生型漆酶BpLac的三维结构图，如图1所示。一般来说，酶表面的柔性loop区域被认为是酶热失活的潜在目标。因此，通过对loop区进行突变以增加酶的刚性来改善酶的热稳定性是一种有效的策略。此外，远离活性位点的loop区突变可以在保持催化活性的同时增强热稳定性。因此本发明选择位于野生型漆酶BpLac结构域2和结构域3之间的loop区(图1中水绿色区域)作为突变候选区域。利用FoldX对这一区域的氨基酸进行位置扫描。选择ΔΔ值最负的氨基酸位点作为候选突变点，最终确定了三个突变位点，即A347，A366和N368。

以含有野生性漆酶BpLac编码基因lac的野生型质粒pET-28a(+)-lac为模板，选取野生性漆酶BpLac的A347，A366，N368三个位点进行饱和突变，在突变位点处引入突变，以如下引物(下划线为突变位点序列)使用KOD plus酶通过两步PCR进行扩增，得到单位点突变型质粒：

A347-forward-1：5’-HNBGCTAAAACATTACGTCCGATCTTCAAAC-3’，

A347-forward-2：5’-GDWGCTAAAACATTACGTCCGATCTTCAAAC-3’，

A347-reverse：5’-TCTTCCTTTGAGCGGACGAG-3’；

A366-forward-1：5’-HNBGATAACGAGCGGACGCTAAC-3’，

A366-forward-2：5’-GDWGATAACGAGCGGACGCTAAC-3’，

A366-reverse：5’-TCGGCTCGGCCGGA-3’；

N368-forward-1：5’-BNBGAGCGGACGCTAACGC-3’，

N368-forward-2：5’-AHRGAGCGGACGCTAACGC-3’，

N368-reverse：5’-ATCAGCTCGGCTCGG-3’；

PCR扩增体系为50μL；PCR扩增程序为：94℃预变性2min，随后进行7个循环(95℃变性10s，68℃退火7min，68℃延伸100s)，循环后4℃保温。

取2μL PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。用DpnⅠ酶解去除突变型质粒库中的模板质粒，然后用DNA连接酶连接。将连接产物转化至E.coli BL21(DE3)中，并涂布于含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB固体平板上，筛选得到含有单位点突变型质粒的突变体菌株。

将上述LB固体平板上的突变体菌株挑取单菌落分别接种于含有1mL液体LB培养基(含卡那霉素50μg/mL)的24孔深孔板中。每块板包含23个突变型和一个野生型。37℃孵育过夜后，取200μL培养液转移至第二块新的24孔深孔板中，每孔包含1mL液体LB培养基(含卡那霉素50μg/mL)，将其在37℃培养2h后加入1μL异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，终浓度为0.5mM，于16℃再培养20h。培养结束后将24孔深孔板在5000rpm和4℃条件下离心10min收集菌体。去掉上清后将每个孔中的菌体用200μL 20mM Tris/HCl缓冲液(pH＝8.0)重悬，加入30μL溶菌酶，于37℃孵育2h，以裂解菌体细胞。随后再将24孔深孔板在5000rpm和4℃条件下离心10min，获得上清液。将10μL上清液添加到96孔板中，该96孔板的每个孔中包含200μL含有5mmol/L Cu²⁺的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.0)，30μL浓度为50mmol/L的ABTS底物。将96孔板在80℃反应10min，反应结束后利用分光光度法测定反应体系的在420nm波长下的吸光值。吸光值的高低反应漆酶活力的高低。

筛选得到漆酶活力高于野生型的突变体菌株，提取单位点突变型质粒进行测序，确认突变的氨基酸，包括A347H、A347S、N368L、N368Q、N368A、N368M、N368T和N368K，经质粒测序后可知，发生上述氨基酸突变的漆酶突变体对应的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3～SEQ ID NO：10所示。测序完成后将酶活力提高的突变体菌株接种于含有250mL液体LB培养基(含卡那霉素50μg/mL)的摇瓶中进行漆酶单位点突变体酶液的制备，具体制备方法同实施例1。将漆酶单位点突变体酶液纯化后进行酶活力的测定，测定方法同实施例1。

漆酶单位点突变体酶液的SDS-PAGE分析结果如图2所示，酶活力测定结果如图3和表1所示。结果表明，漆酶单位点突变体的分子量约为58kDa；相较于野生型漆酶BpLac，纯化后8个单位点突变体对底物ABTS的比酶活均明显提高。

表1.漆酶及其单位点突变体对底物ABTS的比酶活

在8个漆酶单位点突变体中，比酶活显著高于野生型漆酶BpLac的有A347H，N368L，N368M，N368A，N368K，A347S，N368Q，相较于野生型漆酶BpLac的比酶活分别提高了137.26％，145.81％，106.45％，73.55％，73.23％，69.35％，67.26％；其中，N368L的比酶活为15.24U/mg，不仅显著高于野生型漆酶的比酶活，也高于其他7个单位点突变体的比酶活。

研究表明酶的C末端与其热稳定性有关，且用亲水残基替换溶剂暴露的疏水残基(Ile)可能会赋予蛋白质结构热稳定性。本发明中，将比酶活最高的单位点突变体N368L继续叠加单位点突变，在位于C末端的I509位点进行饱和突变，得到比酶活增加的漆酶双位点突变体N368L/I509S，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。漆酶双位点突变体N368L/I509S的SDS-PAGE分析结果见图2，酶活力测定结果见图3。分析可知，双位点突变体N368L/I509S的分子量约为58kDa；单位点突变体N368L叠加I509S突变后，双位点突变体N368L/I509S对底物ABTS的比酶活显著提高，为24.07U/mg，相较于野生型漆酶BpLac的比酶活提高了288.23％。

以上结果初步表明，利用点饱和突变可以筛选得到漆酶突变体来提高蛋白质的比酶活。

实施例3：野生型漆酶BpLac及单位点或双位点突变体的酶学性质分析

采用ABTS为底物对漆酶进行酶活力测定以分析其酶学性质，酶活力测定方法同实施例1。

1、最适pH分析

经纯化的野生型漆酶BpLac(实施例1)及其单位点和双位点突变体(实施例2)在80℃、不同pH条件下进行酶活力测定，以确定其最适pH。所用缓冲液为含5mmol/L Cu²⁺的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH＝3.0～8.0)。

野生型漆酶BpLac及其单位点和双位点突变体在不同pH条件下的相对酶活力变化趋势基本相同，其中，野生型漆酶BpLac的相对酶活力变化曲线如图4所示，野生型漆酶BpLac及其单位点和双位点突变体的最适pH均为4.0。

2、最适温度分析

经纯化的野生型漆酶BpLac(实施例1)及其单位点和双位点突变体(实施例2)在其最适pH条件下(pH 4.0)，测定不同温度(30 90℃)下的酶活性。

野生型漆酶BpLac及其单位点和双位点突变体在不同温度条件下的相对酶活力变化趋势基本相同，其中，野生型漆酶BpLac的相对酶活力变化曲线如图5所示，结果表明，野生型漆酶BpLac及其单位点和双位点突变体的最适温度均为80℃。

3、热稳定性分析

取经纯化的野生型漆酶BpLac(实施例1)及其单位点和双位点突变体(实施例2)，将等量漆酶分别在80℃和90℃水浴环境中保温2h后测量剩余酶活性。结果如图6和表2所示。

表2.漆酶及其突变体的残余酶活力

野生型漆酶BpLac在80℃和90℃分别保温2h后残余酶活力分别为初始时的55.84％和48.36％；在9个突变体中，突变体A347S，N368L，N368Q，N368T，N368L/I509S在80℃和90℃的热稳定性均优于野生型漆酶BpLac，在80℃或90℃保温2h后的残余活性均高于野生型漆酶BpLac，其中，双位点突变体N368L/I509S的热稳定性最好，在80℃保温2h后残余92％的酶活力，在90℃保温2h后残余73.86％的酶活力。单位点突变体A347H在80℃的热稳定性优于野生型漆酶BpLac，保温2h后残余76％的酶活力，然而其在90℃下的热稳定性不如野生型漆酶BpLac，保温2h后残余46.22％的酶活力。

以上酶学性质分析结果表明，本发明得到的漆酶单位点或双位点突变体具有较高的酶活力或热稳定性，在工业应用中具有较大的潜力。

实施例4：漆酶的应用

漆酶以其环保、高效等诸多优势在印染行业、制浆造纸等工业备受人们关注，其在木质素的降解方面应用潜力巨大。本实施例利用漆酶对碱木质素进行解聚。

首先，制备碱木质素母液：称取250mg碱木质素，用10mL的0.1M NaOH溶液完全溶解后，将所得碱木质素溶液用pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液定容至100mL，得到2.5mg/mL的碱木质素母液，4℃备用。

将300μL碱木质素母液加入到5.0mL的离心管中，在每个离心管中分别加入等量的野生型漆酶BpLac及其单位点和双位点突变体(终浓度为0.25U/mL)和介体ABTS(终浓度为1mmol/L)；然后添加一定量pH 4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，确保每个离心管反应体系总体积为3mL。将含有3mL混合液的离心管在振荡器上震荡2秒，使各组分混合均匀后置于60℃、400rpm条件下进行反应，反应时间12h。反应结束时将离心管快速煮沸以终止反应，离心取上清液，测定其在280nm下的吸光值，并根据碱木质素标准曲线计算上清液中碱木质素浓度，并计算碱木质素的降解率。

其中，碱木质素标准曲线绘制方法：

称取10mg碱木质素，加入0.1M NaOH溶液溶解并定容至10mL，作为碱木质素标准溶液母液，浓度为1mg/mL。将碱木质素标准溶液母液按表3所示体系进行稀释，获得不同浓度梯度的碱木质素标准溶液。测定不同浓度碱木质素标准溶液在280nm下的吸光值，以碱木质素浓度为横坐标，OD₂₈₀为纵坐标，绘制标准曲线。

表3碱木质素标准曲线体系制作表

绘制得到的标准曲线如图7所示，拟合方程为y＝0.06373+0.01208x，R²＝0.9995。

根据上述标准曲线计算野生型漆酶BpLac及其单位点和双位点突变体酶解碱木质素的降解率，结果如图8和表4所示。

表4.漆酶及其突变体的碱木质素降解率

漆酶	BpLac-WT	A347H	A347S	N368L	N368Q
						降解率/％	20.93	27.27	23.98	28.92	25.59
漆酶	N368A	N368M	N368T	N368K	N368L/I509S
						降解率/％	22.12	23.47	22.78	24.01	31.59

结果显示，野生型漆酶BpLac在降解碱木质素12h后，碱木质素的降解率为20.93％，而本发明中获得的漆酶单位点和双位点突变体对于碱木质素的效果均优于野生型漆酶BpLac，其中，N368L/I509S对碱木质素的降解效果最好，降解率为31.59％。

以上结果说明本发明得到的漆酶突变体具有较好的木质素降解效果，具有较好的工业应用潜力。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims (15)

1. 一种漆酶突变体，其特征在于，是在氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的野生型漆酶的下述任一一种位点突变后所得到的突变体：A347H、A347S、N368L、N368Q、N368A、N368M、N368T、N368K、N368L/I509S。

2.如权利要求1所述的漆酶突变体，其特征在于，所述野生型漆酶来源于短小芽孢杆菌。

3.一种漆酶突变体的编码基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的漆酶突变体。

4. 如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因是在SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列及其简并序列的基础上突变得到的。

5. 如权利要求4所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：3~SEQ ID NO：11所示。

6.一种含有权利要求3所述的漆酶突变体的编码基因的重组表达载体。

7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的载体质粒为pET-28a(+)。

8.一种含有权利要求6所述的重组表达载体或权利要求3所述的漆酶突变体的编码基因的基因工程菌。

9.如权利要求8所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌。

10.权利要求8所述的基因工程菌在制备漆酶突变体中的应用。

11.权利要求1所述的漆酶突变体或权利要求8所述的基因工程菌在降解木质素中的应用。

12.权利要求1所述的漆酶突变体降解木质素的方法，其特征在于，包括如下步骤：在含有木质素的体系中，加入介体和漆酶突变体，调节反应体系的pH为3.0~5.0，在50~90℃下进行反应，降解木质素。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述介体为ABTS。

14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述反应体系的pH为4.0。

15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为80℃。