WO2012153791A1 - 染色剤及びその用途 - Google Patents

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acid
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芳彦 廣瀬
幸秀 佐藤
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天野エンザイム株式会社
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    • C12Y110/03004—O-aminophenol oxidase (1.10.3.4)
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    • C12Y114/18—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with another compound as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.18)
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    • D06P3/04—Material containing basic nitrogen containing amide groups
    • D06P3/14—Wool

Definitions

  • the present invention relates to a staining agent and its use. Specifically, the present invention relates to a staining agent and a staining method using a modified oxidase.
  • This application has priority based on Japanese Patent Application No. 2011-106532 filed on May 11, 2011, priority based on Japanese Patent Application No. 2011-154209 filed on July 12, 2011 And the priority based on Japanese Patent Application No. 2011-263158 filed on Dec. 1, 2011, the entire contents of these patent applications are incorporated by reference.
  • oxidative dyes such as phenylenediamines and aminophenols
  • Dyeing methods using oxidative dyes take advantage of the fact that they can be dyed in various colors, have a long duration, and have a short dyeing time. It is frequently used for dyeing keratin fibers such as hair.
  • hydrogen peroxide has been used for color development of oxidation dyes.
  • hydrogen peroxide is highly irritating and its use damages hair and scalp.
  • attempts have been made to use oxidase instead of hydrogen peroxide (see, for example, Patent Documents 1 to 3).
  • this invention makes it a subject to provide the dyeing
  • bilirubin oxidase which is one of the oxidases
  • modified BO or PMO bilirubin oxidase
  • the use of bilirubin oxidase (referred to as modified BO or PMO) with a positive charge by chemical modification of amines significantly increases the dyeing effect. It was shown to increase. In addition, good dyeability was observed even at a relatively low pH. Furthermore, it became clear that dyeing with modified BO is excellent in shampoo resistance.
  • the present inventors have clarified that the modification of imparting a positive charge by chemical modification of amines is effective for exhibiting a high staining effect.
  • staining using a modified enzyme the characteristic color tone different from the case where an unmodified enzyme is used was obtained. This fact can also be said to be an important and meaningful finding in the application of a staining method using a modifying enzyme and a staining agent.
  • the modified enzyme enhances the staining effect even when an indole compound, which is considered to be higher in safety, is used as a chromogenic substrate.
  • staining with the modified enzyme was excellent in shampoo resistance.
  • the oxidation dye is one or more compounds selected from the group consisting of phenylenediamine, aminophenol, cresol, toluenediamine, naphthol, indole, indoline, and derivatives thereof.
  • the dyeing agent according to claim 1. [8] The oxidation dye is selected from the group consisting of paraphenylenediamine, paraaminophenol, paratoluenediamine, 4-aminoindole, 5-aminoindole, 6-aminoindole, 4-hydroxyindole, and 5,6-dihydroxyindole.
  • the dyeing agent according to any one of [2] to [6], which is one or more compounds.
  • a dyeing method comprising a step of treating a fiber or a fiber processed product with the dyeing agent according to any one of [1] to [9].
  • the staining method according to [12] wherein the treatment is performed under a pH of 7.0 to 8.0.
  • Results of isoelectric focusing for the modified BO. M is a molecular weight marker.
  • the result of the hair dye test 1. The left is a comparison of color differences ( ⁇ E * ab), and the right is a comparison of redness (a *).
  • Results of hair dyeing test 2 (200U / 100g). The left is a comparison of color differences ( ⁇ E * ab), and the right is a comparison of redness (a *).
  • Results of hair dye test 3 (pH 8.0).
  • the left is a comparison of color differences ( ⁇ E * ab), and the right is a comparison of redness (a *).
  • Results of hair dye test 4 (pH 9.0).
  • the left is a comparison of color differences ( ⁇ E * ab), and the right is a comparison of redness (a *).
  • C Results when 4-aminoindole and 5-aminoindole are used as chromogenic substrates.
  • BO, PMO is pH7, H 2 O 2 was compared with the value of when stained with pH9 conditions.
  • 4AI 4-aminoindole
  • 5AI 5-aminoindole. Results of staining test using indole compound as chromogenic substrate. The relationship between the combination of indole compounds and the staining effect was investigated.
  • C Comparison between various combinations (PMO added at 25 U / 100 g) ).
  • 6AI 6-aminoindole
  • 4HI 4-hydroxyindole. The result of the staining test using 5,6-dihydroxyindole, which is an indole compound, as a chromogenic substrate.
  • the 1st aspect of this invention is related with the dyeing agent used for dyeing
  • the dyeing agent of the present invention include fibers, yarns, cloths, woven fabrics and clothing made of keratin, cotton, diacetate, flax, linen, lyocell, polyacryl, polyamide, polyester, ramie, rayon, Tencel (registered trademark) or triacetate. Used for dyeing.
  • the staining agent of the present invention contains an oxidase (hereinafter referred to as “modifying enzyme”) subjected to a predetermined modification.
  • the dyeing agent of the present invention acts on an oxidation dye and exhibits a desired dyeing effect.
  • the dyes of the present invention are used in combination with an oxidative dye.
  • the expression “used in combination” or “combined” means that an oxidation dye and a modifying enzyme are used in combination.
  • the staining agent of the present invention is provided as a composition in which an oxidation dye and a modifying enzyme are mixed.
  • the stain in this embodiment is called a one-component stain.
  • the staining agent of the present invention can also be provided in the form of a kit comprising a first element containing an oxidative dye and a second element containing a modifying enzyme.
  • the dyeing agent in this aspect is called a two-component dyeing agent.
  • each element is provided in a separate container or compartment, and the two elements are mixed for use.
  • the one-part type dyeing agent is superior to the two-part type dyeing agent in that a simpler usage method can be realized as well as a simple constitution.
  • oxidative dye refers to a dye that requires an oxidation reaction for coloring or dyeing.
  • Oxidative dyes include “dye precursors” that themselves develop color by oxidative polymerization and “dye assistants (couplers)” that exhibit a specific color tone by polymerizing with the dye precursor.
  • die assistants coupled to the dye precursor.
  • an appropriate oxidation dye is employed.
  • oxidation dyes are acridine, anthracene, azulene, benben, benzofuran, benzothiazole, benzothiazoline, carboline, carbazole, cinnoline, chroman, chromene, chrysene, fulvene, furan, imidazole, indazole, indene, indole, indoline, india Lysine, isothiazole, isoquinoline, isoxazole, naphthalene, naphthylene, naphthylpyridine, oxazole, perylene, phenanthrene, phenazine, phthalidine, pteridine, purine, pyran, pyrazole, pyrene, pyridazine, pyridazone, pyridine, pyrimidine, pyrrole, quinazoline, quinoline, Quinoxaline, sulfonyl, thiophen
  • aromatic compounds selected from phenylenediamine, aminophenol, cresol, phenol, naphthol, indol or indoline, or derivatives thereof.
  • the derivative is one substituted with one or more functional groups or substituents.
  • Functional groups or substituents that can be introduced here are halogen; sulfo; sulfonate; sulfamino; sulfanyl; amino; amide; nitro; azo; imino; carboxy; cyano; formyl; hydroxy; halocarbonyl; carbamoyl; C1-18 alkyl; C1-18 alkenyl; C1-18 alkynyl; C1-18 alkoxy; C1-18 oxycarbonyl; C1-18 oxoalkyl; C1-18 alkylsulfanyl; C1-18 alkylsulfonyl; Or selected from the group consisting of amino, wherein each C 1-18 alkyl, C 1-18 alkenyl and C 1-18 alkynyl group may be mono-, di- or poly-substituted with any of the above functional groups or substituents And
  • the dyeing agent of the present invention is particularly useful for dyeing keratin fibers (human hair, cows, horses, sheep, goats, alpaca, angora rabbits, etc.).
  • preferred oxidation dyes for constituting the dyeing agent of the present invention for dyeing keratin fibers include paraphenylenediamines, metaphenylenediamines, orthophenylenediamines, paraaminophenols, metaaminophenols, orthoamino.
  • oxidation dyes are paraphenylenediamine, 5-aminoorthocresol, orthoaminophenol, metaaminophenol, paraaminophenol, 2,6-diaminopyridine, and 5- (2-hydroxyethylamino) -2-toluenediamine.
  • oxidation dyes classified as dye precursors paraphenylenediamine, orthoaminophenol, paraaminophenol, paratoluenediamine, 4-aminoindole, 5-aminoindole, 6- Aminoindole, 4-hydroxyindole, 5,6-dihydroxyindole, etc.
  • dye assistants metalphenylenediamine, metaaminophenol, metadiphenol, naphthol, indole, indoline, indazole, etc.
  • the blending amount of the oxidation dye is not particularly limited, and the blending amount may be determined in consideration of the characteristics and use of the oxidation dye to be used.
  • the oxidation dye is added so that the amount becomes 0.01 to 20% by weight, preferably 0.05 to 10% by weight, more preferably 0.01 to 1% by weight, based on the total amount of the dyeing agent.
  • 0.01 to 20% by weight preferably 0.05 to 10% by weight, more preferably 0.01%, based on the total amount of the first element that will contain the oxidation dye.
  • An oxidative dye can be blended so as to be ⁇ 1% by weight.
  • a dye may be directly blended in addition to the oxidation dye. By directly blending the dye, the dyeing effect can be enhanced and the color tone of the dyeing can be adjusted.
  • direct dyes include 2-amino-4-nitrophenol, 2-amino-5-nitrophenol, 1-amino-4-methylaminoanthraquinone, nitro-paraphenylenediamine / hydrochloride, 1,4-diamino Anthraquinone, nitro-paraphenylenediamine, picramic acid, sodium picramate, 2-amino-5-nitrophenol sulfate, resorcinol, nitro-paraphenylenediamine sulfate, paranitro-orthophenylenediamine sulfate, paranitro-meta Phenylenediamine / sulfate, natural orange 6 (2-hydroxy-1,4-naphthoquinone), acid orange 8, acid violet 17, remazol
  • the amount of direct dye is not particularly limited.
  • the dye can be directly blended so as to be, for example, 0.01 to 20% by weight with respect to the total amount of the dyeing agent.
  • a direct dye is blended with the first element that will contain the oxidative dye and / or the second element that will contain the modifying enzyme.
  • the blending amount is, for example, 0.01 to 20% by weight with respect to the total amount of the first element, and is, for example, 0.01 to 20% by weight with respect to the total amount of the second element.
  • two or more direct dyes can be used in combination.
  • Oxidases include catechol oxidase (EC 1.10.3.1), laccase (EC 1.10.3.2), bilirubin oxidase (EC 1.3.3.5), o-aminophenol oxidase (EC 1.10.3.4), ascorbate oxidase (EC 1.10 .3.3) or monophenol oxidase (EC 1.14.18.1) is used.
  • Derived from plants eg, derived from Anacardiacea, derived from Magnifera indica, derived from Schinusmolle, derived from Pleiogynium timoriense, derived from Podocarpacea
  • animals eg, derived from animals, Or derived from bacteria or fungi (eg, derived from Aspergillus, derived from Botrytis, derived from Collybia, derived from Fomes, derived from Lentinus, derived from Myceliophthora, derived from Neurospora , Pleurotus origin, Podospora origin, Scytalidium origin, Trametes origin, Rhizoctonia origin, Humicola brevis bar thermoidea (H. thermoidea) origin, Humicola H brevispore brevis pora) -derived enzyme can be used. Moreover, you may decide to use the enzyme (recombinant enzyme) produced by the gene recombination technique.
  • bilirubin oxidase is employed as the oxidase.
  • the bilirubin oxidase for example, those derived from microorganisms belonging to the genera Miloseces, Coprinus, Penicillium, and Bacillus can be used.
  • Milosecium spp. Include Milosecium Belcaria MT-1, FERM-BP 653 (Agricultural and Biological Chemistry, Vol.
  • Milosecium Vercaria IFO 6113 examples include conserved strains such as 6133, Milosesium velumaria IFO-6351, Milosesium velumaria IFO-9506, Milosesium tinctum IFO-9950, and Milosesium loridum IFO-9531.
  • Examples of the genus Coprinus include conserved strains such as Coprinus cinereus IFO-8371 and Coprinas lagopides IFO-30120.
  • Penicillium spp. include Penicillium Jancineram (see JP-A-63-309187).
  • Bacillus examples include Bacillus riffeniformis (see JP-A-61-209587).
  • a purified preparation of the enzyme bilirubin oxidase can be obtained by subjecting these strains to liquid culture or solid culture by a conventional method and performing extraction, salting out, dialysis, ion exchange, gel filtration and the like from the culture solution.
  • Bilirubin oxidase derived from Shirohirotake (see JP 59-135886), Asteraceae (see JP 62-285782), alfalfa (see JP 6-319536) or a recombinant (special (See Kaihei 5-199882) and these bilirubin oxidases can also be used.
  • Bilirubin oxidase is also commercially available (Amano Enzyme Co., Ltd., Takara Bio Inc., Asahi Kasei Co., Ltd., Sigma-Aldrich® Corporation, etc.), and the commercially available product may be used.
  • the enzyme used in the present invention is positively charged by chemical modification with amines (diamine or polyamine (triamine, tetraamine, etc.) (hereinafter, the enzyme subjected to the modification is referred to as “ Called "modifier”).
  • the positive charge is increased by the addition of the amino group.
  • modification methods are well known, and for example, refer to chemical modification methods for proteins ⁇ top>, ⁇ bottom> (by Academic Publishing Center, Ohno et al.) And protein hybrids (Kyoritsu Publishing, Inada). That's fine.
  • amino acid residues constituting the enzyme are also possible to add a positive charge by substituting a part of amino acid residues constituting the enzyme with other amino acid residues.
  • acidic amino acid residues for example, aspartic acid, glutamic acid
  • neutral amino acids for example, glutamine, asparagine, serine
  • basic amino acids arginine, histidine
  • Lysine Such amino acid residue substitutions include site-directed mutagenesis (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) and random mutagenesis (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 (Cold, Spring, Harbor, Laboratory, Press, New York) can be used.
  • the substitution of amino acid residues as described above is preferably performed on two or more amino acid residues.
  • the enzyme activity may be affected, so depending on the enzyme to be modified, for example, about 2 to 10 amino acid residues are substituted. It is good to apply.
  • amino acid residue to be substituted it may be used as an index whether or not the enzyme activity is affected. That is, it is preferable to perform substitution after specifying amino acid residues that do not affect (or have a low possibility of affecting) enzyme activity using the results of the three-dimensional structure analysis.
  • an amino acid residue located on the surface is a substitution target in terms of the three-dimensional structure.
  • bilirubin oxidase consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 91st Asp, 96th Asp, 126th Glu, 151st Glu, 181st Glu, 233rd Glu, 280th Asp, 323th Asp, 366th Asp, 376th Asp, 408th Asp, 516th Asp, 529th Glu, 538th Glu It becomes a suitable replacement candidate. Accordingly, one or more of these may be substituted with basic amino acids.
  • Whether or not the desired modification has been achieved can be determined by, for example, comparing the isoelectric point (pI) between the enzyme after modification and the enzyme before modification (typically a native enzyme). . That is, as a result of comparing the isoelectric points by isoelectric focusing or the like, if the modified enzyme has a higher isoelectric point than the unmodified enzyme, the desired modification (addition of positive charge) is performed. It can be judged that it was done. On the other hand, in the case of adding an amino group, the presence / absence, degree, etc. of modification can be determined also by quantitative determination of the amino group.
  • the dyeing agent of the present invention may contain an additional component (arbitrary component) in addition to the components described above.
  • Optional components include alkaline compounds, reducing agents such as thiolactic acid, sodium sulfite, N-acetyl-L-cysteine, surfactants, oily components, silicones, thickeners, solvents, water, chelating agents, amino acids, various salts , Moisturizers, preservatives, UV inhibitors, alcohols, polyhydric alcohols, fragrances and the like.
  • an alkaline compound may be contained. According to the dyeing agent containing an alkaline compound, when it is applied, the swelling of keratin fibers is promoted, and the dyeing effect is improved.
  • the blending amount of the alkaline compound is set so that a desired pH (for example, pH 7.0 to 10.0) can be realized during use.
  • An example of the blending amount in the case of a one-component dyeing agent is 0.01 to 20% by weight based on the total amount of the dyeing agent.
  • an alkaline compound is contained in the first element that contains an oxidation dye, and the blending amount is, for example, 0.01% with respect to the total amount of the first element. ⁇ 20% by weight (however, the alkaline component may be contained in the second element, not the first element, or the alkaline compound may be contained in both the first element and the second element) .
  • alkaline compound examples include amine compounds such as monoethanolamine, monoisopropanolamine, triethanolamine, diethanolamine, ammonia, sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium carbonate, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, Inorganic compounds such as potassium bicarbonate can be used.
  • amine compounds such as monoethanolamine, monoisopropanolamine, triethanolamine, diethanolamine, ammonia, sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium carbonate, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, Inorganic compounds such as potassium bicarbonate can be used.
  • the staining agent of the present invention is prepared in the form of paste (cream), aerosol, gel (gel), liquid, foam or the like.
  • a two-component type consisting of a first element (containing an oxidative dye) and a second element (containing a modifying enzyme)
  • the form of the first element and the second element may not be the same.
  • the second aspect of the present invention relates to a staining method using the staining agent of the present invention.
  • the dyeing method of the present invention fibers or fiber processed articles (hereinafter collectively referred to as “materials to be dyed”) are treated with the dyeing agent of the present invention under conditions where oxygen is present (that is, in an oxygen atmosphere).
  • the dyeing agent is diluted as necessary and then applied to the material to be dyed.
  • the material to be dyed is immersed in a solution in which the staining agent is dissolved.
  • the material to be dyed After mixing the first element and the second element (may be diluted or dissolved in a solvent as necessary), it is applied to the material to be dyed. .
  • One element (the first element or the second element) may be applied to the material to be dyed and then the other may be applied to the material to be dyed so that both elements are mixed on the surface of the material to be dyed.
  • the material to be dyed may be immersed in a solution in which the first element and the second element are dissolved.
  • the staining agent and the material to be dyed are in contact. And the said contact state is maintained for the time required for desired dyeing
  • the contact state is maintained for about 10 minutes to 2 hours, preferably about 20 minutes to 1 hour. To do.
  • the pH conditions during treatment depend on the dye used. However, it is also possible to adjust the pH using a separate pH adjuster.
  • the pH during the treatment is, for example, pH 7.0 to 9.0. As shown in Examples described later, when a modified bilirubin oxidase with a positive charge was used, a high staining effect was exhibited even under relatively low pH conditions. Based on this finding, in one embodiment of the present invention, the treatment is performed under conditions of pH 7.0 to pH 8.0. By adopting the conditions, damage to the material to be dyed due to dyeing can be reduced. This condition is particularly effective when dyeing human hair, and can also reduce damage to human hair and irritation to the skin (scalp).
  • the material to be dyed is usually washed and finally dried.
  • water, detergent or the like can be used for the cleaning.
  • drying means include air drying (natural drying), hot air drying, spin drying, suction drying, barrel drying, and the like.
  • the oxidation dye is oxidized and polymerized by the action of the modifying enzyme, and the material to be dyed is dyed.
  • the enzyme used in the present invention since an enzyme is used for the oxidation reaction, damage (damage) of the material to be dyed accompanying the dyeing process is small. In addition, when applied to hair, there is less risk of adverse effects on the scalp (allergic reaction).
  • the enzyme used in the present invention exhibits high affinity for the material to be stained by the above-described modification. Due to this characteristic, the enzymatic reaction (that is, oxidation of the oxidation dye) proceeds efficiently, and the staining effect is improved.
  • the dyeing agent of the present invention enables effective dyeing while reducing the influence on the material to be dyed.
  • the modifying enzyme in the present invention is also useful as a component of a permanent wave agent.
  • a permanent wave agent disulfide in hair (first thioglycolic acid, thioglycolates, cysteine, hydroxycysteine, dihydroxycysteine, acetylated cysteine, sodium sulfite, etc.)
  • the SS bond is broken, and then the hair is treated with a second agent based on an oxidizing agent to re-form the broken SS bond.
  • the oxidizing agent sodium bromate, perborate, hydrogen peroxide, or the like is used.
  • the modifying enzyme of the present invention can be used. When the modifying enzyme of the present invention is used, it is possible to constitute a one-agent type permanent wave agent.
  • the amino group was quantified by the following method. After aligning the amount of protein in the measurement sample (protein range: 0.6-1.0 mg / ml), prepare the prepared sample (0.25 ml), 4% NaHCO 3 (0.25 ml), 0.1% TNBS (0.25 ml) aqueous solution. Mixed. The reaction was carried out at 40 ° C. for 2 hours. 5% SDS (0.25 ml) and 1M HCl (0.125 ml) were added to stop the reaction, and the absorbance at 345 nm was measured. A sample using water instead of the measurement sample was used as a blank, and a value obtained by subtracting the measured value of the blank was used as ⁇ OD. The amount of amino group was quantified with the amount of amino group binding in unmodified BO being 8 (7 for lysine and 1 for N-terminal).
  • ⁇ E * ab is a value calculated by [( ⁇ L) 2 + ( ⁇ a) 2 + ( ⁇ b) 2 ] 1/2 and is a unit generally used in hair color evaluation.
  • ⁇ E * ab is calculated from the difference between the reference value (measured value of white hair before dyeing), L * value, a * value, and b * value.
  • Table 3 shows the relationship between the degree of color difference and ⁇ E * ab. Although it varies depending on the conditions, in the case of a general hair manicure, ⁇ E * ab is about 40, and when using hydrogen peroxide as an oxidizing agent, ⁇ E * ab is 50 or more.
  • BO modified with putrescine has higher staining effect on PPD and PAP than unmodified BO (FIG. 6).
  • those modified with butylamine showed a tendency to increase the staining effect particularly on PTD (FIG. 6).
  • the modified BO has a higher staining effect than the unmodified BO.
  • the difference in staining effect was particularly noticeable at low enzyme concentrations.
  • redness was stronger in the modified BO than in the unmodified BO.
  • the pI of hair is said to be about 5.5, and hair is negatively charged under general dyeing conditions (for example, pH 9.0).
  • general dyeing conditions for example, pH 9.0.
  • the charge of BO was improved.
  • some modified BOs were charged positively (+) even at pH 9.0.
  • the affinity with hair is improved by the effect of electric charge, and as a result, the dyeing effect is considered to be improved.
  • Method (1) Modification of amino group 1000 equivalents of polyamine (putrescine, 3,3'-diaminodipropylamine, agmatine sulfate) and 100 equivalents of N-hydroxysuccinimide with respect to 100 mg of BO And 200 equivalents of water-soluble carbodiimide (EDC) were added, and the mixture was reacted with 20 mM HEPES (pH 6.5) at 10 ° C. for 1 day at 4 ° C. The pH of putrescine and 3,3′-diaminodipropylamine was adjusted with dilute sulfuric acid.
  • polyamine putrescine, 3,3'-diaminodipropylamine, agmatine sulfate
  • EDC water-soluble carbodiimide
  • FIG. 7 shows the results of isoelectric focusing. Untreated samples showed pI4, but all modified samples had improved charge.
  • Table 9 shows the measurement results of specific activity. The specific activity was reduced to about half by the modification.
  • Table 10 shows the quantitative results of the amino group. It can be confirmed that an amino group is added to the modified BO.
  • the modified BO was also found to improve shampoo resistance.
  • indole compounds (4-aminoindole, 5-aminoindole, etc.) that are considered to be highly safe are used as a chromogenic substrate, hair dyeing that is more effective than hydrogen peroxide when using a modified enzyme was possible. Further, depending on the type and combination of indole compounds used, various color tones could be dyed.
  • the staining agent of the present invention is used for dyeing using an oxidation dye.
  • the dyeing agent of the present invention can be applied to various dyeing methods.
  • the present invention is effective for dyeing hair.

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Abstract

　酸化酵素を利用しつつも優れた染色効果が得られる染色方法及びそれに用いられる染色剤を提供することを課題とする。EC 1.10.3.1で特定される酵素、EC 1.10.3.2で特定される酵素、EC 1.3.3.5で特定される酵素、EC 1.10.3.4で特定される酵素、EC 1.10.3.3で特定される酵素、及びEC 1.14.18.1で特定される酵素からなる群より選択される酵素に対して、アミン類の化学修飾により正電荷を付加して得られる修飾酵素を含む染色剤が提供される。また当該染色剤を用いた染色法が提供される。

Description

染色剤及びその用途
　本発明は染色剤及びその用途に関する。詳しくは、修飾された酸化酵素を用いた染色剤及び染色方法に関する。本出願は、２０１１年５月１１日に出願された日本国特許出願第２０１１－１０６５３２号に基づく優先権、２０１１年７月１２日に出願された日本国特許出願第２０１１－１５４２０９号に基づく優先権、及び２０１１年１２月１日に出願された日本国特許出願第２０１１－２６３１５８号に基づく優先権を主張するものであり、これらの特許出願の全内容は参照により援用される。
　フェニレンジアミン類やアミノフェノール類などの酸化染料を利用した染色法は、様々な色調の染色が可能であることや持続期間が長いこと、更には染色時間が短いことなどの利点を活かし、特にヒト毛髪等、ケラチン繊維の染色に頻用されている。従来、酸化染料の発色には過酸化水素が使用されてきた。しかしながら、過酸化水素は刺激性が強く、その使用によって毛髪及び頭皮等が損傷を受ける。このような問題を克服するため、過酸化水素に代えて酸化酵素を使用することが試みられている（例えば特許文献１～３を参照）。
特許第３９４３１３３号公報 特表２０００－５０２７５７号公報 特開２００１－１３９４４１号公報
　過去に報告された酸化酵素を使用した染色方法では、十分な染色効果は得られておらず、実用化には程遠いものであった。そこで本発明は、酸化酵素を利用しつつも優れた染色効果が得られる染色方法、及びそれに用いられる染色剤を提供することを課題とする。
　本発明者らは、酸化酵素を用いた染色方法では材料に対する酵素の親和性が特に重要であるとの考えの下、酸化酵素の一つであるビリルビンオキシダーゼを用いて検討した。ヒト毛髪の染色を例にとり、染色効果の向上を目指して検討を重ねた結果、アミン類の化学修飾によって正電荷を付与したビリルビンオキシダーゼ（修飾BOまたはPMOと呼ぶ）を用いると染色効果が格段に高まることが示された。また、比較的低いpHにおいても良好な染色性を認めた。更には、修飾BOによる染色は耐シャンプー性に優れていることが明らかとなった。このように本発明者らの検討によって、アミン類の化学修飾によって正電荷を付与するという修飾が高い染色効果の発揮に有効であることが明らかとなった。尚、修飾酵素を用いた染色では、未修飾の酵素を使用した場合とは異なる、特徴的な色調が得られた。この事実も、修飾酵素を用いた染色方法及び染色剤の応用を図る上で重要かつ有意義な知見といえる。
　更なる検討の結果、安全性がより高いとされるインドール化合物を発色基質とした場合においても、修飾酵素が染色効果を高めることが判明した。しかも、修飾酵素による染色は耐シャンプー性に優れていた。また、２種類以上のインドール化合物を併用すれば染色の色彩（色調）を調整可能であることも確認できた。
　以下に示す発明は上記成果及び知見に基づく。
　［１］EC 1.10.3.1で特定される酵素、EC 1.10.3.2で特定される酵素、EC 1.3.3.5で特定される酵素、EC 1.10.3.4で特定される酵素、EC 1.10.3.3で特定される酵素、及びEC 1.14.18.1で特定される酵素からなる群より選択される酵素に対して、アミン類の化学修飾により正電荷を付加して得られる修飾酵素を含む染色剤。
　［２］酸化染料を組み合わせてなることを特徴とする、［１］に記載の染色剤。
　［３］前記酸化染料と前記修飾酵素を含有した一剤型である、［２］に記載の染色剤。
　［４］前記酸化染料を含有する第１要素と、前記修飾酵素を含有する第２要素とからなる二剤型である、［２］に記載の染色剤。
　［５］ケラチン繊維の染色用である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の染色剤。
　［６］前記ケラチン繊維がヒト毛髪である、［５］に記載の染色剤。
　［７］前記酸化染料が、フェニレンジアミン、アミノフェノール、クレゾール、トルエンジアミン、ナフトール、インドール、インドリン及びこれらの誘導体からなる群より選択される一以上の化合物である［２］～［６］のいずれか一項に記載の染色剤。
　［８］前記酸化染料が、パラフェニレンジアミン、パラアミノフェノール、パラトルエンジアミン、４－アミノインドール、５－アミノインドール、６－アミノインドール、４－ヒドロキシインドール及び５，６－ジヒドロキシインドールからなる群より選択される一以上の化合物である、［２］～［６］のいずれか一項に記載の染色剤。
　［９］前記酵素がビリルビンオキシダーゼである、［１］～［８］のいずれか一項に記載の染色剤。
　［１０］［１］～［９］のいずれか一項に記載の染色剤で繊維又は繊維加工品を処理するステップを含む染色方法。
　［１１］前記繊維がケラチン繊維である、［１０］に記載の染色方法。
　［１２］前記ケラチン繊維がヒト毛髪である、［１１］に記載の染色方法。
　［１３］pHが7.0～8.0の条件下で前記処理を行う、［１２］に記載の染色方法。
修飾BOについての等電点電気泳動の結果。Ｍは分子量マーカー。 染毛試験１の結果。左は色差（ΔE*ab）の比較、右は赤み度（a*）の比較である。 染毛試験２（200U/100g）の結果。左は色差（ΔE*ab）の比較、右は赤み度（a*）の比較である。 染毛試験３（pH8.0）の結果。左は色差（ΔE*ab）の比較、右は赤み度（a*）の比較である。 染毛試験４（pH9.0）の結果。左は色差（ΔE*ab）の比較、右は赤み度（a*））の比較である。 各種修飾BOの基質特異性（pH9.0、25U/100g）の比較。異なる発色基質（染色基質）を用いた場合の染色性を比較した。PPD：パラフェニレンジアミン、PAP：パラアミノフェノール、PTD：パラトルエンジアミン 各種修飾BOについての等電点電気泳動の結果。レーン１：未修飾BO、レーン２：ジアミン（プトレシン）修飾BO、レーン３：トリアミン（3,3'-ジアミノジプロピルアミン）修飾BO、レーン４：テトラアミン（アグマチン硫酸塩）修飾BO、レーンＭ：分子量マーカー。 各種修飾BOによる染色効果の比較（pH9.0）。左は色差（ΔE*ab）の比較、右は赤み度（a*）の比較である。 各種修飾BOによる染色効果の比較（pH9.0）。各種修飾BOについて、染色後の毛髪を比較して示した。酵素量は25U/100gに統一した。数値は、白髪との色差（ΔE*ab）である（n=3）。値が大きいほど染色効果が高いことを示す。 耐シャンプー試験の結果。洗浄前の毛髪の色差に対する、洗浄後の毛髪の色差（%）を用いて耐シャンプー性を比較した。 耐シャンプー試験の結果。各種修飾BOについて、洗浄前と洗浄後の毛髪を比較して示した。尚、酵素量は25U/100gに統一した。 インドール化合物を発色基質とした染色試験の結果。BO、PMOはpH7、H2O2はpH9の条件で染色した場合の値で比較した。BO：未修飾酵素、PMO：修飾酵素、H2O2：過酸化水素、4AI：４－アミノインドール、5AI:５－アミノインドール。 耐シャンプー試験の結果。インドール化合物を発色基質として染色した後に洗浄した。BO（未修飾酵素）、PMO（修飾酵素）及びH2O2（過酸化水素）について、耐シャンプー性（堅牢度）を比較・評価した。BO、PMOはpH7、H2O2はpH9の条件で染色した場合の値で比較した。Ａ：４－アミノインドールを発色基質とした場合の結果、Ｂ：５－アミノインドールを発色基質とした場合の結果、Ｃ：４－アミノインドールと５－アミノインドールを発色基質とした場合の結果。 インドール化合物を発色基質とした染色試験の結果。酵素濃度と染色効果の関係を調べた。BO、PMOはpH7、H2O2はpH9の条件で染色した場合の値で比較した。4AI：４－アミノインドール、5AI:５－アミノインドール。 インドール化合物を発色基質とした染色試験の結果。インドール化合物の組合せと染色効果の関係を調べた。BO、PMOはpH7、H2O2はpH9の条件で染色した場合の値で比較した。4AI：４－アミノインドール、5AI:５－アミノインドール、6AI：６－アミノインドール、4HI：４－ヒドロキシインドール。 インドール化合物を発色基質とした染色試験の結果（pH7.0）。異なるインドール化合物を様々な組合せで併用し、色彩の変化を調べた。4AI：４－アミノインドール、5AI:５－アミノインドール、6AI：６－アミノインドール、4HI：４－ヒドロキシインドール。－：酵素なし、＋酵素あり（PMOを25U/100g添加）。 耐シャンプー試験の結果。異なるインドール化合物を様々な組合せで併用し、耐シャンプー性を比較した。Ａ：５－アミノインドールを発色基質とした場合の結果、Ｂ：４－アミノインドールと５－アミノインドールを発色基質として併用した場合の結果、Ｃ：各種組合せ間の比較（PMOを25U/100g添加）。4AI：４－アミノインドール、5AI:５－アミノインドール、6AI：６－アミノインドール、4HI：４－ヒドロキシインドール。 インドール化合物である５，６－ジヒドロキシインドールを発色基質とした染色試験の結果。pH7.0の条件で染色した場合（左）とpH9.0の条件で染色した場合（右）について、過酸化水素（H2O2）、BO（未修飾酵素）及びPMO（修飾酵素）の間で染色結果（色差ΔE*ab）を比較した。 インドール化合物である５，６－ジヒドロキシインドールを発色基質とした染色試験の結果。pH7.0の条件で染色した場合（左）とpH9.0の条件で染色した場合（右）について、酵素量と染色効果（色差ΔE*ab）の関係を、BO（未修飾酵素）とPMO（修飾酵素）の間で比較した。 インドール化合物である５，６－ジヒドロキシインドールを発色基質とした染色試験の結果。各種酸化剤（BO：未修飾酵素、PMO：修飾酵素、H2O2：過酸化水素）を使用して毛髪をpH7.0で染色し、比較した。コントロールは処理前の毛髪である。BO及びPMOは25U/100g添加した。また、H2O2は3%（終濃度）添加した。数値は、白髪との色差（ΔE*ab）である。
１．染色剤
　本発明の第１の局面は繊維又は繊維加工品の染色に用いられる染色剤に関する。本発明の染色剤は例えばケラチン、綿、ジアセテート、亜麻、リンネル、リオセル、ポリアクリル、ポリアミド、ポリエステル、ラミー、レーヨン、テンセル（登録商標）又はトリアセテートからなる繊維、糸、布、織物又は衣類などの染色に利用される。本発明の染色剤は、所定の修飾が施された酸化酵素（以下、「修飾酵素」と呼ぶ）を含む。本発明の染色剤は酸化染料に対して作用し、所望の染色効果を発揮する。従って、典型的には、本発明の染色剤を酸化染料と組み合わせて用いる。本明細書において表現「組み合わせて用いる」又は「組み合わせてなる」とは、酸化染料と修飾酵素が併用されることをいう。一態様として、本発明の染色剤は、酸化染料と修飾酵素が混合された組成物として提供される。当該態様の染色剤を一剤型染色剤と呼ぶ。一方、酸化染料を含む第１要素と、修飾酵素を含む第２要素とからなるキットの形態で本発明の染色剤を提供することもできる。当該態様の染色剤を二剤型染色剤と呼ぶ。二剤型染色剤の場合には各要素が別々の容器又は区画に収容された状態で提供され、使用に際して二つの要素が混合される。尚、一剤型染色剤は簡素な構成となることはもとより、より簡便な使用方法を実現できる点において二剤型染色剤に勝るといえる。
（１）染料
　本明細書において用語「酸化染料」とは、発色ないし染色に酸化反応が必要な染料のことをいう。酸化染料にはそれ自体が酸化重合して発色する「染料前駆体」と、染料前駆体と重合することによって特有の色調を呈する「染料助剤（カップラー）」が含まれる。本発明の染色剤の用途に応じて、適切な酸化染料が採用される。酸化染料の例を挙げればアクリジン、アントラセン、アズレン、ベンベン、ベンゾフラン、ベンゾチアゾール、ベンゾチアゾリン、カルボリン、カルバゾール、シンノリン、クロマン、クロメン、クリセン、フルベン、フラン、イミダゾール、インダゾール、インデン、インドール、インドリン、インドリジン、イソチアゾール、イソキノリン、イソキサゾール、ナフタレン、ナフチレン、ナフチルピリジン、オキサゾール、ペリレン、フェナントレン、フェナジン、フタリジン、プテリジン、プリン、ピラン、ピラゾール、ピレン、ピリダジン、ピリダゾン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、キナゾリン、キノリン、キノキサリン、スルホニル、チオフェン、トリアジン又はこれらの誘導体若しくは置換体、３，４－ジエトキシアニリン、２－メトキシ－ｐ－フェニレンジアミン、１－アミノ－４－ｂ－メトキシエチルアミノ－ベンゼン（Ｎ－ｂ－メトキシエチル－ｐ－フェニレンジアミン）、１－アミノ－４－ビス－（ｂ－ヒドロキシエチル）－アミノベンゼン（Ｎ，Ｎ－ビス－（ｂ－ヒドロキシエチル）－ｐ－フェニレンジアミン、２－メチル－１，３－ジアミノ－ベンゼン（２，６－ジアミノトルエン）、２，４－ジアミノトルエン、２，６－ジアミノトルエン、１－アミノ－４－スルホナト－ベンゼン、１－Ｎ－メチルスルホナト－４－アミノベンゼン、１－メチル－２－ヒドロキシ－４－アミノベンゼン（３－アミノｏ－クレゾール）、１－メチル－２－ヒドロキシ－４－ｂ－ヒドロキシエチルアミノベンゼン（２－ヒドロキシ－４－ｂ－ヒドロキシエチルアミノートルエン）、１－ヒドロキシ－４－メチルアミノ－ベンゼン（ｐ－メチルアミノフェノール）、１－メトキシ－２，４－ジアミノ－ベンゼン（２，４－ジアミノアニソール）、１－エトキシ－２，３－ジアミノ－ベンゼン（２，４－ジアミノフェネトール）、１－ｂ－ヒドロキシエチルオキシ－２，４－ジアミノ－ベンゼン（２，４－ジアミノフェノキシエタノール）、１，３－ジヒドロキシ－２－メチルベンゼン（２－メチルレソルシノール）、１，２，４－トリヒドロキシベンゼン、１，２，４－トリヒドロキシ－５－メチルベンゼン（２，４，５－トリヒドロキシトルエン）、２，３，５－トリヒドロキシトルエン、４，８－ジスルホナト－１－ナフトール、３－スルホナト－６－アミノ－１－ナフトール（Ｊ酸）、６，８－ジスルホナト－２－ナフトール、１，４－フェニレンジアミン、２，５－ジアミノトルエン、２－クロロ－１，４－フェニレンジアミン、２－アミノフェノール、３－アミノフェノール、４－アミノフェノール、１，３－フェニレンジアミン、１－ナフトール、２－ナフトール、４－クロロレソルシノール、１，２，３－ベンゼントリオール（ピロガロール）、１，３－ベンゼンジオール（レソルシノール）、１，２－ベンゼンジオール（ピロカテコール）、２－ヒドロキシ－シンナミン酸、３－ヒドロキシ－シンナミン酸、４－ヒドロキシ－シンナミン酸、２，３－ジアミノ安息香酸、２，４－ジアミノ安息香酸、３，４－ジアミノ安息香酸、３，５－ジアミノ安息香酸、メチル２，３－ジアミノベンゾエート、エチル２，３－ジアミノベンゾエート、イソプロピル２，３－ジアミノベンゾエート、メチル２，４－ジアミノベンゾエート、エチル２，４－ジアミノベンゾエート、イソプロピル２，４－ジアミノベンゾエート、メチル３，４－ジアミノベンゾエート、エチル３，４－ジアミノベンゾエート、イソプロピル３，４－ジアミノベンゾエート、メチル３，５－ジアミノベンゾエート、エチル３，５－ジアミノベンゾエート、イソプロピル３，５－ジアミノベンゾエート、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジアミノ安息香酸アミド、Ｎ，Ｎ－ジエチル－３，４－ジアミノ安息香酸アミド、Ｎ，Ｎ－ジプロピル－３，４－ジアミノ安息香酸アミド、Ｎ，Ｎ－ジブチル－３，４－ジアミノ安息香酸アミド、４－クロロ－１－ナフトール、Ｎ－フェニル－ｐ－フェニレンジアミン、３，４－ジヒドロキシベンズアルデヒド、ピロル、ピロル－２－イソノミダゾール、１，２，３－トリアゾール、ベンゾトリアゾール、ベンズイミダゾール、イミダゾール、インドール、１－アミノ－８－ヒドロキシナフタレン－４－スルホン酸（Ｓ酸）、４，５－ジヒドロキシナフタレン－２，７－ジスルホン酸（クロモトロビン酸）、アントラ二リン酸、４－アミノ安息香酸（PABA）、２－アミノ－８－ナフトール－６－スルホン酸（ガンマー酸）、５－アミノ－１－ナフトール－３－スルホン酸（Ｍ酸）、２－ナフトール－３，６－ジスルホン酸（Ｒ酸）、１－アミノ－８－ナフトール－２，４－ジスルホン酸（シカゴ酸）、１－ナフトール－４－スルホン酸（ネビル－ウィンサー酸）、ペリ酸、Ｎ－ベンゾイルＪ酸、Ｎ－フェニルＪ酸、１，７－クレベス酸、１，６－クレベス酸、ボン酸、ナフトールAS、ディスパースブラック９、ナフトールAS OL、ナフトールAS PH、ナフトールAS KB、ナフトールAS BS、ナフトールAS D、ナフトールAS B1、モルダントブラック3CI 14640（エリオクロムブルーブラックＢ）、４－アミノ－５－ヒドロキシ－２，６－ナフタレンジスルホン酸（Ｈ酸）、ファットブラウンRRソルベントブラウン１（CI 11285）、ヒドロキノン、マンデリン酸、メラミン、o-ニトロベンズアルデヒド、１，５－ジヒドロキシナフタレン、２，６－ジヒドロキシナフタレン、２，３－ジヒドロキシナフタレン、ベンジルイミダゾール、２，３－ジアミノナフタレン、１，５－ジアミノナフタレン、１，８－ジアミノナフタレン、サリチル酸、３－アミノサリチル酸、４－アミノサリチル酸、５－アミノサリチル酸、メチル－３－アミノサリチレート、メチル－４－アミノサリチレート、メチル－５－アミノサリチレート、エチル－３－アミノサリチレート、エチル－４－アミノサリチレート、エチル－５－アミノサリチレート、プロピル－３－アミノサリチレート、プロピル－４－アミノサリチレート、プロピル－５－アミノサリチレート、サリチル酸アミド、４－アミノチオフェノール、４－ヒドロキシチオフェノール、アニリン、４，４’－ジアミノジフェニルアミンスルフェート、４－フェニルアゾアニリン、４－ニトロアニリン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，４－フェニレンジアミン、Ｎ，Ｎ－ジエチル－１，４－フェニレンジアミン、ディスパースオレンジ３、ディスパースイエロー９、ディスパースブルー１、Ｎ－フェニル－１，２－フェニレンジアミン、６－アミノ－２－ナフトール、３－アミノ－２－ナフトール、５－アミノ－１－ナフトール、１，２－フェニレンジアミン、２－アミノピリミジン、４－アミノキナルジン、２－ニトロアニリン、３－ニトロアニリン、２－クロロアニリン、３－クロロアニリン、４－クロロアニリン、４－（フェニルアゾ）レソルシノール（スーダンオレンジＧ、CI11920）、スーダンレッドＢ、CI 26110、スーダンレッドＢ、CI 26050、４’－アミノアセトアニリド、アリザリン、１－アントラミン（１－アミノアントラセン）、１－アミノアントラキノン、アントラキノン、２，６－ジヒドロキシアントラキノン（アントラフラビン酸）、１，５－ジヒドロキシアントラキノン（アントラルフィン）、３－アミノピリジン（ニコチンアミド）、ピリジン－３－カルボン酸（ニコチン酸）、モーダントイエロー１、アリザリンイエローGG、GI 14025、クマジーブルーグレー、アシドブラック48、CI 65005、パランチンファストブラック WAN、アンドブラック52、CI 15711、バランチンクロムブラック 6BN、CI 15705、エリオクロムブルーブラックＲ、モルダンドブラック11、エリオクロムブラックＴ、ナフトールブルーブラック、アシドブラック１、 CI 20470、１，４－ジヒドロキシアントラキノン（キニザリン）、４－ヒドロキシクマリン、ウンベリフェロン、７－ヒドロキシクマリン、エスクレチン６，７－ジヒドロキシクマリン、クマリン、クロモトロープ２Ｂアシドレッド 176、CI 1657、クロモトロープ２Ｂアシドレッド29、CI 16570、クロモトロープFBアシドレッド14、CI 14720、２，６－ジヒドロキシイソニコチン酸、シトラジニン酸、２，５－ジクロロアニリン、２－アミノ－４－クロロトルエン、２－ニトロ－４－クロロアニリン、２－メトキシ－４－ニトロアニリン、ｐ－ブロモフェノールである。好ましくは、フェニレンジアミン、アミノフェノール、クレゾール、フェノール、ナフトール、イノドール又はインドリンから選択される芳香族化合物、又はこれらの誘導体である。ここで誘導体とは1又は複数の官能基又は置換基で置換されたものである。ここで導入されうる官能基又は置換基はハロゲン；スルホ；スルホナト；スルファミノ；スルファニル；アミノ；アミド；ニトロ；アゾ；イミノ；カルボキシ；シアノ；ホルミル；ヒドロキシ；ハロカルボニル；カルバモイル；カルバミドイル；ホスホナト；ホスホニル；Ｃ1-18アルキル；Ｃ1-18アルケニル；Ｃ1-18アルキニル；Ｃ1-18アルコキシ；Ｃ1-18オキシカルボニル；Ｃ1-18オキソアルキル；Ｃ1-18アルキルスルファニル；Ｃ1-18アルキルスルホニル；Ｃ1-18アルキルイミノ又はアミノより成る群から選ばれ、ここで各Ｃ1-18アルキル、Ｃ1-18アルケニル及びＣ1-18アルキニル基は任意の上記の官能基又は置換基により一、二又は多置換されていてもよいものとする。
　本発明の染色剤はケラチン繊維（ヒトの毛髪、ウシ、ウマ、羊、ヤギ、アルパカ、アンゴラウサギ等の毛等）の染色に特に有用である。ケラチン繊維の染色用として本発明の染色剤を構成する場合に好ましい酸化染料の例を挙げればパラフェニレンジアミン類、メタフェニレンジアミン類、オルトフェニレンジアミン類、パラアミノフェノール類、メタアミノフェノール類、オルトアミノフェノール類、ピリジン誘導体、ピリミジン誘導体、ピラゾール誘導体、メタジフェノール類、ナフトール類、インドリン誘導体、インドール誘導体及びこれらの酸付加塩（酸付加塩として例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、又は酢酸塩等を用いてもよい。）、インドリン化合物、インドール化合物である。これらの酸化染料の具体例はパラフェニレンジアミン、５－アミノオルトクレゾール、オルトアミノフェノール、メタアミノフェノール、パラアミノフェノール、２，６－ジアミノピリジン、５－（２－ヒドロキシエチルアミノ）－２－トルエンジアミン、Ｎ，Ｎ－ビス（β－ヒドロキシ）－パラフェニレンジアミン硫酸塩、パラニトロ－オルトフェニレンジアミン、パラニトロ－２’，４’－ジアミノアゾベンゼン・硫酸ナトリウム、トルエン－２，５－ジアミン、５－アミノオルトクレゾール・硫酸塩、パラアミノフェノール・硫酸塩、オルトクロロ－パラフェニレンジアミン・硫酸塩、４，４’－ジアミノジフェニルアミン・硫酸塩、パラメチルアミノフェノール・硫酸塩、パラフェニレンジアミン・硫酸塩、メタフェニレンジアミン・硫酸塩、トルエン－２，５－ジアミン・硫酸塩、２，４－ジアミノフェノキシエタノール・塩酸塩、トルエン－２，５－ジアミン・塩酸塩、メタフェニレンジアミン・塩酸塩、２，４－ジアミノフェノール・塩酸塩、３，３’－イミノジフェノール、パラフェニレンジアミン・塩酸塩、Ｎ－フェニル－パラフェニレンジアミン・塩酸塩、Ｎ－フェニル－パラフェニレンジアミン・酢酸塩、１，５－ジヒドロキシナフタレン、トリレン－３，４－ジアミン、パラメチルアミノフェノール、Ｎ，Ｎ’－ビス（４－アミノフェニル）－２，５－ジアミノ－１，４－キノンジイミン、オルトアミノフェノール・硫酸塩、２，４－ジアミノフェノール・硫酸塩、メタアミノフェノール・硫酸塩、パラトルエンジアミン、インドリン、５，６－ジヒドロキシインドリン、Ｎ－メチル－５，６－ジヒドロキシインドリン、Ｎ－エチル－５，６－ジヒドロキシインドリン、Ｎ－ブチル－５，６－ジヒドロキシインドリン、４－ヒドロキシ－５－メトキシインドリン、６－ヒドロキシ－７－メトキシインドリン、６，７－ジヒドロキシインドリン、４，５－ジヒドロキシインドリン、４－メトキシ－６－ヒドロキシインドリン、Ｎ－ヘキシル－５，６－ジヒドロキシインドリン、２－メチル－５，６－ジヒドロキシインドリン、３－メチル－５，６－ジヒドロキシインドリン、４－ヒドロキシインドリン、２，３－ジメチル－５，６－ジヒドロキシインドリン、２－メチル－５－エチル－６－ヒドロキシインドリン、２－メチル－５－ヒドロキシ－６－β－ヒドロキシエチルインドリン、４－ヒドロキシプロピルインドリン、２－ヒドロキシ－３－メトキシインドリン、６－ヒドロキシ－５－メトキシインドリン、６－ヒドロキシインドリン、５－ヒドロキシインドリン、７－ヒドロキシインドリン、７－アミノインドリン、５－アミノインドリン、４－アミノインドリン、５，６－ジヒドロキシインドリンカルボン酸、１－メチル－５，６－ジヒドロキシインドリン、４，５－ジヒドロキシインドール、５，６－ジヒドロキシインドール、６，７－ジヒドロキシインドール、Ｎ－メチル－５，６－ジヒドロキシインドール、Ｎ－エチル－５，６－ジヒドロキシインドール、Ｎ－ヘキシル－５，６－ジヒドロキシインドール、２－メチル－５，６－ジヒドロキシインドール、３－メチル－５，６－ジヒドロキシインドール、４－ヒドロキシインドール、２，３－ジメチル－５，６－ジヒドロキシインドール、２－メチル－５－エチル－６－ヒドロキシインドール、２－メチル－５－ヒドロキシ－６－β－ヒドロキシエチルインドール、４－ヒドロキシプロピルインドール、２－ヒドロキシ－３－メトキシインドール、４－ヒドロキシ－５－メトキシインドール、６－ヒドロキシ－７－メトキシインドール、６－ヒドロキシ－５－メトキシインドール、６－ヒドロキシインドール、５－ヒドロキシインドール、７－ヒドロキシインドール、７－アミノインドール、６－アミノインドール、５－アミノインドール、４－アミノインドール、５，６－ジヒドロキシインド－ルカルボン酸、１－メチル－５，６－ジヒドロキシインドールである。
　本発明の染色剤には１種又は２種以上の酸化染料が用いられる。２種以上の酸化染料の併用は、例えば、染色効果の向上や色彩（色調）の調整等に有効である。ケラチン繊維の染色用に構成する場合には特に、染料前駆体に分類される酸化染料（パラフェニレンジアミン、オルトアミノフェノール、パラアミノフェノール、パラトルエンジアミン、４－アミノインドール、５－アミノインドール、６－アミノインドール、４－ヒドロキシインドール、５，６－ジヒドロキシインドールなど）と染料助剤に分類される酸化染料（メタフェニレンジアミン、メタアミノフェノール、メタジフェノール、ナフトール、インドール、インドリン、インダゾールなど）を併用するとよい。
　酸化染料の配合量は特に限定されず、使用する酸化染料の特性や用途等を考慮して配合量を決定すればよい。一剤型染色剤の場合、染色剤全量に対して例えば０．０１～２０重量％、好ましくは０．０５～１０重量％、更に好ましくは０．０１～１重量％となるように酸化染料を配合することができる。二剤型染色剤の場合には、酸化染料を含有することになる第１要素全量に対して例えば０．０１～２０重量％、好ましくは０．０５～１０重量％、更に好ましくは０．０１～１重量％となるように酸化染料を配合することができる。
　染色に寄与する成分として、酸化染料に加えて直接染料を配合することにしてもよい。直接染料を配合することにより、染色効果を高めたり、染色の色調を調整したりすることができる。直接染料の例を挙げると、２－アミノ－４－ニトロフェノール、２－アミノ－５－ニトロフェノール、１－アミノ－４－メチルアミノアントラキノン、ニトロ－パラフェニレンジアミン・塩酸塩、１，４－ジアミノアントラキノン、ニトロ－パラフェニレンジアミン、ピクラミン酸、ピクラミン酸ナトリウム、２－アミノ－５－ニトロフェノール・硫酸塩、レゾルシノール、ニトロ－パラフェニレンジアミン・硫酸塩、パラニトロ－オルトフェニレンジアミン・硫酸塩、パラニトロ－メタフェニレンジアミン・硫酸塩、ナチュラルオレンジ６（２－ヒドロキシ－１，４－ナフトキノン）、アシッドオレンジ８、アシッドバイオレット１７、レマゾールブリリアントブルー、エバンスブルー、アシッドブルー８０である。
　直接染料の配合量も特に限定されない。一剤型染色剤の場合、染色剤全量に対して例えば０．０１～２０重量％となるように直接染料を配合することができる。二剤型染色剤の場合には、酸化染料を含有することになる第１要素及び／又は修飾酵素を含有することになる第２要素に直接染料が配合される。この場合の配合量は第１要素全量に対して例えば０．０１～２０重量％、第２要素全量に対して例えば０．０１～２０重量％である。尚、酸化染料と同様、直接染料も２種類以上の併用が可能である。
（２）修飾酵素
　本発明では、天然の状態（ネイティブ）と比較して、保有する正電荷が増加している酸化酵素を用いる。換言すれば、正電荷が付加されるように修飾した酸化酵素が用いられる。酸化酵素には、カテコールオキシダーゼ（EC 1.10.3.1）、ラッカーゼ（EC 1.10.3.2）、ビリルビンオキシダーゼ（EC1.3.3.5）、o-アミノフェノールオキシダーゼ（EC 1.10.3.4）、アスコルビン酸オキシダーゼ（EC 1.10.3.3）、又はモノフェノールオキシダーゼ（EC 1.14.18.1）が用いられる。植物由来（例えば、アナカルジアセア(Anacardiacea）由来、マグニフェラ・インディカ(Magnifera indica)由来、シュイナス・モレ(Schinusmolle)由来、プレイオジニウム・ティモリエンス(Pleiogynium timoriense)由来、ポドカルパセア(Podocarpacea)由来）、動物由来、或いは細菌又は真菌由来（例えば、アスペルギルス（Aspergillus）由来、ボツリチス（Botrytis）由来、コリビア（Collybia）由来、ホメス（Fomes）由来、レンチヌス（Lentinus）由来、ミセリオフソラ（Myceliophthora）由来、ニューロスポラ（Neurospora）由来、プレウロトゥス（Pleurotus）由来、ポドスポラ（Podospora）由来、シタリジウム（Scytalidium）由来、トラメテス（Trametes）由来、リゾクトニア（Rhizoctonia）由来、フミコラ・ブレビス・バー・サーモイデア（H. thermoidea）由来、フミコラ・ブレビスポラ（H. brevispora）由来）の酵素を用いることができる。また、遺伝子組換え技術によって生産された酵素（組換え酵素）を用いることにしてもよい。
　本発明の好ましい一態様では、酸化酵素としてビリルビンオキシダーゼが採用される。ビリルビンオキシダーゼは、例えば、ミロセシウム属、コプリナス属、ペニシリウム属、バチルス属に属する微生物由来のものを用いることができる。ミロセシウム属菌としては、ミロセシウム・ベルカリアMT-1、FERM-BP 653（アグリカルチュラル　アンド　バイオロジカル　ケミストリー、第45巻、2383-2384頁(1981年）参照）、ミロセシウム・ベルカリアIFO 6113、ミロセシウム・ベルカリアIFO 6133、ミロセシウム・ベルカリアIFO 6351、ミロセシウム・ベルカリアIFO 9056、ミロセシウム・チンクタムIFO 9950、ミロセシウム・ロリダムIFO 9531等の保存菌株が挙げられる。また、コプリナス属菌としては、コプリナス・シネレウスIFO 8371、コプリナス・ラゴピデスIFO 30120等の保存菌株が挙げられる。ペニシリウム属菌としてはペニシリウム・ジャンシネラム（特開昭63-309187を参照）が挙げられる。バチルス属菌としてはバチルス・リフェニフォルミス（特開昭61-209587を参照）が挙げられる。これらの菌株を常法により液体培養又は固体培養し、その培養液から抽出、塩析、透析、イオン交換、ゲルろ過などを行うことにより酵素ビリルビンオキシダーゼの精製標品を得ることができる。一方、スエヒロタケ由来（特開昭59-135886を参照）、キク科植物由来（特開昭62-285782を参照）、アルファルファ由来（特開平6-319536を参照）のビリルビンオキシダーゼや、組み換え体（特開平5-199882を参照）も知られており、これらのビリルビンオキシダーゼを使用することもできる。また、ビリルビンオキシダーゼは市販もされており（天野エンザイム株式会社、タカラバイオ株式会社、旭化成株式会社、Sigma-Aldrich Corporation等）、当該市販品を用いることにしてもよい。
　本発明に使用する酵素には、アミン類（ジアミン又はポリアミン（トリアミン、テトラアミンなど））を用いた化学修飾により、正電荷が付加されている（以下、当該修飾が施された酵素のことを「修飾酵素」と呼ぶ）。換言すれば、アミノ基の付加により正電荷が増大している。このような修飾の手法自体は周知であり、例えば、蛋白質の化学修飾法<上>,<下>（学会出版センター、大野ら著）やタンパク質ハイブリッド（共立出版、稲田編）等を参考にすればよい。化学修飾に利用可能なアミン類の例を挙げればn-ブチルアミン、エチレンジミン、プトレシン、3,3'-ジアミノジプロピルアミン、アグマチン、N,N'-ビス(3-アミノプロピル)-1,4-ブタンジアミン、ビス(ヘキサメチレン)トリアミン、1,5-ジアミノペンタン、ジエチレントリアミン、スペルミン、スペルジン、またはそれらの塩等である。
　酵素を構成するアミノ酸残基の一部を他のアミノ酸残基に置換することによっても、正電荷を付加することが可能である。具体的には、遺伝子工学的手法を用い、構成アミノ酸残基の内、酸性アミノ酸残基（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）を中性アミノ酸（例えばグルタミン、アスパラギン、セリン）または塩基性アミノ酸（アルギニン、ヒスチジン、リジン）に置換すればよい。このようなアミノ酸残基の置換には、位置指定突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13 ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）を利用することができる。
　正電荷の付加量を多くするため、好ましくは、上記の如きアミノ酸残基の置換を２以上のアミノ酸残基に対して行う。但し、置換するアミノ酸残基の数が多すぎると、酵素活性に影響を及ぼすおそれがあることから、修飾対象の酵素にもよるが、例えば２～１０個程度のアミノ酸残基に対して置換を施すとよい。
　置換するアミノ酸残基の選定・特定においては、酵素活性に影響するか否かを指標にするとよい。即ち、立体構造解析の結果などを利用し、酵素活性に影響しない（又は影響する可能性が低い）アミノ酸残基を特定した上で置換を施すと良い。一方、立体構造上、表面に位置するアミノ酸残基を置換の標的にすることが好ましい。ここで、アミノ酸残基の置換による修飾の具体例を示すと、配列番号１のアミノ酸配列からなるビリルビンオキシダーゼの場合、91番目のAsp、96番目のAsp、126番目のGlu、151番目のGlu、181番目のGlu、233番目のGlu、280番目のAsp、323番目のAsp、366番目のAsp、376番目のAsp、408番目のAsp、516番目のAsp、529番目のGlu、538番目のGluが好適な置換候補となる。従って、これらの内の一又は二以上を塩基性アミノ酸に置換するとよい。
　所望の修飾が達成されたか否かは、例えば、修飾後の酵素と修飾前の酵素（典型的にはネイティブの酵素）との間で等電点（pI）を比較することによって判断すればよい。即ち、等電点電気泳動などによって等電点を比較した結果、修飾前の酵素よりも修飾後の酵素の方が等電点が高いようであれば、所望の修飾（正電荷の付加）が行われたと判断できる。一方、アミノ基を付加する場合においては、アミノ基の定量によっても修飾の有無、程度などを判断することができる。
　上記の修飾に加えて他の修飾が施されている酵素を用いることにしてもよい。ここでの「他の修飾」として水溶性高分子物質（ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、多糖類、部分加水分解又は部分半エステル化されたスチレンと無水マレイン酸との共重合体、部分加水分解又は部分半エステル化されたジビニルエーテルと無水マレイン酸との共重合体、部分加水分解又は部分半エステル化されたアクリル酸と無水マレイン酸との共重合体、フィコール、ポリアミノ酸、アルブミン等）による化学修飾（特開昭64-60375）やアクリロイル基による修飾（特開2009-044997）等を挙げることができる。「他の修飾」の目的は特に限定されない。例えば、酵素の安定性、活性及び／又は保存性の向上、或いは基質特異性の改変等を目的として「他の修飾」が行われる。
（３）その他の成分
　本発明の染色剤には、上記の各成分の他、追加の成分（任意成分）が含有され得る。任意成分として、アルカリ性化合物、チオ乳酸、亜硫酸ナトリウム、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン等の還元剤、界面活性剤、油性成分、シリコーン類、増粘剤、溶剤、水、キレート剤、アミノ酸、各種塩類、保湿剤、防腐剤、紫外線防止剤、アルコール、多価アルコール、香料等を例示することができる。
　本発明の染色剤をケラチン繊維の染色用として構成する場合においては、アルカリ性化合物を含有させるとよい。アルカリ性化合物を含有した染色剤によれば、それを適用した際、ケラチン繊維の膨潤が促され、染色効果が向上する。アルカリ性化合物の配合量は、使用の際に所望のpH（例えばpH7.0～10.0）を実現できるように設定される。一剤型染色剤の場合の配合量の例は染色剤全量に対して０．０１～２０重量％である。一方、二剤型染色剤の場合には、原則、酸化染料を含有することになる第１要素にアルカリ性化合物を含有させることになり、配合量としては例えば第１要素全量に対して０．０１～２０重量％である（但し、第１要素ではなく第２要素にアルカリ性化合物を含有させることにしても、或いは第１要素と第２要素の両者にアルカリ性化合物を含有させることにしてもよい）。尚、アルカリ性化合物の具体例として、モノエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン等のアミン化合物、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム等の無機化合物等を挙げることができる。
　本発明の染色剤はペースト（クリーム）状、エアゾール状、ゲル（ジェル）状、液状、泡状等の形態に調製される。第１要素（酸化染料を含有する）と第２要素（修飾酵素を含有する）からなる二剤型の場合には、第１要素と第２要素の形態が同一でなくてもよい。
２．染色方法
　本発明の第２の局面は、本発明の染色剤を用いた染色方法に関する。本発明の染色方法では、酸素が存在する条件下（即ち酸素雰囲気下）、本発明の染色剤で繊維又は繊維加工品（以下、まとめて「被染色材料」と呼ぶ）を処理する。一剤型の染色剤の場合、例えば、染色剤を必要に応じて希釈した後、被染色材料に塗布する。或いは、染色剤を溶解した溶液に被染色材料を浸漬する。
　二剤型の染色剤の場合には、例えば、第１要素と第２要素を混合した後（必要に応じて希釈したり、溶媒に溶解したりしてもよい）、被染色材料に塗布する。片方（第１要素又は第２要素）を被染色材料に塗布した後に他方を被染色材料に塗布し、被染色材料の表面等において両要素が混合されるようにしてもよい。また、第１要素と第２要素を溶解した溶液に被染色材料を浸漬することにしてもよい。
　以上のような操作によって染色剤と被染色材料が接触した状態を形成する。そして、所望の染色に必要な時間、当該接触状態を維持する。このときに、染色効果を高めるため又は迅速若しくは効率的な染色のため、保温ないし加温することにしてもよい。被染色材料がヒト毛髪の場合、即ち、本発明の染色方法でヒト毛髪を染色する場合を例にとれば、例えば約１０分～２時間、好ましくは約２０分～１時間、接触状態を維持する。
　処理時のpH条件は使用する染色剤に依存する。但し、別途pH調整剤を使用してpHを調整することも可能である。処理時のpHは例えばpH7.0～9.0である。後述の実施例に示す通り、正電荷を付加した修飾ビリルビンオキシダーゼを使用した場合、比較的低いpH条件でも高い染色効果を示した。この知見に基づき、本発明の一態様では、pH7.0～ph8.0の条件下で処理する。当該条件を採用することにより、染色に伴う被染色材料の損傷を低減することができる。当該条件は特にヒト毛髪を染色する際に有効であり、ヒト毛髪の損傷及び皮膚（頭皮）への刺激も低減することが可能となる。
　上記処理後、通常は被染色材料を洗浄し、最後に乾燥させる。洗浄には例えば水、洗剤等を用いることができる。また乾燥の手段としては、風乾（自然乾燥）、熱風乾燥、スピン乾燥、吸引乾燥、バレル乾燥などを例示できる。
　本発明の染色方法では、修飾酵素の作用によって酸化染料の酸化、重合が生じ、被染色材料が染色される。本発明では、酸化反応に酵素を利用することから、染色処理に伴う被染色材料の損傷（ダメージ）が少ない。また、毛髪に適用した場合においては頭皮への悪影響（アレルギー反応）などのおそれも少なくなる。一方、本発明に使用する酵素は、上記の如き修飾によって、被染色材料に高親和性を示す。この特性によって酵素反応（即ち酸化染料の酸化）が効率的に進行し、染色効果が向上する。このように、本発明の染色剤は、被染色材料などへの影響を低減しつつ、効果的な染色を可能にする。
３．その他の用途
　本発明における修飾酵素はパーマネントウェーブ剤の成分としても有用である。一般にパーマネントウェーブの施術においては、還元剤（チオグリコール酸、チオグリコール酸塩類、システイン、ヒドロキシシステイン、ジヒドロキシシステイン、アセチル化システイン、亜硫酸ナトリウム等）を主成分とする第１剤によって毛髪中のジスルフィド（S-S）結合を切断し、次いで酸化剤を主成分とする第２剤により毛髪を処理し、切断したS-S結合を再形成させる。酸化剤には臭素酸ナトリウム、過ホウ酸塩、過酸化水素などが使用される。このような酸化剤に代えて、本発明の修飾酵素を用いることが可能である。本発明の修飾酵素を使用する場合、一剤型のパーマネントウェーブ剤を構成することも可能である。
　酸化酵素を使用した染色方法における染色効果の向上を目指し、以下の検討を行った。具体的には、酸化酵素の一つであるビリルビンオキシダーゼ（BO）に所定の修飾を施し、染色効果に与える影響を調べた。尚、ヒト毛髪に対する染色を指標とした。
Ａ．BOの修飾
１．方法
（１）アミノ基の修飾
　以下の方法でアミノ基を付加する修飾をBOに施した。200 mgのBO（ミロセシウム・ベルカリア由来、天野エンザイム社製）に対して、モル比で1000当量のプトレシン、100当量のN-ヒドロキシサクシニミド、および200当量の水溶性カルボジイミド（EDC）を加えて、20mM HEPES(pH 6.5)で20mlとして4℃で1日反応させた。尚、プトレシンは希硫酸でpH調整した。
（２）サンプルの精製
　反応後のサンプルから未反応のプトレシンを除くため、20mM ホウ酸緩衝液（pH9.0）で平衡化させた10DGカラム（BIO-RAD）でサンプルを精製した。
（３）活性測定
　試薬ビリルビン30 mgを0.05 mol/L リン酸塩緩衝液 (pH7.0)(0.05 mmol/L EDTA含有)1.0 mlに溶解して基質溶液とした。0.05mol/L リン酸塩緩衝液 (pH7.0)(0.05 mmol/L EDTA含有)に1％となるようにコール酸ナトリウムを溶解し、この3mlに基質溶液0.2 mlと酵素液0.1 mlを混合後、37℃で反応させ、460 nmの吸光度の減少より測定した。1 分間に1μmolのビリルビンを酸化させるのに要する酵素量を1単位と定義している。
（４）等電点電気泳動
　未修飾BOとの電荷の比較のため、等電点電気泳動を行った。
（５）アミノ基の定量
　以下の方法でアミノ基を定量した。測定サンプル（タンパク量：0.6-1.0 mg/mlの範囲で）中のタンパク量を揃えた後、調製サンプル（0.25ml）、4％NaHCO3（0.25mｌ）、0.1% TNBS（0.25ml）水溶液を混合した。40℃で2時間、反応させた。5% SDS（0.25ml）、1M HCl（0.125 ml）を加えて反応を停止させ、345nmの吸光度を測定した。測定サンプルの代わりに水を用いたものをブランクとし、ブランクの測定値を差し引いた値をΔODとした。未修飾BOにおけるアミノ基の結合量を8(リジンの分の7及びN末端の１)としてアミノ基の量を定量した。
２．結果
　活性測定の結果を以下の表１に示す。収率は5割程度であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 サンプルの収率（各サンプルの活性値）
　等電点電気泳動の結果を図１に示す。未処理サンプルはpI4を示すが、修飾サンプルはいずれも対応するバンドが消失している（電荷が向上したと考えられる）。また、修飾サンプルはいずれもバンドがスメアーなっている。修飾の程度が異なる様々なBOが存在しているためと考えられる。
　アミノ基の定量結果を以下の表２に示す。修飾BOではアミノ基が付加されていることがわかる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　以上の結果より、アミノ基の付加により電荷が変化した修飾BOの調製に成功したことを確認した。
Ｂ．染毛試験による修飾BOの染色効果の確認
　上記の通り、調製したBOにはアミノ基が修飾されたことを確認できた。そこで、未修飾BOと修飾BOを用いて染毛試験を実施した。
１．方法
（１）染毛基剤の調製
　EMALEX HC-20(日本エマルジョン株式会社) 2％、乳酸1％、P-フェニレンジアミン（PPD）1%を蒸留水に溶解して、モノエタノールアミンを用いて所定のpHに調整した。次に、ヒドロキシエチルセルロース1.5％を加えて混合し、最終重量80％となるように蒸留水を加えた。続いて、酵素を加え、最終的に100％となるように調製した。
（２）染毛試験
　人白髪毛束（10cm, 1g, ビューラックス製）1本につき染毛基剤を2ｇ塗布した。30℃で30分反応させた（途中15分で裏返した）。水で洗浄後、さらに1％SDSで洗浄して、水洗を色が抜けるまで行った。最後に一晩放置し、風乾させた。
（３）色相評価
　分光測色計CM-700d (コニカミノルタ製)を使用し、10°視野、D65 Day Light、SCEモードにて測定した。CIEL*a*b表色系を用いて未処理の白髪との色差（ΔE*ab）で評価した。尚、L*は明度を表す。0～100の数値があり、数値が高いほど明るいことを示す。また、a*は色彩を示す。-60～+60の数値があり、-であるほど緑を示し、+であるほど赤を示す。ｂ*は色彩を示す。-60～+60の数値があり、-であるほど青を示し、+であるほど黄色を示す。ΔE*abは[(ΔL)2+(Δa)2+(Δb)2]1/2で算出される値であり、ヘアカラーの評価において一般的に使用される単位である。基準値（染毛前の白髪の測定値）のL*値、a*値、b*値との差によりΔE*abを算出する。表３に色差の程度とΔE*abの関係を示す。尚、条件によって変動はするものの、一般的なヘアーマニュキュアの場合、ΔE*abが約40となり、過酸化水素を酸化剤に用いたものはΔE*abは50以上を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
２．結果
（１）染毛試験１(pH8,9における染色効果の比較)
　染毛試験１の結果を表４及び図２に示す。特にpH8の条件では修飾BOの方が染色効果が高い（色差で3程度の相違）。pH9.0の条件においても染色効果の差を認める。全体的に修飾BOの方が毛が赤く染まり、a*（赤み度）の値も高い（図２右）。肉眼による観察では、数値以上に修飾BOの方が良く染まっている印象であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（２）染毛試験２（酵素濃度を一定とし、pH7,8,9,10における染色効果の比較)
　染毛試験２の結果を表５及び図３に示す。特にpH9.0の条件で修飾BOの方が染色効果が高い。（図３左）。いずれのpHにおいても、修飾BOの方がa*が高くなる傾向を示した（図３右）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（３）染毛試験３（pH8での各酵素濃度における染色効果の比較）
　染毛試験３の結果を表６及び図４示す。酵素濃度が低い条件下でも修飾BOは高い染色効果を示した（図４左）。また、本試験においても、修飾BOの方が赤み度が高いことを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（４）染毛試験４（pH9での各酵素濃度と基質特異性の染色効果の比較）
　発色基質としてPPD（パラフェニレンジアミン）以外に、PAP（パラアミノフェノール）、PTD（パラトルエンジアミン）についても染色効果を調べた（基質特異性の検討）。また、新たにブチルアミンを用いて修飾したものも調製し、その染色効果についても同様に比較した。結果を表７及び図５、６に示す。pH9.0の条件において、修飾BO(プトレシン)は高い染色効果を示すことを確認できる（図５左）。また、修飾BO（プトレシン）は赤み度が高くなる傾向を示した。基質特異性に関しては、非修飾BOと比べてプトレシンで修飾したBOの方が、PPD、PAPに対する染色効果が高い（図６）。また、ブチルアミンで修飾したものは特にPTDに対して染色効果が高くなる傾向を示した（図６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　以上の通り、修飾BOは未修飾BOよりも染色効果が高いことが示された。染色効果の差は特に低い酵素濃度において顕著であった。また、修飾BOでは未修飾BOよりも赤みが強くなることが判明した。髪のpIは約5.5といわれており、一般的な染色条件下（例えばpH9.0）では髪はマイナスにチャージする。BOにアミノ基を修飾したことでBOの電荷が向上した結果、修飾BOではpH9.0の条件においてもプラス（＋）にチャージしたものが存在していると考えられる。修飾BOでは電荷の効果によって髪との親和性が向上し、その結果として染色効果が向上したと考えられる。
Ｃ．各種修飾方法による染色効果の確認
　各種ポリアミンを用いてBOを修飾し、染色効果を比較した。
１．方法
（１）アミノ基の修飾
　100 mgのBOに対して、モル比で1000当量のポリアミン（プトレシン、3,3'-ジアミノジプロピルアミン、アグマチン硫酸塩）、100当量のN-ヒドロキシサクシニミド、および200当量の水溶性カルボジイミド（EDC）を加えて、20mM HEPES(pH 6.5)で10 mlとして4℃で1日反応させた。尚、プトレシン、3,3'-ジアミノジプロピルアミンは希硫酸でpH調整した。
（２）サンプルの精製
　反応後のサンプルから未反応のポリアミンを除くため、20mM ホウ酸緩衝液（pH9.0）で平衡化させた10DGカラム（BIO-RAD）でサンプルを精製した。
（３）活性測定
　ビリルビンを基質に用いた波長460nmの吸光度変化による測定法を用いた。
（４）等電点電気泳動
　未修飾BOとの電荷の比較のため、等電点電気泳動を行った。
（５）アミノ基の定量
　TNBSを用いてアミノ基を定量した。
（６）タンパク定量
　Bradford法によりタンパク量を定量した。尚、BSAを基準とした。
（７）耐シャンプー試験（堅牢性試験）
　エマール20C（花王）10体積％溶液に、染毛後の毛束を浸漬し、30分間超音波処理を行った。その後、水でよく洗浄して乾燥後に、色差を測定した。耐シャンプー性は、洗浄前の毛髪の色差に対する、洗浄後の毛髪の色差（%）で表した。
２．結果
（１）修飾反応、等電点電気泳動、比活性の測定、アミノ基の定量
　修飾反応に関して、各サンプルの収率を表８に示す。収率は30%～50%であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　等電点電気泳動の結果を図７に示す。未処理サンプルはpI4を示すが、修飾サンプルはいずれも電荷が向上していた。
　比活性の測定結果を表９に示す。修飾によって比活性は半分程度になっていた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　アミノ基の定量結果を表１０に示す。修飾BOにアミノ基が付加されていることを確認できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（２）染毛試験による染色効果の確認
　調製した各修飾BOについて染毛試験を実施した。方法及び評価はＢ．の場合と同様である。但し、染色はすべてpH9.0の条件で行った。染毛試験の結果を表１１と図８、９に示す。ポリアミンを修飾することで高い染色効果が得られることがわかる。特に、トリアミンを修飾したものは最も染毛効果が高かった（図８左）。最も低い酵素濃度で最大の色差を示したことから、酵素濃度を減らすことで更に染色効果が向上すると予想される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
（３）耐シャンプー試験の結果
　耐シャンプー試験の結果を表１２と図１０、１１に示す。修飾BOによる染色は耐シャンプー性に優れており、未修飾BOを用いた場合よりも色落ちし難い傾向を示した。修飾BOのこの特徴は染毛用途において極めて重要且つ有意義である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　以上の通り、修飾に使用するポリアミンの変更によって染毛効果を劇的に向上させることが可能であった。また、修飾BOは染色効果に加え、耐シャンプー性をも向上させることが判明した。
Ｄ．インドール類縁体を発色基質とした場合の染色効果１
　パラフェニレンジアミンなどよりも安全性が高いとされるインドール化合物（４－アミノインドールや５－アミノインドール等）を発色基質とした場合の染色効果を調べた。
１．方法
（１）アミノ基の修飾
　100 mgのBOに対して、モル比で1000当量の3,3'-ジアミノジプロピルアミン、100当量のN-ヒドロキシサクシニミド、および200当量の水溶性カルボジイミド（EDC）を加えて、20mM HEPES(pH 6.5)で10mlとして4℃で1日反応させた。この反応液を精製したものをPMO(Polyamine Modified Oxidase)として使用した。なお3,3'-ジアミノジプロピルアミン添加後、希硫酸でpH調整した。
　修飾BOとして上記PMOを用いたことと、発色基質としてインドール化合物を用いたことを除いて、試験方法及び評価はＢ．の場合と同様である（一部の条件においては２種類の発色基質を併用することにした）。また、Ｃ．の場合と同様の方法で耐シャンプー試験も実施した。
２．結果
（１）染毛試験による染色効果の確認
　試験結果を表１３及び図１２に示す。PMOを添加することで、未修飾BOや過酸化水素を用いた場合よりも有意に染毛効果が高い事が確認された。4AIや5AIを混合することでより、色彩を黒に近い色へ変えることが可能であった（図１２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 4AI：４－アミノインドール
5AI：５－アミノインドール
（２）耐シャンプー試験の結果
　試験結果を表１４及び図１３に示す。未修飾BOよりもPMOの方が染毛効果に優れ、かつ色落ち（堅牢度が高い）も少ない。一方、4AI＞4AI+5AI＞5AIの順で堅牢度が高くなる傾向にあった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Ｅ．インドール類縁体を発色基質とした場合の染色効果２
　酵素濃度と染色効果の関係、及び２種以上のインドール化合物を併用した場合の染色効果を調べた。
１．方法
　修飾酵素としてPMOを使用した。その他の方法等はＤ.の場合と同様とした。
２．結果
（１）染毛試験の結果
　試験結果を表１５、１６及び図１４～１６に示す。いずれの条件においても、酵素濃度が50Ｕ/100g付近で色差はピークとなった（図１４）。各種インドール化合物を併用したところ、色差に大きな違いは確認できなかったが（図１５）、色彩の変化を認めた（表１６、図１６）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 4AI：４－アミノインドール
5AI：５－アミノインドール
6AI：６－アミノインドール
4HI：４－ヒドロキシインドール
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
 4AI：４－アミノインドール
5AI：５－アミノインドール
6AI：６－アミノインドール
4HI：４－ヒドロキシインドール
（２）耐シャンプー試験の結果
　試験結果を表１７及び図１７に示す。5AIを用いた場合には、酵素濃度を高めていくと堅牢度が高くなる（色落ちが少ない）傾向を示した（図１７Ａ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
 4AI：４－アミノインドール
5AI：５－アミノインドール
6AI：６－アミノインドール
4HI：４－ヒドロキシインドール
　以上の通り、安全性の高いとされるインドール化合物（4-アミノインドールや5-アミノインドール等）を発色基質として採用した場合においても、修飾酵素を用いると過酸化水素よりも効果的な染毛が可能であった。また、使用するインドール化合物の種類、組合せによって、様々な色調の染色が可能であった。
Ｆ．インドール類縁体を発色基質とした場合の染色効果３
　インドール化合物である５，６－ジヒドロキシインドールを発色基質とした場合の染色効果を調べた。５，６－ジヒドロキシインドールはメラニン前駆体であり、酸素存在下において重合し、メラニン色素が形成される。また、安全性が高いものの、その扱いにくさと染色効果の低さが問題とされている。
１．方法
　発色基質として５，６－ジヒドロキシインドールを0.3重量％用いたことを除いて、試験方法及び評価はＤ．（インドール類縁体を発色基質とした場合の染色効果１）に準じた。
２．結果
（１）染毛試験による染色効果の確認
　試験結果を表１８及び図１８～２０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　酸化剤としてPMOを使用すると優れた染色効果が得られることがわかる。PMOは過酸化水素よりも劇的に酸化効果が高い（図１８）。一方、過酸化水素を使用した場合と異なり、PMOを使用した場合には、pH9.0の条件よりもpH7.0の条件の方が染色効果が高い（図１８、１９）。この結果より、PMOを使用すれば毛髪の損傷を抑えつつ高い染色効果が得られるといえる。この特徴は実用上の大きなメリットである。酵素量と染色効果の関係に関しては、最も少ない使用量（25U/100ｇ）のときに最も高い染色効果を示した。この結果は、PMOが高い酸化効果（染色効果）を示すことを裏付ける。
　以上の通り、発色基質として５，６－ジヒドロキシインドールを用いた場合にもPMOが有効であること、換言すれば、PMOを用いれば効果的な染色が可能になることが示された。
　本発明の染色剤は酸化染料を用いた染色に利用される。各種染色法に本発明の染色剤を適用可能である。特に、毛髪の染色に本発明は有効である。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims (13)

  1. 　EC 1.10.3.1で特定される酵素、EC 1.10.3.2で特定される酵素、EC 1.3.3.5で特定される酵素、EC 1.10.3.4で特定される酵素、EC 1.10.3.3で特定される酵素、及びEC 1.14.18.1で特定される酵素からなる群より選択される酵素に対して、アミン類の化学修飾により正電荷を付加して得られる修飾酵素を含む染色剤。
  2. 　酸化染料を組み合わせてなることを特徴とする、請求項１に記載の染色剤。
  3. 　前記酸化染料と前記修飾酵素を含有した一剤型である、請求項２に記載の染色剤。
  4. 　前記酸化染料を含有する第１要素と、前記修飾酵素を含有する第２要素とからなる二剤型である、請求項２に記載の染色剤。
  5. 　ケラチン繊維の染色用である、請求項１～４のいずれか一項に記載の染色剤。
  6. 　前記ケラチン繊維がヒト毛髪である、請求項５に記載の染色剤。
  7. 　前記酸化染料が、フェニレンジアミン、アミノフェノール、クレゾール、トルエンジアミン、ナフトール、インドール、インドリン及びこれらの誘導体からなる群より選択される一以上の化合物である、請求項２～６のいずれか一項に記載の染色剤。
  8. 　前記酸化染料が、パラフェニレンジアミン、パラアミノフェノール、パラトルエンジアミン、４－アミノインドール、５－アミノインドール、６－アミノインドール、４－ヒドロキシインドール及び５，６－ジヒドロキシインドールからなる群より選択される一以上の化合物である、請求項２～６のいずれか一項に記載の染色剤。
  9. 　前記酵素がビリルビンオキシダーゼである、請求項１～８のいずれか一項に記載の染色剤。
  10. 　請求項１～９のいずれか一項に記載の染色剤で繊維又は繊維加工品を処理するステップを含む染色方法。
  11. 　前記繊維がケラチン繊維である、請求項１０に記載の染色方法。
  12. 　前記ケラチン繊維がヒト毛髪である、請求項１１に記載の染色方法。
  13. 　pHが7.0～8.0の条件下で前記処理を行う、請求項１２に記載の染色方法。
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