JP2009044997A - ビリルビンオキシダーゼ(bod)の被覆方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ビリルビンオキシダーゼ(BOD)分子の表面に重合性官能基を導入する重合性官能基導入工程と、該重合性官能基と重合性モノマーが共重合をおこす共重合工程と、を17℃以下で行うビリルビンオキシダーゼ(BOD)の被覆方法を提供する。該被覆方法を用いれば、被覆したビリルビンオキシダーゼ(BOD)の酵素活性の低下を抑制しつつ、熱や有機溶媒に対する安定性を向上させることができる。該方法を用いて被覆したビリルビンオキシダーゼ(BOD)は、燃料電池の酵素電極に好適に用いることができる。
【選択図】図1
Description
近年、医薬分野、化粧品分野、食品分野に至る幅広い分野において、タンパク質等の生理活性物質をポリマー等で被覆する技術が開発されている。ドラッグデリバリーシステム等が代表的な一例である。これらの技術は、活性部位の制御、生体内の運搬、安定性・保存性の向上、反応性の制御など様々な目的で用いられている。具体的には、生理活性物質等をポリマー等で被覆し、目的の活性部位などで生理活性物質等を遊離させて活性反応を起こさせるという技術である。
従来、各工程、特に共重合工程は、一定以上の高温でしか反応が進まないのが技術常識であったが、本発明では、その発想を大きく転換し、17℃以下という比較的低温で各工程を行う方法に成功した。
本各工程は、17℃以下で行うが、4℃以上17℃以下で行うとより好適である。
前記重合性官能基は、ビリルビンオキシダーゼ(BOD)分子の表面に導入可能な重合性官能基であれば特に限定されないが、一例としては、アクリロイル基が挙げられる。
前記重合性モノマーは、前記重合性官能基と重合可能な重合性モノマーであれば特に限定されないが、一例としは、アクリルアミドが挙げられる。
本発明に係る被覆方法を用いれば、ビリルビンオキシダーゼ(BOD)を安定化することができる。
例えば、耐熱性を向上させることにより、ビリルビンオキシダーゼ(BOD)を安定化させることが可能である。
また、有機溶媒耐性を向上させることにより、ビリルビンオキシダーゼ(BOD)を安定化させることが可能である。前記有機溶媒は特に限定されないが、例えば、メタノール耐性を向上させることにより、ビリルビンオキシダーゼ(BOD)を安定化させることが可能である。
本発明では、また、本発明に係る被覆方法を用いて被覆されたビリルビンオキシダーゼ(BOD)を提供する。
該ビリルビンオキシダーゼ(BOD)は、公知のあらゆる用途に用いることができるが、一例を挙げると、酵素電極に固定化して触媒として用いることができる。
本発明では、更に、前記酵素電極を少なくとも用いた燃料電池を提供する。
本発明に係る被覆工程では、まず、ビリルビンオキシダーゼ(以下「BOD」と称する。)分子の表面に重合性官能基2を導入する工程を行う。重合性官能基2の導入方法は、公知のあらゆる方法を用いることができる。例えば、BOD表面に存在するアミノ基に、重合性官能基2を有する有機化合物等を共有結合させることで、BOD分子表面に重合性官能基2を導入することができる。
本発明に係る被覆工程では、重合性官能基導入工程Iを経た後、導入した重合性官能基2と重合性モノマーの共重合反応を起こさせる工程を行う。共重合工程IIにおける共重合反応は、公知のあらゆる方法を用いることができる。例えば、分子表面に重合性官能基2を導入したBODに重合開始剤や反応促進剤を加え、BOD分子表面での重合性官能基2同士の共重合を開始させ、そこへ重合性モノマーと架橋剤を加えることにより行うことができる。
本実施例では、重合性官能基の一例として、アクリロイル基の導入を行った。
まず、10mgのBODと、安定剤として1mgの4−ジメチルアミノアンチピリンを100mMのホウ酸溶液(pH9.3)3.8mLに溶解した。次に、0.2mLのジメチルスルホキシド(DMSO(dimethyl sulfoxide))に4.0mgのN−アクリロキシスクシンイミドを溶解し、前記ホウ酸緩衝液にゆっくりと加え、30℃で2時間反応させた。その後、セファデックスG25カラムを用いて、アクリロイル基を導入したBOD(以下「アクリロイル化BOD」と称する。)を精製した。
0.1mg/mLフルオレスアミン(1.5mLのアセトンに溶解)に対し、前記で精製したアクリロイル化BOD(0.1Mのリン酸緩衝液pH8.0に溶解)を0.5mL加え、25℃で7分間反応させた。その後、分光蛍光光度計を用い、励起波長390nm、発光波長483nmにおける蛍光強度を測定した。未反応のアミン残基の量を測定するために、重合性官能基が導入されていないBOD(以下「フリーBOD」と称する。)をコントロールとして用いた。前記で導入したアクリルロイル化BODのアクリルロイル化率は55.9%であった。
バイアルの中で、全体が3.5mLになるようにアクリロイル化BODと4−ジメチルアミノアンチピリンを混ぜ、窒素を除去した。次に、硫酸アンモニウム(3mg)を除酸素した脱イオン水30μLに溶解した溶液と、N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン3μLをバイアルの中に加え、アクリロイル化BODの表面において重合を開始した。
上記で得た被覆BOD1、2、及びフリーBOD1のミカエリス定数(KM)、反応速度定数(kcat)を、以下の表1の条件下で測定した。基質にはABTS(2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt)を用いた。なお、各BODのタンパク量は、BCA colorimetric protein assayを用いて標準タンパク質のBSAの検量線から求めた。
46.5mM、pH7.0のリン酸ナトリウム溶液に、それぞれ被覆BOD1を2.46μM、被覆BOD2を11.8μM、フリーBOD1を1.07μM溶解し、65℃のホットプレート上で熱処理を行った。熱処理後、表3に記載の条件の下、酵素活性を測定した。
本実施例では、重合性官能基の一例としてアクリロイル基の導入を行った。
まず、40mgのBODと、安定剤として1mgのエチレンジアミン四酢酸(EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid))を100mMのホウ酸溶液(pH9.3)3.8mLに溶解した。次に、0.2mLのDMSOに6.0mgのN−アクリロキシスクシンイミドを溶解し、前記ホウ酸緩衝液にゆっくりと加え、4℃で10時間反応させた。その後、4℃下において、セファデックスG25カラムを用いて、アクリロイル基を導入したアクリロイル化BODを精製した。
実施例1と同様の方法でBODのアクリルロイル化率を測定したところ、前記で導入したアクリルロイル化BODのアクリルロイル化率は60.6%であった。
4℃下において、バイアルの中で全体が3.5mLになるようにアクリロイル化BODとEDTAを混ぜ、窒素を除去した。次に、硫酸アンモニウム(3mg)を除酸素した脱イオン水30μLに溶解した溶液と、N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン3μLをバイアルの中に加え、アクリロイル化BODの表面において重合を開始した。
上記で得た被覆BOD3、4、フリーBOD2、及び3のミカエリス定数(KM)、反応速度定数(kcat)を、以下の表4の条件下で測定した。基質にはABTS(2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt)を用いた。なお、各BODのタンパク量は、BCA colorimetric protein assayを用いて標準タンパク質のBSAの検量線から求めた。
46.5mM、pH7.0のリン酸ナトリウム溶液に、それぞれ被覆BOD3を1.14μM、被覆BOD4を1.98μM、フリーBOD2を0.362μM、フリーBOD3を0.377μM溶解し、65℃のホットプレート上で熱処理を行った。熱処理後、表6に記載の条件の下、酵素活性を測定した。
46.5mM、pH7.0のリン酸ナトリウム溶液に、被覆BOD3、4、フリーBOD2、及び3を溶解し、それぞれ約1.9μMになるように調整した。調整溶液を25、40、50、55、60、65、70、75、80℃の各温度のホットプレート上で、10分間熱処理を行った。熱処理後、上記表6に記載の条件の下、酵素活性を測定した。
2 重合性官能基
Claims (11)
- ビリルビンオキシダーゼ(BOD)分子の表面に重合性官能基を導入する重合性官能基導入工程と、
該重合性官能基と重合性モノマーが共重合を起こす共重合工程と、
を17℃以下で行うビリルビンオキシダーゼ(BOD)の被覆方法。 - 4℃以上17℃以下で行うことを特徴とする請求項1記載の被覆方法。
- 前記重合性官能基は、アクリロイル基であることを特徴とする請求項1記載の被覆方法。
- 前記重合性モノマーは、アクリルアミドであることを特徴とする請求項1記載の被覆方法。
- 請求項1記載の被覆方法を用いたビリルビンオキシダーゼ(BOD)の安定化方法。
- 耐熱性を向上させることを特徴とする請求項5の安定化方法。
- 有機溶媒耐性を向上させることを特徴とする請求項5記載の安定化方法。
- 前記有機溶媒は、メタノールであることを特徴とする請求項7記載の安定化方法。
- 請求項1記載の被覆方法を用いて被覆されたビリルビンオキシダーゼ(BOD)。
- 請求項9のビリルビンオキシダーゼ(BOD)を少なくとも固定化した酵素電極。
- 請求項10の酵素電極を少なくとも用いた燃料電池。
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