JP2004089042A - 耐熱性ビリルビンオキシダーゼおよびその製造法 - Google Patents
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Abstract
【課題】優れた耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼの遺伝子工学的手法による提供。
【解決手段】ビリルビンオキシダーゼの特定アミノ酸配列において、３６１位又は３６４位のプロリンが他のアミノ酸に置換され、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ、上記配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入され、上記配列と７０％以上の相同性を有し、上記アミノ酸配列をコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子によりコードされるビリルビンオキシダーゼ、これらのビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を含むプラスミド、当該組換えプラスミドを含む形質転換体、当該形質転換体を培養し、培養物からビリルビンオキシダーゼを採取することを特徴とするビリルビンオキシダーゼの製造法、上記ビリルビンオキシダーゼを含むビリルビンアッセイキット。
【選択図】 なし
【解決手段】ビリルビンオキシダーゼの特定アミノ酸配列において、３６１位又は３６４位のプロリンが他のアミノ酸に置換され、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ、上記配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入され、上記配列と７０％以上の相同性を有し、上記アミノ酸配列をコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子によりコードされるビリルビンオキシダーゼ、これらのビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子、当該遺伝子を含むプラスミド、当該組換えプラスミドを含む形質転換体、当該形質転換体を培養し、培養物からビリルビンオキシダーゼを採取することを特徴とするビリルビンオキシダーゼの製造法、上記ビリルビンオキシダーゼを含むビリルビンアッセイキット。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、従来のビリルビンオキシダーゼに比して、耐熱性に優れたビリルビンオキシダーゼ、その遺伝子、当該遺伝子を含む組換えプラスミド、当該プラスミドにより得られる形質転換体、当該形質転換体を用いるビリルビンオキシダーゼの製造法および耐熱性に優れたビリルビンオキシダーゼを含むビリルビンアッセイキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビリルビンオキシダーゼは、ビリルビンをビリベルジンに酸化する反応を触媒する、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ）酵素委員会により酵素番号ＥＣ１．３．３．５として分類された酵素である。
【０００３】
ミロセシウム属由来のビリルビンオキシダーゼ（特公昭６０−１２０３１号公報、特公昭６０−１２０３２号公報参照）は、既に遺伝子組換え技術をもちいた量産化システムも構築されており（特許第３１８１６６０号公報参照）、生化学用に広く利用されているものの、安定性の点で十分ではないことが欠点であった。特に、多くの生化学検査用試薬が低温で１〜２年間の性能保証をもつ液状試薬に変わった近年、このビリルビンオキシダーゼを利用したビリルビン測定試薬の開発においては、安定性を向上させるため種々の安定化剤が添加されている。例えば、アミノ酸、金属塩、糖、有機酸塩（特開平６−２８４８８６号公報参照）、ハロゲン化物塩（特開平７−２０３９６２号公報参照）、緩衝液組成又はカルボン酸塩（特許第２８２０８９３号公報参照）、還元剤（特開平１０−４２８９６号公報参照）、含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体（特開平１０−７５７７９号公報参照）、ペンタシアノ鉄錯塩、ヘキサシアノ錯塩、第３級アミン類（特開２０００−８３６６１号公報参照）、リチウム化合物、ホモシステイン（特開２０００−２５３８７３号公報参照）が挙げられる。しかし、これらの安定化剤の添加でも安定性は十分とは言えず、コストの点からも安定なビリルビンオキシダーゼの開発が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、従来知られているビリルビンオキシダーゼに見られない優れた耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼを遺伝子工学的手法により提供するとともに、その大量生産に必要な遺伝子、当該遺伝子を含む組換えプラスミド、当該プラスミドにより得られる形質転換体、当該形質転換体によるビリルビンオキシダーゼの製造法および耐熱性に優れたビリルビンオキシダーゼを含むビリルビンアッセイキットを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ミロセシウム属由来のビリルビンオキシダーゼ遺伝子の遺伝子改変を行ない、ある種のアミノ酸置換により、従来知られているビリルビンオキシダーゼに見られない優れた耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼを製造することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
即ち、本発明は以下の構成を有する。
［１］配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼ。
［２］ 配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、３６１位又は３６４位のプロリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ。
［３］配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ。
［４］ 配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ。
［５］配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子によりコードされ、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ。
［６］［１］ないし［５］のいずれかに記載のビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子。
［７］［６］記載の遺伝子を含む組換え発現プラスミド。
［８］［７］記載の組換えプラスミドを含む形質転換体。
［９］［８］記載の形質転換体を栄養培地で培養し、得られる培養物からビリルビンオキシダーゼを採取することを特徴とするビリルビンオキシダーゼの製造法。［１０］［１］ないし［５］のいずれかに記載のビリルビンオキシダーゼを含むビリルビンアッセイキット。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の構成を詳細に説明する。
本発明は、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子に関する。ただし、当該遺伝子に限定されず、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、３６１位または３６４位のプロリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子も含む。ここで、他のアミノ酸とは、具体的にはアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンをいい（以下同じ。）、耐熱性とは、実施例６に記載の条件、即ち、８０μＭ 硫酸銅を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に本発明のビリルビンオキシダーゼを１６μｇ／ｍＬとなるように溶解した溶液を６０℃で熱処理する場合において、残存活性が熱処理時間が３０分の場合に５０％以上であることをいい、好ましくは５５％以上であることをいう（以下同じ。）。また、本発明では、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼをコードする全ての遺伝子を含む。更に、本発明では、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子を含む。更にまた、本発明では、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子によりコードされ、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子を含む。ここで、ハイブリダイズのためのストリンジェントな条件とは、例えば、野村慎太郎、稲澤譲治著「脱アイソトープ実験プロトコール」ｐ．４０（秀潤社、１９９４）に記載の条件（５００ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．２），７％ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡ、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、４０ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ、６５℃で５分間づつ計４回の洗浄を行う。）が挙げられる。
【０００８】
本発明のビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子は、微生物の遺伝子を用いて公知の手法またはこれに準ずる方法で得ることができる。
１．本発明の耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ遺伝子の取得
以下に、本発明のビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子の取得手順を例示する。
（１） ｐＵＣ−ＢＯの取得
ミロセシウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ）ＭＴ−１（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３）を通常の糸状菌を培養する培地で培養後、菌体を分取する。当該菌体から全ＲＮＡを常法に従い調製する。市販のｍＲＮＡ精製キットを用いて、ポリＡ ＲＮＡを回収する。精製したビリルビンオキシダーゼのＮ末端のアミノ酸配列とプロテアーゼで切断したペプチドのアミノ酸配列を決定する。ＢＯ蛋白の一部分に対応する増幅用プライマーを設計し、上記の全ＲＮＡから逆転写反応により調製したｃＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼチェインリアクション（以下、「ＰＣＲ」ともいう。）反応で増幅し、ＢＯ蛋白の一部分に対応するＤＮＡ断片（以下、「ＢＯ−Ａ」ともいう。）を回収しその塩基配列を決定する。
【０００９】
ＢＯ蛋白のカルボキシル末端部分に対応する増幅用プライマーを設計し、上記のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応で増幅し、ＢＯ蛋白のカルボキシル末端部分に対応するＤＮＡ断片（以下、「ＢＯ−Ｂ」ともいう。）を回収しその塩基配列を決定する。
【００１０】
ＢＯ蛋白のアミノ末端部分に対応する増幅用プライマーを設計し、ポリＡ ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応で増幅し、ＢＯ蛋白のアミノ末端部分に対応するＤＮＡ断片（以下、「ＢＯ−Ｃ」ともいう。）を回収しその塩基配列を決定する。
【００１１】
ＢＯ蛋白のオープンリーディングフレーム全体に対応する増幅用プライマーを設計し、上記のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応で増幅し、ＢＯ蛋白のオープンリーディングフレーム全体に対応するＤＮＡ断片（以下、「ＢＯ−ｆｕｌｌ」ともいう。）を回収し、ｐＵＣ１９プラスミドに挿入し、野生型ビリルビンオキシダーゼの組換えプラスミド（以下、「ｐＵＣ−ＢＯ」ともいう。）を得る。
【００１２】
野生型ビリルビンオキシダーゼ遺伝子の給源としては、得られた野生型ビリルビンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列に基づき合成した適当なプライマーを用いてＰＣＲを行うこと、あるいは本発明で得られた野生型ビリルビンオキシダーゼ遺伝子中の断片をプローブとしたストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、増幅ＤＮＡ断片あるいはシグナルが得られる微生物であればよく、好ましくはミロセシウム属に属する微生物であり、より好ましくはミロセシウム・ベルカリアに属する微生物である。この種の具体的な菌株としてミロセシウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ）ＭＴ−１（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３）を挙げることができる。
【００１３】
野生型ビリルビンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号：１３）が明らかになったことから、本発明のビリルビンオキシダーゼ遺伝子は、野生型ビリルビンオキシダーゼ遺伝子を鋳型として、このＤＮＡ配列に基づいて合成した適当なプライマーを用いて、ＰＣＲを行ない野生型ビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子を取得し、上記の本願の出願時において常用される技術、例えば、ヒドロキシルアミン、亜硝酸、ヒドラジン、ギ酸等の化学変異剤を用いる方法やＰＣＲ法を用いてランダムに変異を導入する方法等の点変異、市販キットを利用する部位特異的に置換、欠損変異を生じさせる部位特異的変異法などの各種方法を用いて取得することができる。
【００１４】
（２） 発現プラスミド ｐＴＧ１−ＢＯの構築
（１）で取得したｐＵＣ−ＢＯを鋳型として、ＰＣＲにより、Ｋｐｎ１サイトを含むビリルビンオキシダーゼ遺伝子の前半部分の遺伝子（以下、「ＢＯ−Ｄ」ともいう。）を得る。 アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のタカアミラーゼプロモーター（ｔａａＧ２、Ｎ．Ｔｕｋａｇｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ，８４，３１９−３２７（１９８９））を含むｐＣＡＭＥ３（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＣＡＭＥ３）（寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１８９６６）として平成１４年８月７日独立行政法人産業技術総合研究所に寄託）を鋳型としてＰＣＲによりｔａａＧ２プロモーター遺伝子（以下、「ｔａａＧ２」ともいう。）を得る。次に、ＰＣＲによりＢＯ−ＤとｔａａＧ２が連結した遺伝子（以下、「ｔａａＧ２−ＢＯ−Ｄ」ともいう。）を得る。一方、ｐＵＣ−ＢＯより、制限酵素Ｋｐｎ１および制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉを用いビリルビンオキシダーゼ遺伝子の後半部分の遺伝子（以下、「ＢＯ−Ｅ」ともいう。）を切り出す。次に、ｔａａＧ２−ＢＯ−ＤとＢＯ−ＥをＫｐｎ１サイトで連結させ、ノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）由来ｐｙｒ４遺伝子を選択マーカーとして持つプラスミドｐＴＧ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＴＧ１）（寄託番号：ＦＥＲＭＰ−１８９６５）として平成１４年８月７日独立行政法人産業技術総合研究所に寄託）の制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ切断サイトに挿入し、発現プラスミドｐＴＧ１−ＢＯを構築する。
【００１５】
（３）変異型ビリルビンオキシダーゼ遺伝子の取得
上記のｐＴＧ１―ＢＯを鋳型として、以下に示すオーバーラップＰＣＲ法による部位特異的変異により組換えビリルビンオキシダーゼ発現プラスミドを作製する。即ち、ｐＴＧ１―ＢＯを鋳型として、２組のプライマー（▲１▼プライマーＢＯ−ＫＥ、プライマーＤ３６１Ｐ／Ｑ３６４Ｐ−２、▲２▼プライマーＢＯ−ＶＨ、プライマーＤ３６１Ｐ／Ｑ３６４Ｐ−１）を用いて、各組のプライマーによりそれぞれのＰＣＲ断片を得る。次に、得られたこれらのＰＣＲ断片を混合したものを鋳型としてＰＣＲを行った後、２種の制限酵素（ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ）により切断した遺伝子断片をプラスミド（ｐＵＣ１１９）に連結する。該連結プラスミドを大腸菌に導入し、組換えビリルビンオキシダーゼの塩基配列を確認する。該連結プラスミドを２種の制限酵素（ＥｃｏＴ１４Ｉ、Ｖａｎ９１Ｉ）で切断した遺伝子断片を発現プラスミドｐＴＧ−ＢＯの野生型ビリルビンオキシダーゼ遺伝子と交換して、耐熱性ビリルビンオキシダーゼ発現プラスミドを得る。
【００１６】
本発明のビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子（以下、「本発明のビリルビンオキシダーゼ遺伝子」ともいう。）の塩基配列が明らかとなったことから、当該遺伝子は化学合成法により取得することができる。また、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、３６１位または３６４位のプロリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子によりコードされ、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼをコードする全ての遺伝子は、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子に基づき、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、あるいはＰＣＲを利用した方法等の公知の手法又はこれに準ずる方法、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（宝酒造株式会社製）、Ｍｕｔａｎｔ−Ｇ（宝酒造株式会社製）、あるいはＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ シリーズキット（宝酒造株式会社製）を用いて得ることができる。
【００１７】
２．組換えビリルビンオキシダーゼ発現プラスミドの作製
本発明の組換え発現プラスミドは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主である原核細胞、酵母中で自律複製可能なもの、あるいは糸状菌、動物、昆虫細胞の染色体に組み込み可能なベクターであれば特に限定されず、例えば、プラスミド ＤＮＡ、ファージ ＤＮＡ等が挙げられる。プラスミド ＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド、例えば、ｐＥＴ系（宝酒造株式会社製）、ｐＧＥＸ系（アマシャム・バイオサイエンス製等）、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）、枯草菌由来のプラスミドとしては、例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等、酵母由来のプラスミドとしては、例えば、ｐＡＵＲ系（宝酒造株式会社製等）などが挙げられる。さらに、レトロウイルスまたはワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスＢａｃＶｅｃｔｏｒ（宝酒造株式会社製）などの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００１８】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター ＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が宿主内で発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のプラスミドには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することが望ましい。
【００１９】
プロモーターは、宿主中で発現できるものであれば特に限定されない。例えば大腸菌が宿主の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
【００２０】
酵母が宿主の場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を用いることができる。
【００２１】
糸状菌が宿主の場合、タカアミラーゼプロモーター、アスパラギン酸プロティナーゼプロモーター、α―アミラーゼプロモーター、リパーゼプロモーター、アルコール脱水素酵素プロモーター等を用いることができる。
【００２２】
動物細胞を宿主とする場合は、プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。
【００２３】
また本発明の組換え発現プラスミドには、本発明の遺伝子、プロモーターのほか、形質転換体の選択を容易にする選択マーカーが付加していることが望ましい。原核細胞、酵母、糸状菌、動物、昆虫細胞等で利用可能な選択マーカーであれば特に限定されることはなく、カナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子あるいはａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤ等の栄養要求性相補遺伝子等が挙げられる。
【００２４】
３．形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換え発現プラスミドを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、原核生物又は真核生物のいずれでも良い。原核生物の例として、例えば、大腸菌等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。真核生物の例としては下等真核生物である酵母や糸状菌が使用でき、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等が挙げられ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等などの糸状菌、動物細胞あるいはＳｆ９等の昆虫細胞が挙げられる。
【００２５】
大腸菌としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。大腸菌などの細菌への組換えプラスミドの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２））、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２６】
酵母としては、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが挙げられる。酵母への組換えプラスミドの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １９４：１８２（１９９０））、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７５：１９２９（１９７８））、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，Ｈ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３：１６３（１９８３））等が挙げられる。
【００２７】
糸状菌としては、アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・カマンベルチー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）などがあげられる。糸状菌への組換えプラスミドの導入方法は、糸状菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばプロトプラスト法（Ｄ．Ｊ．Ｂａｌａｎｃｅ．Ｇ．Ｔｕｒｎｅｒ． Ｇｅｎｅ，３６，３２１，１９８５）、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００２８】
動物細胞としては、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。動物細胞への組換えプラスミドの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えプラスミドの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００２９】
遺伝子の宿主への組込みの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００３０】
４．ビリルビンオキシダーゼの製造
本発明のビリルビンオキシダーゼは、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼである。ただし、これに限定されず、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、３６１位または３６４位のプロリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼも含む。また、本発明では、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼを含む。更に、本発明は、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼを含む。また、本発明は、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子によりコードされ、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼを含む。
【００３１】
例えば、本発明のビリルビンオキシダーゼの好適例として、ミロセシウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ）ＭＴ−１（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３）由来の野生型ビリルビンオキシダーゼ（配列番号：１）の３６１位のアスパラギン酸および３６４位のグルタミンがともにプロリンに置換されたことにより耐熱性を獲得したビリルビンオキシダーゼ（配列番号：２３）が挙げられる。当該ビリルビンオキシダーゼは、従来のビリルビンオキシダーゼに見られない高い耐熱性を示すという優れた性質を持っている。
【００３２】
本発明のビリルビンオキシダーゼは、前記の形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。当該培養物には、培養上清、あるいは培養細胞もしくは培養菌体または細胞もしくは菌体の破砕物のいずれも含まれる。
【００３３】
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われ、固体培養法、液体培養法のいずれでも良い。大腸菌、酵母、糸状菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３４】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸及びその塩、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩（例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等）が挙げられ、その他含窒素化合物（例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、アミノ酸混合物等）が挙げられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【００３５】
培養は、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下行うが、培養温度は形質転換体が良好に生育する条件であれば良く、通常１０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃である。培地のｐＨは形質転換体が良好に生育するｐＨであれば良く、通常ｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ５〜８である。培養時間は、通常１０〜１００時間、好ましくは２０〜７０時間である。なお、培地のｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン、フレオマイシン、ハイグロマイシン、ブレオマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてＩＰＴＧ、インドール酢酸（以下、「ＩＡＡ」ともいう。）、デンプン等のインデューサーを培地に添加してもよい。
【００３６】
培養後、形質転換体の培養物から本発明のビリルビンオキシダーゼを採取するには、本発明のビリルビンオキシダーゼが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、ろ過、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる通常のタンパク質精製法、例えば、熱処理、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、電気泳動法、等電点電気泳動法等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のビリルビンオキシダーゼを単離精製することができる。また、本発明のビリルビンオキシダーゼが菌体内又は細胞内で生産される場合には、菌体又は細胞を超音波破砕機、磨砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の物理的な破壊手段あるいは界面活性剤、溶菌酵素等を用いる生化学的破壊手段により破壊して、本発明のビリルビンオキシダーゼの抽出液を調製し、その後は上記の精製手法と同様にして行うことができる。
【００３７】
５．耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼを含むビリルビンアッセイキット
本発明は、生化学試料中の各種ビリルビンを測定するために有用な、耐熱性に優れたビリルビンオキシダーゼを含むビリルビンアッセイキットである。
本発明の耐熱性を有するビリルビンアッセイキットは、本発明の耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼを少なくとも１回のアッセイに十分な量含む。具体的には、キットは、本発明の耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのビリルビン標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明の耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液としてあるいはまたセンサーストリップとして提供することができる。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下に記載する実施例に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１ ｐＵＣ−ＢＯの取得
１．菌株の培養
まずＢＯを分泌発現する生産菌を以下の如く培養した。培養の為の培地には以下に示すポテトグルコース培地を使用した。
【００４０】
ポテトグルコース培地の作製法
１）馬鈴薯の皮及び芽をとり約１ｃｍの角切りにしたのち、４００ｇを上皿天秤で秤量してステンレスバットに入れる。
２）脱イオン水１０００ｍＬをメスシリンダーで量り、上記のステンレスバットに加え、アデカノールＬＧ−１２６（旭電化工業製）を３滴添加する。
３）ガスコンロではじめ強火で沸騰させ、その後は弱火で２時間煮沸する。その後、流水中で冷却する。
４）冷却後、ガーゼ２枚でろ過する。
５）ろ液を１０００ｍＬに脱イオン水でフィルアップし、グルコースを１０ｇ加えて溶解する。
６）１２１℃で、３０分間オートクレーブする。
【００４１】
上記の如く作製されたポテトグルコース培地２ｍＬに、胞子形成を行なっていないミロセシウム・ベルカリアＭＴ−１（以下、ＢＯ生産菌という。）を接種して１４０ｒｐｍで３０℃、３日間振盪培養した。次にこの培養液２ｍＬを同ポテトグルコース培地１００ｍＬに接種し、１４０ｒｐｍで３０℃、３日間振盪培養した。更に、この培養液２ｍＬを５００ｍＬの同ポテトグルコース培地の入った坂口フラスコに接種して、１２５ｒｐｍ、２５℃で振盪培養した。培養の間、培養液を経時的にサンプリングして、その上清に含まれるＢＯの発現量の変動を、下記に示す測定法によりＢＯ活性を測定し、ＢＯ活性が高い培養液を回収した。
【００４２】
ＢＯ活性測定法
エチレンジアミン四酢酸１ｍＭを含む０．２Ｍ−トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）２５０ｍＬに試薬ビリルビン（和光純薬工業製）５ｍｇを溶解し、この２ｍＬと酵素液０．２ｍＬを３７℃で反応させ４４０ｎｍの吸光度の減少を測定する。この条件下、１分間あたり４４０ｎｍの吸光度を１．０５減少させるときの酵素量を１単位（ｕ）とした。
【００４３】
この培養液から菌体を遠心分離（１２０００ｘｇ，１５分）により菌体を回収し、−８０℃に凍結保存して以下の実験に供した。
【００４４】
２．菌体からの全ＲＮＡの調製法
全ＲＮＡは、グアニジュウム／塩化セシュウム法〔［バイオケミストリ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１３，２６３３（１９７４）］、［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９６，１３１３（１９７７）］、［モレキュラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８２）］〕に従って調製した。
【００４５】
１．で得られた菌体１０ｇと海砂（２０〜３５メッシュ、和光純薬製）５ｇを混合し、すり鉢の中で液体窒素と共に菌体を粉砕した。得られた粉砕物を４０ｍＭの４Ｍ グアニジンチオシアネ−ト（フルカ製）、２００ｍＭ酢酸ナトリウム（和光純薬製）、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ドウジン製）を含む溶液に加え、室温で１５分間振盪混合させた。
【００４６】
得られた混合物を３０ｍＬのコ−ニングチュ−ブに分配し、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１５分）を行なった。次に予め４ｍＬの５Ｍ 塩化セシュウム（和光純薬製）の入った遠心チュ−ブ６本に、得られた上清を６ｍＬづつ重層し、超遠心分離（３７０００ｒｐｍ、１８時間）を行なった。その結果、チュ−ブの底に透明な沈殿物を得た。
【００４７】
この沈殿物を８０％（ｖ／ｖ）エタノ−ルで２回洗浄し乾燥させ、１チュ−ブあたり８０μＬの１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む溶液に溶かした。次に６本分を１本のチュ−ブに集め、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（１ｍＭのＥＤＴＡ含有）（以下、「ＴＥ」ともいう。）、飽和フェノ−ル及びクロロホルムで２回づつ抽出し、最後に得られた水層に１／１０容量の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）溶液と２倍容量のエタノ−ルを加え、−２０℃に１時間おいた。その後、遠心分離（１２０００ｘｇ、１５分）により沈殿を回収し、沈殿を８０％エタノ−ルで洗浄し、乾燥させた。これを滅菌蒸留水２００μＬに溶かし以下の実験に使用した。尚、最終的に得られた全ＲＮＡ量は約２ｍｇであった。
【００４８】
３．全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ） ＋ ＲＮＡの調製法
２．で得られた全ＲＮＡ１．２ｍｇからｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャム バイオサイエンス製）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを１２μｇ回収した。
【００４９】
４．ＢＯ 蛋白のアミノ末端部分の配列と ＢＯ 蛋白をプロテア−ゼで切断したペプチドのアミノ酸配列の決定
（Ｉ） ＢＯ 蛋白のアミノ末端部分のアミノ酸配列の決定
（ｉ） ＢＯ 蛋白の還元カルボキシメチル化
ミロセシウム・ベルカリアＭＴ−１由来の精製したＢＯ蛋白５ｍｇを３ｍＬの６Ｍグアニジン塩酸と２ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、５０℃で２分間処理した後、室温で２４時間放置した。放置しておいた反応液に０．６ｍｇのＤＴＴ（ジチオスレイト−ル）と１．５ｍｇのヨ−ド酢酸を加え暗所で３０分反応させた後、透析チュ−ブに移し、暗所でイオン交換水に透析した。得られた透析内液を凍結乾燥し、以下の実験に用いた。
【００５０】
（ｉｉ）アミノ酸配列の決定
（ｉ）で得られた試料の適当量を液相法プロテインシ−クエンサ−（アプライド・バイオシステム社製）あるいは固相法プロテインシ−クエンサ−（ミリジェン・バイオサ−チ社製）にかけ、得られたデ−タからアミノ酸配列（配列番号：２）を決定した。
【００５１】
（ＩＩ） ＢＯ 蛋白をプロテア−ゼで切断したペプチドのアミノ酸配列の決定
（ｉ）トリプシン分解断片の取得とアミノ酸配列の決定
（Ｉ）の（ｉ）で示したようにＢＯ蛋白を還元カルボキシメチル化した試料を５ｍＭの炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．９）に溶解し、ＴＰＣＫ−トリプシン（ロッシュ・ダイアグノステックス製）をＢＯ蛋白量の１／５０モル量加え、３７℃で６時間処理し、さらに同量のＴＰＣＫ−トリプシンを加え３７℃で２４時間処理した反応液を塩酸でｐＨ２に調整した。トリプシン分解断片は、得られたトリプシン分解反応液の適当量をＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィ−（μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８−１００Ａカラム）を行なうことにより分画し取得した。尚、ＨＰＬＣの条件は下記の通りである。
【００５２】
Ａ液：０．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸／水、Ｂ液：０．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸／５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水、グラジェント：０−１００％（ｖ／ｖ）、Ｂ液のリニアグラジェント流速：０．５ｍＬ／分。
【００５３】
分画し得られたトリプシン分解断片の内、（Ｉ）の（ｉｉ）と同様のプロテインシ−クエンサ−を用いて４種類の断片のアミノ酸配列（配列番号：３〜配列番号：６）を決定した。
【００５４】
（ｉｉ）Ｖ８プロテア−ゼ分解断片の取得とアミノ酸配列の決定
（Ｉ）の（ｉ）で示したようにＢＯ蛋白を還元カルボキシメチル化した試料を５ｍＭの炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．９）に溶解し、Ｖ８プロテア−ゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来：ロッシュ・ダイアグノステックス製）をＢＯ蛋白量の１／５０モル量加え３７℃で６時間処理し、さらに同量のＶ８プロテア−ゼを加え３７℃で２４時間処理した反応液を塩酸でｐＨ２に調整した。Ｖ８プロテア−ゼ分解断片は、得られた分解反応液の適当量を、トリプシン分解の場合と同様にＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィ−を行なうことにより分画し取得した。尚、分画条件も同様である。
【００５５】
分画し得られたＶ８プロテア−ゼ分解断片の内、（Ｉ）の（ｉｉ）と同様のプロテインシ−クエンサ−を用いて６種類の断片のアミノ酸配列（配列番号：７〜配列番号：１２）を決定した。
【００５６】
５．ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によるＤＮＡ断片の取得
ＢＯのｃＤＮＡを含む特定のＤＮＡ領域を、ＰＣＲ法〔［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２３０，１３５０（１９８５）］、メソッド イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１５５，３３５（１９８７）］〕によって、単離増幅した。
【００５７】
（ Ｉ ）ＢＯ蛋白の一部分に対応するＤＮＡ断片の取得
（ ｉ ）ＰＣＲ法に用いたプライマーＤＮＡの合成
４．の（Ｉ）で決定されたＢＯ蛋白のアミノ末端配列（配列番号：２）の１６番目のプロリンから２２番目のグルタミンに対応する塩基配列を予想し、ＤＮＡを合成した。尚、５’側には、ＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片をサブクロ−ニングし易くするために、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を加えてある。以下に示す全てのＤＮＡ合成には、０．２μＭスケ−ルでサイクロンプラスＤＮＡ合成機（ミリジェン・バイオサ−チ社製）を使用した。このＤＮＡをＰＣＲ法のプライマーＮｏ．１とした。プライマーＮｏ．１の配列を以下に示す。
【００５８】
プライマーＮｏ．１の配列：５’ −ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＮＡＴＨＣＣＩＣＣＩＧＴＩＡＡＲＣＡ− ３’（Ｉ：イノシン、Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ、Ｈ＝Ａ、ＣまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、併せて以下同じ。）
【００５９】
次に４．の（ＩＩ）で得られたＢＯ蛋白をトリプシンで分解した断片のうち、１つの断片のアミノ酸配列（配列番号：３）に対応する塩基配列を予想してＤＮＡを合成した。尚、５’側には、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片をサブクロ−ニングし易くするために制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を加えてある。配列番号：３の６番目のグルタミン酸から１２番目のアラニンに対応するＤＮＡの相補的配列をＰＣＲ法のプライマーＮｏ．２とした。プライマーＮｏ．２の配列を以下に示す。
【００６０】
プライマーＮｏ．２：５’ ―ＣＧＧＧＡＴＣＣＲＴＣＲＴＣＩＧＣＲＴＡＩＧＧＩＣＫＴＡ ＹＴＣ― ３’ （Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｙ＝ＴＣ、併せて以下同じ。）
【００６１】
合成したＤＮＡはそれぞれ２００μＬのＴＥに溶解し、ＰＣＲ法のプライマーとして使用した。
【００６２】
（ｉｉ） ＰＣＲ 法に用いた鋳型 ＤＮＡ の調製
２．で得られた全ＲＮＡ１０μＬ（０．５μｇ）と２０μＭのＯｌｉｇｏｍｅｒ（ｄＴ）１５（ロッシュ・ダイアグノステックス製）３μＬを５００μＬ容量のチュ−ブ内で混合し、７０℃で１０分間インキュベ−トした後、すぐに氷中で冷やした。
【００６３】
次に、この得られた混合物４μＬに対し以下の試薬を混合し、３７℃で４５分間インキュベ−トした。この反応物をＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡとした。以下、この反応物を１ｓｔ ＤＮＡ ｍｉｘという。
【００６４】
［５ｘ］ ｒｅｖｅｒｓｅ ｂｕｆｆｅｒ（インビトロジェン株式会社製） ４μＬ、 ０．１Ｍ ＤＴＴ （インビトロジェン株式会社製） ２μＬ、 ＲＮａｓｉｎ（２０ｕｎｉｔｓ）（プロメガ製）１．５μＬ、２．５ｍＭ ＮＴＰｓ（東洋紡製） ８μＬ、 ＭＭＴＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２００ｕｎｉｔｓ）（インビトロジェン株式会社製） １μＬ。
【００６５】
（ｉｉｉ）ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅
反応は、Ｇｅｎｅ ＡｍｐＴＭ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ製）を用い、同社のＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＤＮＡ増幅装置）により行なった。反応溶液の組成は以下の通りである。
【００６６】
Ｈ２Ｏ ５８．５μＬ、 ［１０ｘ］Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ、 ｄＮＴＰｓ，ｍｉｘ １．２５ｍＭ １６μＬ、 プライマーＮｏ．１ ５μＬ、 プライマーＮｏ．２ ５μＬ、 １ｓｔ ＤＮＡ ｍｉｘ ５μＬ、 ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ） ０．５μＬ。
【００６７】
上記の反応液１００μＬを混合し、ミネラルオイル（シグマ社製）１００μＬを加えた。次に反応液の入ったチュ−ブをＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒにセットし、以下の条件で反応を行なった。
【００６８】
９５℃ ０．５分、３７℃ ０．５分、７２℃ ３分。
【００６９】
この条件下で反応を４０サイクル行なった後、更に７２℃で７分間インキュベ−トした。
【００７０】
（ｉｖ）増幅されたＤＮＡの回収
反応後、ミネラルオイルを除き、１００μＬのクロロホルムを加え混合し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２分）を行ない、上清を１００μＬ回収した。このうち１０μＬを用いて１％アガロ−ス電気泳動で回収されたＤＮＡのサイズと量を確認した。その結果約１．５ＫｂｐのＤＮＡ断片が約２μｇ増幅されていることがわかった。
【００７１】
残りの９０μＬを１％アガロ−ス電気泳動にかけ、１．５Ｋｂｐに相当するバンドを切りだし、ＤＮＡ精製キット、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ（ＢＩＯ １０１社製）でこのＤＮＡを抽出した。この操作で約１μｇのＤＮＡ断片が回収された。以下、このＤＮＡ断片をＢＯ−Ａという。
【００７２】
（ｖ）ＰＣＲ法で増幅されたＤＮＡの塩基配列の決定
まず、（ｉｖ）で得られたＢＯ−Ａを制限酵素ＥｃｏＲＩ、あるいはＢａｍＨＩで切断し、１％アガロ−ス電気泳動でサイズを確認した。このＢＯ−ＡはＢａｍＨＩで切断されることがわかった。したがって、制限酵素処理しないＢＯ−Ａと、適当量をあらかじめ制限酵素ＳｍａＩで切断した市販のプラスミドｐＵＣ１９（東洋紡製）［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］と混合し、ライゲ−ションキット（宝酒造製）を用いて１６℃、１８時間連結反応を行なった。
【００７３】
塩基配列は、Ｍ１３ファ−ジ（Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９）のＲＦ ＤＮＡにＤＮＡ断片をクロ−ニングし一本鎖ＤＮＡとして回収したり［メソッド イン エンザイモロジー，１０１，２０（１９８３）］、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９やｐＨＳＧ３９６、ｐＨＳＧ３９７（いずれも宝酒造製）のプラスミドにクロ−ニングし２本鎖ＤＮＡとして回収し鋳型ＤＮＡとし、当該鋳型ＤＮＡを［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰと７−Ｄｅａｚａ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＵＳＢ社製）を用いる従来公知の方法や蛍光物質利用したＴａｑＤｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ製）、ＤＮＡ増幅装置（アプライドバイオシステムズ製）及びＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズ製）を用いる方法で決定した。
【００７４】
決定されたＢＯ−Ａの塩基配列は、配列番号：１３に示した２１９番目のＣから１７７１番目のＣに相当する。
【００７５】
（ＩＩ） ＢＯ 蛋白のカルボキシル末端部分に対応する３ ’ 側の ｃＤＮＡ 断片の取得
（ｉ） ＰＣＲ 法に用いたプライマー ＤＮＡ の合成
（Ｉ）の（ｖ）で決定されたＢＯ−Ａの塩基配列のうち、特異的配列（配列番号：１３の１６９２番目のＣから１７１６番目のＧまで）のＤＮＡを合成した。このＤＮＡをＰＣＲ法のプライマーＮｏ．３とした。尚、（Ｉ）の（ｉ）と同様に５’側には制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付けてある。プライマーＮｏ．３の配列を以下に示す。
【００７６】
プライマーＮｏ．３：５’−ＴＣＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＧＴＴＣＡＧＣＧ−３’
【００７７】
もう一方のプライマーは、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの３’側のｐｏｌｙ（Ａ）配列を利用したＰＣＲ法を行なうために、３つの制限酵素認識部位（５’からＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ）のみを持つＤＮＡを合成し、このＤＮＡをＰＣＲ法のプライマーＮｏ．４とした。プライマーＮｏ．４の配列を以下に示す。
【００７８】
プライマーＮｏ．４：５’−ＧＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＴ−３’
【００７９】
合成したＤＮＡはそれぞれ２００μＬのＴＥに溶解し、ＰＣＲ法のプライマーとして使用した。
【００８０】
（ ｉｉ ） ＰＣＲ 法に用いた鋳型 ＤＮＡ の調製
まず、（Ｉ）の（ｉｉ）で使用したＯｌｉｇｏｍｅｒ（ｄＴ）１５に代えて、５’側にさらにプライマーＮｏ．４の配列をもつＤＮＡを合成し、得たＤＮＡを１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成に用いるプライマーＮｏ．５とした。プライマーＮｏ．５の配列を以下に示す。
【００８１】
プライマーＮｏ．５：５’−ＧＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣ（Ｔ）１７−３’
【００８２】
２．で得られた全ＲＮＡ １０μＬ（０．５μｇ）と２０μＭのプライマーＮｏ．５ ３μＬを５００μＬ容量のチュ−ブ内で混合し、７０℃で１０分間インキュベ−トした後、すぐに氷中で冷やした。次に、この得られた混合物４μＬに対し以下の試薬を混合し、３７℃で４５分間インキュベ−トした。この反応物をＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡとした。以下、この反応物を１ｓｔ ＤＮＡ ｍｉｘ（ｃ）とする。
【００８３】
［５ｘ］ ｒｅｖｅｒｓｅ ｂｕｆｆｅｒ（インビトロジェン製） ４μＬ、 ０．１Ｍ ＤＴＴ （インビトロジェン製） ２μＬ、 ＲＮａｓｉｎ（２０ｕｎｉｔｓ）（プロメガ製） １．５μＬ、 ２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）（東洋紡製） ８μＬ、 ＭＭＴＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２００ｕｎｉｔｓ）（インビトロジェン製） １μＬ。
【００８４】
（ｉｉｉ） ＰＣＲ 法による ＤＮＡ 断片の増幅
反応溶液の組成は以下の通りであり、ＤＮＡ増幅キット、ＤＮＡ増幅装置、増幅反応条件は、（Ｉ）の（ｉｉｉ）と同様である。
【００８５】
Ｈ２Ｏ ５８．５μＬ、 ［１０ｘ］Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ、 ｄＮＴＰｓ，ｍｉｘ １．２５ｍＭ １６μＬ、 プライマーＮｏ．３（２０μＭ） ５μＬ、 プライマーＮｏ．４（２０μＭ） ５μＬ、 １ｓｔ ＤＮＡ ｍｉｘ（ｃ） ５μＬ、 ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ） ０．５μＬ。
【００８６】
（ ｉｖ ） ＰＣＲ 法で増幅された ＤＮＡ の回収と塩基配列の決定
（Ｉ）の（ｉｖ）と同様に、回収した反応液１０μＬを用いて１．５％アガロ−ス電気泳動で増幅されたＤＮＡのサイズと量を確認した。その結果、約２９０ｂｐのＤＮＡ断片が約２μｇ増幅されていることがわかった。残りの９０μＬを１．５％アガロ−ス電気泳動にかけ、２９０ｂｐに相当するバンドを切りだし、ＤＮＡ精製キット、ＭＥＲＭＡＩＤＴＭ Ｋｉｔ（ＢＩＯ １０１社製）でこのＤＮＡを抽出した。この操作で約０．５μｇのＤＮＡ断片が回収された。以下、このＤＮＡ断片をＢＯ−Ｂという。
【００８７】
次に得られたＢＯ−Ｂを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、あらかじめ同じ制限酵素で切断したプラスミドｐＵＣ１９にサブクロ−ニングした。その結果得られたＢＯ−Ｂを含むプラスミドｐＵＣＢＯ−Ｂの塩基配列を決定した。この場合の塩基配列決定は７−Ｄｅａｚａ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−Ｋｉｔ（ＵＳＢ社製）を用いる従来公知の方法でおこなった。
【００８８】
決定されたＢＯ−Ｂの塩基配列は、配列番号：１３に示した１６９２番目のＣから１９５９番目のＡに相当する。ＢＯ−ＡとＢＯ−Ｂの塩基配列を比較すると１６９２番目のＣから１７７１番目のＣが完全に一致すること、この塩基配列から予想されるアミノ酸配列とＢＯ蛋白をＶ８プロテア−ゼで分解した断片の配列の内、配列番号：７の配列と一致すること、その配列のすぐ後にストップコドン（配列番号：１３の塩基配列で１７８２番目から１７８４番目）が現われ、３’末端にｐｏｌｙ（Ａ）配列が存在することから、ＢＯ−Ｂは、目的のＢＯ蛋白のカルボキシル末端部分に対応する３’側のｃＤＮＡ断片である。
【００８９】
（ ＩＩＩ ） ＢＯ 蛋白のアミノ末端部分に対応する５ ’ 側の ｃＤＮＡ 断片の取得
（ ｉ ） ＰＣＲ 法に用いたプライマー ＤＮＡ の合成
（Ｉ）の（ｖ）で決定されたＢ０−Ａの塩基配列のうち、以下に示す特異的配列（配列番号：１３の３２２番目から３４８番目）の相補的配列のＤＮＡを合成した。このＤＮＡをＰＣＲ法のプライマーＮｏ．６とした。プライマーＮｏ．６の配列を以下に示す。
【００９０】
プライマーＮｏ．６：５’−ＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＡＡＣＣＴＧＧＴ−３’
【００９１】
ＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡの合成をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン製）を用いて行なうと、２本鎖ｃＤＮＡ混合物の５’末端にＳａｌＩアダプタ−が導入される。従って、もう一方のプライマーは、この配列を利用することにした。以下に示す配列を合成し、ＰＣＲ法のプライマーＮｏ．７とした。プライマーＮｏ．７の配列を以下に示す。
【００９２】
プライマーＮｏ．７：５’−ＴＣＧＡＣＣＣＡＣＧＣＧＴＣＣＧ−３’
【００９３】
合成したＤＮＡはそれぞれ２００μＬのＴＥに溶解し、ＰＣＲ法のプライマーとして用いた。
【００９４】
（ｉｉ） ＰＣＲ 法に用いた鋳型 ＤＮＡ の調製と ＤＮＡ 断片の増幅
３．で得られたｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを２．５μｇ使用して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン製）により２本鎖ｃＤＮＡ合成し、ＳａｌＩアダプタ−の付加及び制限酵素ＮｏｔＩで切断した反応液をフェノ−ル／クロロホルム抽出、エタノ−ル沈殿、乾燥を行ない、最終的にＴＥ ５０μＬに溶解させたサンプルを鋳型ＤＮＡとした。以下この鋳型ＤＮＡをｃＤＮＡ ｍｉｘという。
【００９５】
ＰＣＲ法の反応溶液の組成は以下の通りであり、ＤＮＡ増幅キット、ＤＮＡ増幅装置、増幅反応条件は、（Ｉ）の（ｉｉｉ）と同様である。
【００９６】
Ｈ２Ｏ ６０．５μＬ、 ［１０ｘ］ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ、 ｄＮＴＰｓ，ｍｉｘ １．２５ｍＭ １６μＬ、 プライマーＮｏ．６（２０μＭ） ５μＬ、 プライマーＮｏ．７（２０μＭ） ５μＬ、 ｃＤＮＡ ｍｉｘ ３μＬ、 ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ） ０．５μＬ。
【００９７】
（ｉｉｉ） ＰＣＲ 法で増幅された ＤＮＡ の回収と塩基配列の決定
（ＩＩ）の（ｉｖ）と同様にＤＮＡを回収し、その結果、約３５０ｂｐのＤＮＡ断片が、約０．５μｇ得られた。以下、このＤＮＡ断片をＢＯ−Ｃという。
【００９８】
次に得られたＢＯ−Ｃを制限酵素ＳａｌＩとＢａｍＨＩで切断し、あらかじめ同じ制限酵素で切断したプラスミドｐＵＣ１９にサブクロ−ニングした。その結果得られたＢＯ−Ｃを含むプラスミドｐＵＣＢＯ−Ｃの塩基配列を決定した。この場合の塩基配列決定は７−Ｄｅａｚａ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−Ｋｉｔ（ＵＳＢ社製）を用いる従来公知の方法でおこなった。決定されたＢＯ−Ｃの塩基配列は、配列番号：１３に示した１番目のＡから３４８番目のＧに相当する。ＢＯ−ＡとＢＯ−Ｃの塩基配列を比較すると２１９番目のＣから３４８番目のＧまでの配列が完全に一致すること、この塩基配列から予想されるアミノ酸配列（配列番号：１３の塩基配列では１８０から２５４番に相当する）とＢＯ蛋白のアミノ末端配列が一致することから、ＢＯ−Ｃは、ＢＯ蛋白のアミノ末端部分に対応する５’側のｃＤＮＡ断片である。
【００９９】
以上、得られたＢＯ−Ａ、ＢＯ−Ｂ及びＢＯ−ＣのＤＮＡ断片のオ−バ−ラップする塩基配列部分を考慮し、結合させた全体の塩基配列を配列番号：１３に示した。
【０１００】
６．前駆体部分と成熟体の ＢＯ （ ＢＯ 蛋白）部分の全体を含む ＤＮＡ 断片の取得
（ｉ）ＰＣＲ法によるオ−プンリ−ディングフレ−ム全体を含むＤＮＡ断片の増幅
５．の（ＩＩＩ）で得られたＢＯ−Ｃの塩基配列の内、配列番号：１３の第１２番目のＴから第３６番目のＴまでの配列とＢＯ−Ｂの塩基配列の内、配列番号：１３の第１８７８番目のＣから第１９０２番目のＧまでの配列の相補的配列のＤＮＡを合成した。それぞれの合成ＤＮＡをＰＣＲのプライマーＮｏ．８、プライマーＮｏ．９として用いた。また、５．の（ＩＩＩ）で得たｃＤＮＡ ｍｉｘをＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。
【０１０１】
ＰＣＲの反応溶液の組成は以下の通りであり、ＤＮＡ増幅キット、ＤＮＡ増幅装置、増幅反応条件は、（Ｉ）の（ｉｉｉ）と同様である。
【０１０２】
Ｈ２Ｏ ６０．５μＬ、 ［１０ｘ］ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ、 ｄＮＴＰｓ，ｍｉｘ １．２５ｍＭ １６μＬ、 プライマーＮｏ．８（２０μＭ） ５μＬ、 プライマーＮｏ．９（２０μＭ） ５μＬ、 （ＩＩＩ）の（ｉｉ）のｃＤＮＡ ｍｉｘ ５μＬ、 ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ） ０．５μＬ。
【０１０３】
（ｉｉ） ＰＣＲ で増幅された ＤＮＡ の回収と塩基配列の決定
（ＩＩ）の（ｉｖ）と同様にＤＮＡを回収し、その結果、約１．９ｋｂｐのＤＮＡ断片が、約１μｇ得られた。以下、このＤＮＡ断片をＢＯ−ｆｕｌｌという。
【０１０４】
次に得られたＢＯ−ｆｕｌｌを、あらかじめ制限酵素ＳｍａＩで切断したプラスミドｐＵＣ１９にサブクロ−ニングし、ＢＯ−ｆｕｌｌを含むプラスミドを得た。以下、このプラスミドをｐＵＣ−ＢＯという。
【０１０５】
実施例２ ビリルビンオキシダーゼ発現プラスミドの構築
アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のタカアミラーゼ遺伝子の高発現プロモーター（ｔａａＧ２）とビリルビンオキシダーゼ遺伝子を融合させて発現プラスミドを構築した。ｔａａＧ２プロモーターを含むプラスミドｐＣＡＭＥ３（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＣＡＭＥ３）、寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１８９６６））を鋳型として、
プライマーＢＯ−ＴＡＡ：５’−ＧＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＧＴＴ―３’（配列番号：１４）
プライマーＢＯ−Ｐ２ ：５’−ＴＧＴＧＴＧＴＴＴＧＡＡＣＡＴＡＡＡＴＧＣＣＴＴＣＴＧ―３’（配列番号：１５）
を用いてＰＣＲ法によりｔａａＧ２プロモーターを含む６４０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。ビリルビンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ−ＢＯ（特許第３１８１６６０号公報参照）を鋳型として、
プライマーＢＯ−Ｐ１ ：５’−ＣＡＧＡＡＧＧＣＡＴＴＴＡＴＧＴＴＣＡＡＡＣＡＣＡＣＡ−３’（配列番号：１６）
プライマーＢＯ−ＫＰＮ ：５’−ＧＴＴＣＴＣＡＧＣＡＧＴＧＡＴＡＴＧＣＡＴＡＧＣ−３’（配列番号：１７）
を使用して、ＰＣＲ法によりビリルビンオキシダーゼ遺伝子のＫｐｎＩ切断部位までの約５２０ｂｐのＤＮＡ断片（ＢＯ−Ｄ）を得た。上記両ＤＮＡ断片を等量混合したものを鋳型とし、プライマーＢＯ−ＴＡＡとプライマーＢＯ−ＫＰＮを用いて再度ＰＣＲを実施し、タカアミラーゼプロモーター（ｔａａＧ２）とビリルビンオキシダーゼ遺伝子の５’−末端側ＫｐｎＩ切断部位までが連結した１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片（ｔａａＧ２−ＢＯ−Ｄ）を得た。次いで、上記ＰＣＲ断片及びｐＵＣ−ＢＯを制限酵素ＫｐｎＩとＳｓｅ８３８７Ｉで切断してそれぞれ１１２７ｂｐのＤＮＡ断片（ｔａａＧ２−ＢＯ−Ｄ）及び１２７４ｂｐのＤＮＡ断片（ＢＯ−Ｅ）を得、ノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）由来ｐｙｒ４遺伝子を選択マーカーとして持つプラスミドｐＴＧ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＴＧ１）、寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１８９６５）の制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ切断サイトに挿入し、発現プラスミドｐＴＧ１−ＢＯを構築した。上記Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）反応ではＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ ＧＲＡＤＩＥＮＴ４０（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を使用し、反応組成は、鋳型ＤＮＡ２５０ｎｇ、プライマー各２００ｎＭ、Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ（Ｅｘ Ｔａｑ Ｖｅｒｓｉｏｎ、宝酒造製）２０〜５０μＬ とし、ＰＣＲ条件をＳｔｅｐ １；９５℃ １分、Ｓｔｅｐ ２：９５℃ １分、５６℃ １分、７２℃ １分（３０サイクル）、Ｓｔｅｐ ３：７２℃ ５分、Ｓｔｅｐ ４：４℃とした（以下、実施例３〜６において同じ。）。
【０１０６】
実施例３ アスペルギルス・ニドランス（ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ）におけるビリルビンオキシダーゼの発現
アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）Ｇ１９１株（ＦＧＳＣ（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）Ｎｏ．Ａ７２２株）の形質転換は Ｄ．Ｊ．ＢａｌａｎｃｅとＧ．Ｔｕｒｎｅｒの方法（Ｇｅｎｅ，３６，３２１（１９８５））に従って行った。形質転換株をデンプン培地（可溶性デンプン １．０％（ｗ／ｖ）、硝酸ナトリウム０．６％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム０．１５２％（ｗ／ｖ）、塩化カリウム０．０５２％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム０．０５２％（ｗ／ｖ）、ｐ−アミノ安息香酸０．０００２％（ｗ／ｖ）、硫酸銅０．００２％（ｗ／ｖ）、０．５ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、寒天１．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ＝６．５）に植菌し、３７℃で培養して菌体に再生させ、ＡＢＴＳの縮合による発色によりビリルビンオキシダーゼ生産能を示す形質転換株を得た。
【０１０７】
実施例４ ビリルビンオキシダーゼの製造法
実施例２で得られたビリルビンオキシダーゼ生産能を有する形質転換株を液体培地（マルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン１．０％（ｗ／ｖ）、硝酸ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム０．０５％（ｗ／ｖ）、硫酸銅０．００２％（ｗ／ｖ）、ｐ−アミノ安息香酸２μｇ／ｍＬ、ｐＨ６．５）に胞子を植菌し、３０℃で９６時間通気培養して、ビリルビンオキシダーゼを発現させた。
【０１０８】
培養液（１Ｌ、０．１ｕ／ｍＬ）から菌体を除去した培養上清に、５０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、１時間攪拌した。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０分間）した上清に更に７０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、さらに１時間攪拌した。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０分間）し、得られた沈澱を０．０８ｍＭ硫酸銅を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、さらに同緩衝液で一晩透析した。予め同緩衝液で平衡化したＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑカラム（６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス株式会社に透析液を供し、０〜０．５Ｍ食塩を含む同緩衝液で溶離した。活性画分を透析後濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（１２０ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス株式会社に供し、０．２Ｍ食塩を含む同緩衝液で溶離した。活性画分を回収したのち透析で脱塩後凍結乾燥することにより精製ビリルビンオキシダーゼ１０ｍｇ（４０ｕ）を得た。
【０１０９】
実施例５ 変異型ビリルビンオキシダーゼの作製
精製したｐＴＧ１−ＢＯプラスミドを鋳型として、オーバーラップＰＣＲ法により部位特異的変異を導入した。ｐＴＧ１−ＢＯを鋳型とし、
プライマーＢＯ−ＫＥ：５’−ＣＴＡＣＣＣＡＡＡＴＡＧＡＣＡＧＴＣＴＧＣＴＣＧ−３’ （配列番号：１８）、
プライマーＤ３６１Ｐ／Ｑ３６４Ｐ−２：
５’−ＧＧＴＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＴＣＴＧＣＴＡＣ−３’（配列番号：１９）
を用いてＰＣＲを行った。同様に、プライマーＢＯ−ＶＨ：
５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＴ−３’（配列番号：２１）、
プライマーＤ３６１Ｐ／Ｑ３６４Ｐ−１：
５’−ＧＴＡＧＣＡＧＡＣＣＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣ−３’（配列番号：２２）
を用いてＰＣＲを行った。１．２％アガロースゲル電気泳動後両ＰＣＲ断片を抽出し、両者を混合したものを鋳型として、プライマーＢＯ−ＫＥとＢＯ−ＶＨを使用して再度ＰＣＲを行った。得られたＤＮＡを精製し、制限酵素ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＵＣ１１９に連結し大腸菌ＪＭ１０９に導入した。目的とする変異点以外に変異が生じていないことを塩基配列を決定して確認した。このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＴ１４ＩとＶａｎ９１Ｉで切断して得られた変異が導入されたＤＮＡ断片を、ｐＴＧ１−ＢＯの同様の制限酵素切断断片と置換したプラスミドを得た。アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）Ｇ１９１株を形質転換し培養・精製することで、変異型ビリルビンオキシダーゼ８ｍｇ（３０ｕ）を得た。培養・精製は、実施例５記載の条件に従った。
【０１１０】
実施例６ 変異型ビリルビンオキシダーゼの安定性の測定
実施例５で得られた変異型ビリルビンオキシダーゼの安定性を、野生型酵素と比較した。各酵素を１６μｇ／ｍＬとなるように８０μＭ 硫酸銅を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、６０℃で熱処理を行った。一定時間毎に残存活性を測定した。その結果を表１に記載した。
【０１１１】
【表１】
【０１１２】
表１に示す６０℃での熱安定性試験結果から明らかなように、本発明のビリルビンオキシダーゼである変異型ビリルビンオキシダーゼの活性半減期（残存活性が５０％となるまでの時間）は、従来の野生型ビリルビンオキシダーゼの半減期よりも１．７倍向上してしていた。この高い耐熱性により、従来のビリルビン測定試薬よりも更に安定性の優れたビリルビン測定試薬が提供できるとともに、ビリルビン測定試薬のコスト低減も図ることができ、更にビリルビンの測定においてもより信頼性の高い結果が期待できる。
【０１１３】
【発明の効果】
野生型ビリルビンオキシダーゼのアミノ酸配列（配列番号：１）に改変を加えることにより、本発明で得られるビリルビンオキシダーゼ、即ち、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼ、配列表の配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、３６１位または３６４位のプロリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ、配列表の配列番号２３で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ、配列表の配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ、配列表の配列番号２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子によりコードされ、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼは、野生型ビリルビンオキシダーゼを含む従来のビリルビンオキシダーゼに比して熱安定性が向上しているため、より安定性の高いビリルビン測定試薬を提供できるとともに、当該ビリルビン測定試薬のコストを低減することができ、更にビリルビンの測定においてもより信頼性の高い結果が期待できる。
【０１１４】
以下、次の事項を開示する。
（１１）配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、３６１位又は３６４位のプロリンが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンから選ばれたアミノ酸により置換されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ。
（１２）耐熱性が、８０μＭ 硫酸銅を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中、６０℃で３０分処理する場合において、残存活性が５０％以上である（１１）記載のビリルビンオキシダーゼ。
（１３）残存活性が５５％以上である（１２）記載のビリルビンオキシダーゼ。（２１）配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ８０μＭ 硫酸銅を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中、６０℃で３０分処理する場合において、残存活性が５０％以上であるビリルビンオキシダーゼ。
（２２）残存活性が５５％以上である（２１）記載のビリルビンオキシダーゼ。（３１） 配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ８０μＭ 硫酸銅を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中、６０℃で３０分処理する場合において、残存活性が５０％以上であるビリルビンオキシダーゼ。
（３２）残存活性が５５％以上である（３１）記載のビリルビンオキシダーゼ。（３３）相同性が８０％以上である（３１）または（３２）記載のビリルビンオキシダーゼ。
（３４）相同性が９０％以上である（３１）乃至（３３）のいずれかに記載のビリルビンオキシダーゼ。
（４１）配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子によりコードされ、かつ８０μＭ 硫酸銅を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中、６０℃で３０分処理する場合において、残存活性が５０％以上であるビリルビンオキシダーゼ。
（４２）残存活性が５５％以上である（４１）記載のビリルビンオキシダーゼ。（５１）（１１）乃至（１３）、（２１）、（２２）、（３１）乃至（３４）、（４１）、（４２）のいずれかに記載のビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子。
（６１）（５１）に記載の遺伝子を含む組換え発現プラスミド。
（７１）（６１）に記載の組換えプラスミドを含む形質転換体。
（８１）（７１）に記載の形質転換体を栄養培地で培養し、得られる培養物からビリルビンオキシダーゼを採取することを特徴とするビリルビンオキシダーゼの製造法。
（９１）（１１）乃至（１３）、（２１）、（２２）、（３１）乃至（３４）、（４１）、（４２）のいずれかに記載のビリルビンオキシダーゼを含むビリルビンアッセイキット。
【０１１５】
【発明が属する技術分野】
本発明は、従来のビリルビンオキシダーゼに比して、耐熱性に優れたビリルビンオキシダーゼ、その遺伝子、当該遺伝子を含む組換えプラスミド、当該プラスミドにより得られる形質転換体、当該形質転換体を用いるビリルビンオキシダーゼの製造法および耐熱性に優れたビリルビンオキシダーゼを含むビリルビンアッセイキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビリルビンオキシダーゼは、ビリルビンをビリベルジンに酸化する反応を触媒する、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ）酵素委員会により酵素番号ＥＣ１．３．３．５として分類された酵素である。
【０００３】
ミロセシウム属由来のビリルビンオキシダーゼ（特公昭６０−１２０３１号公報、特公昭６０−１２０３２号公報参照）は、既に遺伝子組換え技術をもちいた量産化システムも構築されており（特許第３１８１６６０号公報参照）、生化学用に広く利用されているものの、安定性の点で十分ではないことが欠点であった。特に、多くの生化学検査用試薬が低温で１〜２年間の性能保証をもつ液状試薬に変わった近年、このビリルビンオキシダーゼを利用したビリルビン測定試薬の開発においては、安定性を向上させるため種々の安定化剤が添加されている。例えば、アミノ酸、金属塩、糖、有機酸塩（特開平６−２８４８８６号公報参照）、ハロゲン化物塩（特開平７−２０３９６２号公報参照）、緩衝液組成又はカルボン酸塩（特許第２８２０８９３号公報参照）、還元剤（特開平１０−４２８９６号公報参照）、含窒素複素環化合物のメルカプト誘導体（特開平１０−７５７７９号公報参照）、ペンタシアノ鉄錯塩、ヘキサシアノ錯塩、第３級アミン類（特開２０００−８３６６１号公報参照）、リチウム化合物、ホモシステイン（特開２０００−２５３８７３号公報参照）が挙げられる。しかし、これらの安定化剤の添加でも安定性は十分とは言えず、コストの点からも安定なビリルビンオキシダーゼの開発が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、従来知られているビリルビンオキシダーゼに見られない優れた耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼを遺伝子工学的手法により提供するとともに、その大量生産に必要な遺伝子、当該遺伝子を含む組換えプラスミド、当該プラスミドにより得られる形質転換体、当該形質転換体によるビリルビンオキシダーゼの製造法および耐熱性に優れたビリルビンオキシダーゼを含むビリルビンアッセイキットを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ミロセシウム属由来のビリルビンオキシダーゼ遺伝子の遺伝子改変を行ない、ある種のアミノ酸置換により、従来知られているビリルビンオキシダーゼに見られない優れた耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼを製造することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
即ち、本発明は以下の構成を有する。
［１］配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼ。
［２］ 配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、３６１位又は３６４位のプロリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ。
［３］配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ。
［４］ 配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ。
［５］配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子によりコードされ、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ。
［６］［１］ないし［５］のいずれかに記載のビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子。
［７］［６］記載の遺伝子を含む組換え発現プラスミド。
［８］［７］記載の組換えプラスミドを含む形質転換体。
［９］［８］記載の形質転換体を栄養培地で培養し、得られる培養物からビリルビンオキシダーゼを採取することを特徴とするビリルビンオキシダーゼの製造法。［１０］［１］ないし［５］のいずれかに記載のビリルビンオキシダーゼを含むビリルビンアッセイキット。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の構成を詳細に説明する。
本発明は、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子に関する。ただし、当該遺伝子に限定されず、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、３６１位または３６４位のプロリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子も含む。ここで、他のアミノ酸とは、具体的にはアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンをいい（以下同じ。）、耐熱性とは、実施例６に記載の条件、即ち、８０μＭ 硫酸銅を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に本発明のビリルビンオキシダーゼを１６μｇ／ｍＬとなるように溶解した溶液を６０℃で熱処理する場合において、残存活性が熱処理時間が３０分の場合に５０％以上であることをいい、好ましくは５５％以上であることをいう（以下同じ。）。また、本発明では、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼをコードする全ての遺伝子を含む。更に、本発明では、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子を含む。更にまた、本発明では、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子によりコードされ、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子を含む。ここで、ハイブリダイズのためのストリンジェントな条件とは、例えば、野村慎太郎、稲澤譲治著「脱アイソトープ実験プロトコール」ｐ．４０（秀潤社、１９９４）に記載の条件（５００ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．２），７％ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡ、６５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、４０ｍＭ ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ、６５℃で５分間づつ計４回の洗浄を行う。）が挙げられる。
【０００８】
本発明のビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子は、微生物の遺伝子を用いて公知の手法またはこれに準ずる方法で得ることができる。
１．本発明の耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ遺伝子の取得
以下に、本発明のビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子の取得手順を例示する。
（１） ｐＵＣ−ＢＯの取得
ミロセシウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ）ＭＴ−１（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３）を通常の糸状菌を培養する培地で培養後、菌体を分取する。当該菌体から全ＲＮＡを常法に従い調製する。市販のｍＲＮＡ精製キットを用いて、ポリＡ ＲＮＡを回収する。精製したビリルビンオキシダーゼのＮ末端のアミノ酸配列とプロテアーゼで切断したペプチドのアミノ酸配列を決定する。ＢＯ蛋白の一部分に対応する増幅用プライマーを設計し、上記の全ＲＮＡから逆転写反応により調製したｃＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼチェインリアクション（以下、「ＰＣＲ」ともいう。）反応で増幅し、ＢＯ蛋白の一部分に対応するＤＮＡ断片（以下、「ＢＯ−Ａ」ともいう。）を回収しその塩基配列を決定する。
【０００９】
ＢＯ蛋白のカルボキシル末端部分に対応する増幅用プライマーを設計し、上記のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応で増幅し、ＢＯ蛋白のカルボキシル末端部分に対応するＤＮＡ断片（以下、「ＢＯ−Ｂ」ともいう。）を回収しその塩基配列を決定する。
【００１０】
ＢＯ蛋白のアミノ末端部分に対応する増幅用プライマーを設計し、ポリＡ ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応で増幅し、ＢＯ蛋白のアミノ末端部分に対応するＤＮＡ断片（以下、「ＢＯ−Ｃ」ともいう。）を回収しその塩基配列を決定する。
【００１１】
ＢＯ蛋白のオープンリーディングフレーム全体に対応する増幅用プライマーを設計し、上記のｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応で増幅し、ＢＯ蛋白のオープンリーディングフレーム全体に対応するＤＮＡ断片（以下、「ＢＯ−ｆｕｌｌ」ともいう。）を回収し、ｐＵＣ１９プラスミドに挿入し、野生型ビリルビンオキシダーゼの組換えプラスミド（以下、「ｐＵＣ−ＢＯ」ともいう。）を得る。
【００１２】
野生型ビリルビンオキシダーゼ遺伝子の給源としては、得られた野生型ビリルビンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列に基づき合成した適当なプライマーを用いてＰＣＲを行うこと、あるいは本発明で得られた野生型ビリルビンオキシダーゼ遺伝子中の断片をプローブとしたストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることにより、増幅ＤＮＡ断片あるいはシグナルが得られる微生物であればよく、好ましくはミロセシウム属に属する微生物であり、より好ましくはミロセシウム・ベルカリアに属する微生物である。この種の具体的な菌株としてミロセシウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ）ＭＴ−１（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３）を挙げることができる。
【００１３】
野生型ビリルビンオキシダーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号：１３）が明らかになったことから、本発明のビリルビンオキシダーゼ遺伝子は、野生型ビリルビンオキシダーゼ遺伝子を鋳型として、このＤＮＡ配列に基づいて合成した適当なプライマーを用いて、ＰＣＲを行ない野生型ビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子を取得し、上記の本願の出願時において常用される技術、例えば、ヒドロキシルアミン、亜硝酸、ヒドラジン、ギ酸等の化学変異剤を用いる方法やＰＣＲ法を用いてランダムに変異を導入する方法等の点変異、市販キットを利用する部位特異的に置換、欠損変異を生じさせる部位特異的変異法などの各種方法を用いて取得することができる。
【００１４】
（２） 発現プラスミド ｐＴＧ１−ＢＯの構築
（１）で取得したｐＵＣ−ＢＯを鋳型として、ＰＣＲにより、Ｋｐｎ１サイトを含むビリルビンオキシダーゼ遺伝子の前半部分の遺伝子（以下、「ＢＯ−Ｄ」ともいう。）を得る。 アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のタカアミラーゼプロモーター（ｔａａＧ２、Ｎ．Ｔｕｋａｇｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ，８４，３１９−３２７（１９８９））を含むｐＣＡＭＥ３（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＣＡＭＥ３）（寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１８９６６）として平成１４年８月７日独立行政法人産業技術総合研究所に寄託）を鋳型としてＰＣＲによりｔａａＧ２プロモーター遺伝子（以下、「ｔａａＧ２」ともいう。）を得る。次に、ＰＣＲによりＢＯ−ＤとｔａａＧ２が連結した遺伝子（以下、「ｔａａＧ２−ＢＯ−Ｄ」ともいう。）を得る。一方、ｐＵＣ−ＢＯより、制限酵素Ｋｐｎ１および制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉを用いビリルビンオキシダーゼ遺伝子の後半部分の遺伝子（以下、「ＢＯ−Ｅ」ともいう。）を切り出す。次に、ｔａａＧ２−ＢＯ−ＤとＢＯ−ＥをＫｐｎ１サイトで連結させ、ノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）由来ｐｙｒ４遺伝子を選択マーカーとして持つプラスミドｐＴＧ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＴＧ１）（寄託番号：ＦＥＲＭＰ−１８９６５）として平成１４年８月７日独立行政法人産業技術総合研究所に寄託）の制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ切断サイトに挿入し、発現プラスミドｐＴＧ１−ＢＯを構築する。
【００１５】
（３）変異型ビリルビンオキシダーゼ遺伝子の取得
上記のｐＴＧ１―ＢＯを鋳型として、以下に示すオーバーラップＰＣＲ法による部位特異的変異により組換えビリルビンオキシダーゼ発現プラスミドを作製する。即ち、ｐＴＧ１―ＢＯを鋳型として、２組のプライマー（▲１▼プライマーＢＯ−ＫＥ、プライマーＤ３６１Ｐ／Ｑ３６４Ｐ−２、▲２▼プライマーＢＯ−ＶＨ、プライマーＤ３６１Ｐ／Ｑ３６４Ｐ−１）を用いて、各組のプライマーによりそれぞれのＰＣＲ断片を得る。次に、得られたこれらのＰＣＲ断片を混合したものを鋳型としてＰＣＲを行った後、２種の制限酵素（ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ）により切断した遺伝子断片をプラスミド（ｐＵＣ１１９）に連結する。該連結プラスミドを大腸菌に導入し、組換えビリルビンオキシダーゼの塩基配列を確認する。該連結プラスミドを２種の制限酵素（ＥｃｏＴ１４Ｉ、Ｖａｎ９１Ｉ）で切断した遺伝子断片を発現プラスミドｐＴＧ−ＢＯの野生型ビリルビンオキシダーゼ遺伝子と交換して、耐熱性ビリルビンオキシダーゼ発現プラスミドを得る。
【００１６】
本発明のビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子（以下、「本発明のビリルビンオキシダーゼ遺伝子」ともいう。）の塩基配列が明らかとなったことから、当該遺伝子は化学合成法により取得することができる。また、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、３６１位または３６４位のプロリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子によりコードされ、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼをコードする全ての遺伝子は、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子に基づき、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、あるいはＰＣＲを利用した方法等の公知の手法又はこれに準ずる方法、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（宝酒造株式会社製）、Ｍｕｔａｎｔ−Ｇ（宝酒造株式会社製）、あるいはＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ シリーズキット（宝酒造株式会社製）を用いて得ることができる。
【００１７】
２．組換えビリルビンオキシダーゼ発現プラスミドの作製
本発明の組換え発現プラスミドは、適当なベクターに本発明の遺伝子を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主である原核細胞、酵母中で自律複製可能なもの、あるいは糸状菌、動物、昆虫細胞の染色体に組み込み可能なベクターであれば特に限定されず、例えば、プラスミド ＤＮＡ、ファージ ＤＮＡ等が挙げられる。プラスミド ＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド、例えば、ｐＥＴ系（宝酒造株式会社製）、ｐＧＥＸ系（アマシャム・バイオサイエンス製等）、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）、枯草菌由来のプラスミドとしては、例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等、酵母由来のプラスミドとしては、例えば、ｐＡＵＲ系（宝酒造株式会社製等）などが挙げられる。さらに、レトロウイルスまたはワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスＢａｃＶｅｃｔｏｒ（宝酒造株式会社製）などの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００１８】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクター ＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が宿主内で発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のプラスミドには、プロモーター、本発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを含有するものを連結することが望ましい。
【００１９】
プロモーターは、宿主中で発現できるものであれば特に限定されない。例えば大腸菌が宿主の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。
【００２０】
酵母が宿主の場合のプロモーターは、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を用いることができる。
【００２１】
糸状菌が宿主の場合、タカアミラーゼプロモーター、アスパラギン酸プロティナーゼプロモーター、α―アミラーゼプロモーター、リパーゼプロモーター、アルコール脱水素酵素プロモーター等を用いることができる。
【００２２】
動物細胞を宿主とする場合は、プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。
【００２３】
また本発明の組換え発現プラスミドには、本発明の遺伝子、プロモーターのほか、形質転換体の選択を容易にする選択マーカーが付加していることが望ましい。原核細胞、酵母、糸状菌、動物、昆虫細胞等で利用可能な選択マーカーであれば特に限定されることはなく、カナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子あるいはａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤ等の栄養要求性相補遺伝子等が挙げられる。
【００２４】
３．形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換え発現プラスミドを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、原核生物又は真核生物のいずれでも良い。原核生物の例として、例えば、大腸菌等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌が挙げられる。真核生物の例としては下等真核生物である酵母や糸状菌が使用でき、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属等の酵母、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等が挙げられ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等などの糸状菌、動物細胞あるいはＳｆ９等の昆虫細胞が挙げられる。
【００２５】
大腸菌としては、例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。大腸菌などの細菌への組換えプラスミドの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２））、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００２６】
酵母としては、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが挙げられる。酵母への組換えプラスミドの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １９４：１８２（１９９０））、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７５：１９２９（１９７８））、酢酸リチウム法（Ｉｔｏｈ，Ｈ．：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３：１６３（１９８３））等が挙げられる。
【００２７】
糸状菌としては、アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・カマンベルチー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ）などがあげられる。糸状菌への組換えプラスミドの導入方法は、糸状菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばプロトプラスト法（Ｄ．Ｊ．Ｂａｌａｎｃｅ．Ｇ．Ｔｕｒｎｅｒ． Ｇｅｎｅ，３６，３２１，１９８５）、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００２８】
動物細胞としては、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが用いられる。動物細胞への組換えプラスミドの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えプラスミドの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００２９】
遺伝子の宿主への組込みの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００３０】
４．ビリルビンオキシダーゼの製造
本発明のビリルビンオキシダーゼは、配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼである。ただし、これに限定されず、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、３６１位または３６４位のプロリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼも含む。また、本発明では、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼを含む。更に、本発明は、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼを含む。また、本発明は、配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子によりコードされ、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼを含む。
【００３１】
例えば、本発明のビリルビンオキシダーゼの好適例として、ミロセシウム・ベルカリア（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｖｅｒｒｕｃａｒｉａ）ＭＴ−１（寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３）由来の野生型ビリルビンオキシダーゼ（配列番号：１）の３６１位のアスパラギン酸および３６４位のグルタミンがともにプロリンに置換されたことにより耐熱性を獲得したビリルビンオキシダーゼ（配列番号：２３）が挙げられる。当該ビリルビンオキシダーゼは、従来のビリルビンオキシダーゼに見られない高い耐熱性を示すという優れた性質を持っている。
【００３２】
本発明のビリルビンオキシダーゼは、前記の形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。当該培養物には、培養上清、あるいは培養細胞もしくは培養菌体または細胞もしくは菌体の破砕物のいずれも含まれる。
【００３３】
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われ、固体培養法、液体培養法のいずれでも良い。大腸菌、酵母、糸状菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３４】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸及びその塩、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩（例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム等）が挙げられ、その他含窒素化合物（例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、アミノ酸混合物等）が挙げられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【００３５】
培養は、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下行うが、培養温度は形質転換体が良好に生育する条件であれば良く、通常１０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃である。培地のｐＨは形質転換体が良好に生育するｐＨであれば良く、通常ｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ５〜８である。培養時間は、通常１０〜１００時間、好ましくは２０〜７０時間である。なお、培地のｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリン、フレオマイシン、ハイグロマイシン、ブレオマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてＩＰＴＧ、インドール酢酸（以下、「ＩＡＡ」ともいう。）、デンプン等のインデューサーを培地に添加してもよい。
【００３６】
培養後、形質転換体の培養物から本発明のビリルビンオキシダーゼを採取するには、本発明のビリルビンオキシダーゼが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、ろ過、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる通常のタンパク質精製法、例えば、熱処理、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、電気泳動法、等電点電気泳動法等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のビリルビンオキシダーゼを単離精製することができる。また、本発明のビリルビンオキシダーゼが菌体内又は細胞内で生産される場合には、菌体又は細胞を超音波破砕機、磨砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の物理的な破壊手段あるいは界面活性剤、溶菌酵素等を用いる生化学的破壊手段により破壊して、本発明のビリルビンオキシダーゼの抽出液を調製し、その後は上記の精製手法と同様にして行うことができる。
【００３７】
５．耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼを含むビリルビンアッセイキット
本発明は、生化学試料中の各種ビリルビンを測定するために有用な、耐熱性に優れたビリルビンオキシダーゼを含むビリルビンアッセイキットである。
本発明の耐熱性を有するビリルビンアッセイキットは、本発明の耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼを少なくとも１回のアッセイに十分な量含む。具体的には、キットは、本発明の耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのビリルビン標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明の耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液としてあるいはまたセンサーストリップとして提供することができる。
【００３８】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下に記載する実施例に限定されるものではない。
【００３９】
実施例１ ｐＵＣ−ＢＯの取得
１．菌株の培養
まずＢＯを分泌発現する生産菌を以下の如く培養した。培養の為の培地には以下に示すポテトグルコース培地を使用した。
【００４０】
ポテトグルコース培地の作製法
１）馬鈴薯の皮及び芽をとり約１ｃｍの角切りにしたのち、４００ｇを上皿天秤で秤量してステンレスバットに入れる。
２）脱イオン水１０００ｍＬをメスシリンダーで量り、上記のステンレスバットに加え、アデカノールＬＧ−１２６（旭電化工業製）を３滴添加する。
３）ガスコンロではじめ強火で沸騰させ、その後は弱火で２時間煮沸する。その後、流水中で冷却する。
４）冷却後、ガーゼ２枚でろ過する。
５）ろ液を１０００ｍＬに脱イオン水でフィルアップし、グルコースを１０ｇ加えて溶解する。
６）１２１℃で、３０分間オートクレーブする。
【００４１】
上記の如く作製されたポテトグルコース培地２ｍＬに、胞子形成を行なっていないミロセシウム・ベルカリアＭＴ−１（以下、ＢＯ生産菌という。）を接種して１４０ｒｐｍで３０℃、３日間振盪培養した。次にこの培養液２ｍＬを同ポテトグルコース培地１００ｍＬに接種し、１４０ｒｐｍで３０℃、３日間振盪培養した。更に、この培養液２ｍＬを５００ｍＬの同ポテトグルコース培地の入った坂口フラスコに接種して、１２５ｒｐｍ、２５℃で振盪培養した。培養の間、培養液を経時的にサンプリングして、その上清に含まれるＢＯの発現量の変動を、下記に示す測定法によりＢＯ活性を測定し、ＢＯ活性が高い培養液を回収した。
【００４２】
ＢＯ活性測定法
エチレンジアミン四酢酸１ｍＭを含む０．２Ｍ−トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）２５０ｍＬに試薬ビリルビン（和光純薬工業製）５ｍｇを溶解し、この２ｍＬと酵素液０．２ｍＬを３７℃で反応させ４４０ｎｍの吸光度の減少を測定する。この条件下、１分間あたり４４０ｎｍの吸光度を１．０５減少させるときの酵素量を１単位（ｕ）とした。
【００４３】
この培養液から菌体を遠心分離（１２０００ｘｇ，１５分）により菌体を回収し、−８０℃に凍結保存して以下の実験に供した。
【００４４】
２．菌体からの全ＲＮＡの調製法
全ＲＮＡは、グアニジュウム／塩化セシュウム法〔［バイオケミストリ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１３，２６３３（１９７４）］、［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１９６，１３１３（１９７７）］、［モレキュラー クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８２）］〕に従って調製した。
【００４５】
１．で得られた菌体１０ｇと海砂（２０〜３５メッシュ、和光純薬製）５ｇを混合し、すり鉢の中で液体窒素と共に菌体を粉砕した。得られた粉砕物を４０ｍＭの４Ｍ グアニジンチオシアネ−ト（フルカ製）、２００ｍＭ酢酸ナトリウム（和光純薬製）、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ドウジン製）を含む溶液に加え、室温で１５分間振盪混合させた。
【００４６】
得られた混合物を３０ｍＬのコ−ニングチュ−ブに分配し、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１５分）を行なった。次に予め４ｍＬの５Ｍ 塩化セシュウム（和光純薬製）の入った遠心チュ−ブ６本に、得られた上清を６ｍＬづつ重層し、超遠心分離（３７０００ｒｐｍ、１８時間）を行なった。その結果、チュ−ブの底に透明な沈殿物を得た。
【００４７】
この沈殿物を８０％（ｖ／ｖ）エタノ−ルで２回洗浄し乾燥させ、１チュ−ブあたり８０μＬの１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む溶液に溶かした。次に６本分を１本のチュ−ブに集め、１０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）（１ｍＭのＥＤＴＡ含有）（以下、「ＴＥ」ともいう。）、飽和フェノ−ル及びクロロホルムで２回づつ抽出し、最後に得られた水層に１／１０容量の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）溶液と２倍容量のエタノ−ルを加え、−２０℃に１時間おいた。その後、遠心分離（１２０００ｘｇ、１５分）により沈殿を回収し、沈殿を８０％エタノ−ルで洗浄し、乾燥させた。これを滅菌蒸留水２００μＬに溶かし以下の実験に使用した。尚、最終的に得られた全ＲＮＡ量は約２ｍｇであった。
【００４８】
３．全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ） ＋ ＲＮＡの調製法
２．で得られた全ＲＮＡ１．２ｍｇからｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（アマシャム バイオサイエンス製）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを１２μｇ回収した。
【００４９】
４．ＢＯ 蛋白のアミノ末端部分の配列と ＢＯ 蛋白をプロテア−ゼで切断したペプチドのアミノ酸配列の決定
（Ｉ） ＢＯ 蛋白のアミノ末端部分のアミノ酸配列の決定
（ｉ） ＢＯ 蛋白の還元カルボキシメチル化
ミロセシウム・ベルカリアＭＴ−１由来の精製したＢＯ蛋白５ｍｇを３ｍＬの６Ｍグアニジン塩酸と２ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、５０℃で２分間処理した後、室温で２４時間放置した。放置しておいた反応液に０．６ｍｇのＤＴＴ（ジチオスレイト−ル）と１．５ｍｇのヨ−ド酢酸を加え暗所で３０分反応させた後、透析チュ−ブに移し、暗所でイオン交換水に透析した。得られた透析内液を凍結乾燥し、以下の実験に用いた。
【００５０】
（ｉｉ）アミノ酸配列の決定
（ｉ）で得られた試料の適当量を液相法プロテインシ−クエンサ−（アプライド・バイオシステム社製）あるいは固相法プロテインシ−クエンサ−（ミリジェン・バイオサ−チ社製）にかけ、得られたデ−タからアミノ酸配列（配列番号：２）を決定した。
【００５１】
（ＩＩ） ＢＯ 蛋白をプロテア−ゼで切断したペプチドのアミノ酸配列の決定
（ｉ）トリプシン分解断片の取得とアミノ酸配列の決定
（Ｉ）の（ｉ）で示したようにＢＯ蛋白を還元カルボキシメチル化した試料を５ｍＭの炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．９）に溶解し、ＴＰＣＫ−トリプシン（ロッシュ・ダイアグノステックス製）をＢＯ蛋白量の１／５０モル量加え、３７℃で６時間処理し、さらに同量のＴＰＣＫ−トリプシンを加え３７℃で２４時間処理した反応液を塩酸でｐＨ２に調整した。トリプシン分解断片は、得られたトリプシン分解反応液の適当量をＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィ−（μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８−１００Ａカラム）を行なうことにより分画し取得した。尚、ＨＰＬＣの条件は下記の通りである。
【００５２】
Ａ液：０．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸／水、Ｂ液：０．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸／５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／水、グラジェント：０−１００％（ｖ／ｖ）、Ｂ液のリニアグラジェント流速：０．５ｍＬ／分。
【００５３】
分画し得られたトリプシン分解断片の内、（Ｉ）の（ｉｉ）と同様のプロテインシ−クエンサ−を用いて４種類の断片のアミノ酸配列（配列番号：３〜配列番号：６）を決定した。
【００５４】
（ｉｉ）Ｖ８プロテア−ゼ分解断片の取得とアミノ酸配列の決定
（Ｉ）の（ｉ）で示したようにＢＯ蛋白を還元カルボキシメチル化した試料を５ｍＭの炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．９）に溶解し、Ｖ８プロテア−ゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来：ロッシュ・ダイアグノステックス製）をＢＯ蛋白量の１／５０モル量加え３７℃で６時間処理し、さらに同量のＶ８プロテア−ゼを加え３７℃で２４時間処理した反応液を塩酸でｐＨ２に調整した。Ｖ８プロテア−ゼ分解断片は、得られた分解反応液の適当量を、トリプシン分解の場合と同様にＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィ−を行なうことにより分画し取得した。尚、分画条件も同様である。
【００５５】
分画し得られたＶ８プロテア−ゼ分解断片の内、（Ｉ）の（ｉｉ）と同様のプロテインシ−クエンサ−を用いて６種類の断片のアミノ酸配列（配列番号：７〜配列番号：１２）を決定した。
【００５６】
５．ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法によるＤＮＡ断片の取得
ＢＯのｃＤＮＡを含む特定のＤＮＡ領域を、ＰＣＲ法〔［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２３０，１３５０（１９８５）］、メソッド イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１５５，３３５（１９８７）］〕によって、単離増幅した。
【００５７】
（ Ｉ ）ＢＯ蛋白の一部分に対応するＤＮＡ断片の取得
（ ｉ ）ＰＣＲ法に用いたプライマーＤＮＡの合成
４．の（Ｉ）で決定されたＢＯ蛋白のアミノ末端配列（配列番号：２）の１６番目のプロリンから２２番目のグルタミンに対応する塩基配列を予想し、ＤＮＡを合成した。尚、５’側には、ＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片をサブクロ−ニングし易くするために、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を加えてある。以下に示す全てのＤＮＡ合成には、０．２μＭスケ−ルでサイクロンプラスＤＮＡ合成機（ミリジェン・バイオサ−チ社製）を使用した。このＤＮＡをＰＣＲ法のプライマーＮｏ．１とした。プライマーＮｏ．１の配列を以下に示す。
【００５８】
プライマーＮｏ．１の配列：５’ −ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＮＡＴＨＣＣＩＣＣＩＧＴＩＡＡＲＣＡ− ３’（Ｉ：イノシン、Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＴ、Ｈ＝Ａ、ＣまたはＴ、Ｒ＝ＡまたはＧ、併せて以下同じ。）
【００５９】
次に４．の（ＩＩ）で得られたＢＯ蛋白をトリプシンで分解した断片のうち、１つの断片のアミノ酸配列（配列番号：３）に対応する塩基配列を予想してＤＮＡを合成した。尚、５’側には、ＰＣＲ産物のＤＮＡ断片をサブクロ−ニングし易くするために制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を加えてある。配列番号：３の６番目のグルタミン酸から１２番目のアラニンに対応するＤＮＡの相補的配列をＰＣＲ法のプライマーＮｏ．２とした。プライマーＮｏ．２の配列を以下に示す。
【００６０】
プライマーＮｏ．２：５’ ―ＣＧＧＧＡＴＣＣＲＴＣＲＴＣＩＧＣＲＴＡＩＧＧＩＣＫＴＡ ＹＴＣ― ３’ （Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｙ＝ＴＣ、併せて以下同じ。）
【００６１】
合成したＤＮＡはそれぞれ２００μＬのＴＥに溶解し、ＰＣＲ法のプライマーとして使用した。
【００６２】
（ｉｉ） ＰＣＲ 法に用いた鋳型 ＤＮＡ の調製
２．で得られた全ＲＮＡ１０μＬ（０．５μｇ）と２０μＭのＯｌｉｇｏｍｅｒ（ｄＴ）１５（ロッシュ・ダイアグノステックス製）３μＬを５００μＬ容量のチュ−ブ内で混合し、７０℃で１０分間インキュベ−トした後、すぐに氷中で冷やした。
【００６３】
次に、この得られた混合物４μＬに対し以下の試薬を混合し、３７℃で４５分間インキュベ−トした。この反応物をＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡとした。以下、この反応物を１ｓｔ ＤＮＡ ｍｉｘという。
【００６４】
［５ｘ］ ｒｅｖｅｒｓｅ ｂｕｆｆｅｒ（インビトロジェン株式会社製） ４μＬ、 ０．１Ｍ ＤＴＴ （インビトロジェン株式会社製） ２μＬ、 ＲＮａｓｉｎ（２０ｕｎｉｔｓ）（プロメガ製）１．５μＬ、２．５ｍＭ ＮＴＰｓ（東洋紡製） ８μＬ、 ＭＭＴＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２００ｕｎｉｔｓ）（インビトロジェン株式会社製） １μＬ。
【００６５】
（ｉｉｉ）ＰＣＲ法によるＤＮＡ断片の増幅
反応は、Ｇｅｎｅ ＡｍｐＴＭ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ製）を用い、同社のＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＤＮＡ増幅装置）により行なった。反応溶液の組成は以下の通りである。
【００６６】
Ｈ２Ｏ ５８．５μＬ、 ［１０ｘ］Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ、 ｄＮＴＰｓ，ｍｉｘ １．２５ｍＭ １６μＬ、 プライマーＮｏ．１ ５μＬ、 プライマーＮｏ．２ ５μＬ、 １ｓｔ ＤＮＡ ｍｉｘ ５μＬ、 ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ） ０．５μＬ。
【００６７】
上記の反応液１００μＬを混合し、ミネラルオイル（シグマ社製）１００μＬを加えた。次に反応液の入ったチュ−ブをＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒにセットし、以下の条件で反応を行なった。
【００６８】
９５℃ ０．５分、３７℃ ０．５分、７２℃ ３分。
【００６９】
この条件下で反応を４０サイクル行なった後、更に７２℃で７分間インキュベ−トした。
【００７０】
（ｉｖ）増幅されたＤＮＡの回収
反応後、ミネラルオイルを除き、１００μＬのクロロホルムを加え混合し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、２分）を行ない、上清を１００μＬ回収した。このうち１０μＬを用いて１％アガロ−ス電気泳動で回収されたＤＮＡのサイズと量を確認した。その結果約１．５ＫｂｐのＤＮＡ断片が約２μｇ増幅されていることがわかった。
【００７１】
残りの９０μＬを１％アガロ−ス電気泳動にかけ、１．５Ｋｂｐに相当するバンドを切りだし、ＤＮＡ精製キット、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ ＩＩ（ＢＩＯ １０１社製）でこのＤＮＡを抽出した。この操作で約１μｇのＤＮＡ断片が回収された。以下、このＤＮＡ断片をＢＯ−Ａという。
【００７２】
（ｖ）ＰＣＲ法で増幅されたＤＮＡの塩基配列の決定
まず、（ｉｖ）で得られたＢＯ−Ａを制限酵素ＥｃｏＲＩ、あるいはＢａｍＨＩで切断し、１％アガロ−ス電気泳動でサイズを確認した。このＢＯ−ＡはＢａｍＨＩで切断されることがわかった。したがって、制限酵素処理しないＢＯ−Ａと、適当量をあらかじめ制限酵素ＳｍａＩで切断した市販のプラスミドｐＵＣ１９（東洋紡製）［ジーン（Ｇｅｎｅ），３３，１０３（１９８５）］と混合し、ライゲ−ションキット（宝酒造製）を用いて１６℃、１８時間連結反応を行なった。
【００７３】
塩基配列は、Ｍ１３ファ−ジ（Ｍ１３ｍｐ１８、Ｍ１３ｍｐ１９）のＲＦ ＤＮＡにＤＮＡ断片をクロ−ニングし一本鎖ＤＮＡとして回収したり［メソッド イン エンザイモロジー，１０１，２０（１９８３）］、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９やｐＨＳＧ３９６、ｐＨＳＧ３９７（いずれも宝酒造製）のプラスミドにクロ−ニングし２本鎖ＤＮＡとして回収し鋳型ＤＮＡとし、当該鋳型ＤＮＡを［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰと７−Ｄｅａｚａ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＵＳＢ社製）を用いる従来公知の方法や蛍光物質利用したＴａｑＤｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ製）、ＤＮＡ増幅装置（アプライドバイオシステムズ製）及びＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ３７３Ａ（アプライドバイオシステムズ製）を用いる方法で決定した。
【００７４】
決定されたＢＯ−Ａの塩基配列は、配列番号：１３に示した２１９番目のＣから１７７１番目のＣに相当する。
【００７５】
（ＩＩ） ＢＯ 蛋白のカルボキシル末端部分に対応する３ ’ 側の ｃＤＮＡ 断片の取得
（ｉ） ＰＣＲ 法に用いたプライマー ＤＮＡ の合成
（Ｉ）の（ｖ）で決定されたＢＯ−Ａの塩基配列のうち、特異的配列（配列番号：１３の１６９２番目のＣから１７１６番目のＧまで）のＤＮＡを合成した。このＤＮＡをＰＣＲ法のプライマーＮｏ．３とした。尚、（Ｉ）の（ｉ）と同様に５’側には制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を付けてある。プライマーＮｏ．３の配列を以下に示す。
【００７６】
プライマーＮｏ．３：５’−ＴＣＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＴＣＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＧＴＴＣＡＧＣＧ−３’
【００７７】
もう一方のプライマーは、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの３’側のｐｏｌｙ（Ａ）配列を利用したＰＣＲ法を行なうために、３つの制限酵素認識部位（５’からＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ）のみを持つＤＮＡを合成し、このＤＮＡをＰＣＲ法のプライマーＮｏ．４とした。プライマーＮｏ．４の配列を以下に示す。
【００７８】
プライマーＮｏ．４：５’−ＧＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＴ−３’
【００７９】
合成したＤＮＡはそれぞれ２００μＬのＴＥに溶解し、ＰＣＲ法のプライマーとして使用した。
【００８０】
（ ｉｉ ） ＰＣＲ 法に用いた鋳型 ＤＮＡ の調製
まず、（Ｉ）の（ｉｉ）で使用したＯｌｉｇｏｍｅｒ（ｄＴ）１５に代えて、５’側にさらにプライマーＮｏ．４の配列をもつＤＮＡを合成し、得たＤＮＡを１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成に用いるプライマーＮｏ．５とした。プライマーＮｏ．５の配列を以下に示す。
【００８１】
プライマーＮｏ．５：５’−ＧＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣ（Ｔ）１７−３’
【００８２】
２．で得られた全ＲＮＡ １０μＬ（０．５μｇ）と２０μＭのプライマーＮｏ．５ ３μＬを５００μＬ容量のチュ−ブ内で混合し、７０℃で１０分間インキュベ−トした後、すぐに氷中で冷やした。次に、この得られた混合物４μＬに対し以下の試薬を混合し、３７℃で４５分間インキュベ−トした。この反応物をＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡとした。以下、この反応物を１ｓｔ ＤＮＡ ｍｉｘ（ｃ）とする。
【００８３】
［５ｘ］ ｒｅｖｅｒｓｅ ｂｕｆｆｅｒ（インビトロジェン製） ４μＬ、 ０．１Ｍ ＤＴＴ （インビトロジェン製） ２μＬ、 ＲＮａｓｉｎ（２０ｕｎｉｔｓ）（プロメガ製） １．５μＬ、 ２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）（東洋紡製） ８μＬ、 ＭＭＴＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２００ｕｎｉｔｓ）（インビトロジェン製） １μＬ。
【００８４】
（ｉｉｉ） ＰＣＲ 法による ＤＮＡ 断片の増幅
反応溶液の組成は以下の通りであり、ＤＮＡ増幅キット、ＤＮＡ増幅装置、増幅反応条件は、（Ｉ）の（ｉｉｉ）と同様である。
【００８５】
Ｈ２Ｏ ５８．５μＬ、 ［１０ｘ］Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ、 ｄＮＴＰｓ，ｍｉｘ １．２５ｍＭ １６μＬ、 プライマーＮｏ．３（２０μＭ） ５μＬ、 プライマーＮｏ．４（２０μＭ） ５μＬ、 １ｓｔ ＤＮＡ ｍｉｘ（ｃ） ５μＬ、 ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ） ０．５μＬ。
【００８６】
（ ｉｖ ） ＰＣＲ 法で増幅された ＤＮＡ の回収と塩基配列の決定
（Ｉ）の（ｉｖ）と同様に、回収した反応液１０μＬを用いて１．５％アガロ−ス電気泳動で増幅されたＤＮＡのサイズと量を確認した。その結果、約２９０ｂｐのＤＮＡ断片が約２μｇ増幅されていることがわかった。残りの９０μＬを１．５％アガロ−ス電気泳動にかけ、２９０ｂｐに相当するバンドを切りだし、ＤＮＡ精製キット、ＭＥＲＭＡＩＤＴＭ Ｋｉｔ（ＢＩＯ １０１社製）でこのＤＮＡを抽出した。この操作で約０．５μｇのＤＮＡ断片が回収された。以下、このＤＮＡ断片をＢＯ−Ｂという。
【００８７】
次に得られたＢＯ−Ｂを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、あらかじめ同じ制限酵素で切断したプラスミドｐＵＣ１９にサブクロ−ニングした。その結果得られたＢＯ−Ｂを含むプラスミドｐＵＣＢＯ−Ｂの塩基配列を決定した。この場合の塩基配列決定は７−Ｄｅａｚａ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−Ｋｉｔ（ＵＳＢ社製）を用いる従来公知の方法でおこなった。
【００８８】
決定されたＢＯ−Ｂの塩基配列は、配列番号：１３に示した１６９２番目のＣから１９５９番目のＡに相当する。ＢＯ−ＡとＢＯ−Ｂの塩基配列を比較すると１６９２番目のＣから１７７１番目のＣが完全に一致すること、この塩基配列から予想されるアミノ酸配列とＢＯ蛋白をＶ８プロテア−ゼで分解した断片の配列の内、配列番号：７の配列と一致すること、その配列のすぐ後にストップコドン（配列番号：１３の塩基配列で１７８２番目から１７８４番目）が現われ、３’末端にｐｏｌｙ（Ａ）配列が存在することから、ＢＯ−Ｂは、目的のＢＯ蛋白のカルボキシル末端部分に対応する３’側のｃＤＮＡ断片である。
【００８９】
（ ＩＩＩ ） ＢＯ 蛋白のアミノ末端部分に対応する５ ’ 側の ｃＤＮＡ 断片の取得
（ ｉ ） ＰＣＲ 法に用いたプライマー ＤＮＡ の合成
（Ｉ）の（ｖ）で決定されたＢ０−Ａの塩基配列のうち、以下に示す特異的配列（配列番号：１３の３２２番目から３４８番目）の相補的配列のＤＮＡを合成した。このＤＮＡをＰＣＲ法のプライマーＮｏ．６とした。プライマーＮｏ．６の配列を以下に示す。
【００９０】
プライマーＮｏ．６：５’−ＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＧＴＣＡＧＧＧＴＡＡＡＣＣＴＧＧＴ−３’
【００９１】
ＰＣＲ法の鋳型ＤＮＡの合成をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン製）を用いて行なうと、２本鎖ｃＤＮＡ混合物の５’末端にＳａｌＩアダプタ−が導入される。従って、もう一方のプライマーは、この配列を利用することにした。以下に示す配列を合成し、ＰＣＲ法のプライマーＮｏ．７とした。プライマーＮｏ．７の配列を以下に示す。
【００９２】
プライマーＮｏ．７：５’−ＴＣＧＡＣＣＣＡＣＧＣＧＴＣＣＧ−３’
【００９３】
合成したＤＮＡはそれぞれ２００μＬのＴＥに溶解し、ＰＣＲ法のプライマーとして用いた。
【００９４】
（ｉｉ） ＰＣＲ 法に用いた鋳型 ＤＮＡ の調製と ＤＮＡ 断片の増幅
３．で得られたｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを２．５μｇ使用して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン製）により２本鎖ｃＤＮＡ合成し、ＳａｌＩアダプタ−の付加及び制限酵素ＮｏｔＩで切断した反応液をフェノ−ル／クロロホルム抽出、エタノ−ル沈殿、乾燥を行ない、最終的にＴＥ ５０μＬに溶解させたサンプルを鋳型ＤＮＡとした。以下この鋳型ＤＮＡをｃＤＮＡ ｍｉｘという。
【００９５】
ＰＣＲ法の反応溶液の組成は以下の通りであり、ＤＮＡ増幅キット、ＤＮＡ増幅装置、増幅反応条件は、（Ｉ）の（ｉｉｉ）と同様である。
【００９６】
Ｈ２Ｏ ６０．５μＬ、 ［１０ｘ］ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ、 ｄＮＴＰｓ，ｍｉｘ １．２５ｍＭ １６μＬ、 プライマーＮｏ．６（２０μＭ） ５μＬ、 プライマーＮｏ．７（２０μＭ） ５μＬ、 ｃＤＮＡ ｍｉｘ ３μＬ、 ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ） ０．５μＬ。
【００９７】
（ｉｉｉ） ＰＣＲ 法で増幅された ＤＮＡ の回収と塩基配列の決定
（ＩＩ）の（ｉｖ）と同様にＤＮＡを回収し、その結果、約３５０ｂｐのＤＮＡ断片が、約０．５μｇ得られた。以下、このＤＮＡ断片をＢＯ−Ｃという。
【００９８】
次に得られたＢＯ−Ｃを制限酵素ＳａｌＩとＢａｍＨＩで切断し、あらかじめ同じ制限酵素で切断したプラスミドｐＵＣ１９にサブクロ−ニングした。その結果得られたＢＯ−Ｃを含むプラスミドｐＵＣＢＯ−Ｃの塩基配列を決定した。この場合の塩基配列決定は７−Ｄｅａｚａ−Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−Ｋｉｔ（ＵＳＢ社製）を用いる従来公知の方法でおこなった。決定されたＢＯ−Ｃの塩基配列は、配列番号：１３に示した１番目のＡから３４８番目のＧに相当する。ＢＯ−ＡとＢＯ−Ｃの塩基配列を比較すると２１９番目のＣから３４８番目のＧまでの配列が完全に一致すること、この塩基配列から予想されるアミノ酸配列（配列番号：１３の塩基配列では１８０から２５４番に相当する）とＢＯ蛋白のアミノ末端配列が一致することから、ＢＯ−Ｃは、ＢＯ蛋白のアミノ末端部分に対応する５’側のｃＤＮＡ断片である。
【００９９】
以上、得られたＢＯ−Ａ、ＢＯ−Ｂ及びＢＯ−ＣのＤＮＡ断片のオ−バ−ラップする塩基配列部分を考慮し、結合させた全体の塩基配列を配列番号：１３に示した。
【０１００】
６．前駆体部分と成熟体の ＢＯ （ ＢＯ 蛋白）部分の全体を含む ＤＮＡ 断片の取得
（ｉ）ＰＣＲ法によるオ−プンリ−ディングフレ−ム全体を含むＤＮＡ断片の増幅
５．の（ＩＩＩ）で得られたＢＯ−Ｃの塩基配列の内、配列番号：１３の第１２番目のＴから第３６番目のＴまでの配列とＢＯ−Ｂの塩基配列の内、配列番号：１３の第１８７８番目のＣから第１９０２番目のＧまでの配列の相補的配列のＤＮＡを合成した。それぞれの合成ＤＮＡをＰＣＲのプライマーＮｏ．８、プライマーＮｏ．９として用いた。また、５．の（ＩＩＩ）で得たｃＤＮＡ ｍｉｘをＰＣＲの鋳型ＤＮＡとした。
【０１０１】
ＰＣＲの反応溶液の組成は以下の通りであり、ＤＮＡ増幅キット、ＤＮＡ増幅装置、増幅反応条件は、（Ｉ）の（ｉｉｉ）と同様である。
【０１０２】
Ｈ２Ｏ ６０．５μＬ、 ［１０ｘ］ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ、 ｄＮＴＰｓ，ｍｉｘ １．２５ｍＭ １６μＬ、 プライマーＮｏ．８（２０μＭ） ５μＬ、 プライマーＮｏ．９（２０μＭ） ５μＬ、 （ＩＩＩ）の（ｉｉ）のｃＤＮＡ ｍｉｘ ５μＬ、 ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ） ０．５μＬ。
【０１０３】
（ｉｉ） ＰＣＲ で増幅された ＤＮＡ の回収と塩基配列の決定
（ＩＩ）の（ｉｖ）と同様にＤＮＡを回収し、その結果、約１．９ｋｂｐのＤＮＡ断片が、約１μｇ得られた。以下、このＤＮＡ断片をＢＯ−ｆｕｌｌという。
【０１０４】
次に得られたＢＯ−ｆｕｌｌを、あらかじめ制限酵素ＳｍａＩで切断したプラスミドｐＵＣ１９にサブクロ−ニングし、ＢＯ−ｆｕｌｌを含むプラスミドを得た。以下、このプラスミドをｐＵＣ−ＢＯという。
【０１０５】
実施例２ ビリルビンオキシダーゼ発現プラスミドの構築
アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来のタカアミラーゼ遺伝子の高発現プロモーター（ｔａａＧ２）とビリルビンオキシダーゼ遺伝子を融合させて発現プラスミドを構築した。ｔａａＧ２プロモーターを含むプラスミドｐＣＡＭＥ３（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＣＡＭＥ３）、寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１８９６６））を鋳型として、
プライマーＢＯ−ＴＡＡ：５’−ＧＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＧＴＴ―３’（配列番号：１４）
プライマーＢＯ−Ｐ２ ：５’−ＴＧＴＧＴＧＴＴＴＧＡＡＣＡＴＡＡＡＴＧＣＣＴＴＣＴＧ―３’（配列番号：１５）
を用いてＰＣＲ法によりｔａａＧ２プロモーターを含む６４０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。ビリルビンオキシダーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ−ＢＯ（特許第３１８１６６０号公報参照）を鋳型として、
プライマーＢＯ−Ｐ１ ：５’−ＣＡＧＡＡＧＧＣＡＴＴＴＡＴＧＴＴＣＡＡＡＣＡＣＡＣＡ−３’（配列番号：１６）
プライマーＢＯ−ＫＰＮ ：５’−ＧＴＴＣＴＣＡＧＣＡＧＴＧＡＴＡＴＧＣＡＴＡＧＣ−３’（配列番号：１７）
を使用して、ＰＣＲ法によりビリルビンオキシダーゼ遺伝子のＫｐｎＩ切断部位までの約５２０ｂｐのＤＮＡ断片（ＢＯ−Ｄ）を得た。上記両ＤＮＡ断片を等量混合したものを鋳型とし、プライマーＢＯ−ＴＡＡとプライマーＢＯ−ＫＰＮを用いて再度ＰＣＲを実施し、タカアミラーゼプロモーター（ｔａａＧ２）とビリルビンオキシダーゼ遺伝子の５’−末端側ＫｐｎＩ切断部位までが連結した１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片（ｔａａＧ２−ＢＯ−Ｄ）を得た。次いで、上記ＰＣＲ断片及びｐＵＣ−ＢＯを制限酵素ＫｐｎＩとＳｓｅ８３８７Ｉで切断してそれぞれ１１２７ｂｐのＤＮＡ断片（ｔａａＧ２−ＢＯ−Ｄ）及び１２７４ｂｐのＤＮＡ断片（ＢＯ−Ｅ）を得、ノイロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）由来ｐｙｒ４遺伝子を選択マーカーとして持つプラスミドｐＴＧ１（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｐＴＧ１）、寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１８９６５）の制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ切断サイトに挿入し、発現プラスミドｐＴＧ１−ＢＯを構築した。上記Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）反応ではＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ ＧＲＡＤＩＥＮＴ４０（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を使用し、反応組成は、鋳型ＤＮＡ２５０ｎｇ、プライマー各２００ｎＭ、Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ（Ｅｘ Ｔａｑ Ｖｅｒｓｉｏｎ、宝酒造製）２０〜５０μＬ とし、ＰＣＲ条件をＳｔｅｐ １；９５℃ １分、Ｓｔｅｐ ２：９５℃ １分、５６℃ １分、７２℃ １分（３０サイクル）、Ｓｔｅｐ ３：７２℃ ５分、Ｓｔｅｐ ４：４℃とした（以下、実施例３〜６において同じ。）。
【０１０６】
実施例３ アスペルギルス・ニドランス（ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ）におけるビリルビンオキシダーゼの発現
アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）Ｇ１９１株（ＦＧＳＣ（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）Ｎｏ．Ａ７２２株）の形質転換は Ｄ．Ｊ．ＢａｌａｎｃｅとＧ．Ｔｕｒｎｅｒの方法（Ｇｅｎｅ，３６，３２１（１９８５））に従って行った。形質転換株をデンプン培地（可溶性デンプン １．０％（ｗ／ｖ）、硝酸ナトリウム０．６％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム０．１５２％（ｗ／ｖ）、塩化カリウム０．０５２％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム０．０５２％（ｗ／ｖ）、ｐ−アミノ安息香酸０．０００２％（ｗ／ｖ）、硫酸銅０．００２％（ｗ／ｖ）、０．５ｍＭ ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、寒天１．５％（ｗ／ｖ）、ｐＨ＝６．５）に植菌し、３７℃で培養して菌体に再生させ、ＡＢＴＳの縮合による発色によりビリルビンオキシダーゼ生産能を示す形質転換株を得た。
【０１０７】
実施例４ ビリルビンオキシダーゼの製造法
実施例２で得られたビリルビンオキシダーゼ生産能を有する形質転換株を液体培地（マルトース２．０％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン１．０％（ｗ／ｖ）、硝酸ナトリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム０．０５％（ｗ／ｖ）、硫酸銅０．００２％（ｗ／ｖ）、ｐ−アミノ安息香酸２μｇ／ｍＬ、ｐＨ６．５）に胞子を植菌し、３０℃で９６時間通気培養して、ビリルビンオキシダーゼを発現させた。
【０１０８】
培養液（１Ｌ、０．１ｕ／ｍＬ）から菌体を除去した培養上清に、５０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、１時間攪拌した。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０分間）した上清に更に７０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、さらに１時間攪拌した。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、３０分間）し、得られた沈澱を０．０８ｍＭ硫酸銅を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、さらに同緩衝液で一晩透析した。予め同緩衝液で平衡化したＲＥＳＯＵＲＣＥ Ｑカラム（６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス株式会社に透析液を供し、０〜０．５Ｍ食塩を含む同緩衝液で溶離した。活性画分を透析後濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（１２０ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス株式会社に供し、０．２Ｍ食塩を含む同緩衝液で溶離した。活性画分を回収したのち透析で脱塩後凍結乾燥することにより精製ビリルビンオキシダーゼ１０ｍｇ（４０ｕ）を得た。
【０１０９】
実施例５ 変異型ビリルビンオキシダーゼの作製
精製したｐＴＧ１−ＢＯプラスミドを鋳型として、オーバーラップＰＣＲ法により部位特異的変異を導入した。ｐＴＧ１−ＢＯを鋳型とし、
プライマーＢＯ−ＫＥ：５’−ＣＴＡＣＣＣＡＡＡＴＡＧＡＣＡＧＴＣＴＧＣＴＣＧ−３’ （配列番号：１８）、
プライマーＤ３６１Ｐ／Ｑ３６４Ｐ−２：
５’−ＧＧＴＡＴＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＴＴＧＧＧＴＣＴＧＣＴＡＣ−３’（配列番号：１９）
を用いてＰＣＲを行った。同様に、プライマーＢＯ−ＶＨ：
５’−ＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＴ−３’（配列番号：２１）、
プライマーＤ３６１Ｐ／Ｑ３６４Ｐ−１：
５’−ＧＴＡＧＣＡＧＡＣＣＣＡＡＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＡＧＡＴＡＣＣ−３’（配列番号：２２）
を用いてＰＣＲを行った。１．２％アガロースゲル電気泳動後両ＰＣＲ断片を抽出し、両者を混合したものを鋳型として、プライマーＢＯ−ＫＥとＢＯ−ＶＨを使用して再度ＰＣＲを行った。得られたＤＮＡを精製し、制限酵素ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＵＣ１１９に連結し大腸菌ＪＭ１０９に導入した。目的とする変異点以外に変異が生じていないことを塩基配列を決定して確認した。このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＴ１４ＩとＶａｎ９１Ｉで切断して得られた変異が導入されたＤＮＡ断片を、ｐＴＧ１−ＢＯの同様の制限酵素切断断片と置換したプラスミドを得た。アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）Ｇ１９１株を形質転換し培養・精製することで、変異型ビリルビンオキシダーゼ８ｍｇ（３０ｕ）を得た。培養・精製は、実施例５記載の条件に従った。
【０１１０】
実施例６ 変異型ビリルビンオキシダーゼの安定性の測定
実施例５で得られた変異型ビリルビンオキシダーゼの安定性を、野生型酵素と比較した。各酵素を１６μｇ／ｍＬとなるように８０μＭ 硫酸銅を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、６０℃で熱処理を行った。一定時間毎に残存活性を測定した。その結果を表１に記載した。
【０１１１】
【表１】
表１に示す６０℃での熱安定性試験結果から明らかなように、本発明のビリルビンオキシダーゼである変異型ビリルビンオキシダーゼの活性半減期（残存活性が５０％となるまでの時間）は、従来の野生型ビリルビンオキシダーゼの半減期よりも１．７倍向上してしていた。この高い耐熱性により、従来のビリルビン測定試薬よりも更に安定性の優れたビリルビン測定試薬が提供できるとともに、ビリルビン測定試薬のコスト低減も図ることができ、更にビリルビンの測定においてもより信頼性の高い結果が期待できる。
【０１１３】
【発明の効果】
野生型ビリルビンオキシダーゼのアミノ酸配列（配列番号：１）に改変を加えることにより、本発明で得られるビリルビンオキシダーゼ、即ち、配列番号２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼ、配列表の配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、３６１位または３６４位のプロリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ、配列表の配列番号２３で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ、配列表の配列番号２３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ、配列表の配列番号２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子によりコードされ、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼは、野生型ビリルビンオキシダーゼを含む従来のビリルビンオキシダーゼに比して熱安定性が向上しているため、より安定性の高いビリルビン測定試薬を提供できるとともに、当該ビリルビン測定試薬のコストを低減することができ、更にビリルビンの測定においてもより信頼性の高い結果が期待できる。
【０１１４】
以下、次の事項を開示する。
（１１）配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、３６１位又は３６４位のプロリンが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンから選ばれたアミノ酸により置換されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ。
（１２）耐熱性が、８０μＭ 硫酸銅を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中、６０℃で３０分処理する場合において、残存活性が５０％以上である（１１）記載のビリルビンオキシダーゼ。
（１３）残存活性が５５％以上である（１２）記載のビリルビンオキシダーゼ。（２１）配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ８０μＭ 硫酸銅を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中、６０℃で３０分処理する場合において、残存活性が５０％以上であるビリルビンオキシダーゼ。
（２２）残存活性が５５％以上である（２１）記載のビリルビンオキシダーゼ。（３１） 配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ８０μＭ 硫酸銅を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中、６０℃で３０分処理する場合において、残存活性が５０％以上であるビリルビンオキシダーゼ。
（３２）残存活性が５５％以上である（３１）記載のビリルビンオキシダーゼ。（３３）相同性が８０％以上である（３１）または（３２）記載のビリルビンオキシダーゼ。
（３４）相同性が９０％以上である（３１）乃至（３３）のいずれかに記載のビリルビンオキシダーゼ。
（４１）配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子によりコードされ、かつ８０μＭ 硫酸銅を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中、６０℃で３０分処理する場合において、残存活性が５０％以上であるビリルビンオキシダーゼ。
（４２）残存活性が５５％以上である（４１）記載のビリルビンオキシダーゼ。（５１）（１１）乃至（１３）、（２１）、（２２）、（３１）乃至（３４）、（４１）、（４２）のいずれかに記載のビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子。
（６１）（５１）に記載の遺伝子を含む組換え発現プラスミド。
（７１）（６１）に記載の組換えプラスミドを含む形質転換体。
（８１）（７１）に記載の形質転換体を栄養培地で培養し、得られる培養物からビリルビンオキシダーゼを採取することを特徴とするビリルビンオキシダーゼの製造法。
（９１）（１１）乃至（１３）、（２１）、（２２）、（３１）乃至（３４）、（４１）、（４２）のいずれかに記載のビリルビンオキシダーゼを含むビリルビンアッセイキット。
【０１１５】
Claims (10)
- 配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼ。
- 配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、３６１位又は３６４位のプロリンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ。
- 配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ。
- 配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有し、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ。
- 配列表の配列番号：２３で表されるアミノ酸配列を有するビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる遺伝子によりコードされ、かつ耐熱性を有するビリルビンオキシダーゼ。
- 請求項１ないし５のいずれかに記載のビリルビンオキシダーゼをコードする遺伝子。
- 請求項６記載の遺伝子を含む組換え発現プラスミド。
- 請求項７記載の組換えプラスミドを含む形質転換体。
- 請求項８記載の形質転換体を栄養培地で培養し、得られる培養物からビリルビンオキシダーゼを採取することを特徴とするビリルビンオキシダーゼの製造法。
- 請求項１ないし５のいずれかに記載のビリルビンオキシダーゼを含むビリルビンアッセイキット。
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