KR101740099B1 - 라카아제를 포함하는 바이오연료전지 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 지오바실러스속 미생물(Geobacillus sp. AR1)로부터 유래된 라카아제가 고정된 캐소드 전극을 포함하는 바이오연료전지 및 상기 바이오연료전지를 사용하여 전기를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 라카아제가 고정된 캐소드 전극을 포함하는 바이오연료전지는 종래의 바이오연료전지에 비하여, 향상된 내열성을 나타낼 뿐만 아니라, 온도가 증가되는 환경에서 오히려 전기 생산성이 증대되므로, 다양한 바이오연료전지의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

라카아제를 포함하는 바이오연료전지{Biofuel cell comprising laccase}
본 발명은 라카아제를 포함하는 바이오연료전지에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 지오바실러스속 미생물(Geobacillus sp. AR1)로부터 유래된 라카아제가 고정된 캐소드 전극을 포함하는 바이오연료전지 및 상기 바이오연료전지를 사용하여 전기를 생산하는 방법에 관한 것이다.
바이오연료전지(Biofuel cell; BFC)는 효소와 미생물 등이 갖고 있는 생물의 기능을 이용하여 전자공여체인 기질이 가지고 있는 화학에너지를 전기에너지로 전환하는 장치를 의미한다. 구체적으로, 효소반응 또는 미생물의 대사에 의하여 기질이 분해되는 과정에서 발생되는 화학에너지를 전기에너지로 변환시키는 수단과 상기 변환된 전기에너지를 회수하는 수단을 포함하여, 결과적으로는 미생물을 사용하여 기질로부터 전기를 생산하는 장치를 의미한다. 통상적으로, 바이오연료전지는 산화효소 또는 이를 발현시키는 미생물이 고정된 아노드(anode) 전극, 환원효소 또는 이를 발현시키는 미생물이 고정된 캐소드(cathode) 전극, 상기 아노드 전극과 캐소드 전극을 연결하는 전선 및 상기 아노드 전극과 캐소드 전극이 담겨진 각각의 반응조로 구성되는데, 상기 각 반응조에 각각의 기질이 포함된 배지가 충진되면, 아노드 전극에 고정된 산화효소 또는 미생물이 분해시켜서, 분해산물로서 수소이온과 전자를 생성시키고, 상기 생성된 전자는 아노드 전극으로부터 캐소드 전극으로 이동하며, 캐소드 전극에 고정된 환원효소는 기질을 산화시키면서, 상기 이동된 전자를 이용하여 배지내의 용존산소를 물의 형태로 전환시켜서 결과적으로는 상기 전선을 통해 연속적으로 전류가 흐르게 된다. 이러한 바이오연료전지의 핵심은 각 전극에 고정된 효소 또는 미생물로서 상기 각 효소 또는 미생물이 기질에 작용하여 전자의 발생 및 소모 효율이 증가할 수록 미생물 연료전지에서 생산되는 전기의 생산량이 증가하게 된다.
이러한 바이오연료전지는 대체로 효소보다는 미생물을 사용하게 되는데, 기질분해 활성이 일정기간 동안만 유지되고 이후에는 기질분해 활성이 저하되는 효소와는 달리 미생물은 생명활동을 통해 기질분해 활성을 지속적으로 유지할 수 있기 때문이다. 최근에는 미생물에 대한 기질이 지속적으로 유지될 수 있는 폐수 처리장치와 상기 바이오연료전지를 연동시켜서, 폐수처리와 전기생산을 동시에 수행하는 방법이 개발되고 있다. 예를 들어, 한국특허공개 제2013-0029530호에는 미생물연료전지와 미생물전기분해전지가 융합된 에너지 자립형 고도 폐수처리 장치 및 상기 장치를 통한 폐수처리 방법이 개시되어 있다. 그러나, 이처럼 미생물을 사용한 바이오연료전지라 하여도 전기 생산이 일정수준 지속되면, 저항값이 증가하여 바이오연료전지 자체의 온도가 증가되고, 온도의 증가는 미생물의 활성을 감소시키므로, 결과적으로는, 미생물을 이용한 바이오연료전지 역시 수명이 제한된다는 단점이 부각되었다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여는, 내열성을 갖는 미생물을 사용하여야 하는데, 이러한 내열성 미생물은 기질공급이 용이하지 않을 뿐만 아니라 배양조건이 제한되므로, 내열성 미생물을 이용한 바이오연료전지의 개발이 원활하게 진행되지 못하는 실정이다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 없는 실정이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 고온조건하에서도 구동할 수 있는 바이오연료전지를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 캐소드 전극에 고정되는 환원효소로서 내열성 효소인 라카아제를 포함하는 바이오연료전지는 넓은 온도범위에서 구동될 수 있을 뿐만 아니라, 고온조건에서는 전기 생산성이 더욱 향상됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 라카아제를 포함하는 바이오연료전지를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바이오연료전지를 이용하여 전기를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 고온조건하에서도 구동할 수 있는 바이오연료전지를 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 미생물이 아닌 효소를 이용한 바이오연료전지에 주목하게 되었다. 통상적으로, 효소를 사용하는 바이오연료전지는 효소의 활성저하로 인하여 미생물을 사용하는 바이오연료전지 보다도 구동기간이 짧다는 단점이 있는 반면, 미생물을 이용하는 바이오연료전지에 비하여, 기질이 단순하고, 미생물 배양시에 필요한 각종 탄소원, 질소원 등의 구성요소를 필요로 하지 않으므로, 바이오연료전지를 단순화할 수 있다는 장점이 있다. 뿐만 아니라, 아가로스 등의 고정매체를 이용하여 바이오연료전지의 아노드 전극 또는 캐소드 전극에 효소를 고정화시키면, 상기 고정매체가 효소반응 환경을 유지시켜서 효소의 활성을 장시간 동안 유지시킬 수 있고, 내열성 미생물의 경우에는 미생물의 생존에 필요한 필수성분이 필요하지만, 내열성 효소의 경우에는 이러한 필수성분이 필요하지 않다는 장점이 있다.
이에, 본 발명자들은 효소를 사용하는 바이오연료전지의 캐소드 전극에 고정시키기에 적합한 내열성 환원효소를 검색한 결과, 라카아제를 선발하였다. 특히, 지오바실러스속 미생물(Geobacillus sp. AR1)로부터 유래된 라카아제는 pH 4.0 내지 9.0의 비교적 넓은 범위에서 효소활성을 나타내고, 40 내지 100℃의 넓은 온도범위에서 효소활성을 나타내며, pH 6.5 및 80℃에서 최적 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 100℃에서 180분동안 노출된 경우에도 50% 이상의 효소활성이 유지되는 내열성을 나타냄을 확인하였다. 이에, 상기 라카아제를 캐소드 전극에 고정시키고, 산화환원 반응에 의한 전류생산을 시험한 결과, 온도조건이 증가할 수록 전류의 생산성이 증가함을 확인하였다.
따라서, 라카아제가 고정된 캐소드 전극을 포함하는 바이오연료전지를 사용하면, 바이오연료전지의 사용기간에 비례하여 증가되는 온도로 인한 문제점을 해결할 수 있음을 알 수 있었다.
상술한 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 라카아제를 포함하는 바이오연료전지를 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 라카아제를 포함하는 바이오연료전지는 (a) 지오바실러스속 미생물(Geobacillus sp. AR1)로부터 유래된 라카아제가 고정된 캐소드(cathode) 전극; (b) 상기 라카아제의 기질을 포함하고, 라카아제의 효소반응환경을 제공하는 제1 배지; (c) 상기 캐소드 전극과 제1 배지가 담겨진 캐소드 반응조; (d) 산화효소가 고정된 아노드(anode) 전극; (e) 상기 산화효소의 기질을 포함하고, 산화효소의 효소반응환경을 제공하는 제2 배지; (f) 상기 아노드 전극과 제2 배지가 담겨진 아노드 반응조; 및 (g) 상기 아노드 전극과 캐소드 전극을 연결하는 전선을 포함한다.
본 발명의 용어 "바이오연료전지(biofuel cell)"란, 효소와 미생물 등이 갖고 있는 생물의 기능을 이용하여 산화-환원반응을 일으키는 전지를 의미하는데, 구체적으로는 반응조 내에 존재하는 효소 또는 미생물의 대사에 의하여 기질의 촉매반응을 진행하는 과정에서 발생되는 화학에너지를 전기에너지로 변환시키는 수단과 상기 변환된 전기에너지를 회수하는 수단을 포함하여, 결과적으로는 효소 또는 미생물을 사용하여 기질로부터 전기를 생산하는 장치를 의미한다. 통상적으로, 바이오연료전지는 산화효소 또는 이의 생산 미생물이 고정된 아노드 전극, 환원효소 또는 이의 생산 미생물이 고정된 캐소드 전극, 상기 효소 또는 미생물과 반응할 수 있는 기질을 포함하고, 각 효소 또는 미생물의 기질반응 환경을 제공하는 배지, 상기 전극을 연결하는 전선, 상기 두 개의 전극, 상기 각 전극과 배지가 담겨진 각각의 반응조로 구성된다. 상기 각 반응조에 각 효소의 기질이 포함된 배지를 충진시키면, 아노드 전극에서는 기질을 아노드 전극에 고정된 산화효소 또는 미생물이 반응시켜서, 수소이온과 전자를 생성시키고, 상기 생성된 전자는 전선을 통하여 캐소드 전극으로 이동하며, 전자를 받은 캐소드 전극에 고정된 환원효소는 기질을 산화시키면서, 부반응으로 전자를 이용하여 용존산소를 물로 전환시켜서, 전달된 전자를 소모하게 되어, 결과적으로는 캐소드 전극에서 아노드 전극으로 전류가 흐르게 된다.
상기 바이오연료전지는 효소 또는 미생물에 의하여 기질에서 수소이온과 전자가 생성되면 전류를 생성할 수 있으므로, 상기 반응조에 기질을 지속적으로 공급하면, 전류가 지속적으로 생성될 수 있다. 상기 바이오연료전지는 효소를 촉매로 하여 유기 화합물의 전극 반응을 이용하는 효소연료전지, 미생물 반응으로 연료를 전극 반응을 일으키기 쉬운 화합물로 변환하는 미생물연료전지, 광합성 세균 등을 사용하여 태양에너지를 이용하는 생물 태양전지 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 바이오연료전지는 라카아제가 고정된 캐소드 전극을 포함하므로, 라카아제가 고정된 캐소드 전극을 포함하는 효소전지로 해석될 수 있다.
본 발명의 용어 "라카아제(laccase, EC 1.10.3.2)"란, 구리를 함유하는 다중구리산화효소(multicopper oxidase)의 일종을 의미한다. 상기 라카아제는 대부분 3가지 cupredoxine-type domain으로 구성된 비슷한 구조를 갖는데, 이들 효소는 단일페놀, 폴리페놀, 메톡시 치환 페놀, 방향족 아민, 리그닌 등의 다양한 페놀 화합물들에 대한 기질 특이성을 나타낸다. 대부분의 라카아제는 3개의 구리이온을 함유하며 단백질 구조 내에 3가지(type-1, type-2, type-3)의 구리결합자리를 가지고 있다. 효소반응에서 기질의 산화반응은 type-1 구리에 의해 촉매 되어 전자는 트리뉴클리어 클러스터(trinulear cluster, 1개의 type-2 copper와 2개의 type-3 cooper로 구성)를 따라 이동하고, 산소분자의 환원과 물 분자의 방출을 동반하게 된다. 이런 전자이동 메커니즘을 바탕으로 라카아제는 단량체(monomer)의 교차연결, 고분자의 분해 및 방향족 화합물의 개열에 관여한다. 이와 같이 라카아제는 다양한 기질 특이성뿐만 아니라 폭넓은 반응 능력 때문에 염료 탈색, 펄프 표백, 생물학적 환경 정화, 폴리머 합성, 바이오센서 등의 여러 분야에서 활용되고 있다. 상기 라카아제의 구체적인 아미노산 서열 또는 그를 코딩하는 유전자의 염기서열 정보는 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스(GenBank Accession No. JX011007 등)에서 얻을 수 있는데, 예를 들어, 라카아제는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 서열번호 2의 DNA 서열로부터 발현되는 단백질로 표시될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 라카아제는 바이오연료전지에 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 지오바실러스속 미생물(Geobacillus sp. AR1)로부터 유래된 라카아제가 될 수 있고, 보다 바람직하게는 pH 4.0 내지 9.0의 pH 조건 및 40 내지 100℃의 온도조건에서 활성을 나타내고, 100℃에서 180분동안 노출된 경우에도 50% 이상의 효소활성을 유지하는 내열성을 나타내는 지오바실러스속 미생물로부터 유래된 라카아제가 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산을 포함하는 라카아제가 될 수 있다.
아울러, 상기 라카아제 보다도 내열성 및 전류생산성이 향상될 수 있다면, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 일부 아미노산이 부가, 치환, 결실 등의 방법으로 변이된 변이체 단백질도 본 발명에서 제공하는 라카아제의 범주에 포함될 수 있다.
특히, 본 발명에서 제공하는 라카아제는 서열번호 1의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.
끝으로, 본 발명에서 제공하는 라카아제는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 라카아제를 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
상기 라카아제가 고정되는 캐소드 전극은 전자를 전달받아 라카아제로 전달할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 카본 펠트, 카본 페이퍼, 카본 클로스 등의 재질로 제조된 것 또는 에어캐소드(air-cathode)를 사용할 수 있다.
상기 라카아제의 기질은 라카아제에 의하여 산화되어 전자를 소모할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 다양한 페놀 화합물이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 카테콜(Catechol), 2,6-DMP(2,6-Dimethoxy-phenol), 4-메틸카테콜(4-Methylcatechol) 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 바이오연료전지를 구성하는 아노드 전극에 고정된 산화효소는 전자를 생성할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 당탈수소효소, 알코올탈수소효소, 알데하이드탈수소효소, 피루브산탈수소효소, 숙신산탈수소효소, 아미노산탈수소효소, 글루타티온환원효소, 글루코오스산화효소(glucose oxidase) 등의 다양한 탈수소효소를 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
상기 산화효소가 고정된 아노드 전극은 상기 산화효소가 고정될 수 있고, 산화효소로부터 생성된 전자를 전선으로 운반할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 백금, 스테인레스 스틸 메시, 카본 펠트, 카본 페이퍼 등의 재질로 제조된 것을 사용할 수 있다.
상기 산화효소의 기질은 산화효소가 효소반응에 의하여 전자를 생성할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어 산화효소로서 알도스 당 탈수소효소를 이용하는 경우에는 기질로서 글루코스 등의 6탄당을 사용할 수 있다.
상기 캐소드 전극과 아노드 전극이 담겨지는 제1 배지 및 제2 배지는 각 전극에 고정된 산화효소 및 라카아제가 정상적인 효소활성을 나타낼 수 있는 반응환경을 제공하고, 생성 또는 소모되는 전자의 전달이 가능하게 하는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 pH 4.0 내지 9.0을 유지하는 완충용액이 될 수 있는데, 예를 들어, pH 6.5의 인산염 완충액을 사용할 수 있다.
상술한 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 라카아제를 포함하는 바이오연료전지를 이용하여 전기를 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 라카아제를 포함하는 바이오연료전지를 이용하여 전기를 생산하는 방법은 (a) 상기 바이오연료전지의 캐소드 반응조에 제1 배지를 공급하고, 아노드 반응조에 제2 배지를 공급하는 단계; 및 (b) 상기 공급된 각 배지에 포함된 기질을 이용하여 아노드 전극에 고정된 산화효소가 전자를 생산하고, 생산된 전자는 전선을 통해 캐소드 전극으로 이동하며, 캐소드 전극에서 라카아제에 의해 전자가 소모되어, 전류를 생성하는 단계를 포함한다. 이때, 사용된 기질, 배지 등의 조건은 상술한 바와 동일하다.
본 발명에서 제공하는 바이오연료전지는 이에 포함된 라카아제의 특성상 25 내지 100℃의 넓은 온도범위에서 전류를 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 전류의 생산도중에 증가하는 저항값에 의하여 반응조의 온도가 증가하면, 온도가 증가함에 따라, 전류의 생성량이 더욱 증가하는 특성을 나타낸다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 라카아제가 고정된 글래시 카본(glassy carbon) 전극을 산소로 1시간 이상 버블링(bubbling)시킨 효소반응액(20mM 인산염 완충액(oH 6.5) 및 1 mM catechol)에 넣고, 50 mV/s의 주사속도로 25℃에서 전류 전위곡선 분석을 수행한 결과, 환원 전류가 증가함에 따라 0.35 V 부근에서 산화 피크의 강도가 크게 증가하여 전류가 흐르게 됨을 확인하였고(도 6), 70℃에서는 25℃ 보다 높은 산화 피크를 나타내어 전류 생성량이 증가함을 확인하였다(도 6).
본 발명에서 제공하는 라카아제가 고정된 캐소드 전극을 포함하는 바이오연료전지는 종래의 바이오연료전지에 비하여, 향상된 내열성을 나타낼 뿐만 아니라, 온도가 증가되는 환경에서 오히려 전기 생산성이 증대되므로, 다양한 바이오연료전지의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 발현 및 정제된 라카아제의 SDS-PAGE 분석결과를 나타내는 전기영동사진으로서, 1번 레인은 마커이고, 2번 레인은 IPTG가 처리되지 않고 배양된 세포의 세포파쇄물이며, 3번 레인은 IPTG를 처리하여 배양된 세포의 세포파쇄물이고, 4번 레인은 IPTG를 처리하여 배양된 세포의 세포파쇄물의 상등액이며, 5번 레인은 IPTG를 처리하여 배양된 세포의 세포파쇄물의 침전물이고, 6번 레인은 IPTG를 처리하여 배양된 세포의 세포파쇄물의 침전물에 결합완충액을 처리한 시료이며, 7번 레인은 HisTrap HP column에서 용출된 활성분획이고, 8번 레인은 HisTrap HP column에서 용출된 활성분획을 젤 필트레이션 컬럼(gel filtration column)을 통과시켜 용출된 활성분획의 시료이다이다.
도 2는 라카아제의 UV-visible 흡수 스펙트럼 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 pH 변화에 따른 라카아제의 활성변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 반응온도 변화에 따른 라카아제의 활성변화를 나타내는 그래프이다.
도 5는 라카아제의 열처리 시간에 따른 효소활성 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 온도변화에 따른 라카아제가 고정된 글래시 카본 전극을 이용한 전류 전위곡선(cyclic voltamogram) 분석결과를 나타내는 그래프로서, (…)은 라카아제가 고정되지 않은 글래시 카본 전극을 25℃에서　반응한 경우를 나타내고, (----)은 라카아제를　고정한　글래시　카본　전극을 25℃에서　반응한 경우를 나타내며, (━━)은 라카아제를　고정한　글래시　카본　전극을 70℃에서　반응한 경우를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 라카아제의 생산
실시예 1-1: 라카아제 유전자의 수득 및 상기 유전자 발현용 재조합 벡터의 제작
지오바실러스속 미생물(Geobacillus sp. AR1)을 영양배지(0.1% beef extract, 0.2% yeast extract, 0.5% peptone, 0.5% NaCl, pH7.4)에 접종하고, 65℃에서 24시간 동안 배양한 다음, GeneAll GENEx Genomic kit(GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다.
라카아제 유전자의 염기서열이 규명된 다른 지오바실러스속 미생물(Geobacillus stearothermophilus)의 염기서열에 기반하여, 상기 지오바실러스속 미생물(Geobacillus sp. AR1) 유래 라카아제 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 합성한 다음, 상기 추출된 게놈 DNA와 합성된 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 증폭된 DNA 단편을 수득하였다.
Primer 1: 5'-CAGGCCTTCTGGAGGGGGTGGCCCC-3'(서열번호 3)
Primer 2: 5'-GTGCCACGGGCCCCTGTACGCTGCC-3'(서열번호 4)
상기 수득한 DNA 단편을 Topo blunt vector(Enzynomics, Korea)에 클로닝하여 라카아제 유전자 도입벡터 pLAC1를 제작하고, 이에 포함된 라카아제 유전자의 염기서열을 ABI Prism 3700 genetic analyzer(Perkin-Elmer Applied Biosystems, USA)를 사용하여 분석하였다. 그 결과, 상기 라카아제 유전자(서열번호 2)는 825bp의 ORF(open reading frame)로 구성되어, 274개의 아미노산으로 구성된 단백질(서열번호 1)을 코딩할 것으로 예상되었고, 상기 코딩된 라카아제 단백질의 예상분자량은 약 29.8kDa이며, 등전점은 약 6.07 정도로 예측되었다.
상기 pLAC1를 주형으로 하고, 하기 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 0.83 kb의 DNA 단편을 증폭시켰다.
Primer 3: 5'-TGGCCCCCATATGCCAGACATTTTTCAACA-3'(서열번호 5)
Primer 4: 5'-GTACTCGAGTGTCCATTCCTCCCTTC-3'(서열번호 6)
상기 증폭된 0.83 kb의 DNA 단편에 제한효소인 NdeI/XhoI을 처리하여 절단하고, 동일한 제한효소로 처리된 pET-21a 벡터(Novagen)에 도입하여, 라카아제 발현벡터 pET-LAC1를 제작하였다. 상기 발현벡터는 라카아제의 C-말단에 His-tag가 부착된 융합 단백질을 생산할 수 있도록 설계되었다.
실시예 1-2: 라카아제의 생산
상기 실시예 1-1에서 제작한 라카아제 발현벡터 pET-LAC1를 대장균(E. coli SoluBL, DE3)에 도입하여 형질전환체를 제조하고, 상기 제조된 형질전환체를 50㎍/㎖ 암피실린이 포함된 LB 배지(tryptone 10 g/ℓ, yeast extract 5 g/ℓ 및 NaCl 5 g/ℓ)에 접종한 다음, 37℃에서 16시간 동안 전배양하였다. 상기 전배양된 배양물을 새로운 LB 배지에 접종하고, O.D.600에서의 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양한 다음, 0.5 mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 가하고, 37℃에서 5시간동안 추가로 배양하였다. 배양이 종료된 후, 배양물을 원심분리하여 균체를 수득하고, 변성 완충액(20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 2 M urea and 2% Triton X-100)에 현탁시킨 다음, 초음파를 가하여 균체파쇄물을 수득하였다. 상기 수득한 균체파쇄물을 원심분리(27,000×g, 10분)하여 침전물을 수득하고, 상기 수득한 침전물에 결합 완충액(20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 6 M guanidine HCl, 5 mM imidazole 및 1 mM 2-Mercaptoethanol)을 가하여 실온에서 1시간 동안 용해시켰다. 상기 용해물을 다시 원심분리하여 상등액을 수득하고, 상기 수득한 상등액을 친화성 컬럼(HisTrap HP column, GE Healthcare)에 적용한 다음, 세척용 완충액(20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 6 M urea, 20 mM imidazole 및 1 mM 2-Mercaptoethanol)으로 세척하고, 재접힘 완충액(20 mM Tris pH 8.0, 500 mM NaCl 및 20 mM imidazole)을 가하여 단백질의 재접힘을 유도하였다. 이어, 용출액(20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl 및 500 mM imidazole)을 0 에서　100％ 까지　농도구배를　주어　가하고, 활성분획을 수득하였다. 상기 수득한 활성분획을 농축하고, 젤 필트레이션 컬럼(gel filtration column)을 통과시켜 용출된 활성분획에　대하여 SDS-PAGE 분석을 수행하였다(도 1).
도 1은 발현 및 정제된 라카아제의 SDS-PAGE 분석결과를 나타내는 전기영동사진으로서, 1번 레인은 마커이고, 2번 레인은 IPTG가 처리되지 않고 배양된 세포의 세포파쇄물이며, 3번 레인은 IPTG를 처리하여 배양된 세포의 세포파쇄물이고, 4번 레인은 IPTG를 처리하여 배양된 세포의 세포파쇄물의 상등액이며, 5번 레인은 IPTG를 처리하여 배양된 세포의 세포파쇄물의 침전물이고, 6번 레인은 IPTG를 처리하여 배양된 세포의 세포파쇄물의 침전물에 결합완충액을 처리한 시료이며, 7번 레인은 HisTrap HP column에서 용출된 활성분획이고, 8번 레인은 HisTrap HP column에서 용출된 활성분획을 젤 필트레이션 컬럼(gel filtration column)을 통과시켜 용출된 활성분획의 시료이다. 도 1에서 보듯이, 약 29 kDa 크기의 라카아제가 발현됨을 확인하였다.
실시예 1-3: 라카아제의 UV - visible 흡수 스펙트럼 분석
라카아제는 통상 4개의 구리를 함유하는 것으로 알려져 있는데 본 라카아제의 구리 함유 여부를 조사하기 위하여, UV-visible 흡수 스펙트럼 분석을 수행하였다.
대략적으로, 상기 실시예 1-2에서 생산된 라카아제를 20mM 인산염 완충액(pH 6.5)에 가하고, UV/VIS spectrophotometer(Optizen 2120UV, Mecasys, Korea)에 적용하여 UV-visible 흡수 스펙트럼 분석을 수행하였다(도 2).
도 2는 라카아제의 UV-visible 흡수 스펙트럼 분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 2에서 보듯이, 600nm(type-1 blue copper center에 상응)와 330 nm(type-3 copper center에 상응)에서 피크를 나타냄을 확인하였다. 이로부터, 상기 생산된 라카아제는 전형적인 라카아제와 같이 Type 1과 3의 구리결합부위를 포함함을 알 수 있었다.
실시예 1-4: 라카아제의 효소활성 분석
상기 실시예 1-2에서 생산된 라카아제의 효소활성에 대한 pH 효과, 반응온도 효과. 내열성 및 기질특이성을 분석하였다.
실시예 1-4-1: pH 효과분석
상기 실시예 1-2에서 생산된 0.1 mg/㎖의 라카아제 0.1㎖을, 기질인 5 mM 2,6-Dimethoxy-phenol(DMP)와 0.1mM CuSO4를 포함하는 반응액에 가하고, pH 2 내지 9의 조건(50 mM Sodium acetate(pH 3.0~6.0), 50mM Sodium phosphate(pH 6.0~7.5), 50mM Tris-HCl(pH 8.0~9.0))하에서, 75℃에서 10분동안 반응시키고, 반응산물의 흡광도(O.D.470nm)를 측정하여 활성변화를 분석하였다(도 3).
도 3은 pH 변화에 따른 라카아제의 활성변화를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, pH 6.5에서 최적 효소활성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 1-4-2: 반응온도 효과분석
상기 실시예 1-2에서 생산된 0.1 mg/㎖의 라카아제 0.1㎖을, 기질인 5 mM 2,6-DMP와 0.1mM CuSO4를 포함하는 50mM 인산염 완충액(pH 6.5)에 가하고, 40 내지 100℃에서 10분동안 반응시키고, 반응산물의 흡광도(O.D.470nm)를 측정하여 활성변화를 분석하였다(도 4).
도 4는 반응온도 변화에 따른 라카아제의 활성변화를 나타내는 그래프이다. 도 4에서 보듯이, 80℃에서 최적 효소활성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 1-4-3: 내열성 분석
상기 실시예 1-2에서 생산된 라카아제를 100℃에서 250분 동안 처리하면서, 시간별로 이의 효소활성 변화를 분석하였다(도 5). 이때, 효소활성 측정은 기질인 5 mM 2,6-DMP와 0.1mM CuSO4를 포함하는 50mM 인산염 완충액(pH 6.5)에서 80℃에서 10분동안 반응시켜서 수행하였다.
도 5는 라카아제의 열처리 시간에 따른 효소활성 변화를 나타내는 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 100℃에서 180분동안 열처리할 경우, 효소활성이 반감됨을 확인하였다.
실시예 1-4-4: 기질 특이성 분석
라카아제의 기질로 공지된 카테콜(Catechol), 2,6-DMP 또는 4-메틸카테콜(4-Methylcatechol)을 기질로 사용하여, 상기 실시예 1-2에서 생산된 라카아제의 기질 특이성을 분석하였다(표 1). 이때, 효소 활성과 기질 농도와의 관계를 나타내는 kinetic 값은 EZ-Fit program의 Michaelis-Menten 식을 이용하여 계산하였다.
라카아제의 기질 특이성
기질 εmax(M-1cm-1) 파장(nm) Km(mM) kcat(S-1) kcat/Km(mM-1S-1)
카테콜
2,6-DMP
4-메틸카테콜		 2211
35645
2091		 450
470
420		 0.078
0.0151
0.1274		 0.668
0.101
0.8487		 8.5641
6.6887
6.6617
상기 표 1에서 보듯이, 상기 라카아제는 2,6-DMP에 대해 가장 높은 기질 친화도를 나타내었고, 4-메틸카테콜에 대해서는 가장 높은 촉매상수(kcat)을 나타내었으며, 촉매 효율(kcat/Km)은 카테콜이 가장 우수함을 확인하였다.
실시예 2: 라카아제의 전기화학적 활성 분석
전기화학 분석기(WPG100e, WonaTech, Korea)를 사용한 전류 전위곡선(cyclic voltamogram) 분석에 미치는 라카아제의 효과를 분석하고자 하였다.
먼저, Referenc 전극인 Ag/AgCl 전극(Bioanalytical Systems, BAS MF-2079); counter 전극인 백금선(platinum wire, Bioanalytical Systems, BAS MF-1052); 및 글래시 카본(glassy carbon) 전극(diameter, 3.0 mm)(CH Instruments, CHI104)을 0.3㎛ 알루미나 슬러리(umina slurry)를 사용하여 1차 세척한 다음, 0.05㎛ 알루미나 슬러리를 사용하여 2차 세척하고, 증류수 조건에서 초음파를 처리하였으며, 이후 실온에서 건조시켰다.
한편, 0.4% 아가로스를 포함하는 20mM 인산염 완충액(pH 6.5)에 동일부피의 1 mg/㎖ 라카아제 용액을 가하고 혼합하고, 상기 혼합액을 상기 건조된 글래시 카본 전극의 표면에 도포한 다음, 4℃에서 2시간 동안 건조시켜서, 라카아제가 고정된 글래시 카본 전극을 수득하였다. 상기 라카아제가 고정된 글래시 카본 전극을 산소로 1시간 이상 버블링(bubbling)시킨 효소반응액(20mM 인산염 완충액(pH 6.5) 및 1 mM catechol)에 넣고, 50 mV/s의 주사속도하에서 전류 전위곡선 분석을 수행하였다. 대조군으로는 라카아제가 고정되지 않은 글래시 카본 전극을 이용한 전류 전위곡선 분석결과를 사용하였다.
도 6은 온도변화에 따른 전류 전위곡선 분석결과를 나타내는 그래프로서, (…)은 라카아제가 고정되지 않은 글래시 카본 전극을 25℃에서　반응한 경우를 나타내고, (----)은 라카아제를　고정한　글래시　카본　전극을 25℃에서　반응한 경우를 나타내며, (━━)은 라카아제를　고정한　글래시　카본　전극을 70℃에서　반응한 경우를 나타낸다. 라카아제가 고정되지 않은 전극을 사용한 경우에는, 별다른 피크 변화가 나타나지 않은 반면, 25℃에서 라카아제가 고정된 전극을 사용한 경우에는, 환원 전류가 증가함에 따라 0.35 V 부근에서 산화 피크의 강도가 증가하여 전류가 흐르게 됨을 확인하였다. 또한 70℃에서는 25℃ 보다 높은 산화 피크를 나타내어 전류 생성량이 증가함을 확인하였다(도 6).
따라서, 본 발명에서 제공하는 라카아제는 반응온도가 증가할 수록 전류생성량을 증대시키는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
<110> Dong-eui University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Biofuel cell comprising laccase <130> KPA140484-KR <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant thermophilic laccase <400> 1 Met Pro Asp Ile Phe Gln Gln Glu Ala Arg Gly Trp Leu Arg Cys Gly 1 5 10 15 Ala Pro Pro Phe Ala Gly Ala Val Ala Gly Leu Thr Thr Lys His Gly 20 25 30 Gly Glu Ser Lys Gly Pro Phe Ala Ser Leu Asn Met Gly Leu His Val 35 40 45 Gly Asp Asp Arg Thr Asp Val Val Asn Asn Arg Arg Arg Leu Ala Glu 50 55 60 Trp Leu Ala Phe Pro Leu Glu Arg Trp Val Cys Cys Glu Gln Val His 65 70 75 80 Gly Ala Asp Ile Gln Lys Val Thr Lys Ser Asp Arg Gly Asn Gly Ala 85 90 95 Gln Asp Phe Ala Thr Ala Val Pro Gly Val Asp Gly Leu Tyr Thr Asp 100 105 110 Glu Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Cys Phe Ala Asp Cys Val Pro Ile 115 120 125 Tyr Phe Val Ala Pro Ser Ala Gly Leu Val Gly Leu Ala His Ala Gly 130 135 140 Trp Arg Gly Thr Ala Gly Gly Ile Ala Gly His Met Val Arg Leu Trp 145 150 155 160 Gln Thr Arg Glu His Ile Ala Pro Ser Asp Ile Tyr Val Ala Ile Gly 165 170 175 Pro Ala Ile Gly Pro Cys Cys Tyr Thr Val Asp Asp Arg Val Val Asp 180 185 190 Ser Leu Arg Pro Thr Leu Pro Pro Glu Ser Pro Leu Pro Trp Arg Glu 195 200 205 Thr Ser Pro Gly Gln Tyr Ala Leu Asp Leu Lys Glu Ala Asn Arg Leu 210 215 220 Gln Leu Leu Ala Ala Gly Val Pro Asn Ser His Ile Tyr Val Ser Glu 225 230 235 240 Arg Cys Thr Ser Cys Glu Glu Ala Leu Phe Phe Ser His Arg Arg Asp 245 250 255 Arg Gly Thr Thr Gly Arg Met Leu Ala Phe Ile Gly Arg Arg Glu Glu 260 265 270 Trp Thr <210> 2 <211> 825 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant thermophilic laccase <400> 2 atgccagaca tttttcaaca agaagcccgc ggctggctcc gttgcggggc gcctccgttt 60 gctggagccg tcgctggatt gacgacgaaa catggcgggg agagcaaagg gccgttcgcc 120 tcgctgaata tggggctgca tgtcggcgat gaccgcacgg atgtcgtcaa caaccgccgg 180 cgcttggcgg aatggcttgc attcccgctt gagcgatggg tatgttgcga acaagtgcat 240 ggtgccgaca ttcagaaagt gacgaaaagt gaccggggga acggggcgca agatttcgcc 300 acggcggttc caggggtcga tgggttgtat acagacgagg cgggggtatt gctcgcgctt 360 tgttttgccg attgtgtgcc catttatttt gtggcgccat ctgctgggtt agtcggcctt 420 gctcatgccg ggtggcgggg aacggcgggc ggcatcgctg gtcacatggt gcggctttgg 480 caaacgcgcg aacacatcgc gccgagcgac atctatgttg ccatcggacc tgccatcggt 540 ccgtgctgtt atacggttga cgaccgggtc gtggacagtc tgcgcccgac gcttcctccg 600 gaaagcccgt tgccatggcg ggaaacaagc ccagggcaat atgcgctcga cttaaaggaa 660 gccaaccggc tccagttgct cgcggctggc gttccgaaca gccatattta tgtgtcggaa 720 cgctgtacaa gctgtgagga agcgttgttt ttttcccacc gccgcgaccg cggaacgacc 780 ggaaggatgt tggcgttcat tggccgaagg gaggaatgga catga 825 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caggccttct ggagggggtg gcccc 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtgccacggg cccctgtacg ctgcc 25 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tggcccccat atgccagaca tttttcaaca 30 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtactcgagt gtccattcct cccttc 26

Claims (10)

  1. (a) 지오바실러스속 미생물(Geobacillus sp. AR1)로부터 유래된 것으로서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 라카아제가 고정된 캐소드(cathode) 전극;
    (b) 상기 라카아제의 기질을 포함하고, 라카아제의 효소반응환경을 제공하는 제1 배지;
    (c) 상기 캐소드 전극과 제1 배지가 담겨진 캐소드 반응조;
    (d) 산화효소가 고정된 아노드(anode) 전극;
    (e) 상기 산화효소의 기질을 포함하고, 산화효소의 효소반응환경을 제공하는 제2 배지;
    (f) 상기 아노드 전극과 제2 배지가 담겨진 아노드 반응조; 및
    (g) 상기 아노드 전극과 캐소드 전극을 연결하는 전선을 포함하는, 바이오연료전지.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 라카아제는 pH 4.0 내지 9.0의 pH 조건 및 40 내지 100℃의 온도조건에서 활성을 나타내고, 100℃에서 180분동안 노출된 경우에도 50 내지 100%의 효소활성을 유지하는 내열성을 나타내는 것인 바이오연료전지.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 캐소드 전극은 카본 펠트, 카본 페이퍼, 카본 클로스 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 재질로 제조된 것 또는 에어캐소드(air-cathode)인 것인 바이오연료전지.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 라카아제의 기질은 카테콜(Catechol), 2,6-DMP(2,6-Dimethoxy-phenol), 4-메틸카테콜(4-Methylcatechol) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 기질인 것인 바이오연료전지.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 산화효소는 당탈수소효소, 알코올탈수소효소, 알데하이드탈수소효소, 피루브산탈수소효소, 숙신산탈수소효소, 아미노산탈수소효소, 글루타티온환원효소, 글루코오스산화효소 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 효소인 것인 바이오연료전지.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 아노드 전극은 백금, 스테인레스 스틸 메시, 카본 펠트, 카본 페이퍼 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 재질로 제조된 것인 바이오연료전지.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 각 배지는 pH 4.0 내지 9.0을 유지하는 완충액인 것인 바이오연료전지.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 바이오연료전지는 25 내지 100℃에서 전류를 생성하는 것인 바이오연료전지.
  10. (a) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 바이오연료전지의 캐소드 반응조에 제1 배지를 공급하고, 아노드 반응조에 제2 배지를 공급하는 단계; 및
    (b) 상기 공급된 각 배지에 포함된 기질을 이용하여 아노드 전극에 고정된 산화효소가 전자를 생산하고, 생산된 전자는 전선을 통해 캐소드 전극으로 이동하며, 캐소드 전극에서 라카아제에 의해 전자가 소모되어, 전류를 생성하는 단계를 포함하는, 전기생산 방법.
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