EP2852665A1 - Laccase de podospora anserina et ses applications - Google Patents

Laccase de podospora anserina et ses applications

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Publication number
EP2852665A1
EP2852665A1 EP13735432.0A EP13735432A EP2852665A1 EP 2852665 A1 EP2852665 A1 EP 2852665A1 EP 13735432 A EP13735432 A EP 13735432A EP 2852665 A1 EP2852665 A1 EP 2852665A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
laccase
seq
enzyme
laccase according
host cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP13735432.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Nicolas Mano
Fabien Durand
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP2852665A1 publication Critical patent/EP2852665A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
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    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/88—Taste or flavour enhancing agents
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    • Y02E60/30—Hydrogen technology
    • Y02E60/50—Fuel cells

Definitions

  • the present invention relates to a novel laccase isolated from Podospora anserina, its preparation process and its use in particular for the delignification of paper, as a bleaching agent, depolluting and deodorizing or for reducing oxygen.
  • Laccases are copper enzymes that oxidize polyphenols using oxygen as the final acceptor of electrons. They are present in plants, in many fungi (degradation of lignin) as well as in some bacteria.
  • laccases are such that their active site is composed of 4 atonies of copper, one of type 1 ( ⁇ ), isolated, responsible for the oxidation of phenols and a custer of 3 atoms of copper (one of type 2, T2 , and two of type 3, T3) responsible for the activation! we have (3 ⁇ 4.
  • laccases The mechanism of action of laccases, and in particular the role of the metallic center, remains poorly understood; a mechanism is admitted in two stages:
  • Copper T1 pulls an electron off the substrate
  • the electron is transferred to the center T2 / T3 over a distance of about 12.5 ⁇ , after complete reduction of the nuclear center, the reduction of the molecular oxygen intent.
  • the inventors have now identified a new laccase produced by Podospora anserina which has more advantageous characteristics than commercially available laccases, in particular that of Trametes versicolor.
  • the invention relates to the purified laccase isolated from Podospora anserina from SEQ. ID. No. i; this enzyme corresponds to a protein predicted by the sequencing of the genome of Podospora anserina (translated from the gene having the number of B2ANK.8 accession in the UniProt database, the complete gene is SEQ. ID. No. 2) except for the 30 amino acids positioned at the N-terminus of the protein; in particular, the purified laccase (purity> 95%) according to the invention has an identity percentage of less than 90%, and in order of preference increasing at least 95%, 97%, 98% and 99% of identity, compared to the laccase of Podospora anserina from SEQ. ID. No.
  • nucleic acid sequence SEQ. JD. No. 4 (corresponding to SEQ ID NO: 2 excluding the fragment coding for the 30 amino acids positioned at the N-terminus) codes for this laccase of SEQ. ID. No. 1.
  • the laccase of SEQ, ID. N 3 is also an object of the present invention, the laccase of SEQ. ID. No. 3 differs from the laccase of SEQ. fD. No. 1 in that it comprises an additional amino acid, a serine, in N-terminal positio; this laccase is obtained by expressing in the yeast Pichia postons the nucleic acid molecule of SEQ. ID. No. 4 cloned into the expression vector pFD56 whose construction is such that it allows the expression of a protein carrying an additional serine N ⁇ terminal.
  • the laccase of SEQ. ID. No. 5, which corresponds to the polypeptide encoded by SEQ ID NO. No. 2 and which has the 30 amino acids of N-terminus, is also an object of the present invention.
  • a variant of the invention relates to a laccase of SEQ. ID. No. 1 comprising at least one alteration (substitution, deletion or insertion) within the sequence of 30 amino acids positioned at the N-terminus, the other amino acids not in this sequence being preferably unchanged and the identity of this enzyme being at least 90%, preferably 95%, 97%, 98% and 99%, with SEQ ID NO. No. l.
  • sequence with respect to the sequence of the laccase of Podospora anserina is assessed according to the percentage of amino acid residues that are identical, when the two sequences are aligned, so as to obtain the maximum of correspondence between them.
  • the percent identity can be calculated by those skilled in the art using a computer program for sequence comparison such as, for example, that of the BLAST suite (Altschul et al., NAR, 25, 3389-3402).
  • the BLAST programs are implemented on the comparison window consisting of the entire SEQ. ID. No. 1 indicated as a reference sequence.
  • a peptide having an amino acid sequence having at least X% identity with a reference sequence is defined, in the present invention, as a peptide whose sequence may include up to 100-X alterations per 100 amino acids of the sequence. reference, while retaining the functional properties of said reference peptide.
  • alteration includes deiét ⁇ ons, substitutions or insertions consecutive or dispersed amino acids in the reference sequence.
  • the new laccase according to the invention has improved properties compared to. laccases commercially available from Tramet.es versicolor, Rhtts vernicifera, Amaricus bisporus or Pleurotus ostreat s.
  • the present invention also relates to a nucleic acid molecule encoding the laccase according to the invention; preferably, it is a nucleic acid molecule of sequence chosen from SEQ. ID, No. 2 or preferentially, it is about SEQ. ID. No. 4 coding for the laccase of Podospora anserina cleaved at the first 30 amino acids positioned at the N-terminus of the. protein.
  • the molecule of nucleic acid encoding the laccase according to the invention can be cloned into an expression vector such as a plasmid and transformed into an appropriate host such as a bacterium, a yeast or a cell culture.
  • Expression vector means a vector having a region allowing the insertion of a coding nucleotide sequence between the signals essential for its expression, in particular, a promoter (constitutive or inducible), a ribosome binding site, a transcription termination signal and, optionally, a selection marker such as an antibiotic resistance gene.
  • the present invention also relates to an expression vector comprising said nucleic acid molecule and to a host cell transformed with said expression vector and expressing an iacca.se according to the invention.
  • the introduction of the expression vector into the host cell can be carried out by any method known to those skilled in the art, in particular by modifying the membrane permeability of the host cell, for example in the presence of calcium ions, or by eleciroporation.
  • said cells After culturing the transformed host cells to express the laccase according to the invention, said cells can be recovered by centrifugation, iysées in order to release the enzymes of which said laccase according to the invention.
  • the laccase according to the invention is produced by the yeast Pichia pas to ris.
  • the nucleic acid molecule of SEQ. Id. ° 4 coding for the laccase sequence SEQ. Id. No. 3 when cloned into the vector pFD56 as described below, is introduced by homologous recombination into the yeast genome at the AOX1 gene.
  • the plasmid pFD56 once linearized by digestion with the enzyme pme1, is introduced into the yeast by electroporarion and the positive clones are selected on YPD + agar medium containing zeocin at 100 ⁇ g / ml.
  • a preculture of 200 ml of YPD medium supplemented with zeocin (100 ⁇ g / ml) is inoculated. After stirring overnight at 220 rpm and at 30 ° C, this preculture is then centrifuged for 10 minutes at 4000 rpm and the pellet is taken up in 200 ml of sterile water to eliminate any presence of glucose. After a second centrifugation, a culture of 2L in MMH medium containing 1MM of C SO 4 in a 5L Erlenmeyer flask is then seeded with this pellet. The yeasts are incubated at 25 ° C with stirring (220 rpm) for 2 hours before adding 0.5% methanol to start the induction. This induction step will be repeated for 5 days to obtain the maximum of enzymes.
  • vector for expression in Pichia postons pFD56
  • plasmid pPICZa plasmid pPICZa containing the DNA sequence coding for the laccase of Podospora anserina in phase with the Saccharomyces cerevisi ⁇ -factor secretion factor and containing the methanol-inducible AOX.1 promoter .
  • yeast strain Pichia pastoris GS1 used for the production of the laccase according to the invention after integration of the cassette resulting from the vector pFD56 containing the AOXI promoter, the peptide signai ⁇ -factor and the DNA sequence encoding the laccase of Podospora anserina.
  • Escherichia coli can be chosen as host microorganism, the plasmids which can then be used are in particular the plasmids pBluescript, pUC18, pET, pGEX, pGS. pMAL-e2 or the like.
  • the laccase is advantageously expressed by an E. coli bacterium transformed with a pET21a expression vector coding for an enzyme contiguous to a 6HIS label in the C-terminal position.
  • This process is fast and simple; indeed, the induction of the expression of the laccase of Podospora anserina in E. coli bacterium takes place in 4 to 24 hours.
  • 6HIS label allows the purification of laccase of Podospora anserina by affinity chromatography on a nickel resin in a single step to obtain a pure enzyme.
  • the skilled person chooses the host cell according to the expression vector used.
  • the expression vector pET21a when used, ors chooses a host cell expressing T7 RNA polymerase such as strains of E. coli BL 21 D.E3, BL 21 -SI, BL2 1 pLys, Novablue (DE3 ) or BL 2 i Star.
  • a host cell expressing T7 RNA polymerase such as strains of E. coli BL 21 D.E3, BL 21 -SI, BL2 1 pLys, Novablue (DE3 ) or BL 2 i Star.
  • the present invention also relates to a process for preparing a laccase according to the invention comprising the steps of:
  • step a a.) host cell preparation, expressing the laccase according to the invention; b) culturing the host cells prepared in step a);
  • step d) treatment of the culture medium obtained in step e) by hydrophobic interaction chromatography;
  • the process according to the invention is such that:
  • yeast strain Pichia pastoris used is the GS115 strain
  • the expression vector, in Pichia pastoris is the plasmid pPICZa containing the DNA sequence coding for the laccase of Podospora anserina in phase with the Saccharomyces cerevisiae ⁇ -factor secretion factor and containing the methanolic inducing AOX1 promoter;
  • the culture carried out in step b) comprises at least one step of culture in the liquid phase, with stirring, at a temperature of between 18 and 37 ° C., preferably 25 ° C., during which the expression of laccase is induced by the addition of methanol; induction by addition of methanol can optionally be renewed.
  • the process When the process is carried out according to these preferred conditions, it allows the production of laccase with a short induction time, of the order of 3 to 7 days; the purification of laccase is carried out in. a single chromatography step hydrophobic interactions and the laecase thus produced includes the four copper atoms necessary for. his activity.
  • the method for preparing a laecase according to the invention comprises the steps of:
  • step d) treating, the lysate obtained in step c) by affinity cliromaiography;
  • the laecase according to the invention has electrochemical properties that are better than the laccases sold commercially (see point 10 of the experimental part), in particular that of Trametes versicoior.
  • laccases according to the invention are of particular interest in the following applications;
  • laccases concern the delignil cation and / or the whiteness of the payroll.
  • the laccases according to the invention offer an advantageous alternative for achieving the delignification but also the bleaching of the paperless chlorine-free paper.
  • laccases according to the invention can also be used to remove the ink from the paper and / or discolor, especially for its recycling ; they may also be used for the treatment of fabrics, in particular the bleaching of cotton or to produce the discolored indigo color of jeans,
  • isaccase Another very frequent application of isaccase is their use as a depolluting agent; this enzyme can indeed degrade a broad spectrum of undesirable environmental contaminants including phenols (possibly chlorinated phenolic pollutant) and plastics.
  • Advantageous use of the Iaccases according to the invention thus relates to the depollution of phenol products.
  • iaccases Thanks to their ability to degrade pollutants, iaccases also deodorize materials such as tissues; they are thus useful in detergent compositions for washing clothes or dishes.
  • Iaccases are used in the food industry as a food product preservative, particularly as an additive in order to eliminate oxidizing reagents (deoxygenation), for example for the stabilization of fruit juices and wine.
  • They are also used as a flavor enhancer of a food product; for example, they are involved in the process of preparing cocoa to enhance its taste (soaking in a laccase solution before drying and grilling),
  • the Iaccases according to the invention also have the advantage of permitting the crosslinking of the whey proteins, in oligo- or polymers, and thus lead to the formation of gels (Faergemand et al, 1998 J, Agric Food Chem.46, 1326-1333 Mattinen et al, 2005 FEBS Journal 272, 3640-3650).
  • Iaccases are involved in the process of producing ethanol from recycled raw material.
  • iaccases are useful for the synthesis of anesthetic, anti-inflammatory, antibiotic or iodine compounds.
  • the laccase according to the invention is of particular interest for the manufacture of electrodes on which the enzyme is immobilized.
  • the present invention also relates to laccase electrodes comprising a conductive material such as a conductive metal, especially platinum, copper, silver, aluminum, gold or aluminum. steel or carbon, such as glassy carbon, carbon fibers, carbon nanotube fibers or diamond ... said conductive material is covered with a deposit comprising at least one laccase according to the invention; said deposit may further comprise a redox polymer to improve the electrical conduction between the enzyme and the electrode as well as the stability of the system.
  • a conductive material such as a conductive metal, especially platinum, copper, silver, aluminum, gold or aluminum.
  • steel or carbon such as glassy carbon, carbon fibers, carbon nanotube fibers or diamond ...
  • said conductive material is covered with a deposit comprising at least one laccase according to the invention; said deposit may further comprise a redox polymer to improve the electrical conduction between the enzyme and the electrode as well as the stability of the system.
  • the redox polymer may for example be chosen from polymers based on ferrocene, osmium and ruthenium and conductive polymers such as, for example, polypyrrole and polyananilline.
  • the methods for immobilizing the laccase on said conductive material may be chosen from the standard methods available to those skilled in the art which include in particular the inclusion of the laccase of a polymeric matrix, the adsorption of the laccase to the polymeric membrane surface, covalent bonding, electrodeposition (Gao et al., Chem Int.Ed. 2002, 41, No. 5, 810-813) or the technique described in the US patent application 2009/0053582.
  • the laccase electrode on which the laccase is immobilized is also covered with a membrane which prevents detachment of said enzyme from the electrode.
  • said membrane may consist of a nation, cellulose or any biocompatible material, that is to say compatible with a physiological vironcession.
  • the present invention thus also relates to an oxygen biosensor, phenolic compounds or aromatic amines consisting of a laccase electrode according to the invention.
  • a biosensor consists of an electrode on which is immobilized a bioreceptor capable of recognizing a biological target; the fixation of the biological target on the bioreceptor leads to physico-chemical modifications of the membrane and the production of an electrical signal by an electrochemical transducer (amperometric, potentiometric, conductimetric, ...) attached to the electrode.
  • the bioreceptor is a laccase according to the invention and the biological target is a compound selected from oxygen, phenolic compounds or aromatic amines.
  • the present invention also relates to an oxygen sensor consisting of an electrode according to the invention.
  • the laccase electrode according to the invention can also be advantageously used as a cathode in an enzymatic biopic;
  • Figure 1A schematically represents the operating principle of an enzymatic biopia.
  • the biopi IES 3 enzyme according to the invention are devices comprising an electrode laccase (lacca) as cathode and an anode where an oxidation reaction of a substrate occurs (catalyzed F "enzyme X");
  • the substrate may be glucose and the "enzyme X" glucose oxidase, such a cell is of particular interest when the biopic is implanted in an individual for a medical application;
  • the substrate may also be chosen, for example, from nitrites, nitrates, sulphides, urates, ascorbates, glutamates, pyruvates, lactates, cellulose ...
  • glucose oxidase glucose oxidase (glucose or all the sugars being oxidized by this enzyme)
  • lactate oxidase lactate
  • pyruvate oxidase pyruvay
  • alcohol oxidase alcohol
  • cholesterol oxidase cholesterol oxidase
  • glutamate oxidase glutamate
  • pyranose oxidase pyranose
  • choline oxidase cellobiose dehydrogenase (glucose)
  • glucose dehydrogenase glucose dehydrogenase or all sugars being oxidized by this enzyme
  • pyranose dehydrogenase fructose dehydrogenase (fructose)
  • FIG. 1B more specifically illustrates enzymatic glucose biopia; such an enzymatic biopic consists of two electrodes modified by the immobilization of enzymes.
  • a glucose oxidase (GOx) is attached to the anode (1) via a conductive polymer "/” and a laccase (LAC) is attached to the cathode (2) by means of a conductive polymer "ZI".
  • GOx glucose oxidase
  • LAC laccase
  • the electrons are transferred from the glucose present in the physiological fluid to the GOx, then from the GOx to the conductive polymer "/" and the conductive polymer "I" to the anode, to the cathode, the electrons are transferred from the cathode to the conductive polymer "27", then to the laccase and finally the laccase to oxygen present in the physiological fluid.
  • a biopile can also possibly operate by modifying the electrodes with their respective enzymes and by adding soluble mediators, such as ferrocenemethanol for the anode and potassium ferricyanide for the cathode, and adding if necessary a membrane separating the anode and the cathode.
  • soluble mediators such as ferrocenemethanol for the anode and potassium ferricyanide for the cathode
  • Such a biopile can be used as a miniaturized energy source and implanted in a living organism.
  • Figure 1A shows schematically the operating principle of an enzymatic biopile
  • Figure 1B shows a glucose enzyme biopile.
  • Figure 2 shows the plasmid map of the vector pFD56.
  • Figure 3 is a graph showing the catalytic activity of the laccase of SEQ. he). # 3 according .'invention depending on the concentration of ABTS at 37 ° C,
  • Figure 4 is a graph showing the catalytic activity of SEQ ID laccase. No. 3 according to the invention as a function of the concentration of SGZ at 37 ° C.
  • Figure 5 is a graph showing the relative activity of the laccase of SEQ. ID. No. 3 according to the invention as a function of the pH on the oxidation of ABTS.
  • Figure é illustrates the stability of the laccase of SEQ. ID. No. 3 according to the invention at different pH at 4 ° C.
  • Figure 7 is a graph showing the relative activity of the laccase of
  • SEQ. ID. No. 3 according to the invention as a function of the temperature on the oxidation of the ABTS.
  • Figure 8 is a graph showing the stability of the laccase of SEQ.
  • Figure 9 shows the effect of NaCl on the activity of SEQ laccase. ID. No. 3 according to the invention at pH 7.
  • This strain is used for plasmid amplification during the steps of constructing the protein expression vector.
  • GS1 15 Pichia pastoris yeast strain used for the production of Laccase after integration of the cassette from vector PFD56 containing the AOX1 promoter, the signal peptide-factor and the DNA sequence coding for the laccase of SEQ. ID, No. 3 according to the invention derived from Podospora anserina.
  • Bacteria DH has $ supercompetent are prepared using the method inoue (Sambrook and Russian!).
  • the DNA is introduced into the yeast Pichia pastoris GS1 by electroporation on an Eppendorf Eporator (Eppendorf, France).
  • a plasmid DNA purification kit (Qiagen) is used for small and large amounts of DNA preparations.
  • the double-stranded DNA is sequenced by the company Millegen (Toulouse, France).
  • the SED sequence gene. ID. No. 4 corresponding to the sequence coding for the truncated Podospora anserina laccase (B2ANKS accession) of the portion coding for the first 30 amino acids of the N-terminus was synthesized by. Genecust Europe (Luxembourg), The NheI and NotI restriction sites were respectively added at 3 'and 5' of the sequence to facilitate cloning.
  • the plasmid pPICZa as well as the synthesized gene were then treated with the two restriction enzymes Nbe1 and NoIl and the digests were gel purified with the "nucleospia" kit.
  • the laccase gene is then ligated into the plasmid by co-incubation with T4 DNA Ligase at 37 ° C overnight.
  • the neoformed plastrids (pFD56) are then selected and amplified by transformation of DH5 ⁇ bacteria on a box containing zeocin at 25 ⁇ g / ml.
  • the corresponding gene is introduced by homologous recombination at the AOX1 gene.
  • the plasmid pFD56 once linearized by digestion with PmeI enzyme is introduced into yeast by electroporation and positive clones are selected on YPD medium - agar containing Zeocin to iOOpg / 'ml.
  • the sequence of the plasmid thus obtained is SEQ. 1D. # 6.
  • the laccase enzyme of SEQ ID. No. 3 is produced by the yeast Pichia pastoris via methanoi induction. To do this, a preculture of 200 ml of zeocin-supplemented YPD medium (100 ⁇ g / ml) is inoculated with strain GS1 having integrated the cassette contained on the plasmid pFD56. After stirring overnight at 220 rpm and at 30 ° C. C, this preculture is then centrifuged for 10 min at 4000 rpm and the pellet is taken up in 200 ml of sterile water in order to eliminate any presence of glucose.
  • a 2L culture in MMH medium containing 2 mM CuSO 4 in an Erlenmeyer flask of 51 is then seeded with this pellet.
  • the yeasts are incubated at 25 ° C with stirring (220 rpm) for 2hrs before adding 0.5% methanol to start the induction. This induction step will be repeated during days to obtain the maximum of enzymes.
  • the 2L culture is centrifuged and the supernatant containing the enzyme of interest is concentrated on a stirring cell with a YM10 membrane with a cutoff of 1 OkDa to reach a volume of 4. 5mI final.
  • 1.7M of ammonium sulfate is added to the 4-5ml of the culture supernatant before being filtered through a 0.22 ⁇ filter to be injected onto a hydrophobic interaction chromatography column, a 60mJ PhenyiHP (GE Healthcare *), coupled to the AT system purifying (GE Healthcare *), equilibrated in a Potassium phosphate 50r.oM buffer, (NH ⁇ SC 1.7, pB 6.
  • the elution is carried out by a gradient from 0% to 100% d Potassium phosphate buffer 50mM pH 6 at a flow rate of 2.5 mL min
  • the fractions containing the laccase protein are identified by an activity test with ABTS and are pooled, concentrated and stored in 50mM Potassium phosphate buffer pH 6 by Arrsicon YM10 membrane centrifugation At this stage, the protein is pure and can be stored at -20 ° C in soluble form.
  • the enzyme concentration of a solution is calculated from a BSA range according to the Bradford technique [2].
  • Enzymatic tests were performed using a Varian spectrophotometer in a 0.1 M citrate / phosphate buffer at 37 ° C in a volume of 3 mL following the oxidation of different substrates at a given wavelength as a function of time.
  • the specific activity of the enzyme is expressed in pmol of oxidized substrates per minute and per rng of protein.
  • the experiments are carried out at 37 ° C. on a Varian spectrophotometer in a 0.1 M citrate / phosphate buffer pH 3.4.
  • the concentration of ABTS varies in the test from 0 to 15 mM.
  • the test is triggered by the addition of enzyme.
  • the experimental points are analyzed by non-linear regression according to the model of Miehaelis-Menten using the Sigma-plot 6.0 software according to the equation below:
  • Figure 3 shows the catalytic activity of the accase of SEQ ID NO. No. 3 as a function of ABTS concentration at 37 ° C
  • the experiments are carried out at 37 ° C. on a Varian spectrophotometer in a 50 mM citrate-phosphate buffer pH 7.
  • the concentration of SGZ, diluted in methanol, varies in the 0 to 50 ⁇ test.
  • the test triggered by the addition of enzyme, is to monitor the oxidation of SGZ at 530 nm by colorimetric changes (ss 3 0n m -. 84 mM 1 cm "1).
  • the study of the change in the rate constant of the reaction as a function of pH is carried out over a pH range of from 3 to 7 in a 0.1 M citrate / phosphate buffer using FABTS at 1 nm as a substrate.
  • the experiments are carried out at 37 ° C. using a Varian spectrophotometer.
  • the activity is followed by the oxidation of ⁇ BTS resulting in a colorimetric change measured at 420 nm.
  • the test is triggered by adding the enzyme.
  • Figure 5 shows the relative activity of the laccase of SEQ. ÎD, No. 3 as a function of pH on oxidation of ABTS.
  • the enzyme at a concentration of 0.15 mg / ml is preincubated in 50 mM phosphate-citrate buffer (or 50 mM Tris-H 2 S0 4 for pH 8 and 9) at a given pH at 4 ° C.
  • samples of 5 ⁇ are taken and the residual activity of the enzyme incubated at different folds is determined using a Varian spectrophotometer at 44 () nm in a 0.1M citrate / phosphate pH buffer. 3.4 at 37 ° C, in the presence of 150 ⁇ ABTS, The test is triggered by adding the enzyme. The results obtained are shown in Figure 6.
  • the "enzyme is preincubated at a concentration of 0.35 mg MI in a bath to dryness at 60 ° C and 37 ° C in a potassium phosphate buffer 50 mM. PH 6.
  • Residual activity of the enzyme incubated at these temperatures is determined using a Varian spectrophotometer at 440 nm in 0.1 M citrate / phosphate buffer pH 3.4 at 37 ° C., in the presence of 150 ⁇ l of ABTS. is triggered by adding the enzyme
  • the results obtained are shown in Figure S. . Eiisde of the eBzymatii activity and the presence of NaCi
  • two enzymatic electrodes were prepared comprising either the Iaccase of SEQ. ID. No. 3 according to the present invention, the Iaccase of Trametes versicolor (the iaccase commonly used in electrochemistry) and a redox polymer.
  • the catalytic current for C reduction is 40% higher for the electrode modified with the new enzyme.
  • the stability over time is 200% greater.

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Abstract

La présente invention se rapporte à une nouvelle laccase de Podospora anserina, à son procédé de préparation ainsi qu'à son utilisation notamment pour la délignificaiion du papier, comme décolorant, dépolluant et désodorisant ou encore pour réduire l'oxygène.

Description

LACCASE DE PODOSPORA ANSERINA ET SES APPLICATIONS
La présente invention se rapporte à une nouvelle laccase isolée à partir de Podospora anserina, à son procédé de préparation ainsi qu'à son utilisation notamment pour la délignification du papier, comme décolorant, dépolluant et désodorisant ou encore pour réduire l'oxygène.
Les laccases sont des enzymes à cuivre qui oxydent les poiyphénols en utilisant l'oxygène comme accepteur final d'électrons. Elles sont présentes dans les plantes, dans de très nombreux champignons (dégradation de la lignine) ainsi que dans quelques bactéries.
La structure des laccases est telle que leur site actif est constitué de 4 atonies de cuivre, un de type 1 (ΊΠ ), isolé, responsable de l'oxydation des phénols et un cîuster de 3 atomes de cuivre (un de type 2, T2, et deux de type 3, T3) responsable de l 'activât! on du (¾.
Le mécanisme d'action des laccases et notamment le rôle du centre métallique, reste mal connu ; il est admis un mécanisme en deux temps :
1. le cuivre Tî arrache un électron au substrat ;
2. l'électron est transféré au centre T2/T3 sur une distance d'environ 12,5 Â, Après complète réduction du centre trfnucléaire, la réduction de l'oxygène moléculaire intendent.
Schéma générai de la réaction d'oxyd tion des phénols par les laccases
Les inventeurs ont maintenant identifié une nouvelle laccase produite par Podospora anserina qui présente des caractéristi ues plus avantageuses que les laccases disponibles dans le commerce, notamment celle de Trametes versicolor.
Selon un premier objet, l'invention se rapporte à la laccase purifiée et isolée de Podospora anserina de SEQ. ID. N° i ; cette enzyme correspond à une protéine prédite par le séquençage du génome de Podospora anserina (traduite à partir du gène ayant le numéro d'accession B2ANK.8 dans la base de données UniProt, ce gène complet a pour séquence SEQ. ID. N°2) à l'exception des 30 acides aminés positionnés à extrémité N-terminale de la protéine ; en particulier, la laccase purifiée (pureté > 95%) selon l'invention présente un pourcentage d'identité d'an moins 90%, et par ordre de préférence croissant au moins 95%, 97%, 98% et 99% d'identité, par rapport à la laccase de Podospora anserina de SEQ. ID. N°l, selon une variante particulière, elle comporte une troncature totale ou partielle de 30 acides aminés positionnés à l'extrémité N-terniinale ; elle catalyse la réaction d'oxydation de noyaux phénoliques et est liée à quatre atomes de cuivre ; la séquence d'acides nucléiques SEQ. JD. N°4 (correspondant à la SEQ. ID. N°2 à l'exclusion du fragment codant pour les 30 acides aminés positionnés à l'extrémité N- terminale) code pour cette laccase de SEQ. ID. N° l .
La laccase de SEQ, ID. N 3 est également un objet de la présente invention, la laccase de SEQ. ID. N°3 diffère de la laccase de SEQ. fD. N°l en ce qu'elle comporte un acide aminé additionnel, une sérine, en positio N-terminale ; cette laccase est obtenue en exprimant dans la levure Pichia postons la molécule d'acide nucléique de SEQ. ID. N°4 clonée dans le vecteur d'expression pFD56 dont la construction est telle qu'elle permet l'expression d'une protéine portant une sérine additionnelle en position N~ terminale.
La laccase de SEQ. ID. N°5, qui correspond au poîypeptide codé par la SEQ, ID. N°2 et qui comporte les 30 acides aminés de extrémité N-terminale, est également un objet de la présente invention,
De façon générale, les inventeurs ont constaté que les modifications de séquences introduites à l'extrémité N-terminale, qu'il s'agisse d'ajout d'acides aminés ou de substitution, délétion ou insertion au sein de l'extrémité N-terminaie dans la limite du maintien d'une identité d'au moins 90% avec la SEQ. ID. N° L n'affectaient pas les propriétés enzymatiques de l laccase selon l'invention. Ainsi une variante de l'invention se rapporte à une laccase de SEQ. ID. N°l comportant au moins une altération (substitution, délétion ou insertion) au sein de la séquence des 30 acides aminés positionnés à l'extrémité N-terminale, les autres acides aminés non situés dans cette séquence étant de préférence inchangés et l'identité de cette enzyme étant d'au moins 90%, de préférence 95%, 97%, 98% et 99%, avec la SEQ, ID. N°l.
L'identité d'une séquence par rapport à la séquence de la laccase de Podospora anserina (SEQ. ID. N°l ) comme séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les deux séquences sont alignées, de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles.
Le pourcentage d'identité peut être calculé par 3 'homme du métier en utilisant un programme informatique de comparaison de séquences tel que, par exemple celui de la suite BLAST (Altschul et al, NAR, 25, 3389-3402). Les programmes BLAST sont mis en œuvre sur la fenêtre de comparaison constituée de ia totalité de la SEQ. ID. N° 1 indiquée comme séquence de référence.
Un peptide ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X% d'identité avec une séquence de référence est défini, dans la présente invention, comme un peptide dont la séquence peut inclure jusque 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence de référence, tout en conservant les propriétés fonctionnelles dudit peptide de référence. Au sens de la présente invention, le terme altération inclut les déiétïons, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence.
Une séquence protéique SEQ. ÏD. °5 prédite à partir du séquençage systématique du génome de Podospora anserina est décrite dans la base de données UniProt (numéro d'accession B2ANK8) ; il convient de souligner que les informations présentées dans ia base de données UniProt sont prédictives et putatives, elles ne résultent pas de l'isolement et de la caractérisation expérimentales de protéines de Podospora anserina. En outre, la base de données UniProt n'indique aucune activité enzymatique précise pour cette protéine prédite.
La nouvelle laccase selon l'invention présente des propriétés améliorées par rapport aux. laccases disponibles dans le commerce issues de Tramet.es versicolor, Rhtts vernicifera, Âgarîcus bisporus ou encore Pleurotus ostreat s.
La présente invention se rapporte également à une molécule d'acide nucléique codant pour la laccase selon l'invention ; de préférence, il s'agit d'une molécule d'acide nucléique de séquence choisie parmi la SEQ. ID, N°2 ou de façon préférentielle, il s'agit, de la SEQ. ID. N°4 codant pour ia laccase de Podospora anserina clivée au niveau des 30 premiers acides aminés positionnés à ['extrémité N-terminale de la. protéine.
La molécule d'acide nucléique codant pour la laccase selon l'invention peut être clonée dans un vecteur d'expression tel qu'un plasmide, puis transformée dans un hôte approprié tel qu'une bactérie, une levure ou encore une culture cellulaire.
Par vecteur d'expression, on entend un vecteur possédant une région permettant l'insertion d'une séquence nucléotidique codante entre les signaux indispensables à son expression, notamment, un promoteur (constitutif ou inductible), un site de fixation des ribosomes, un signal de terminaison de transcription et, éventuellement, un marqueur de sélection tel qu'un gène de résistance à un antibiotique.
La présente invention se rapporte encore à un vecteur d'expression comprenant ladite molécule d'acide nucléique et à une cellule hôte transformée avec ledit vecteur d'expression et exprimant une iacca.se selon l'invention.
L'Introduction du vecteur d'expression dans la cellule hôte peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, en particulier, par modification de la perméabilité membranaire de la cellule hôte, par exemple en présence d'ions calcium, ou par éleciroporation.
Après culture des cellules hôtes transformées pour exprimer la laccase selon l'invention, lesdites cellules peuvent être récupérées par centrifugation, iysées afin de libérer les enzymes dont ladite laccase selon l'invention.
Selon une variante préférée de l'invention, la laccase selon l'invention est produite par la levure Pichia pas to ris.
Pour permettre la surproduction et la sécrétion de la laccase dans le milieu de culture de la levure Pichia pastoris, la molécule d'acide nucléique de SEQ. ÏD. °4, codant pour la laccase de séquence SEQ. ÏD. N°3 lorsqu'elle est clonée dans le vecteur pFD56 comme décrit ci-après, est introduite par recombinaison homologue dans le génome de la levure, au niveau du gène AOX1. Pour cela, le plasmide pFD56, une fois linéarisé par digestion avec l'enzyme pmeï, est introduit dans la levure par élecrroporarion et les clones positifs sont sélectionnés sur milieu YPD + agar contenant de la zéocine à I00pg/ml. À partir d'un clone isolé sur boite de Pétri, une préculture de 200 mL de milieu YPD supplémentée en zéocine (100 pg mL) est ensemencée. Après une nuit sous agitation à 220 rpm et à 30°C, cette préculture est alors centrifugée 10 minutes à 4000 rpm et le culot est repris dans 200 ml d'eau stérile afin d'éliminer toute présence de glucose. Apres une seconde centrifugation, une culture de 2L en milieu MMH contenant ImM de C SO4 dans un Erlenmeyer de 5L est alors ensemencée par ce culot. Les levures sont incubées à 25°C sous agitation (220 rpm) pendant 2 heures avant d'ajouter 0,5% de méthanol pour lancer l'induction. Cette étape d'induction sera répétée durant 5 jours afin d'obtenir le maximum d'enzymes.
Pour la mise en oeuvre de cette méthode, on peut, sans caractère limitatif, utiliser le matériel suivant : - vecteur pour l'expression dans Pichia postons (pFD56): pîasmide pPICZa contenant la séquence ADN codant pour la laccase de Podospora anserina en phase avec le facteur de sécrétion α-factor de Saccharomyces cerevisi e et contenant le promoteur AOX.1 indueiibîe au méthanol.
- souche de levure Pichia pastoris GS1 15 utilisée pour la production de la laccase selon l'invention après intégration de la cassette issue du vecteur pFD56 contenant le promoteur AOXÎ, le pepiide signai α-factor et la séquence ADN codant la laccase de Podospora anserina.
~ Milieux de culture :
Milieu riche YPD (pour levure) :
1 % yeast extract
2% bacto-peptone
2% glucose
pH non ajusté, autoclavé pendant 20 mm à 120°C
Milieu minimum MMH (pour levure) :
1,34% yeast nitrogen base
1% Casamino acid
0,4% histidine
4* 10"s % Biotine
pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à .120°C
Milieu riche LB (pour bactérie) :
Tryptone 10 g/L
Extrait de levure 5 g/L
NaCl 5 g/L
H20 distillée qsp IL
pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C,
Selon une autre variante, Escherichia coli peut être choisie comme micro-organisme hôte, les piasmides qui peuvent alors être utilisés sont notamment, les piasmides pBluescript, pUCl8, pET, pGEX, pGS. pMAL-e2 ou similaires.
Selon cette variante de préparation de la laccase selon l'invention, la laccase est avantageusement exprimée par une bactérie E. coli transformée avec un vecteur d'expression pET21a codant pour une enzyme accolée à une étiquette 6HIS en position C- terminaie. Ce procédé est rapide et simple ; en effet, l'induction de l'expression de la laccase de Podospora anserina dans la bactérie E. coii s'effectue en 4 à 24 heures.
En outre. étiquette 6HIS permet la purification de la laccase de Podospora anserina par chromaiographie d'affinité sur une résine nickel en une seule étape pour l'obtention d'une enzyme pure.
Pour la mise en œuvre de ce procédé de préparation, l'homme du métier choisit la cellule hôte en fonction du vecteur d'expression utilisé.
De préférence, lorsque le vecteur d'expression pET21a est utilisé, ors choisit une cellule hôte exprimant la T7 RNA polymérase telles que les souches d'E, coii BL21 D.E3, BL21-SI, BL21 pLys, Novablue(DE3) ou BL2i Star.
La présente invention se rapporte également à un procédé de préparation d'une laccase selon l'invention comprenant les étapes de :
a.) préparation de cellules hôtes, exprimant la laccase selon l'invention ; b) mise en culture des cellules hôtes préparées à l'étape a) ;
c) récupération du milieu de culture et élimination des cellules hôtes, par exemple par centrifugation ;
d) traitement du milieu de culture obtenu à l'étape e) par chromatographie d'interactions hydrophobes ;
e) récupération de ladite laccase purifiée.
Selon un mode de mise en œuvre préféré, le procédé selon l'invention est tel que :
- la souche de levure Pichia pastoris utilisée est la souche GS115 ;
- le vecteur d'expression, clans Pichia pastoris (pFD56) est le plasmide pPICZa contenant la séquence ADN codant pour la laccase de Podospora anserina en phase avec le facteur de sécrétion α-factor de Saccharomyces cerevisiae et contenant le promoteur AOX1 inductibîe au méthanoî ;
- la culture réalisée à l'étape b) comprend au moins une étape de culture en phase liquide, sous agitation, à une température comprise entre 18 et 37°C, de préférence 25°C, au cours de laquelle, l'expression de la laccase est induite par l'ajout de méthanol ; l'induction par ajout de méthanol pouvant éventuellement être renouvelée.
Lorsque le procédé est mis en œuvre selon ces conditions préférées, il permet la production de la laccase avec un temps d'induction court, de l'ordre de 3 à 7 jours ; la purification de la laccase est réalisée en. une seule étape de chromatographie d'interactions hydrophobes et la laecase ainsi produite comporte bien les quatre atomes de cuivre nécessaires à. son activité.
Lorsque la laecase selon l'invention est produite par une souche telle qiv 'Escheri hia coli, alors le procédé de préparation d'une laecase selon invention comprend les étapes de :
a) préparation de cellules hôtes, exprimant la laecase selon l'invention ;
b) mise en culture des cellules hôtes préparées à l'étape a) ;
c) lyse des cellules hôtes ;
d) traitement, du lysat obtenu à l'étape c) par cliromaiographie d'affinité ;
e) récupération de ladite laecase purifiée.
Il est également possible de produire une laecase en présence d'agents dénaturants comme l'urée, le chlorure de guanidium, le SDS, le triton... ; la laecase ainsi produite sera alors dépourvue de cuivre et pourra être activée par l'ajout d'atomes de cuivre.
La Demanderesse a démontré que la laecase selon l'invention présente des propriétés électrochimiques meilleures que les laccases vendues dans le commerce (voir le point 10 de la partie expérimentale), en particulier celle de Trametes versicoior.
Ainsi, de par leurs propriétés enzymatiques avantageuses, les laccases selon l'invention présentent un intérêt particulier dans les applications suivantes ;
- Utilisatio dans l'industrie papetière.
Les applications les plus habituelles des laccases concernent la délignil cation et/ou le blanchimen de la paie à papier.
Dans la préparation industrielle de papier, la séparation et la dégradation de la lignine dans la pâte de bois sont classiquement obtenues en utilisant du chlore et/ou des oxydants chimiques ; ces méthodes conventionnelles présentent l'inconvénient d'être polluantes. Les laccases selon l'invention offrent une alternative avantageuse pour réaliser la délignification mais aussi le blanchiment de la paie à papier sans chlore.
- Utilisation comme décolorant.
La capacité qu'ont les laccases à blanchir le papier peut s'appliquer dans d'autres domaines : les laccases selon l'invention peuvent également être utilisées pour éliminer l'encre du papier et/ou le décolorer, notamment en vue de son recyclage ; elles peuvent, également être utilisées pour le traitement des tissus, en particulier le blanchiment du coton ou pour produire la couleur indigo décolorée des jean's,
- Utilisation comme dépolluant.
Une autre application très fréquente des îaccases concerne leur utilisation comme dépolluant ; cette enzyme peut en effet dégrader un large spectre de contaminants environnementaux indésirables incluant des phénols (polluant phénolique éventuellement chlorés) et des matières plastiques. Une utilisation avantageuse des Iaccases selon l'invention concerne ainsi la dépollution de produits à base de phénol.
- Utilisation comme désodorisant et dans des compositions détergentes.
Grâce à leur capacité de dégrader des polluants, les iaccases permettent également de désodoriser des matériaux comme les tissus ; elles sont ainsi utiles dans des compositions détergentes pour le lavage du linge ou de la vaisselle.
~ Utilisation dans l'industrie alimentaire.
Les Iaccases sont utilisées dans l'industrie alimentaire comme conservateur de produit alimentaire, en particulier comme additif afin d'éliminer des réactifs oxydants (désoxygénation), par exemple pour la stabilisation des jus de fruits et du vin.
Elles sont également utilisées comme exhausteur de goût de produit alimentaire ; par exemple, elles sont impliquées dans le précédé de préparation du cacao pour en exhausser le goût (trempage dans une solution de laccase avant de sécher et griller),
Les Iaccases selon l'invention ont encore comme intérêt de permettre la réticulation des protéines du lactosérum, en oligo- ou polymères et conduire ainsi à la formation de gels (Faergemand et al, 1998 J, Agric. Food Chem.46, 1326-1333 ; Mattinen et al, 2005 FEBS Journal 272, 3640-3650).
- Utilisation pour la mise en œuvre de synthèses organiques.
Les Iaccases interviennent dans le procédé de production d'éthanol à partir de matière première recyclée.
- Utilisation dans le domaine pharmaceutique.
Là encore, les iaccases sont utiles pour la synthèse cle composés anesthésiques, anti-inflammatoires, antibiotiques ou encore de F iode.
- Utilisation dans le domaine cosmétique.
De nombreux développements sont réalisés dans le domaine cosmétique, il s'agit en particulier d'utilisation comme réactifs dans des compositions de teinture d'oxydation où les laccases permettent la préparation de produit moins irritant. Elles permettent également la préparation de produit éclaircissant pour la peau.
Enfin, elles peuvent être utilisées dans des déodorants ou des produits d'hygiène comme le savon et le dentifrice.
·· Utilisation poux la fabrication d'électrodes et de hiopiles,
La laccase selon l'invention présente un intérêt particulier pour la fabrication d'électrodes sur lesquelles l'enzyme est immobilisée.
Ainsi, la présente invention se rapporte également à des électrodes à laccase comprenant un matériau conducteur tel qu'un métal conducteur, notamment, du platine, du cuivre, de l'argent, de l'aluminium, de l'or ou de l'acier ou du carbone, comme du carbone vitreux, des fibres de carbone, des fibres de nanotubes de carbone ou encore en diamant... ledit matériau conducteur est recouvert d'un dépôt comprenant au moins une laccase selon l'invention ; ledit dépôt pouvant en outre comprendre un polymère redox pour améliorer la conduction électrique entre l'enzyme et l'électrode ainsi que la stabilité du système.
Le polymère redox peut être par exemple choisi parmi les polymères à base de ferrocène, d'osmium et de ruthénium et les polymères conducteurs tels que par exemple le polypyrrole et la poîyananilline.
Les méthodes d'immobilisation de la laccase sur ledit matériau conducteur peuvent être choisies parmi les méthodes classiques à la disposition de l'homme du métier qui comprennent notamment l'inclusion de la laccase dam une matrice polymérique, l'adsorption de la laccase à la surface de la membrane polymérique, la fixation par liaison covalente, l 'électrodéposition (Gao et ί, Chem. Int. ED. 2002, 41, N°5, 810-813} ou encore la technique décrite dans la Demande de Brevet Américain US 2009/0053582.
Selon une variante de réalisation, l'électrode à laccase sur laquelle est immobilisée la laccase est également recouverte d'une membrane qui évite le détachement de ladite enzyme de l'électrode. Selon les applications envisagées, ladite membrane peut être constituée de nation, de cellulose ou de tout matériau biocompatibie, c'est-à-dire compatible avec un e vironnement physiologique.
La présente invention se rapporte ainsi également à un biocapteur à oxygène, de composés phénoiiques ou d'aminés aromatiques constitué d'une électrode à laccase selon ['invention. De façon générale, un biocapteur consiste en une électrode sur laquelle est immobilisé un biorécepteur capable de reconnaître une cible biologique ; la fixation de la cible biologique sur le biorécepteur conduit à des modifications physico- chimiques de la membrane et la production d'un signal électrique par un transducteur électrochimique (ampérométrique, potentiornétrique, conductimétrique, ... ) accolé à l'électrode. Dans le cas présent, le biorécepteur est une laccase selon l'invention et la cible biologique est un composé choisi parmi le F oxygène, des composés phénoliques ou des aminés aromatiques.
La présente invention se rapporte aussi à un capteur à oxygène constitué d'une électrode selon F invention.
L'électrode à laccase selon l'invention peut encore être avantageusement utilisée à titre de cathode dans une biopiie enzymatique ; la Figure 1À représente schématiquemeni le principe de fonctionnement d'une biopiie enzymatique. Les biopi'ies enzymatiques selon 3 'invention sont des dispositifs comprenant une électrode à laccase (lacca) à titre de cathode et une anode où une réaction d'oxydation d'un substrat se produit (catalysée par F« enzyme X ») ; à titre d'illustration, le substrat peut être du glucose et !'« enzyme X » la glucose oxydase, une telle pile présente un intérêt particulier lorsque la biopiie est implantée chez un individu pour une application médicale ; le substrat peut aussi être choisi, par exemple, parmi des nitrites, nitrates, sulfures, urates, ascorbates, glutamates, pyruvates, lactates, de la cellulose... si une application en dépollution est envisagée, le choix de l'enzyme se fera alors en fonction du substrat à dégrader, à titre d'exemple, les enzymes suivantes peuvent être utilisées, le type de substrat qu'elles peuvent dégrader est mentionné entre parenthèse : la glucose oxydase (glucose ou tous les sucres étant oxydés par cette enzyme), la lactate oxydase (lactate), la pyruvate oxydase (pyruvaie), l'alcool oxydase (alcool), la cholestérol oxydase (cholestérol), la glutamate oxydase (glutamate), la pyranose oxydase (pyranose), la choline oxydase (choline), la cellobiose déshydrogénase (ceîîobiose), la glucose déshydrogénase (glucose ou tous les sucres étant oxydés par cette enzyme), la pyranose déshydrogénase (pyranose), la fructose déshydrogénase (fructose), l'aldéhyde oxydase (aldéhyde), la giuconolactone oxydase (glucunolactone), l'alcool déshydrogénase (alcool), l'ascorbate oxydase (oxygène ou ascorbate) ou encore la sulfure dioxygénase (sulfure). Le procédé d'oxydation et de réduction concomitant aux électrodes de la biopiie produit un courant électrique,
La Figure 1B illustre plus spécifiquement une biopiie enzymatique à glucose ; une telle biopiie enzymatique consiste en deux électrodes modifiées par l'immobilisation d'enzymes. Une glucose oxydase (GOx) est fixée sur l'anode (1) par l'intermédiaire d'un polymère conducteur « / » et une laccase (LAC) est fixée sur la cathode (2) par l'intermédiaire d'un polymère conducteur « ZI ». En fonctionnement, à l'anode, les électrons sont transférés du glucose présent dans le fluide physiologique vers la GOx, puis de la GOx au polymère conducteur « / » et du polymère conducteur « I » vers l'anode, A la cathode, les électrons sont transférés de la cathode vers le polymère conducteur « 27 », puis vers la laccase et enfin de la laccase à l'oxygène présent dans le fluide physiologique.
Il est à noter qu'une biopile peut aussi éventuellement fonctionner en modifiant les électrodes avec leurs enzymes respectives et en rajoutant des médiateurs solubles, tels que le ferrocèneméthanol pour l'anode et le ferricyanure de potassium pour la cathode, et en rajoutant le cas échéant une membrane séparant F anode et la cathode.
Une telle biopile peut être utilisée comme une source d'énergie miniaturisée et être implantée dans un organisme vivant.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortironi de la description qui va suivre, qui se réfèrent à des exemples de mise en œuvre de la présente invention, ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles :
Figures
La Figure 1À représente schématiquement le principe de fonctionnement d'une biopile enzymatique ; la Figure 1B représente une biopile enzymatique à glucose.
La Figure 2 représente la carte plasrnidique du vecteur pFD56.
La Figure 3 est un graphe représentant l'activité catalytique de la laccase de SEQ. il). N°3 selon .'invention en fonction de la concentration d'ABTS à 37°C,
La Figure 4 est un graphe représentant l'activité catalytique de la laccase de SEQ- ID. N°3 selon l'invention en fonction de la concentration de SGZ à 37°C.
La Figure 5 est une courbe représentant Γ activité relative de la laccase de SEQ. ID. N°3 selon l'invention en fonction du pH sur l'oxydation de l'ABTS.
La Figure é illustre la stabilité de la laccase de SEQ. ID. N°3 selon l'invention à différents pH à 4°C.
La Figure 7 est un graphe représentant l'activité relative de la laccase de
SEQ. ID. N°3 selon l'invention en fonction de ia température sur l'oxydation de l'ABTS.
La Figure 8 est un graphe représentant la stabilité de la laccase de SEQ.
ÏD. N°3 selon l'invention en fonction du temps à 37°C et 6Û°C sur Foxydation de l'ABTS.
La Figure 9 représente l'effet du NaCl sur l'activité de la laccase de SEQ. ID. N°3 selon l'invention à pH 7. L.Préparatjoii de l& laccase issae du ch&mpl on Po osi?om m^g a
3■ Souche bactérienne ά"' Escherichia coli
ΟΗ5α : ίί^Ε44, Δ βΛΙ169, (Φ80 iacZDM ï S). hsdRA l, recAl , end Al , gyrA96, thi-l , relAl (Hanahan, 1 83), Cette souche est utilisée pour l'amplification de plasmide lors des étapes de construction du vecteur d'expression protéique.
2. Vecteur
pFI 56 : Plasmide pPIC-Ζα contenant la séquence ADN codant pour la laccase de SEQ. ÎD. N°3 selon l'invention issue de Podospor anserina en phase avec le facteur de sécrétion a- factor de Saccharomyces cerevisiae et contenant le promoteur- AOXl inductible au méthanol ; le plasmide est représenté à la Figure 2.
3. Souche de la levure Pichia pastoris
GS1 15 : souche de levure Pichia pastoris utilisée pour la production de la Laccase après intégration de la cassette issue du vecteur PFD56 contenant le promoteur AOXl, le pepiide signal -factor eî la séquence ADN codant la laccase de SEQ. ID, N°3 selon l'invention issue de Podospora anserina.
4. Milieu de culture
Milieu riche YPD (pour levure) :
ί % yeast extract
2% bacto-peptone
2% glucose
pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C
Milieu minimum MMH (pour levure) :
1 ,34% yeast nitrogen base
1% Casamino acid
0,4% histidine
4* 1 Ô"5 % Biotine
pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C
Milieu riche LB (pour bactérie) ;
Tryptone 10 g/L
Extrait de levure 5 g/L
NaCI 5 g/L H20 distillée qsp IL
pH non ajusté, autoclavé pendant 20 min à 120°C
Techniques de génie génétique
5, Transformation des bactéries supercompétentes
Les bactéries DH$a supercompétentes sont préparées à l'aide de la méthode d'inoue (Sambrook et Russe! ).
6· Transfonnation de la levure Pichia pas loris
L ADN est introduit dans la levure Pichia pastorîs GS1 15 par électroporation sur un Eppendorf Eporator (Eppendorf, France).
Préparation de ΑΡΝ
Un kit de purification d'ADN plasmidique (Qiagen) est utilisé pour les préparations d'ADN en petite et grande quantité.
8. Séquençage de ΑΡΝ double brin
L'ADN double brin est séquencé par la société Millegen (Toulouse, France).
9- Construction du vecteur d'expression de ia laccase
Le gène de séquence SED. ID. N°4 correspondant à la séquence codant la laccase de Podospora anserina (accession B2ANKS) tronqué de ia partie codant pour les 30 premiers acides aminés de l'extrémité N «terminale a été synthétisé par la. société Genecust Europe (Luxembourg), Les sites de restriction Nhei et Notl ont été respectivement ajoutés en 3' et 5' de la séquence pour faciliter le clonage. Le plasmide pPICZa ainsi que le gène synthétisé ont alors été traités avec les deux enzymes de restrictions Nbeï et Noil et les produits de digestion ont été purifiés sur gel avec le kit « nucleospia ». Le gène de la laccase est alors ligué dans le plasmide par co-incubation avec la T4 DNA Ligase à 37°C sur ia nuit. Les plasraides néoformés (pFD56) sont alors sélectionnés et amplifiés par transformation de bactéries DH5a sur boite contenant de la zéocine à 25pg/ml.
10. I tégration de la séquence codant la laccase dans le génome de Pichia posions
Pour permettre la surproduction et ta sécrétion de l'enzyme dans le milieu de culture de la levure Pichia pastorîs, le gène correspondant est introduit par recombinaison homologue au niveau du gène AOXl . Pour cela, le plasmide pFD56 une fois linéarisé par digestion avec l'enzyme pmel, est introduit dans la levure par électroporation et les clones positifs sont, sélectionnés sur milieu YPD - agar contenant de la zéocine à iOOpg/'ml. La séquence du plasmide ainsi obtenu est la SEQ. 1D. N°6.
Production, purification et c r ctérlsaîion de ^r^^ jMçasx^ î^ e à P dos& rtt
Production de la laccase
L'enzyme laccase de SEQ, ID. N°3 est produite par la levure Pichia pastoris via une induction au méthanoi. Pour ce faire, une préculture de 200 mL de milieu YPD suppîémentée en zéocine (100 pg/mL) est ensemencée par la souche GS1 15 ayant intégré la cassette contenue sur le plasmide pFD56, Après une nuit sous agitation à 220 rpm et à 30°C, cette préculture est alors centrifugée 10min à 4000rpm et le culot est repris dans 200ml d'eau stérile afin d'éliminer toute présence de glucose. Apres une seconde centrifugation, une culture de 2L en milieu MMH contenant 2mM de CuS04 dans un Erlenmeyer de 51. est alors ensemencée par ce culot. Les levures sont incubées à 25°C sous agitation (220 rpm) pendant 2hrs avant d'ajouter 0.5% de méthanoi pour lancer l'induction. Cette étape d'induction sera répétée durant Sjours afin d'obtenir le maximum d'enzymes. Pour récupérer les protéines sécrétées, la culture de 2L est centrifugée et le surnageant contenant l'enzyme d'intérêt est concentré sur une cellule d'agitation avec une membrane YM10 d'un seuil de coupure de 1 OkDa pour atteindre un volume de 4-5mI final.
Purification de la laccase par chrornatographie d'interactions hydrophobes
Une fois concentré, 1.7M d'ammonium sulfate est ajouté au 4-5ml du surnageant de culture avant d'être filtré sur filtre de 0,22μηα pour être injecté sur une colonne de chrornatographie d'interactions hydrophobes, une PhenyiHP de 60mj (GE Healthcare*), couplée au système A TA purifier (GE Healthcare*), équilibrée dans un tampon Potassium phosphate 50r.oM, (NH^SC 1.7 , pB 6. L'éiution est réalisée par un gradient de 0% à 100% d'un tampon Potassium phosphate 50mM pH 6 sous un débit de 2,5 mL min. Les fractions contenant la protéine laccase sont identifiées par un test d'activité à l ABTS et sont rassemblées, concentrées et stockées dans un tampon Potassium phosphate 50mM pH 6 par centrifugation sur membrane Arrsicon YM10. A ce stade, la protéine est pure et peut être conservée à -20°C sous forme soluble.
En comparant avec d'autres laceases disponibles commercialement, il apparaît un réel avantage d'utilisation de cette protéine vis-à-vis du protocole de purification. En effet, une seule étape de purification est nécessaire pour l'obtention d'une enzyme pure en opposition avec les successions de chrornatographie (size exclusion, échangeuse anionique ou canonique hydrophobe...) utilisées pour les autres enzymes [1]. I. Carae érisatioa de F enzyme
La concentration en enzyme d'une solution est calculée à partir d'une gamme BSA selon la technique Bradford [2].
Les tests enzymatiques sont effectués à F aide d'un spectrophotomètre Varian dans un tampon 0.1 M citrate/phosphate à 37°C dans un volume de 3mL en suivant l'oxydation de différents substrats à une longueur d'onde donnée en fonction du temps. L'activité spécifique de l'enzyme est exprimée en pmoles de substrats oxydés par minute et par rng de protéine. Les substrats utilisés dans cette étude sont : Î'ABTS (£ 20.™ = 36 mM"1 cm"1) et la syrmgaldazme, SGZ (8530^ = 64 mM"1 cm"5).
Elude des pr p iétés enzvmatigites de la ïaccase de Podosper anserina.
Détermination des constantes cinétiques (k^ et de Miehae is (KM) à l'état stationnaire 3, ABTS
Les expériences sont réalisées à 37°C sur un spectrophotomètre Varian dans un tampon 0.1 M citrate/phosphate pH 3.4, La concentration en ABTS varie dans le test de 0 à L5mM. Le test est déclenché par l'ajout d'enzyme. Les points expérimentaux sont analysés par régression non linéaire selo le modèle de Miehaelis-Menten à l'aide du logiciel Sigma-plot 6.0 selon l'équation ci-dessous:
Modèle de Miehaelis-Menten
Résultats ; kcat - 1372 s"1, Km = 307 μΜ
La Figure 3 représente l'activité catalytique de la Ïaccase de SEQ, ID. N°3 en fonction de la concentration d'ABTS à 37°C,
4.
Les expériences sont réalisées à 37°C sur un spectrophotomètre Varian dans un tampon citrate-phosphate 50mM pH 7. La concentration en SGZ, diluée dans le méihanol, varie dans !e test de 0 à 50μΜ. Le test, déclenché par l'ajout d'enzyme, consiste à suivre l'oxydation de la SGZ à 530nm par changement coiorîmétrique (ss30nm - 84 mM' 1 cm."1).
Résultats : kcat = Os"1, KM = 10.9 μΜ
Ces résultats sont présentés à la Figure 4. S, Ac iv té mction άιι H
L'étude de la variation de la constante de vitesse de la réaction en fonction du pH est réalisée sur une gamme de pH allant de 3 à 7 dans un tampon 0, 1 M citrate/phosphate en utilisant FABTS à îtnM comme substrat. Les expériences sont réalisées à 37°C à l'aide d'un spectrophotornètre Varian, L'activité est suivie par l'oxydation de l'ÀBTS aboutissant à un changement colorimétrique mesuré à 420nm. Le test est déclenché par ajout de l'enzyme.
La Figure 5 représente l'activité relative de la laccase de SEQ. ÎD, N°3 en fonction du pH sur l'oxydation de l'ABTS.
6. Stabilité en fonction du pH
L'enzyme à une concentration de 0.15mg/ml est préincubée dans un tampon phosphate-citrate 50mM (ou Tris-H2S04 50mM pour pH 8 et 9) à un pH donné à 4°C. A des temps réguliers, des prélèvements de 5μΙ, sont effectués et l'activité résiduelle de l'enzyme incubée aux différents pli est déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Varian à 44()nm dans un tampon 0.1M citrate/phosphate pH 3.4 à 37°C, en présence de 150μΜ d'ABTS, Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. Les résultats obtenus sont représentés à la Figure 6.
7. Activité en fonction de la température
L'étude de la variation de la constante de vitesse de la réaction en fonction de la température est réalisée dans un tampon 0.1 M citrate/phosphate pH 4 en présence de 0.,5m d'ABTS. La température varie de 15 à 80°C Le suivi de l'activité s'effectue sur un spectrophotomètre Varian CARY UV Biomelt régulé en température. Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. Les résultats obtenus sont représentés à la Figure 7.
8. Stabilité de PeBxy&se en fonction de la température
L "enzyme est préincubée à une concentration de 0.35 mg mï dans un bain à sec à 60°C et à 37°C dans un tampon Potassium phosphate 50 mM. pH 6. A des temps réguliers, des prélèvements de 5μΤ sont effectués et l'activité résiduelle de l'enzyme incubée à ces températures est déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre Varian à 440nm dans un tampon 0.1 M citrate/phosphate pH 3.4 à 37°C, en présence de 150 μ d'ABTS. Le test est déclenché par ajout de l'enzyme. Les résultats obtenus sont représentés à la Figure S. . Eiisde de l'activité eBzymatii e ess présence de NaCi
Pour vérifier j'influence du chlorure de sodium (présent en milieu physiologique) sur l'activité de la Iaccase, des concentrations croissantes en NaCi ont été ajoutées an test d'activité consistant à suivre l'oxydation à 530nm de la SGZ à 37°C dans un tampon phosphate-citrate 50mM pH 7.
Comme le montre la Figure 9 (Effet du NaCi sur ractivlié de la iaccase à pl i 7), en présence de 150mM de NaCi, concentration correspondant aux conditions physiologiques, l'enzyme présente encore 70% d'activité d'oxydation,
10. Mesures éiectrochimiques
Pour démontrer l'avantage de cette nouvelle enzyme et à titre d'exemple comparatif, deux électrodes enzymatiqucs ont été préparées comprenant soit la Iaccase de SEQ. ID. N°3 selon la présente invention, soit la Iaccase de Trametes versicolor (la iaccase communément utilisée en électrochimie) et un polymère redox. A pH 7 et en présence de Cl, le courant cataîytique pour la réduction d'C est 40 % plus important pour l'électrode modifiée avec la nouvelle enzyme. En outre, l stabilité dans le temps est 200% plus importante.
Référesices bibliographiqaes
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2. Bradford, M. M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantifies of protein utiiizing the principîe of protein-d e binding. Anal Biochem, 1976. 72; p. 248-54.
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4. Sakasegawa, S,, et ai., Bilirubin oxidase activity ofBacillus subtilis CotA. Appl Environ Microbiol, 2006. 72( 1 ): p. 972-5.
5. Felsenfeld, G., The détermination of cuprous ion in copper proteins. Àrch Biochem Biophys, 1960. 87: p. 247-51.

Claims

REVENDICATIONS
1. Laccase purifiée caractérisée en ce qu'elle présente ira pourcentage d'identité d'au moins 90% par rapport à la laccase de Podospora anserina de SEQ. ID. N°l ; en ce qu'elle catalyse la réaction d'oxydation de noyaux phenoliques et ers ce qu'elle est liée à quatre atomes de cuivre,
2. Laccase purifiée selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les laccases de séquence SEQ, ID. N°l , 3 et 5.
3. Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour une s accase selon la revendication 1 ou la revendication 2.
4, Molécule d'acide nucléique selon la revendication 2, de séquence choisie parmi la SEQ. ID, N°2 et 4.
5. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend une molécule d'acide nucléique selon la revendication 3 ou 4.
6. Cellule hôte exprimant une laccase selon la revendication L caractérisée en ce qu'elle est transformée avec un vecteur d'expression selon la revendication 5.
7. Procédé de préparation d'une laccase selon la revendication 1 comprenant les étapes de :
a) préparation de cellules hôtes selon la revendication 6 ;
b) mise en culture de cellules hôtes préparées à l'étape a) ;
c) récupération du milieu de culture et élimination desdiles cellules hôtes dans le cas des protéines sécrétées ou lyse des cellules hôtes ;
d) traitement du milieu ou lysat obtenu à l'étape c) par chromatographîe d'interactions hydrophobes ;
e) récupération de ladite laccase purifiée,
caractérisé en ce que ladite cellule hôte préparée à l'étape a) est une souche de levure Pichia pasioris transformée avec le vecteur pFD56 et en ce que l'expression de la laccase est induite par l'ajout de méthanol.
8. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 comme réactif dans une composition de teinture d'oxydation des fibres kératiniques.
9. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 pour la délignification et/ou le blanchiment de pâte à papier.
10. Utilisation de la laccase selon la revendication i ou la revendication 2 comme décolorant, notamment des encres pour papier et du tissu.
1 1. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 pour former des gels par réticulation des protéines dn lactosérum,
12. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou )a revendication 2 comme conservateur de produit alimentaire.
13. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 comme exhausteur de goût de produit alimentaire.
14. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 pour la dépollution des produits à base de phénol.
15. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 dans des compositions détergentes, notamment pour le lavage du linge ou de la vaisselle.
16. Utilisation de la laccase selon ia revendication 1 ou la revendication 2 dans des produits d'hygiène, tel que les déodorants, le savon et le dentifrice.
17. Utilisation de ia laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 pour la production d'éthanol.
18. Utilisation de la laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2 pour i synthèse de composés pharmaceutiques.
19. Electrode à laccase comprenant un matériau conducteur recouvert d'un dépôt comprenant au moins une laccase selon la revendication 1 ou la revendication 2.
20. Biocapteur à oxygène, composés phénoliques ou aminés organiques, caractérisé en ce qu 'il est constitué d'une électrode selon la revendication 1 .
21 . Capteur à oxygène, caractérisé en ce qu'il est constitué d'une électrode selon ia revendication 1 .
22. Biopiîe enzymatique comprenant une anode sur laquelle est immobilisée une enzyme catalysant une réaction d'oxydation et une électrode selon la revendication 19 à titre de cathode.
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