CN109439635A - 一种催化效率提高的CotA漆酶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种催化效率提高的CotA漆酶及其应用，属于酶工程技术领域。本发明的CotA漆酶突变体具有宽广的底物范围和高热稳定性，耐碱性环境，在染料脱色和环境有害物质的降解中表现突出。S208G/F227A双突变菌株催化效率是原来的5.1倍，在60℃，70℃，80℃条件下的半衰期分别为1.35h，0.51h和0.44h。在90℃条件下孵育5分钟仍有超过40％的酶活。将改造后的CotA突变酶用于降解4种染料。结果表明构建的突变体S208G/F227A重组菌株具有良好的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种催化效率提高的CotA漆酶及其应用，属于酶工程技术领域。
背景技术
漆酶(EC 1.10.3.2)是一种多铜氧化酶，因其能够催化多种酚类，芳香族有机物氧化，并且以氧原子为最终电子受体，最终生成水，并且没有其他有害的副产物生成。因此被称为是一种绿色，环保，环境友好的生物催化剂。漆酶在印染废水的处理，药物合成，食品能源等领域具有广泛的应用前景。
不同物种来源的漆酶，因其分子结构的差异表现出了不同的特性和功能。漆酶的研究主要集中在真菌漆酶，而对细菌漆酶的研究较少。细菌漆酶首次发现于1993年，其中，细菌漆酶因为其具有良好的热稳定性，耐碱能力突出，底物范围宽泛而脱颖而出，受到学术界和工业界的广泛关注。在1993年，首次发现了来源于Azospirillum lipoferum菌株的细菌漆酶。一般来说，工业纺织染料的脱色是在高于9.0的pH水平和高于60℃的温度下进行的。然而，大多数真菌漆酶在碱性和高温环境下活性较低。近年来，来源于芽孢杆菌菌属的CotA漆酶逐渐受到了专家学者的关注。芽孢杆菌来源的漆酶相对于真菌漆酶具有优异的热稳定性和耐碱性。据有关报道，细菌漆酶的底物结合口袋比真菌漆酶的底物结合口袋宽，因此表明细菌漆酶可能具有催化更多大分子底物氧化的能力。因此，CotA漆酶可能更适合工业纺织品染料脱色。CotA-漆酶由于不能没有糖基化作用，所以易从自然酶中获得晶体结构。漆酶中有四个铜中心，可分为三个杯状区域。四个铜中心分别是T1Cu2+、T2Cu2+、T3Cu2+和T4Cu2+。T2和T3起着三核Cu簇的作用。电子在Cu团簇中发生转变。T2Cu2+区域为ABTS的结合位点。
然而，由于其催化效率低，CotA漆酶的工业应用受到限制。为了满足工业应用的要求，急需寻找一种满足工业化生产条件的CotA漆酶。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种催化效率提高的CotA漆酶，含有如SEQ ID NO.1～3任一所示的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述CotA漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述CotA漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述CotA漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二个目的是提供编码所述CotA漆酶的DNA分子。
本发明的第三个目的是提供一种提高CotA漆酶催化效率的方法，是在SEQ IDNO.4所示序列的基础上，将第208位的丝氨酸替换为甘氨酸，和/或将第227位的苯丙氨酸替换为丙氨酸。
本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α、或E.coli TOP10。
本发明的第五个目的是提供一种产CotA漆酶的方法，所述方法是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，35～37℃条件下发酵2～4h，再15～18℃发酵20～24h。
本发明的第六个目的是提供所述CotA漆酶的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括但不限于印染废水的处理、药物合成、食品中酚类有害物质的去除、木质素的降解、生物染料的制备。
本发明的第七个目的是提供一种染料的吸附方法，所述方法是将所述CotA漆酶按10～50U/g染料的比例加入至浓度为0.05～0.1mg/mL的印染废水中，于30～60℃反应5～10h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述CotA漆酶按10U/g染料的比例加入至浓度为0.05mg/mL的印染废水中，于50℃反应5h。
有益效果：本发明通过理性设计和定点突变的方法对来源于段小芽胞杆菌W3(Bacillus pumlusW3)CotA漆酶进行改造，构建了突变菌株提高了其催化效率，可达到改造前的5.1倍。突变株S208G/F227A在90℃条件下孵育5分钟还有超过40％的酶活。并将改造后的CotA突变酶用于降解4种染料(甲基红、酸性蓝129、孔雀石绿和甲基蓝)，S208G/F227A能够有效的降解4种染料，甲基红、酸性蓝129、孔雀石绿和甲基蓝降解率分别为69.8％、85.7％、96.5％和64.2％。
附图说明
图1为CotA漆酶的最适pH(a)和pH稳定性(b)图；
图2为CotA漆酶的最适温度曲线；
图3为CoA漆酶在不同温度(60～90℃)下酶的稳定性；
图4为CotA漆酶对染料脱色率图。
具体实施方式
酶活单位定义：每分钟氧化1umol底物所需的酶量为一个酶活单位U。
漆酶酶活的测定方法，在50℃下，以0.3mM的ABTS为底物，在pH3.5下测定酶活。使用紫外分光光度计检测420nm处的波长。动力学参数Km和Kcat利用Michaelis-Mentenequation计算。
最适温度以3mM ABTS为底物，pH3.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲盐，在不同的温度(20-90℃)下孵育一段时间后测量。
热稳定性：将酶在(50、60、70、80、90℃)孵育，每隔一段时间测一次剩余酶活。
脱色率：利用野生型CotA-laccase和突变体S208G/F227A对多种染料进行脱色。使用2mM ACS作为介体，0.025mg/mL的染料，10U的纯酶，100mM，pH3.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，3mL体系。反应体系在50℃孵育5小时。测定反应后在染料最大吸光度的吸光度值计算脱色率。
实施例1 CotA漆酶突变体的构建
以含有野生型CotA漆酶基因的pColdⅡ质粒为模板，突变引物见表格，利用定点突变试剂盒的一步PCR法完成定点突变。PCR产物使用DPN1酶在37℃下处理一小时。Dpn1酶是一种特异性切除甲基化的DNA链的限制性核酸酶，被用来切除模板DNA。处理完成后将PCR产物转入E.coli DH5α，筛选阳性克隆，并进行DNA测序验证。将突变质粒转入E.coli BL21(DE3)表达目标蛋白。
表1定点突变所需引物
利用定点突变的技术，所有来源于B.pumilus W3的CotA-laccase突变体都被成功的构建出来。构建了4株突变菌株，S208G，F227A，S208G/F227A，将携带有突变体和野生型基因的重组质粒pColdⅡ转入E.coli BL21(DE3)进行表达。
实施例2 CotA漆酶的制备及性质研究
将分别携带突变体和野生型基因的重组菌E.coli BL21(DE3)接种于5mL的LB培养基，加入5u的氨苄青霉素，37℃，200rpm过夜培养10小时。然后取1mL菌液到50mL新鲜的LB培养基中，加入50u的氨苄青霉素，37℃，200rpm培养1到2小时，直到OD600在0.3到0.5之间。将温度降低到15℃放置半小时。加入40uL的0.5M的IPTG和50ul的0.25M的CuSO4，终浓度分别为0.4mM和0.25mM.15℃，200rpm培养20h。
将收获的发酵液4℃，8000rpm离心5分钟，收集菌体，用20mM的pH7.0的磷酸盐缓冲液重悬菌体。使用超声破碎仪进行细胞破碎；将破碎液4℃，8000rpm离心20min，收集到的上清液即为粗酶液。
将粗酶液置于70℃下孵育15min，4℃，8000rpm离心20min去除沉淀。
将上清液过0.22滤膜，因为重组蛋白N端具有His6-tag，所以利用镍柱亲和层析的方法进行纯化来分离目标蛋白，使用AKTA-avant蛋白纯化仪。使用1mL的HisTrap HP进行纯化。用pH7.0的含有20mM的咪唑的磷酸盐缓冲液进行平衡柱子，然后用0-500mM梯度的咪唑进行洗脱。收集穿透峰和洗脱峰对应下的蛋白溶液。获得电泳级别的目的蛋白，使用HiTrapTM Desalting(购自GE Healthcare)5mL进行脱盐处理。SDS-PAGE和PAGE检测蛋白表达和分离情况。
为了比较酶学性质，将突变体与野生型通过镍离子亲和色谱法，使用HisTrap TMHP columns进行纯化。具有代表性的突变菌株的蛋白量大约在65kDa。对酶突变前后的动力学参数进行测定，结果如表1所示。与野生型漆酶相比，S208G的催化效率(kcat/Km)提高了1.3倍。与野生型漆酶相比，F227的催化效率提高了2.11倍。此外，双突变株S208G/F227的KCAT/Km值增加了5.13倍。
表1动力学参数
实施例3 CotA漆酶的最适pH和pH稳定性分析
最适pH以3mM ABTS为底物，50℃，在不同梯度pH的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲盐中测量。pH稳定性在4℃，不同pH的缓冲盐下孵育4h然后测量。
以ABTS为底物，测定纯化后的CotA漆酶的最适反应pH，pH范围从2.0到7.0(图1)。pH3.5～4.0时，酶活达724.3～763.7U/L。pH7～10时，孵育4h的酶活可达到75％～90％。
使用ABTS作为底物，野生型CotA漆酶和突变体的最佳pH值约3.5。pH值的稳定性表明，野生型CotA漆酶在pH值为6～10时是稳定的。突变体在pH值为7.0～10时稳定。所有CotA漆酶在pH 10时更稳定。与在pH＝10的条件下孵育2小时的剩余酶活相比，在pH 3.0条件下孵育2小时后还有大约40％的酶活。此外，与在pH为12的条件下孵育2小时后的剩余酶活相比，pH 10条件下孵育2小时，剩余酶活仍然超过50％。
实施例4 CotA漆酶最适反应温度和温度稳定性
最适温度以3mM ABTS为底物，pH3.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲盐，在不同的温度(20-90℃)下孵育30min后测量。
野生型CotA laccase和突变体S208G/F227A以ABTS为底物进行测试，最适反应温度都为80℃(图2)。突变体S208G和F227A的最适反应温度为70℃。稳定性研究表明，突变体与野生型CotA laccase具有很高的热稳定性。野生型漆酶在60℃、70℃和80℃培养5h后半衰期分别为2.31、1.52和0.83h。在90℃培养5min后，野生型漆酶的残留活性大于70％。S208G分别在60℃、70℃和80℃下孵育5h的半衰期分别为1.57、1.34和0.56h。在60℃、70℃和80℃下培养5h后，F227A的半衰期分别为1.12、0.47和0.38h。S208G/F227A的半衰期在60℃、70℃和80℃孵育5h后分别为1.35、0.51和0.44h。经90℃培养5min后，所有酶活力均在40％以上(图3)，稳定性研究表明，所有突变体均能满足工业应用的需要。
实施例5漆酶对染料的降解
比较纯化后的野生型漆酶和3株突变菌株对于不同染料的降解能力。以ABTS为介体进行实验，多种不同类型的染料的降解情况(图4)。
比较了四种染料(甲基红、酸性蓝129、孔雀绿和甲基蓝)对纯化酶的脱色能力。采用ABTS作为介体进行。用CotA漆酶对甲基红、酸性蓝129、孔雀石绿和甲基蓝进行脱色。每mg染料加入10U漆酶，反应体系在pH 3.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，温度为50℃条件下反应5h。与野生型CotA漆酶相比，S208G对酸性蓝和孔雀石绿的脱色率有所提高，对甲基红的降解率为50.6％，酸性蓝129的降解率为83.3％，孔雀石绿的降解率为92.4％，甲基蓝的降解率为60.67％。F227的脱色率与野生型CotA漆酶相比无显著差异，对甲基红的降解率为66.4％，对酸性蓝129的降解率为80.6％，对孔雀石绿的降解率为93.8％，对甲基蓝的降解率为65.3％。与野生型CotA漆酶相比，S208G/F227A的脱色率大幅度提高，对甲基红的降解率为69.8％，对酸性蓝129的降解率为85.7％，对孔雀石绿的降解率为96.5％，对甲基蓝的降解率为64.2％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种催化效率提高的CotA漆酶及其应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Asn Leu Glu Lys Phe Val Asp Glu Leu Pro Ile Pro Glu Val Ala
1 5 10 15
Glu Pro Val Lys Lys Asn Pro Arg Gln Thr Tyr Tyr Glu Ile Ala Met
20 25 30
Glu Glu Val Phe Leu Lys Val His Ser Asp Leu Pro Pro Thr Lys Leu
35 40 45
Trp Thr Tyr Asn Gly Gly Leu Pro Gly Pro Thr Ile Lys Ala Asn Arg
50 55 60
Asn Glu Lys Val Lys Val Lys Trp Met Asn Lys Leu Pro Leu Lys His
65 70 75 80
Phe Leu Pro Val Asp His Thr Ile His Ala Gly His His Asp Glu Pro
85 90 95
Glu Val Lys Thr Val Val His Leu His Gly Gly Val Thr Pro Ala Ser
100 105 110
Ser Asp Gly Tyr Pro Glu Ala Trp Phe Ser Arg Asp Phe Glu Ala Thr
115 120 125
Gly Pro Phe Phe Glu Arg Glu Val Tyr Glu Tyr Pro Asn His Gln Gln
130 135 140
Ala Cys Thr Leu Trp Tyr His Asp His Ala Met Ala Leu Thr Arg Leu
145 150 155 160
Asn Val Tyr Ala Gly Leu Ala Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Asp Ala Phe
165 170 175
Glu Lys Ser Leu Glu Leu Pro Lys Asp Glu Tyr Asp Ile Pro Leu Met
180 185 190
Ile Met Asp Arg Thr Phe Gln Glu Asp Gly Ala Leu Phe Tyr Pro Gly
195 200 205
Arg Pro Asn Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Leu Pro Asp Pro Ser Ile
210 215 220
Val Pro Phe Phe Cys Gly Glu Thr Ile Leu Val Asn Gly Lys Val Trp
225 230 235 240
Pro Tyr Leu Glu Val Glu Pro Arg Lys Tyr Arg Phe Arg Ile Leu Asn
245 250 255
Ala Ser Asn Thr Arg Thr Tyr Glu Leu His Leu Asp Asn Asp Ala Thr
260 265 270
Ile Leu Gln Ile Gly Ser Asp Gly Gly Phe Leu Pro Arg Pro Val His
275 280 285
His Gln Ser Phe Ser Ile Ala Pro Ala Glu Arg Phe Asp Val Ile Ile
290 295 300
Asp Phe Ser Ala Tyr Glu Asn Gln Thr Ile Val Leu Lys Asn Lys Ala
305 310 315 320
Gly Cys Gly Gln Glu Val Asn Pro Glu Thr Asp Ala Asn Ile Met Gln
325 330 335
Phe Lys Val Thr Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ala Ala Lys Thr Leu Arg
340 345 350
Pro Ile Phe Lys Pro Leu Pro Pro Leu Arg Pro Ser Arg Ala Asp Asn
355 360 365
Glu Arg Thr Leu Thr Leu Thr Gly Thr Gln Asp Lys Tyr Gly Arg Pro
370 375 380
Ile Leu Leu Leu Asp Asn Gln Phe Trp Asn Asp Pro Val Thr Glu Asn
385 390 395 400
Pro Arg Leu Gly Ser Val Glu Val Trp Asn Ile Val Asn Pro Thr Arg
405 410 415
Gly Thr His Pro Ile His Leu His Leu Val Gln Phe Arg Val Ile Asp
420 425 430
Arg Arg Pro Phe Asp Thr Asp Ile Tyr Gln Ser Thr Gly Glu Ile Val
435 440 445
Tyr Thr Gly Pro Asn Glu Ala Pro Pro Leu His Glu Gln Gly Tyr Lys
450 455 460
Asp Thr Ile Gln Ala His Ala Gly Glu Val Ile Arg Ile Ile Ala Arg
465 470 475 480
Phe Val Pro Tyr Ser Gly Arg Tyr Val Trp His Cys His Ile Leu Glu
485 490 495
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<210> 2
<211> 510
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<400> 2
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195 200 205
Arg Pro Asn Asn Thr Pro Glu Asp Ser Asp Leu Pro Asp Pro Ser Ile
210 215 220
Val Pro Ala Phe Cys Gly Glu Thr Ile Leu Val Asn Gly Lys Val Trp
225 230 235 240
Pro Tyr Leu Glu Val Glu Pro Arg Lys Tyr Arg Phe Arg Ile Leu Asn
245 250 255
Ala Ser Asn Thr Arg Thr Tyr Glu Leu His Leu Asp Asn Asp Ala Thr
260 265 270
Ile Leu Gln Ile Gly Ser Asp Gly Gly Phe Leu Pro Arg Pro Val His
275 280 285
His Gln Ser Phe Ser Ile Ala Pro Ala Glu Arg Phe Asp Val Ile Ile
290 295 300
Asp Phe Ser Ala Tyr Glu Asn Gln Thr Ile Val Leu Lys Asn Lys Ala
305 310 315 320
Gly Cys Gly Gln Glu Val Asn Pro Glu Thr Asp Ala Asn Ile Met Gln
325 330 335
Phe Lys Val Thr Arg Pro Leu Lys Gly Arg Ala Ala Lys Thr Leu Arg
340 345 350
Pro Ile Phe Lys Pro Leu Pro Pro Leu Arg Pro Ser Arg Ala Asp Asn
355 360 365
Glu Arg Thr Leu Thr Leu Thr Gly Thr Gln Asp Lys Tyr Gly Arg Pro
370 375 380
Ile Leu Leu Leu Asp Asn Gln Phe Trp Asn Asp Pro Val Thr Glu Asn
385 390 395 400
Pro Arg Leu Gly Ser Val Glu Val Trp Asn Ile Val Asn Pro Thr Arg
405 410 415
Gly Thr His Pro Ile His Leu His Leu Val Gln Phe Arg Val Ile Asp
420 425 430
Arg Arg Pro Phe Asp Thr Asp Ile Tyr Gln Ser Thr Gly Glu Ile Val
435 440 445
Tyr Thr Gly Pro Asn Glu Ala Pro Pro Leu His Glu Gln Gly Tyr Lys
450 455 460
Asp Thr Ile Gln Ala His Ala Gly Glu Val Ile Arg Ile Ile Ala Arg
465 470 475 480
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485 490 495
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<210> 4
<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
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1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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100 105 110
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180 185 190
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<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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gttatttggt ctacctggat aaaatagtgc gcca 34
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<212> DNA
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<400> 7
taacacacca gaagatagtg accttccaga tccctctatc gtgccagc 48
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<212> DNA
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gtttccccgc aaaaagctgg cacgatagag ggatctggaa ggtca 45
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gtttccccgc aaaaagctgg cacgatagag ggatctggaa ggtca 45
Claims (10)
1.一种催化效率提高的CotA漆酶，其特征在于，含有如SEQ ID NO.1～3任一所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述CotA漆酶的DNA分子。
3.一种提高CotA漆酶催化效率的方法，是在SEQ ID NO.4所示序列的基础上，将第208位的丝氨酸替换为甘氨酸，和/或将第227位的苯丙氨酸替换为丙氨酸。
4.表达权利要求1所述CotA漆酶的基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，宿主为细菌或真菌细胞。
6.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主；所述大肠杆菌包括E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α、或E.coli TOP10。
7.一种产CotA漆酶的方法，其特征在于，将权利要求4～6任一所述的基因工程菌接种至培养基中进行培养产酶。
8.权利要求1所述CotA漆酶在食品、化工、生物、医药、环境领域的应用。
9.一种吸附染料的方法，其特征在于，将权利要求1所述的CotA漆酶按10～50U/g染料的比例加入至印染废水中，于30～60℃反应5～10h。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述印染废水中染料浓度为0.05～0.1mg/mL的。
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