JP2008161178A - 熱安定性を有する変異型ビリルビンオキシダーゼ - Google Patents

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Abstract

【課題】ビリルビンオキシダーゼの酵素活性やその耐熱性の程度が所定レベル以上の変異型ビリルビンオキシダーゼを提供する。
【解決手段】不完全糸状菌Myrothecium verrucaria由来、野生型ビリルビンオキシダーゼのアミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が、耐熱性を向上し得るように欠失、置換、付加若しくは挿入されている変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。該変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは、例えば、変性温度T値が72℃以上である。
【選択図】図1

Description

本発明は、熱安定性を有する変異型ビリルビンオキシダーゼに関する。より詳しくは、酵素活性に加えて耐熱性の程度が所定レベル以上の変異型ビリルビンオキシダーゼに関する。
「酵素」は、生命の維持に係わる多くの反応を生体内の温和な条件下で円滑に進める生体内触媒である。この酵素は、生体内で代謝回転し、生体内で必要に応じて生産されて、その触媒機能を発揮する。
現在、この酵素を生体外で利用する技術が、既に実用化されたり、あるいは実用化に向けた検討が行われたりしている。例えば、有用物質の生産、エネルギー関連物質の生産、測定又は分析、環境保全、医療などの様々な技術分野において、酵素の利用技術が進展している。比較的近年では、燃料電池の一種である酵素電池(例えば、特許文献1参照)、酵素電極、酵素センサー(酵素反応を利用して化学物質を計測するセンサー)などの技術も提案されている。
この酵素の化学的本体はタンパク質であるので、酵素は、熱やpHの程度によって変性する性質を有する。このため、酵素は、金属触媒などの他の化学的触媒に比べて生体外での安定性が低い。従って、酵素を生体外で利用する場合は、環境の変化に対して酵素をより安定的に働かせて、その活性を持続させるようにすることが重要である。
酵素を生体外で利用する場合、酵素自体の性質や機能を人工的に改変させる方法や酵素の働く場所の環境を工夫する方法などのアプローチが採用されることになる。前者の方法では、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を人工的に変化させ、この変化させた遺伝子を大腸菌等の生物の中で発現させることによって人工的に変異したタンパク質を作製し、そして、利用目的にあった機能や性質を備える変異型タンパク質を選別(スクリーニング)することが一般的に行われている(例えば、特許文献2参照)。
ここで、「ビリルビンオキシダーゼ(Bilirubin oxidase)」は、ビリルビンをビルベルジンに酸化する反応を触媒する酵素であり、マルチ胴オキシダーゼ(複数の銅イオンを活性中心に持つ酵素の総称)に属する酵素の一種である。この酵素は、従来から臨床検査の場面における肝機能等の検査試薬(血清中のビリルビンの測定試薬)として広く使用されているが、近年では、上記酵素電池のカソード(Cathode、正極)側において、酸素の電気化学的4電子還元反応を実現する触媒としても注目されている。
このビリルビンオキシダーゼを生体外での利用の期待が高まっている中で、熱安定性のより優れた同酵素を追究する技術(例えば、特許文献3参照)、同酵素の酵素活性をより長期にわたって安定的に持続させるための技術も提案されている(特許文献4参照)。
特開2004−71559号公報。 特開2004−298185号公報。 特開2006−68003号公報。 特開2000−83661号公報。
ビリルビンオキシダーゼの生体外利用を踏まえると、その熱安定性をさらに向上させる必要がある。しかし、このビリルビンオキシダーゼは、60℃、1時間の熱処理により酵素活性が20%以下にまで低下してしまうという問題を抱えており、例えば、酵素電池の分野において、利用される酵素群の中では最も熱安定性が低く、また、負極側の酵素(例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ)に比べて著しく熱安定性が低いため、酵素電池の実用化の大きな障害となっている。また、このビリルビンオキシダーゼを同じマルチ銅オキシダーゼであるラッカーゼに代替するという選択枝もあるが、このラッカーゼも耐熱性に問題がある上に、室温、中性pH領域で酵素活性がビリルビンオキシダーゼと比較して著しく低いという問題がある。
そこで、本発明は、ビリルビンオキシダーゼの生体外での広範な利用可能性を視野に入れ、ビリルビンオキシダーゼの酵素活性やその耐熱性の程度が所定レベル以上の変異型ビリルビンオキシダーゼを提供することを主な目的とする。
本発明では、不完全糸状菌Myrothecium verrucaria(以下、M. verrucaria)由来ビリルビンオキシダーゼの配列番号1の野生型アミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が、耐熱性を向上し得るように欠失、置換、付加若しくは挿入されている変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ、より好適には、例えば、変性温度T値が72℃以上である変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼである。さらには、60℃、1時間加熱処理後の残存酵素活性率(residual activity)が20%以上である変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼである。例えば、配列番号2〜45及び57〜67のアミノ酸配列を有する変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼを提供する。なお、前記不完全糸状菌は、例えば、M. verrucaria NBRC(IFO)6113株を採用することができる。また、変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼを酵母Pichia methanolicaを宿主として発現させると、大量発現が可能である。
ここで、配列番号2に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは、配列番号1の野生型アミノ酸配列のN末端から49番目のグルタミンがリジンに置換されている(以下、略記号Q49K)。同様に、配列番号3に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは72番目のグルタミンがグルタミン酸に置換されており(Q72E)、配列番号4に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは81番目のバリンがロイシンに置換されており(V81L)、配列番号5に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは121番目のチロシンがセリンに置換されており(Y121S)、配列番号6に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは147番目のアルギニンがプロリンに置換されており(R147P)、配列番号7に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは185番目のアラニンがセリンに置換されており(A185S)、配列番号8に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは210番目のプロリンがロイシンに置換されており(P210L)、配列番号9に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは225番目のフェニルアラニンがバリンに置換されており(F225V)、配列番号10に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは258番目のグリシンがバリンに置換されており(G258V)、配列番号11に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは264番目のアラニンがバリンに置換されており(A264V)、配列番号12に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは322番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されており(D322N)、配列番号13に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは335番目のアスパラギンがセリンに置換されており(N335S)、配列番号14に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは356番目のアルギニンがロイシンに置換されており(R356L)、配列番号15に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは359番目のプロリンがセリンに置換されており(P359S)、配列番号16に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは370番目のアスパラギン酸がチロシンに置換されており(D370Y)、配列番号17に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは371番目のバリンがアラニンに置換されており(V371A)、配列番号18に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは423番目のプロリンがロイシンに置換されており(P423L)、配列番号19に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは468番目のメチオニンがバリンに置換されており(M468V)、配列番号20に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは476番目のロイシンがプロリンに置換されており(L476P)、配列番号21に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは513番目のバリンがロイシンに置換されている(V513L)。また、配列番号57に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは103番目のアラニンがプロリンに置換されており(A103P)、配列番号58に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは270番目のチロシンがアスパラギン酸に置換されており(Y270D)、配列番号59に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは299番目のセリンがアスパラギンに置換されており(S299N)、配列番号60に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは381番目のバリンがロイシンに置換されており(V381L)、配列番号61に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは418番目のアラニンがスレオニンに置換されており(A418T)、配列番号62に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは437番目のアルギニンがヒスチジンに置換されている(R437H)。
また、配列番号22に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは、配列番号1の野生型アミノ酸配列のN末端から49番目のグルタミンがリジンに、371番目のバリンがアラニンに置換されている(以下、略記号Q49K/V371A)。同様に、配列番号23に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは72番目のグルタミンがグルタミン酸に、210番目のプロリンがロイシンに置換されており(Q72E/P210L)、配列番号24に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは72番目のグルタミンがグルタミン酸に、264番目のアラニンがバリンに置換されており(Q72E/A264V)、配列番号25に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは81番目のバリンがロイシンに、147番目のアルギニンがプロリンに置換されており(V81L/R147P)、配列番号26に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは81番目のバリンがロイシンに、423番目のプロリンがロイシンに置換されており(V81L/P423L)、配列番号27に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは121番目のチロシンがセリンに、476番目のロイシンがプロリンに置換されており(Y121S/L476P)、配列番号28に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは185番目のアラニンがセリンに、258番目のグリシンがバリンに置換されており(A185S/G258V)、配列番号29に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは210番目のプロリンがロイシンに、264番目のアラニンがバリンに置換されており(P210L/A264V)、配列番号30に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは225番目のフェニルアラニンがバリンに、322番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換されており(F225V/D322N)、配列番号31に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは225番目のフェニルアラニンがバリンに、476番目のロイシンがプロリンに置換されており(F225V/L476P)、配列番号32に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは264番目のアラニンがバリンに、356番目のアルギニンがロイシンに置換されており(A264V/R356L)、配列番号33に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは264番目のアラニンがバリンに、476番目のロイシンがプロリンに置換されており(A264V/L476P)、配列番号34に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは322番目のアスパラギン酸がアスパラギンに、468番目のメチオニンがバリンに置換されており(D322N/M468V)、配列番号35に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは335番目のアスパラギンがセリンに、423番目のプロリンがロイシンに置換されており(N335S/P423L)、配列番号36に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは356番目のアルギニンがロイシンに、476番目のロイシンがプロリンに置換されており(R356L/L476P)、配列番号37に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは371番目のバリンがアラニンに、513番目のバリンがロイシンに置換されている(V371A/V513L)。
さらに、配列番号38に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは、配列番号1の野生型アミノ酸配列のN末端から49番目のグルタミンがリジンに、371番目のバリンがアラニンに、513番目のバリンがロイシンに置換されている(以下、略記号Q49K/V371A/V513L)。同様に、配列番号39に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは72番目のグルタミンがグルタミン酸に、210番目のプロリンがロイシンに、264番目のアラニンがバリンに置換されており(Q72E/P210L/A264V)、配列番号40に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは81番目のバリンがロイシンに、335番目のアスパラギンがセリンに、423番目のプロリンがロイシンに置換されており(V81L/N335S/P423L)、配列番号41に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは121番目のチロシンがセリンに、370番目のアスパラギン酸がチロシンに、476番目のロイシンがプロリンに置換されており(Y121S/D370Y/L476P)、配列番号42に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは185番目のアラニンがセリンに、264番目のアラニンがバリンに、476番目のロイシンがプロリンに置換されており(A185S/A264V/L476P)、配列番号43に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは225番目のフェニルアラニンがバリンに、322番目のアスパラギン酸がアスパラギンに、468番目のメチオニンがバリンに置換されており(F225V/D322N/M468V)、配列番号44に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは225番目のフェニルアラニンがバリンに、370番目のアスパラギン酸がチロシンに、476番目のロイシンがプロリンに置換されており(F225V/D370Y/L476P)、配列番号45に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは264番目のアラニンがバリンに、356番目のアルギニンがロイシンに、476番目のロイシンがプロリンに置換されている(A264V/R356L/L476P)。また、配列番号63に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは264番目のアラニンがバリンに、299番目のセリンがアスパラギンに、476番目のロイシンがプロリンに置換されており(A264V/S299N/L476P)、配列番号64に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは264番目のアラニンがバリンに、381番目のバリンがロイシンに、476番目のロイシンがプロリンに置換されており(A264V/V381L/L476P)、配列番号65に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは264番目のアラニンがバリンに、418番目のアラニンがスレオニンに、476番目のロイシンがプロリンに置換されており(A264V/A418T/L476P)、配列番号66に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは264番目のアラニンがバリンに、437番目のアルギニンがヒスチジンに、476番目のロイシンがプロリンに置換されている(A264V/R437H/L476P)。さらに、配列番号67に示される変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは103番目のアラニンがプロリンに、264番目のアラニンがバリンに、270番目のチロシンがアスパラギン酸に、476番目のロイシンがプロリンに置換されている(A103P/A264V/Y270D/L476P)。
なお、本発明において、「加熱処理後の残存酵素活性率(residual activity)」は、「酵素活性残存率」、あるいは「酵素活性維持率」と称してもよく、酵素に対して所定の加熱処理を施したときに、その前後で活性がどのように変化するかを表した値である。すなわち、加熱処理の前後において、同一条件で酵素活性測定を行い、加熱処理後の活性値が処理前に比べてどれだけ存在するかを百分率で表した値である。本発明において基準とする「加熱処理」の条件は、緩衝液中60℃での1時間静置処理であり、この加熱処理前
後における、前記酵素活性値の比を百分率で表している。
また、本発明における「変性温度T」とは、示差走査マイクロカロリメトリーの測定によって求めた値である。この測定における標品としての酵素溶液の昇温速度は1時間当たり60℃で行った。
本発明に係る変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは、加熱処理後においても酵素活性を所定レベル以上維持することができる。
次に、本発明の具体的実施例について、実験結果に基づき説明する。
(実施例1):M. verrucaria由来BOのcDNAクローニング
1-1:M. verrucariaの培養及びメッセンジャーRNAの単離
本実施例で使用したM. verrucaria NBRC(IFO)6113株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部から分譲を受けた。入手した乾燥菌体を、復水液(ポリペプトン:0.5%、酵母エキス:0.3%、MgSO4・7H2O:0.1%)に懸濁させ、この懸濁液をポテトデキストロース寒天(PDA)プレート(ポテトデキストロース:2.4%、アガロース:1.5%)に接種した。これを5〜7日間、室温で培養を行ったところ、PDAプレートの表面は白色の菌糸により覆われた。これをスパチュラでかき集めて-80℃で保存した。菌体の収量はPDAプレート1枚(直径9cm)当たり50〜60 mg(湿重量)であった。
メッセンジャーRNA(以下、mRNA)は、トータルRNA(mRNA、リボソームRNA、転移RNAの混合物)として抽出した。約100 mgのM. verrucariaの凍結菌体粉末から100μg(UV吸収により定量)のトータルRNAが得られ、その1/4量を次の逆転写PCRの一反応分の鋳型RNAとして用いた。
1-2:逆転写PCRによるBO遺伝子断片の作製。
逆転写PCRは、OneStep RT-PCR Kit(キアゲン)を用いて、上記トータルRNAを鋳型として行った。逆転写PCRに用いるPCRプライマーは、既報のBOのcDNAの塩基配列を基に、以下の「表1」に示すように設計した。
得られたPCR産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、1700bp付近に強いバンドが確認できた。この1700bpというサイズから目的のBO遺伝子を含む増幅断片であると推察されたので、この断片をアガロースゲルスラブより切り出して、次の工程に用いた。
1-3:pYES2/CTベクターへのBO遺伝子断片の組み込み
得られた1700bpの増幅断片は制限酵素HindIII、XbaIにより消化した後、同酵素で消化したpYES2/CTプラスミドベクター(インビトロジェン)と連結した。この際、制限酵素処理によるpYES2/CTベクターの5’突出末端の脱リン酸化処理にはCalf intestine由来アルカリフォスファターゼ(タカラバイオ)を、挿入断片とpYES2/CTベクターの連結反応にはT4 DNAリガーゼ(タカラバイオ)をそれぞれ用いた。
ここで得られる反応産物によりE. coli TOP10株(インビトロジェン)を形質転換して、LB/Amp寒天平板培地(組成は表2参照)に接種した。一晩培養後、アンピシリンに対する薬剤耐性を有する形質転換体のコロニーが得られた。これを3mlのLB/Amp培地で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドベクターを単離した。
得られたプラスミドベクターのBO遺伝子を含む挿入部分の塩基配列を調べたところ、配列番号48であった。
配列番号48に示した塩基配列は1719bpであり、572残基分のアミノ酸に相当する。一方、成熟型のM. verrucaria由来BOは、534残基のアミノ酸から構成される(配列番号1)。ここで、この差分にあたる38残基のアミノ酸はN末端側に存在し、そのC末端側に存在するタンパク質の分泌を司るシグナルペプチドである。この部分は翻訳後、分泌に際して切断される。
1−4:AAA配列の挿入
次に、1-3で作製したプラスミドベクターに対して、組換えタンパク質の発現量を増加させるように、その塩基配列の一部に改良を施した。具体的には、開始コドン(ATG)より上流側(5’-側)の3塩基を以下のように変更した。
この3塩基の変更には、以下の表4に示すPCRプライマーを用いて、Quick-change Mutagenesis Kit(ストラタジーン)によって行った。詳細な実験手順は付属のマニュアルに従った。
塩基配列の確認は、変更箇所を含むBO遺伝子の全領域において行い、設計したとおりに変更されていることを確認した。以降、配列変更後のプラスミドベクターを「pYES2/CT-BOベクター」と称する。
(実施例2):S. cerevisiaeによる組換えBOの分泌発現系の構築
2−1:pYES2/CT-BOベクターによるS. cerevisiaeの形質転換。
次に、上記pYES2/CT-BOベクターを用いて、S. cerevisiaeの形質転換を行った。S. cerevisiaeは、pYES2/CTベクターと共に市販されているINVSc1株(インビトロジェン)を用いた。ここでは、酢酸リチウム法によりS. cerevisiaeの形質転換を行った。詳細な実験手順はpYES2/CTベクターに付属のマニュアルを参考にした。形質転換酵母の選択には、SCGlu寒天平板培地(組成は表5を参照)を用いた。
2−2:組換えBOの分泌発現。
pYES2/CT-BOベクターによるS. cerevisiaeの形質転換体のコロニーを15 ml のSCGlu液体培地に接種し、14〜20時間、30℃で震とう培養を行った。得られた菌体は一旦、遠心分離(1500×g、室温、10分)により沈澱させた。
ここで、SCGlu液体培地を捨てた後、得られた菌体はSCGal培地(組成は表6を参照)50 mlに濁度(OD600)が約0.5になるように加えた。これを10−14時間、25℃で震盪培養を行った。培養後は遠心分離により菌体を除き、残りの培養液を5 ml程度まで濃縮して、20 mM リン酸Naバッファー(pH 7.4)に対して透析を行った。
組換えBOの精製は、Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィー(His-trap HP(1 ml)、アマシャムバイオサイエンス)により行った。精製の方法は付属のマニュアルに従った。得られた精製後の組換えBOはSDS-PAGE等により純度100%であることを確認した。これの収量は1L培養に換算するとそれぞれ0.36 mgであった。
(実施例3):分子進化工学的手法による組換えBOの耐熱化スクリーニング
次に、分子進化工学的手法による組換えBOの耐熱化スクリーニングを行った。具体的には、Error-prone PCRを用いたランダム変異の挿入、変異体のBO遺伝子ライブラリの作製、変異体遺伝子ライブラリによるS. cerevisiaeの形質転換、96ウェルプレートを用いた耐熱化スクリーニングを行った。
3-1:Error-prone PCRを用いたランダム変異の挿入。
pYES2/CT-BOベクターを鋳型としてError-prone PCRによるランダム変異の挿入を行った。ここで用いるN末端側のPCRプライマーは開始コドンより218塩基対下流に存在する唯一のBglIIサイト(AGATCT)を含むように設計した。また、C末端側はXbaIサイト(TCTAGA)を含むよう以下のように設計した(表7参照)。
これらのプライマーを用いて、GeneMorph PCR Mutagenesis Kit(ストラタジーン)によりError-prone PCRを行った。反応条件は同キットに付属のマニュアルを参考にして設定した。
得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動によって分析したところ、約15 00bpのPCR断片を得ることができた。得られたPCR産物の収量から計算される変異の頻度は、1000bp当たり1.5 箇所であった。計算方法は同キットに付属のマニュアルを参照した。
3−2:変異体のBO遺伝子ライブラリの作製。
上記3-1で作製した、ランダムに変異が挿入されたBO遺伝子断片は、1−3で示した方法と同様の方法でpYES2/CT-BOベクターのBglII-XbaIサイトへの組み込み、E. coliTOP10株の形質転換を行った。ここでは約6600個の形質転換体のコロニー、即ち、約6600種の変異体遺伝子を含むプラスミドのライブラリを得た。
3-3:変異体BO遺伝子ライブラリによるS. cerevisiaeの形質転換。
上記3−2で示した方法によって、変異体遺伝子ライブラリによるS. cerevisiae INVSc1株(インビトロジェン)の形質転換を行った。S. cerevisiae INVSc1のコンピテントセルは、酢酸リチウム法によって作製した。得られた形質転換体のライブラリに対して96ウェルプレートを用いた耐熱化スクリーニングを行う。
3-4:96ウェルプレートを用いた耐熱化スクリーニング実験。
SCGlu培地を96ウェルプレートに150mlずつ分注する。上記で作製した形質転換酵母ライブラリのコロニーを個々のウェルに1つずつ接種した。これを20〜23時間、27℃で震盪培養を行った。この培養後、それぞれのウェルの濁度は目視によるとほぼ一定となった。
この段階で一度96ウェルプレートごと遠心分離(1500×g, 20℃, 10分)を行い、菌体を一旦沈殿させた。それぞれのウェルの底に沈澱した菌体をかき乱さないように、SCGlu培地を完全に取り除いた。ここへSCGal培地を180 ml分注して、さらに8時間、27℃で震盪培養を行った。この培養後、再び遠心分離(1500×g, 20℃, 10分)を行い、菌体を沈澱させた。この上澄み液100 mlを別の新しい96ウェルプレートに移し変えた。ここで熱処理を行う場合は、この96ウェルプレート上のサンプル溶液をセロファンテープでシールした後、80℃のドライオーブンで15分間放置した。熱処理後は5分間、氷浴上で急冷した後、室温で15分放置した。これに等量の20 mM ABTS溶液(100 mM Tris-HCl pH 8.0)を混合した。ウェル内の溶液がABTSの反応に伴って緑色に呈色する様子を反応開始1時間後まで観察した。比較とした野生型に比較してABTSの呈色が強いものをピックアップして、それに相当する菌体を20%グリセロールストックとして-80℃で保存した。
図1に耐熱化スクリーニングの一例を示す。図1は、反応開始1時間後のABTSの呈色の様子を示している。中央の2列(左から6,7列目)のすべては比較としての野生型の組換えBOであり、6列目は他のウェルと同様に熱処理を行ったものである。7列目は野生型の組換えBOの熱処理のない場合の比較である。
図1によると、四角囲い部分のウェルが6列目の野生型のどれよりも強くABTSが呈色していることがわかる。これらのウェルでは、野生型組換えBOに比較して熱安定性が向上した変異体BOが発現していると考えられる。
本実施例では3−4で示した耐熱化スクリーニングを96ウェルプレートで50枚、計4000検体について行い、耐熱化変異体BOを発現したと考えられる形質転換酵母を26個選出した。
得られた26個の形質転換酵母からプラスミドベクターを抽出し、BO遺伝子領域の塩基配列の解析を行った結果、以下の26種の変異がBO遺伝子に挿入されていることが判明した。すなわち、上述した略記号Q49K, Q72E, V81L, Y121S, R147P, A185S, P210L, F225V, G258V, A264V, D322N, N335S, R356L, P359S, D370Y, V371A, P423L, M468V, L476P, V513L, A103P, Y270D, S299N, V381L, A418T, R437Hの変異が確認された。
(実施例4):耐熱化変異体のPichia methanolicaによる大量発現
以下では、耐熱化スクリーニングによって発見した26種の耐熱化変異体候補を大量に発現するために、新たに酵母Pichia methanolica(以下、P. methanolica)を用いた組換えBOの分泌発現系の構築を行い、野生型および耐熱化変異体候補の大量発現を試みた。
4−1:pMETaB-BOベクターの作製及びそれによるP. methanolicaの形質転換
まず、P. methanolica の発現系で用いる発現ベクターの作製を行った。ここで用いるpMETaBベクター(インビトロジェン)にはS. cerevisiae由来の分泌シグナル:α因子が含まれるので、その下流に成熟BOに相当する遺伝子を挿入した。成熟BO遺伝子領域のPCRによる増幅には、鋳型としてpYES2/CT-BOベクターを、プライマーとして以下の「表8」に示すものを用いて行った。
得られた1500bpの増幅断片は制限酵素EcoRI、SpeIにより消化した後、同酵素で消化したpMETaBベクターと連結した。この連結反応の際、1−3で示した処理と同様の処理を反応物に施した。作製したBO遺伝子領域を含むpMETaBベクター(以降、pMETaB-BOベクターとする)は、挿入したBO遺伝子部分の塩基配列の確認を行った。変異体BOの場合は、ここで作成したpMETaB-BOベクターに対してQuickChange Mutagenesis Kits(インビトロジェン)により変異を挿入した。以降の操作は野生型、変異体に関わらずすべて同様に行った。
上記の野生型及び26種の耐熱化変異体候補のpMETaB-BOベクターに加え、26種の耐熱化変異体候補の2つまたは3つまたは4つを組み合わせた多重変異体のpMETaB-BOベクターも同様に作製し、塩基配列の確認を行った。
作製したすべてのpMETaB-BOベクター によるP. methanolicaの形質転換を行った。P. methanolicaは、PMAD11株(インビトロジェン)を用いた。形質転換はpMETaBベクターに付属のマニュアルに記載された方法に従って行った。形質転換酵母の選択はMD寒天平板培地(組成は表9を参照)により行った。この反応のコンピテンシーは、いずれも〜10/1μgDNAであり、マニュアルに記載の値とほぼ一致した。
4−2:P. methanolicaによる組換えBOの大量発現
形質転換後5〜7日で得られたMD培地上の形質転換酵母のコロニーは3 mLのBMDY培地(組成は表10を参照)で一晩培養した。得られた培養液の一部を再度、MD寒天平板培地に展開した。この2〜3日後に得られる白色の精製コロニーは、次項の大量発現に用いた。
次に、P. methanolicaによる組換えBOの大量発現作業に移行した。形質転換酵母の精製コロニーを50mLのBMDY液体培地に接種して、一晩、30℃で震とう培養を行った。このときOD600は2〜5となった。ここで、得られた菌体を一旦遠心分離(1500×g、室温、10分)により沈澱させ、BMDY液体培地を除いた後、菌体のみをBMMY液体培地(組成は表11を参照)50〜100 mlに懸濁した。これを24時間、27℃で震とう培養を行った。その後、終濃度0.5%メタノールを添加して、さらに24時間、同条件で培養を行った。これを96時間ま
で行った後、遠心分離により菌体を除き、残りの培養液を5〜10 ml程度まで濃縮して、50 mM Tris-HClバッファー(pH 7.6)に対して透析を行った。
4−3.組換えBOの精製
続いて、アニオン交換クロマトグラフィーによる組換えBOの精製を行った。前工程で調製した組換えBOを含む粗製液は、アニオン交換カラム(HiTrap Q HP;ベッド体積:5 ml;GEヘルスケアバイオサイエンス)を用いて精製を行った。精製条件は既報(Biochemistry, 38, 3034-3042(1999))を参考にして行った。
次に、疎水クロマトグラフィーによる組換えBOの精製を行った。疎水クロマトグラフィーに使用したカラムはToyopearl Butyl-650 Mカラム(100 ml;22 mm x 20 cm;東ソー)である。精製条件は既報(Biochemistry, 44, 7004-7012(2005))を参考にして行った。精製後に得られた組換えBO(A264V)のUV-visスペクトルを図2に示す。
図2に示したA264Vのスペクトルパターンは既報(Protein Expression Purif., 41, 77-83 (2005))のP. pastrisによる組換えBOのそれに完全に一致していた。
P. methanolicaによる大量培養の最終的な収量は、最大で11.7 mg / 1L培養であった。
4−4:耐熱性の評価。
次に、P. methanolicaによる組換えBO及び市販品のBO(アマノエンザイム)の耐熱性の評価を行った。耐熱性の評価は加熱処理後の残存活性率の比較によって行った。BO活性測定はABTSを基質として用い、反応進行に伴う730 nmの吸光度変化(ABTSの反応物の増加に由来する)を追跡した。測定条件は「表12」のとおりとした。なお、BO濃度は活性測定の際、730 nmの吸光度変化が1分間当たり0.01 〜 0.2 程度となるように調製した。反応はABTSを含むリン酸緩衝液(2980 〜 2995μL)に酵素溶液(5〜20μL)を加えることで開始した。
P. methanolicaで発現させた計26種の耐熱化BO変異体候補(Q49K, Q72E, V81L, Y121S, R147P, A185S, P210L, F225V, G258V, A264V, D322N, N335S, R356L, P359S, D370Y, V371A, P423L, M468V, L476P, V513L, A103P, Y270D, S299N, V381L, A418T, R437H)及びこれらの2つまたは3つまたは4つを組み合わせた多重変異体について、耐熱性実験を行った。各酵素溶液の熱処理は氷浴中の500 mlチューブに分注した150 mlの酵素溶液(100 mM リン酸Kバッファー(pH 6.0))を60℃に設定したヒートブロック上にすばやく移動させ、一定時間放置後、再び氷浴中にすばやく戻すという方法を採用した。この耐熱化確認実験の結果を表13にまとめた。
4−5:変性温度の測定
耐熱性の評価を行った55種の耐熱化BO変異体の変性温度Tを示差走査マイクロカロリメトリー(以下、DSC:Differenctial scanning calorimetryと略す)により測定した。DSCはMicroCal社の
VP-DSCを用いた。酵素溶液は2.0〜2.5 mg/mlとし、昇温は1時間に60℃の速度で行った。この結果を活性の耐熱化確認実験と共に表13にまとめた。
本発明に係る変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼは、例えば、酵素を固定化した電極を用いる燃料電池、特に、該酵素電池のカソード(Cathode、正極)側において、酸素の電気化学的4電子還元反応を実現する触媒として利用できる。
耐熱化スクリーニングの一例を示し、ABTSの発色の様子を示している図(反応開始1時間)である。 変異型組換えBOのUV-visスペクトルを示す図である。

Claims (61)

  1. 不完全糸状菌Myrothecium verrucaria由来ビリルビンオキシダーゼの配列番号1の野生型アミノ酸配列において、少なくとも一つ以上のアミノ酸残基が欠失、置換、付加若しくは挿入されている変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  2. 変性温度T値が72℃以上である請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  3. 60℃、1時間加熱処理後の残存酵素活性率(residual activity)が20%以上である請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  4. 前記不完全糸状菌は、Myrothecium verrucaria NBRC(IFO)6113株であることを特徴とする請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  5. 酵母Pichia methanolicaを宿主として発現させたことを特徴とする請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  6. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から49番目のグルタミンをリジンに置換(Q49K)した配列番号2に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  7. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から72番目のグルタミンをグルタミン酸に置換(Q72E)した配列番号3に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  8. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から81番目のバリンをロイシンに置換(V81L)した配列番号4に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  9. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から121番目のチロシンをセリンに置換(Y121S)した配列番号5に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  10. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から147番目のアルギニンをプロリンに置換(R147P)した配列番号6に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  11. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から185番目のアラニンをセリンに置換(A185S)した配列番号7に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  12. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から210番目のプロリンをロイシンに置換(P210L)した配列番号8に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  13. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から225番目のフェニルアラニンをバリンに置換(F225V)した配列番号9に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  14. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から258番目のグリシンをバリンに置換(G258V)した配列番号10に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  15. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から264番目のアラニンをバリンに置換(A264V)した配列番号11に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  16. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から322番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換(D322N)した配列番号12に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  17. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から335番目のアスパラギンをセリンに置換(N335S)した配列番号13に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  18. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から356番目のアルギニンをロイシンに置換(R356L)した配列番号14に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  19. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から359番目のプロリンをセリンに置換(P359S)した配列番号15に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  20. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から370番目のアスパラギン酸をチロシンに置換(D370Y)した配列番号16に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  21. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から371番目のバリンをアラニンに置換(V371A)した配列番号17に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  22. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から423番目のプロリンをロイシンに置換(P423L)した配列番号18に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  23. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から468番目のメチオニンをバリンに置換(M468V)した配列番号19に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  24. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から476番目のロイシンをプロリンに置換(L476P)した配列番号20に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  25. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から513番目のバリンをロイシンに置換(V513L)した配列番号21に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  26. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から103番目のアラニンをプロリンに置換(A103P)した配列番号57に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  27. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から270番目のチロシンをアスパラギン酸に置換(Y270D)した配列番号58に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  28. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から299番目のセリンをアスパラギンに置換(S299N)した配列番号59に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  29. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から381番目のバリンをロイシンに置換(V381L)した配列番号60に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  30. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から418番目のアラニンをスレオニンに置換(A418T)した配列番号61に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  31. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から437番目のアルギニンをヒスチジンに置換(R437H)した配列番号62に示される請求項1記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  32. 請求項6〜31記載の置換から選択される2または3または4のアミノ酸残基置換を組み合わせた多重変異型ビリルビンオキシダーゼ。
  33. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から49番目のグルタミンをリジンに置換(Q49K)、371番目のバリンをアラニンに置換(V371A)した配列番号22に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  34. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から72番目のグルタミンをグルタミン酸に置換(Q72E)、210番目のプロリンをロイシンに置換(P210L)した配列番号23に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  35. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から72番目のグルタミンをグルタミン酸に置換(Q72E)、264番目のアラニンをバリンに置換(A264V)した配列番号24に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  36. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から81番目のバリンをロイシンに置換(V81L)、147番目のアルギニンをプロリンに置換(R147P)した配列番号25に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  37. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から81番目のバリンをロイシンに置換(V81L)、423番目のプロリンをロイシンに置換(P423L)した配列番号26に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  38. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から121番目のチロシンをセリンに置換(Y121S)、476番目のロイシンをプロリンに置換(L476P)した配列番号27に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  39. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から185番目のアラニンをセリンに置換(A185S)、258番目のグリシンをバリンに置換(G258V)した配列番号28に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  40. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から210番目のプロリンをロイシンに置換(P210L)、264番目のアラニンをバリンに置換(A264V)した配列番号29に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  41. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から225番目のフェニルアラニンをバリンに置換(F225V)、322番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換(D322N)した配列番号30に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  42. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から225番目のフェニルアラニンをバリンに置換(F225V)、476番目のロイシンをプロリンに置換(L476P)した配列番号31に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  43. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から264番目のアラニンをバリンに置換(A264V)、356番目のアルギニンをロイシンに置換(R356L)した配列番号32に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  44. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から264番目のアラニンをバリンに置換(A264V)、476番目のロイシンをプロリンに置換(L476P)した配列番号33に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  45. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から322番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換(D322N)、468番目のメチオニンをバリンに置換(M468V)した配列番号34に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  46. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から335番目のアスパラギンをセリンに置換(N335S)、423番目のプロリンをロイシンに置換(P423L)した配列番号35に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  47. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から356番目のアルギニンをロイシンに置換(R356L)、476番目のロイシンをプロリンに置換(L476P)した配列番号36に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  48. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から371番目のバリンをアラニンに置換(V371A)、513番目のバリンをロイシンに置換(V513L)した配列番号37に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  49. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から49番目のグルタミンをリジンに置換(Q49K)、371番目のバリンをアラニンに置換(V371A)、513番目のバリンをロイシンに置換(V513L)した配列番号38に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  50. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から72番目のグルタミンをグルタミン酸に置換(Q72E)、210番目のプロリンをロイシンに置換(P210L)、264番目のアラニンをバリンに置換(A264V)した配列番号39に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  51. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から81番目のバリンをロイシンに置換(V81L)、335番目のアスパラギンをセリンに置換(N335S)、423番目のプロリンをロイシンに置換(P423L)した配列番号40に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  52. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から121番目のチロシンをセリンに置換(Y121S)、370番目のアスパラギン酸をチロシンに置換(D370Y)、476番目のロイシンをプロリンに置換(L476P)した配列番号41に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  53. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から185番目のアラニンをセリンに置換(A185S)、264番目のアラニンをバリンに置換(A264V)、476番目のロイシンをプロリンに置換(L476P)した配列番号42に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  54. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から225番目のフェニルアラニンをバリンに置換(F225V)、322番目のアスパラギン酸をアスパラギンに置換(D322N)、468番目のメチオニンをバリンに置換(M468V)した配列番号43に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  55. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から225番目のフェニルアラニンをバリンに置換(F225V)、370番目のアスパラギン酸をチロシンに置換(D370Y)、476番目のロイシンをプロリンに置換(L476P)した配列番号44に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  56. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から264番目のアラニンをバリンに置換(A264V)、356番目のアルギニンをロイシンに置換(R356L)、476番目のロイシンをプロリンに置換(L476P)した配列番号45に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  57. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から264番目のアラニンをバリンに置換(A264V)、299番目のセリンをアスパラギンに置換(S299N)、476番目のロイシンをプロリンに置換(L476P)した配列番号63に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  58. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から264番目のアラニンをバリンに置換(A264V)、381番目のバリンをロイシンに置換(V381L)、476番目のロイシンをプロリンに置換(L476P)した配列番号64に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  59. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から264番目のアラニンをバリンに置換(A264V)、418番目のアラニンをスレオニンに置換(A418T)、476番目のロイシンをプロリンに置換(L476P)した配列番号65に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  60. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から264番目のアラニンをバリンに置換(A264V)、437番目のアルギニンをヒスチジンに置換(R437H)、476番目のロイシンをプロリンに置換(L476P)した配列番号66に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
  61. 前記野生型アミノ酸配列において、N末端から103番目のアラニンをプロリンに置換(A103P)、N末端から264番目のアラニンをバリンに置換(A264V)、270番目のチロシンをアスパラギン酸に置換(Y270D)、476番目のロイシンをプロリンに置換(L476P)した配列番号67に示される請求項32記載の変異型耐熱性ビリルビンオキシダーゼ。
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