LACCASE DE PODOSPORA ANSERINA ET SES APPLICATIONS
La présente invention se rapporte à une nouvelle laccase isolée à partir de Podospora anserina, à son procédé de préparation ainsi qu'à son utilisation notamment pour la délignification du papier, comme décolorant, dépolluant et désodorisant ou encore pour réduire l'oxygène.
Les laccases sont des enzymes à cuivre qui oxydent les poiyphénols en utilisant l'oxygène comme accepteur final d'électrons. Elles sont présentes dans les plantes, dans de très nombreux champignons (dégradation de la lignine) ainsi que dans quelques bactéries.
La structure des laccases est telle que leur site actif est constitué de 4 atonies de cuivre, un de type 1 (ΊΠ ), isolé, responsable de l'oxydation des phénols et un cîuster de 3 atomes de cuivre (un de type 2, T2, et deux de type 3, T3) responsable de l 'activât! on du (¾.
Le mécanisme d'action des laccases et notamment le rôle du centre métallique, reste mal connu ; il est admis un mécanisme en deux temps :
1. le cuivre Tî arrache un électron au substrat ;
2. l'électron est transféré au centre T2/T3 sur une distance d'environ 12,5 Â, Après complète réduction du centre trfnucléaire, la réduction de l'oxygène moléculaire intendent.
Schéma générai de la réaction d'oxyd tion des phénols par les laccases
Les inventeurs ont maintenant identifié une nouvelle laccase produite par Podospora anserina qui présente des caractéristi ues plus avantageuses que les laccases disponibles dans le commerce, notamment celle de Trametes versicolor.
Selon un premier objet, l'invention se rapporte à la laccase purifiée et isolée de Podospora anserina de SEQ. ID. N° i ; cette enzyme correspond à une protéine prédite par le séquençage du génome de Podospora anserina (traduite à partir du gène
ayant le numéro d'accession B2ANK.8 dans la base de données UniProt, ce gène complet a pour séquence SEQ. ID. N°2) à l'exception des 30 acides aminés positionnés à extrémité N-terminale de la protéine ; en particulier, la laccase purifiée (pureté > 95%) selon l'invention présente un pourcentage d'identité d'an moins 90%, et par ordre de préférence croissant au moins 95%, 97%, 98% et 99% d'identité, par rapport à la laccase de Podospora anserina de SEQ. ID. N°l, selon une variante particulière, elle comporte une troncature totale ou partielle de 30 acides aminés positionnés à l'extrémité N-terniinale ; elle catalyse la réaction d'oxydation de noyaux phénoliques et est liée à quatre atomes de cuivre ; la séquence d'acides nucléiques SEQ. JD. N°4 (correspondant à la SEQ. ID. N°2 à l'exclusion du fragment codant pour les 30 acides aminés positionnés à l'extrémité N- terminale) code pour cette laccase de SEQ. ID. N° l .
La laccase de SEQ, ID. N 3 est également un objet de la présente invention, la laccase de SEQ. ID. N°3 diffère de la laccase de SEQ. fD. N°l en ce qu'elle comporte un acide aminé additionnel, une sérine, en positio N-terminale ; cette laccase est obtenue en exprimant dans la levure Pichia postons la molécule d'acide nucléique de SEQ. ID. N°4 clonée dans le vecteur d'expression pFD56 dont la construction est telle qu'elle permet l'expression d'une protéine portant une sérine additionnelle en position N~ terminale.
La laccase de SEQ. ID. N°5, qui correspond au poîypeptide codé par la SEQ, ID. N°2 et qui comporte les 30 acides aminés de extrémité N-terminale, est également un objet de la présente invention,
De façon générale, les inventeurs ont constaté que les modifications de séquences introduites à l'extrémité N-terminale, qu'il s'agisse d'ajout d'acides aminés ou de substitution, délétion ou insertion au sein de l'extrémité N-terminaie dans la limite du maintien d'une identité d'au moins 90% avec la SEQ. ID. N° L n'affectaient pas les propriétés enzymatiques de l laccase selon l'invention. Ainsi une variante de l'invention se rapporte à une laccase de SEQ. ID. N°l comportant au moins une altération (substitution, délétion ou insertion) au sein de la séquence des 30 acides aminés positionnés à l'extrémité N-terminale, les autres acides aminés non situés dans cette séquence étant de préférence inchangés et l'identité de cette enzyme étant d'au moins 90%, de préférence 95%, 97%, 98% et 99%, avec la SEQ, ID. N°l.
L'identité d'une séquence par rapport à la séquence de la laccase de Podospora anserina (SEQ. ID. N°l ) comme séquence de référence s'apprécie en fonction
du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les deux séquences sont alignées, de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles.
Le pourcentage d'identité peut être calculé par 3 'homme du métier en utilisant un programme informatique de comparaison de séquences tel que, par exemple celui de la suite BLAST (Altschul et al, NAR, 25, 3389-3402). Les programmes BLAST sont mis en œuvre sur la fenêtre de comparaison constituée de ia totalité de la SEQ. ID. N° 1 indiquée comme séquence de référence.
Un peptide ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X% d'identité avec une séquence de référence est défini, dans la présente invention, comme un peptide dont la séquence peut inclure jusque 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence de référence, tout en conservant les propriétés fonctionnelles dudit peptide de référence. Au sens de la présente invention, le terme altération inclut les déiétïons, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence.
Une séquence protéique SEQ. ÏD. °5 prédite à partir du séquençage systématique du génome de Podospora anserina est décrite dans la base de données UniProt (numéro d'accession B2ANK8) ; il convient de souligner que les informations présentées dans ia base de données UniProt sont prédictives et putatives, elles ne résultent pas de l'isolement et de la caractérisation expérimentales de protéines de Podospora anserina. En outre, la base de données UniProt n'indique aucune activité enzymatique précise pour cette protéine prédite.
La nouvelle laccase selon l'invention présente des propriétés améliorées par rapport aux. laccases disponibles dans le commerce issues de Tramet.es versicolor, Rhtts vernicifera, Âgarîcus bisporus ou encore Pleurotus ostreat s.
La présente invention se rapporte également à une molécule d'acide nucléique codant pour la laccase selon l'invention ; de préférence, il s'agit d'une molécule d'acide nucléique de séquence choisie parmi la SEQ. ID, N°2 ou de façon préférentielle, il s'agit, de la SEQ. ID. N°4 codant pour ia laccase de Podospora anserina clivée au niveau des 30 premiers acides aminés positionnés à ['extrémité N-terminale de la. protéine.
La molécule d'acide nucléique codant pour la laccase selon l'invention peut être clonée dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide, puis transformée dans un hôte approprié tel qu'une bactérie, une levure ou encore une culture cellulaire.
Par vecteur d'expression, on entend un vecteur possédant une région permettant l'insertion d'une séquence nucléotidique codante entre les signaux
indispensables à son expression, notamment, un promoteur (constitutif ou inductible), un site de fixation des ribosomes, un signal de terminaison de transcription et, éventuellement, un marqueur de sélection tel qu'un gène de résistance à un antibiotique.
La présente invention se rapporte encore à un vecteur d'expression comprenant ladite molécule d'acide nucléique et à une cellule hôte transformée avec ledit vecteur d'expression et exprimant une iacca.se selon l'invention.
L'Introduction du vecteur d'expression dans la cellule hôte peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, en particulier, par modification de la perméabilité membranaire de la cellule hôte, par exemple en présence d'ions calcium, ou par éleciroporation.
Après culture des cellules hôtes transformées pour exprimer la laccase selon l'invention, lesdites cellules peuvent être récupérées par centrifugation, iysées afin de libérer les enzymes dont ladite laccase selon l'invention.
Selon une variante préférée de l'invention, la laccase selon l'invention est produite par la levure Pichia pas to ris.
Pour permettre la surproduction et la sécrétion de la laccase dans le milieu de culture de la levure Pichia pastoris, la molécule d'acide nucléique de SEQ. ÏD. °4, codant pour la laccase de séquence SEQ. ÏD. N°3 lorsqu'elle est clonée dans le vecteur pFD56 comme décrit ci-après, est introduite par recombinaison homologue dans le génome de la levure, au niveau du gène AOX1. Pour cela, le plasmide pFD56, une fois linéarisé par digestion avec l'enzyme pmeï, est introduit dans la levure par élecrroporarion et les clones positifs sont sélectionnés sur milieu YPD + agar contenant de la zéocine à I00pg/ml. À partir d'un clone isolé sur boite de Pétri, une préculture de 200 mL de milieu YPD supplémentée en zéocine (100 pg mL) est ensemencée. Après une nuit sous agitation à 220 rpm et à 30°C, cette préculture est alors centrifugée 10 minutes à 4000 rpm et le culot est repris dans 200 ml d'eau stérile afin d'éliminer toute présence de glucose. Apres une seconde centrifugation, une culture de 2L en milieu MMH contenant ImM de C SO4 dans un Erlenmeyer de 5L est alors ensemencée par ce culot. Les levures sont incubées à 25°C sous agitation (220 rpm) pendant 2 heures avant d'ajouter 0,5% de méthanol pour lancer l'induction. Cette étape d'induction sera répétée durant 5 jours afin d'obtenir le maximum d'enzymes.
Pour la mise en oeuvre de cette méthode, on peut, sans caractère limitatif, utiliser le matériel suivant :
- vecteur pour l'expression dans Pichia postons (pFD56): pîasmide pPICZa contenant la séquence ADN codant pour la laccase de Podospora anserina en phase avec le facteur de sécrétion α-factor de Saccharomyces cerevisi e et contenant le promoteur AOX.1 indueiibîe au méthanol.
- souche de levure Pichia pastoris GS1 15 utilisée pour la production de la laccase selon l'invention après intégration de la cassette issue du vecteur pFD56 contenant le promoteur AOXÎ, le pepiide signai α-factor et la séquence ADN codant la laccase de Podospora anserina.
~ Milieux de culture :
Milieu riche YPD (pour levure) :
1 % yeast extract
2% bacto-peptone
2% glucose
pH non ajusté, autoclavé pendant 20 mm à 120°C
Milieu minimum MMH (pour levure) :
1,34% yeast nitrogen base
1% Casamino acid
0,4% histidine
4* 10"s % Biotine
pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à .120°C
Milieu riche LB (pour bactérie) :
Tryptone 10 g/L
Extrait de levure 5 g/L
NaCl 5 g/L
H20 distillée qsp IL
pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C,
Selon une autre variante, Escherichia coli peut être choisie comme micro-organisme hôte, les piasmides qui peuvent alors être utilisés sont notamment, les piasmides pBluescript, pUCl8, pET, pGEX, pGS. pMAL-e2 ou similaires.
Selon cette variante de préparation de la laccase selon l'invention, la laccase est avantageusement exprimée par une bactérie E. coli transformée avec un vecteur d'expression pET21a codant pour une enzyme accolée à une étiquette 6HIS en position C- terminaie.
Ce procédé est rapide et simple ; en effet, l'induction de l'expression de la laccase de Podospora anserina dans la bactérie E. coii s'effectue en 4 à 24 heures.
En outre. étiquette 6HIS permet la purification de la laccase de Podospora anserina par chromaiographie d'affinité sur une résine nickel en une seule étape pour l'obtention d'une enzyme pure.
Pour la mise en œuvre de ce procédé de préparation, l'homme du métier choisit la cellule hôte en fonction du vecteur d'expression utilisé.
De préférence, lorsque le vecteur d'expression pET21a est utilisé, ors choisit une cellule hôte exprimant la T7 RNA polymérase telles que les souches d'E, coii BL21 D.E3, BL21-SI, BL21 pLys, Novablue(DE3) ou BL2i Star.
La présente invention se rapporte également à un procédé de préparation d'une laccase selon l'invention comprenant les étapes de :
a.) préparation de cellules hôtes, exprimant la laccase selon l'invention ; b) mise en culture des cellules hôtes préparées à l'étape a) ;
c) récupération du milieu de culture et élimination des cellules hôtes, par exemple par centrifugation ;
d) traitement du milieu de culture obtenu à l'étape e) par chromatographie d'interactions hydrophobes ;
e) récupération de ladite laccase purifiée.
Selon un mode de mise en œuvre préféré, le procédé selon l'invention est tel que :
- la souche de levure Pichia pastoris utilisée est la souche GS115 ;
- le vecteur d'expression, clans Pichia pastoris (pFD56) est le plasmide pPICZa contenant la séquence ADN codant pour la laccase de Podospora anserina en phase avec le facteur de sécrétion α-factor de Saccharomyces cerevisiae et contenant le promoteur AOX1 inductibîe au méthanoî ;
- la culture réalisée à l'étape b) comprend au moins une étape de culture en phase liquide, sous agitation, à une température comprise entre 18 et 37°C, de préférence 25°C, au cours de laquelle, l'expression de la laccase est induite par l'ajout de méthanol ; l'induction par ajout de méthanol pouvant éventuellement être renouvelée.
Lorsque le procédé est mis en œuvre selon ces conditions préférées, il permet la production de la laccase avec un temps d'induction court, de l'ordre de 3 à 7 jours ; la purification de la laccase est réalisée en. une seule étape de chromatographie
d'interactions hydrophobes et la laecase ainsi produite comporte bien les quatre atomes de cuivre nécessaires à. son activité.
Lorsque la laecase selon l'invention est produite par une souche telle qiv 'Escheri hia coli, alors le procédé de préparation d'une laecase selon invention comprend les étapes de :
a) préparation de cellules hôtes, exprimant la laecase selon l'invention ;
b) mise en culture des cellules hôtes préparées à l'étape a) ;
c) lyse des cellules hôtes ;
d) traitement, du lysat obtenu à l'étape c) par cliromaiographie d'affinité ;
e) récupération de ladite laecase purifiée.
Il est également possible de produire une laecase en présence d'agents dénaturants comme l'urée, le chlorure de guanidium, le SDS, le triton... ; la laecase ainsi produite sera alors dépourvue de cuivre et pourra être activée par l'ajout d'atomes de cuivre.
La Demanderesse a démontré que la laecase selon l'invention présente des propriétés électrochimiques meilleures que les laccases vendues dans le commerce (voir le point 10 de la partie expérimentale), en particulier celle de Trametes versicoior.
Ainsi, de par leurs propriétés enzymatiques avantageuses, les laccases selon l'invention présentent un intérêt particulier dans les applications suivantes ;
- Utilisatio dans l'industrie papetière.
Les applications les plus habituelles des laccases concernent la délignil cation et/ou le blanchimen de la paie à papier.
Dans la préparation industrielle de papier, la séparation et la dégradation de la lignine dans la pâte de bois sont classiquement obtenues en utilisant du chlore et/ou des oxydants chimiques ; ces méthodes conventionnelles présentent l'inconvénient d'être polluantes. Les laccases selon l'invention offrent une alternative avantageuse pour réaliser la délignification mais aussi le blanchiment de la paie à papier sans chlore.
- Utilisation comme décolorant.
La capacité qu'ont les laccases à blanchir le papier peut s'appliquer dans d'autres domaines : les laccases selon l'invention peuvent également être utilisées pour éliminer l'encre du papier et/ou le décolorer, notamment en vue de son recyclage ; elles
peuvent, également être utilisées pour le traitement des tissus, en particulier le blanchiment du coton ou pour produire la couleur indigo décolorée des jean's,
- Utilisation comme dépolluant.
Une autre application très fréquente des îaccases concerne leur utilisation comme dépolluant ; cette enzyme peut en effet dégrader un large spectre de contaminants environnementaux indésirables incluant des phénols (polluant phénolique éventuellement chlorés) et des matières plastiques. Une utilisation avantageuse des Iaccases selon l'invention concerne ainsi la dépollution de produits à base de phénol.
- Utilisation comme désodorisant et dans des compositions détergentes.
Grâce à leur capacité de dégrader des polluants, les iaccases permettent également de désodoriser des matériaux comme les tissus ; elles sont ainsi utiles dans des compositions détergentes pour le lavage du linge ou de la vaisselle.
~ Utilisation dans l'industrie alimentaire.
Les Iaccases sont utilisées dans l'industrie alimentaire comme conservateur de produit alimentaire, en particulier comme additif afin d'éliminer des réactifs oxydants (désoxygénation), par exemple pour la stabilisation des jus de fruits et du vin.
Elles sont également utilisées comme exhausteur de goût de produit alimentaire ; par exemple, elles sont impliquées dans le précédé de préparation du cacao pour en exhausser le goût (trempage dans une solution de laccase avant de sécher et griller),
Les Iaccases selon l'invention ont encore comme intérêt de permettre la réticulation des protéines du lactosérum, en oligo- ou polymères et conduire ainsi à la formation de gels (Faergemand et al, 1998 J, Agric. Food Chem.46, 1326-1333 ; Mattinen et al, 2005 FEBS Journal 272, 3640-3650).
- Utilisation pour la mise en œuvre de synthèses organiques.
Les Iaccases interviennent dans le procédé de production d'éthanol à partir de matière première recyclée.
- Utilisation dans le domaine pharmaceutique.
Là encore, les iaccases sont utiles pour la synthèse cle composés anesthésiques, anti-inflammatoires, antibiotiques ou encore de F iode.
- Utilisation dans le domaine cosmétique.
De nombreux développements sont réalisés dans le domaine cosmétique, il s'agit en particulier d'utilisation comme réactifs dans des compositions de teinture
d'oxydation où les laccases permettent la préparation de produit moins irritant. Elles permettent également la préparation de produit éclaircissant pour la peau.
Enfin, elles peuvent être utilisées dans des déodorants ou des produits d'hygiène comme le savon et le dentifrice.
·· Utilisation poux la fabrication d'électrodes et de hiopiles,
La laccase selon l'invention présente un intérêt particulier pour la fabrication d'électrodes sur lesquelles l'enzyme est immobilisée.
Ainsi, la présente invention se rapporte également à des électrodes à laccase comprenant un matériau conducteur tel qu'un métal conducteur, notamment, du platine, du cuivre, de l'argent, de l'aluminium, de l'or ou de l'acier ou du carbone, comme du carbone vitreux, des fibres de carbone, des fibres de nanotubes de carbone ou encore en diamant... ledit matériau conducteur est recouvert d'un dépôt comprenant au moins une laccase selon l'invention ; ledit dépôt pouvant en outre comprendre un polymère redox pour améliorer la conduction électrique entre l'enzyme et l'électrode ainsi que la stabilité du système.
Le polymère redox peut être par exemple choisi parmi les polymères à base de ferrocène, d'osmium et de ruthénium et les polymères conducteurs tels que par exemple le polypyrrole et la poîyananilline.
Les méthodes d'immobilisation de la laccase sur ledit matériau conducteur peuvent être choisies parmi les méthodes classiques à la disposition de l'homme du métier qui comprennent notamment l'inclusion de la laccase dam une matrice polymérique, l'adsorption de la laccase à la surface de la membrane polymérique, la fixation par liaison covalente, l 'électrodéposition (Gao et ί, Chem. Int. ED. 2002, 41, N°5, 810-813} ou encore la technique décrite dans la Demande de Brevet Américain US 2009/0053582.
Selon une variante de réalisation, l'électrode à laccase sur laquelle est immobilisée la laccase est également recouverte d'une membrane qui évite le détachement de ladite enzyme de l'électrode. Selon les applications envisagées, ladite membrane peut être constituée de nation, de cellulose ou de tout matériau biocompatibie, c'est-à-dire compatible avec un e vironnement physiologique.
La présente invention se rapporte ainsi également à un biocapteur à oxygène, de composés phénoiiques ou d'aminés aromatiques constitué d'une électrode à laccase selon ['invention. De façon générale, un biocapteur consiste en une électrode sur laquelle est immobilisé un biorécepteur capable de reconnaître une cible biologique ; la
fixation de la cible biologique sur le biorécepteur conduit à des modifications physico- chimiques de la membrane et la production d'un signal électrique par un transducteur électrochimique (ampérométrique, potentiornétrique, conductimétrique, ... ) accolé à l'électrode. Dans le cas présent, le biorécepteur est une laccase selon l'invention et la cible biologique est un composé choisi parmi le F oxygène, des composés phénoliques ou des aminés aromatiques.
La présente invention se rapporte aussi à un capteur à oxygène constitué d'une électrode selon F invention.
L'électrode à laccase selon l'invention peut encore être avantageusement utilisée à titre de cathode dans une biopiie enzymatique ; la Figure 1À représente schématiquemeni le principe de fonctionnement d'une biopiie enzymatique. Les biopi'ies enzymatiques selon 3 'invention sont des dispositifs comprenant une électrode à laccase (lacca) à titre de cathode et une anode où une réaction d'oxydation d'un substrat se produit (catalysée par F« enzyme X ») ; à titre d'illustration, le substrat peut être du glucose et !'« enzyme X » la glucose oxydase, une telle pile présente un intérêt particulier lorsque la biopiie est implantée chez un individu pour une application médicale ; le substrat peut aussi être choisi, par exemple, parmi des nitrites, nitrates, sulfures, urates, ascorbates, glutamates, pyruvates, lactates, de la cellulose... si une application en dépollution est envisagée, le choix de l'enzyme se fera alors en fonction du substrat à dégrader, à titre d'exemple, les enzymes suivantes peuvent être utilisées, le type de substrat qu'elles peuvent dégrader est mentionné entre parenthèse : la glucose oxydase (glucose ou tous les sucres étant oxydés par cette enzyme), la lactate oxydase (lactate), la pyruvate oxydase (pyruvaie), l'alcool oxydase (alcool), la cholestérol oxydase (cholestérol), la glutamate oxydase (glutamate), la pyranose oxydase (pyranose), la choline oxydase (choline), la cellobiose déshydrogénase (ceîîobiose), la glucose déshydrogénase (glucose ou tous les sucres étant oxydés par cette enzyme), la pyranose déshydrogénase (pyranose), la fructose déshydrogénase (fructose), l'aldéhyde oxydase (aldéhyde), la giuconolactone oxydase (glucunolactone), l'alcool déshydrogénase (alcool), l'ascorbate oxydase (oxygène ou ascorbate) ou encore la sulfure dioxygénase (sulfure). Le procédé d'oxydation et de réduction concomitant aux électrodes de la biopiie produit un courant électrique,
La Figure 1B illustre plus spécifiquement une biopiie enzymatique à glucose ; une telle biopiie enzymatique consiste en deux électrodes modifiées par l'immobilisation d'enzymes. Une glucose oxydase (GOx) est fixée sur l'anode (1) par l'intermédiaire d'un polymère conducteur « / » et une laccase (LAC) est fixée sur la
cathode (2) par l'intermédiaire d'un polymère conducteur « ZI ». En fonctionnement, à l'anode, les électrons sont transférés du glucose présent dans le fluide physiologique vers la GOx, puis de la GOx au polymère conducteur « / » et du polymère conducteur « I » vers l'anode, A la cathode, les électrons sont transférés de la cathode vers le polymère conducteur « 27 », puis vers la laccase et enfin de la laccase à l'oxygène présent dans le fluide physiologique.
Il est à noter qu'une biopile peut aussi éventuellement fonctionner en modifiant les électrodes avec leurs enzymes respectives et en rajoutant des médiateurs solubles, tels que le ferrocèneméthanol pour l'anode et le ferricyanure de potassium pour la cathode, et en rajoutant le cas échéant une membrane séparant F anode et la cathode.
Une telle biopile peut être utilisée comme une source d'énergie miniaturisée et être implantée dans un organisme vivant.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortironi de la description qui va suivre, qui se réfèrent à des exemples de mise en œuvre de la présente invention, ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles :
Figures
La Figure 1À représente schématiquement le principe de fonctionnement d'une biopile enzymatique ; la Figure 1B représente une biopile enzymatique à glucose.
La Figure 2 représente la carte plasrnidique du vecteur pFD56.
La Figure 3 est un graphe représentant l'activité catalytique de la laccase de SEQ. il). N°3 selon .'invention en fonction de la concentration d'ABTS à 37°C,
La Figure 4 est un graphe représentant l'activité catalytique de la laccase de SEQ- ID. N°3 selon l'invention en fonction de la concentration de SGZ à 37°C.
La Figure 5 est une courbe représentant Γ activité relative de la laccase de SEQ. ID. N°3 selon l'invention en fonction du pH sur l'oxydation de l'ABTS.
La Figure é illustre la stabilité de la laccase de SEQ. ID. N°3 selon l'invention à différents pH à 4°C.
La Figure 7 est un graphe représentant l'activité relative de la laccase de
SEQ. ID. N°3 selon l'invention en fonction de ia température sur l'oxydation de l'ABTS.
La Figure 8 est un graphe représentant la stabilité de la laccase de SEQ.
ÏD. N°3 selon l'invention en fonction du temps à 37°C et 6Û°C sur Foxydation de l'ABTS.
La Figure 9 représente l'effet du NaCl sur l'activité de la laccase de SEQ. ID. N°3 selon l'invention à pH 7.
L.Préparatjoii de l& laccase issae du ch&mpl on Po osi?om m^g a
3■ Souche bactérienne ά"' Escherichia coli
ΟΗ5α : ίί^Ε44, Δ βΛΙ169, (Φ80 iacZDM ï S). hsdRA l, recAl , end Al , gyrA96, thi-l , relAl (Hanahan, 1 83), Cette souche est utilisée pour l'amplification de plasmide lors des étapes de construction du vecteur d'expression protéique.
2. Vecteur
pFI 56 : Plasmide pPIC-Ζα contenant la séquence ADN codant pour la laccase de SEQ. ÎD. N°3 selon l'invention issue de Podospor anserina en phase avec le facteur de sécrétion a- factor de Saccharomyces cerevisiae et contenant le promoteur- AOXl inductible au méthanol ; le plasmide est représenté à la Figure 2.
3. Souche de la levure Pichia pastoris
GS1 15 : souche de levure Pichia pastoris utilisée pour la production de la Laccase après intégration de la cassette issue du vecteur PFD56 contenant le promoteur AOXl, le pepiide signal -factor eî la séquence ADN codant la laccase de SEQ. ID, N°3 selon l'invention issue de Podospora anserina.
4. Milieu de culture
Milieu riche YPD (pour levure) :
ί % yeast extract
2% bacto-peptone
2% glucose
pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C
Milieu minimum MMH (pour levure) :
1 ,34% yeast nitrogen base
1% Casamino acid
0,4% histidine
4* 1 Ô"5 % Biotine
pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C
Milieu riche LB (pour bactérie) ;
Tryptone 10 g/L
Extrait de levure 5 g/L
NaCI 5 g/L
H20 distillée qsp IL
pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C
Techniques de génie génétique
5, Transformation des bactéries supercompétentes
Les bactéries DH$a supercompétentes sont préparées à l'aide de la méthode d'inoue (Sambrook et Russe! ).
6· Transfonnation de la levure Pichia pas loris
L ADN est introduit dans la levure Pichia pastorîs GS1 15 par électroporation sur un Eppendorf Eporator (Eppendorf, France).
Préparation de ΑΡΝ
Un kit de purification d'ADN plasmidique (Qiagen) est utilisé pour les préparations d'ADN en petite et grande quantité.
8. Séquençage de ΑΡΝ double brin
L'ADN double brin est séquencé par la société Millegen (Toulouse, France).
9- Construction du vecteur d'expression de ia laccase
Le gène de séquence SED. ID. N°4 correspondant à la séquence codant la laccase de Podospora anserina (accession B2ANKS) tronqué de ia partie codant pour les 30 premiers acides aminés de l'extrémité N «terminale a été synthétisé par la. société Genecust Europe (Luxembourg), Les sites de restriction Nhei et Notl ont été respectivement ajoutés en 3' et 5' de la séquence pour faciliter le clonage. Le plasmide pPICZa ainsi que le gène synthétisé ont alors été traités avec les deux enzymes de restrictions Nbeï et Noil et les produits de digestion ont été purifiés sur gel avec le kit « nucleospia ». Le gène de la laccase est alors ligué dans le plasmide par co-incubation avec la T4 DNA Ligase à 37°C sur ia nuit. Les plasraides néoformés (pFD56) sont alors sélectionnés et amplifiés par transformation de bactéries DH5a sur boite contenant de la zéocine à 25pg/ml.
10. I tégration de la séquence codant la laccase dans le génome de Pichia posions
Pour permettre la surproduction et ta sécrétion de l'enzyme dans le milieu de culture de la levure Pichia pastorîs, le gène correspondant est introduit par recombinaison homologue au niveau du gène AOXl . Pour cela, le plasmide pFD56 une fois linéarisé par digestion avec l'enzyme pmel, est introduit dans la levure par électroporation et les clones positifs sont, sélectionnés sur milieu YPD - agar contenant de la zéocine à iOOpg/'ml.
La séquence du plasmide ainsi obtenu est la SEQ. 1D. N°6.
Production, purification et c r ctérlsaîion de ^r^^ jMçasx^ î^ e à P dos& rtt
Production de la laccase
L'enzyme laccase de SEQ, ID. N°3 est produite par la levure Pichia pastoris via une induction au méthanoi. Pour ce faire, une préculture de 200 mL de milieu YPD suppîémentée en zéocine (100 pg/mL) est ensemencée par la souche GS1 15 ayant intégré la cassette contenue sur le plasmide pFD56, Après une nuit sous agitation à 220 rpm et à 30°C, cette préculture est alors centrifugée 10min à 4000rpm et le culot est repris dans 200ml d'eau stérile afin d'éliminer toute présence de glucose. Apres une seconde centrifugation, une culture de 2L en milieu MMH contenant 2mM de CuS04 dans un Erlenmeyer de 51. est alors ensemencée par ce culot. Les levures sont incubées à 25°C sous agitation (220 rpm) pendant 2hrs avant d'ajouter 0.5% de méthanoi pour lancer l'induction. Cette étape d'induction sera répétée durant Sjours afin d'obtenir le maximum d'enzymes. Pour récupérer les protéines sécrétées, la culture de 2L est centrifugée et le surnageant contenant l'enzyme d'intérêt est concentré sur une cellule d'agitation avec une membrane YM10 d'un seuil de coupure de 1 OkDa pour atteindre un volume de 4-5mI final.
Purification de la laccase par chrornatographie d'interactions hydrophobes
Une fois concentré, 1.7M d'ammonium sulfate est ajouté au 4-5ml du surnageant de culture avant d'être filtré sur filtre de 0,22μηα pour être injecté sur une colonne de chrornatographie d'interactions hydrophobes, une PhenyiHP de 60mj (GE Healthcare*), couplée au système A TA purifier (GE Healthcare*), équilibrée dans un tampon Potassium phosphate 50r.oM, (NH^SC 1.7 , pB 6. L'éiution est réalisée par un gradient de 0% à 100% d'un tampon Potassium phosphate 50mM pH 6 sous un débit de 2,5 mL min. Les fractions contenant la protéine laccase sont identifiées par un test d'activité à l ABTS et sont rassemblées, concentrées et stockées dans un tampon Potassium phosphate 50mM pH 6 par centrifugation sur membrane Arrsicon YM10. A ce stade, la protéine est pure et peut être conservée à -20°C sous forme soluble.
En comparant avec d'autres laceases disponibles commercialement, il apparaît un réel avantage d'utilisation de cette protéine vis-à-vis du protocole de purification. En effet, une seule étape de purification est nécessaire pour l'obtention d'une enzyme pure en opposition avec les successions de chrornatographie (size exclusion, échangeuse anionique ou canonique hydrophobe...) utilisées pour les autres enzymes [1].
I. Carae érisatioa de F enzyme
La concentration en enzyme d'une solution est calculée à partir d'une gamme BSA selon la technique Bradford [2].
Les tests enzymatiques sont effectués à F aide d'un spectrophotomètre Varian dans un tampon 0.1 M citrate/phosphate à 37°C dans un volume de 3mL en suivant l'oxydation de différents substrats à une longueur d'onde donnée en fonction du temps. L'activité spécifique de l'enzyme est exprimée en pmoles de substrats oxydés par minute et par rng de protéine. Les substrats utilisés dans cette étude sont : Î'ABTS (£ 20.™ = 36 mM"1 cm"1) et la syrmgaldazme, SGZ (8530^ = 64 mM"1 cm"5).
Elude des pr p iétés enzvmatigites de la ïaccase de Podosper anserina.
Détermination des constantes cinétiques (k^ et de Miehae is (KM) à l'état stationnaire 3, ABTS
Les expériences sont réalisées à 37°C sur un spectrophotomètre Varian dans un tampon 0.1 M citrate/phosphate pH 3.4, La concentration en ABTS varie dans le test de 0 à L5mM. Le test est déclenché par l'ajout d'enzyme. Les points expérimentaux sont analysés par régression non linéaire selo le modèle de Miehaelis-Menten à l'aide du logiciel Sigma-plot 6.0 selon l'équation ci-dessous:
Modèle de Miehaelis-Menten
Résultats ; kcat - 1372 s"1, Km = 307 μΜ
La Figure 3 représente l'activité catalytique de la Ïaccase de SEQ, ID. N°3 en fonction de la concentration d'ABTS à 37°C,
4.
Les expériences sont réalisées à 37°C sur un spectrophotomètre Varian dans un tampon citrate-phosphate 50mM pH 7. La concentration en SGZ, diluée dans le méihanol, varie dans !e test de 0 à 50μΜ. Le test, déclenché par l'ajout d'enzyme, consiste à suivre l'oxydation de la SGZ à 530nm par changement coiorîmétrique (ss30nm - 84 mM' 1 cm."1).
Résultats : kcat = Os"1, KM = 10.9 μΜ
Ces résultats sont présentés à la Figure 4.
S, Ac iv té mction άιι H
L'étude de la variation de la constante de vitesse de la réaction en fonction du pH est réalisée sur une gamme de pH allant de 3 à 7 dans un tampon 0, 1 M citrate/phosphate en utilisant FABTS à îtnM comme substrat. Les expériences sont réalisées à 37°C à l'aide d'un spectrophotornètre Varian, L'activité est suivie par l'oxydation de l'ÀBTS aboutissant à un changement colorimétrique mesuré à 420nm. Le test est déclenché par ajout de l'enzyme.
La Figure 5 représente l'activité relative de la laccase de SEQ. ÎD, N°3 en fonction du pH sur l'oxydation de l'ABTS.
6. Stabilité en fonction du pH
L'enzyme à une concentration de 0.15mg/ml est préincubée dans un tampon phosphate-citrate 50mM (ou Tris-H2S04 50mM pour pH 8 et 9) à un pH donné à 4°C. A des temps réguliers, des prélèvements de 5μΙ, sont effectués et l'activité résiduelle de l'enzyme incubée aux différents pli est déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Varian à 44()nm dans un tampon 0.1M citrate/phosphate pH 3.4 à 37°C, en présence de 150μΜ d'ABTS, Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. Les résultats obtenus sont représentés à la Figure 6.
7. Activité en fonction de la température
L'étude de la variation de la constante de vitesse de la réaction en fonction de la température est réalisée dans un tampon 0.1 M citrate/phosphate pH 4 en présence de 0.,5m d'ABTS. La température varie de 15 à 80°C Le suivi de l'activité s'effectue sur un spectrophotomètre Varian CARY UV Biomelt régulé en température. Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. Les résultats obtenus sont représentés à la Figure 7.
8. Stabilité de PeBxy&se en fonction de la température
L "enzyme est préincubée à une concentration de 0.35 mg mï dans un bain à sec à 60°C et à 37°C dans un tampon Potassium phosphate 50 mM. pH 6. A des temps réguliers, des prélèvements de 5μΤ sont effectués et l'activité résiduelle de l'enzyme incubée à ces températures est déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Varian à 440nm dans un tampon 0.1 M citrate/phosphate pH 3.4 à 37°C, en présence de 150 μ d'ABTS. Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. Les résultats obtenus sont représentés à la Figure S.
. Eiisde de l'activité eBzymatii e ess présence de NaCi
Pour vérifier j'influence du chlorure de sodium (présent en milieu physiologique) sur l'activité de la Iaccase, des concentrations croissantes en NaCi ont été ajoutées an test d'activité consistant à suivre l'oxydation à 530nm de la SGZ à 37°C dans un tampon phosphate-citrate 50mM pH 7.
Comme le montre la Figure 9 (Effet du NaCi sur ractivlié de la iaccase à pl i 7), en présence de 150mM de NaCi, concentration correspondant aux conditions physiologiques, l'enzyme présente encore 70% d'activité d'oxydation,
10. Mesures éiectrochimiques
Pour démontrer l'avantage de cette nouvelle enzyme et à titre d'exemple comparatif, deux électrodes enzymatiqucs ont été préparées comprenant soit la Iaccase de SEQ. ID. N°3 selon la présente invention, soit la Iaccase de Trametes versicolor (la iaccase communément utilisée en électrochimie) et un polymère redox. A pH 7 et en présence de Cl, le courant cataîytique pour la réduction d'C est 40 % plus important pour l'électrode modifiée avec la nouvelle enzyme. En outre, l stabilité dans le temps est 200% plus importante.
Référesices bibliographiqaes
1. Colao, M.C., et al., Heteroiogous expression of Iccl gene front Trametes trogii in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme. Microb Cell Fact, 2006. 5: . 31 .
2. Bradford, M. M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantifies of protein utiiizing the principîe of protein-d e binding. Anal Biochem, 1976. 72; p. 248-54.
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5. Felsenfeld, G., The détermination of cuprous ion in copper proteins. Àrch Biochem Biophys, 1960. 87: p. 247-51.