JP2006238808A - 新規なピリドキサール4−デヒドロゲナーゼ及びその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】メソリゾビウム(Mesorhizobium)属微生物及びアグロバクテリウム(Agrobacterium)属由来の新規PLDHと、それをコードするDNAを提供する。このPLDHを用いてピリドキサールを脱水素し、4-ピリドキソラクトンや4-ピリドキシン酸を製造することができる。さらに該酵素を利用した優れたビタミンB6定量法・試薬が提供できる。本発明によるPLDHは、活性に優れるなど工業的に有利な性状を示す。
【選択図】 なし
Description
特には、本発明は新規な酵素ピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ(pyridoxal 4-dehydrogenase, PLDH)及び該酵素遺伝子、並びにそれらの利用技術に関する。
4-ピリドキシン酸は、4-ピリドキソラクトンからラクトン環を加水分解することで容易に得られるが、4-ピリドキシン酸にもキレート活性や紫外線吸収能(特許文献1、4)があり、化粧品原料、食品添加物、医薬品、飼料添加物などとしての使用が期待される。
微生物のピリドキサールデヒドロゲナーゼはシュウドモナス属(Pseudomonas sp.) MA-1由来のもの(非特許文献5)、ミクロバクテリウム ルテオルム(Microbacterium luteolum, 旧名Aureobacterium luteolum)由来の酵素(非特許文献6)、Microbacterium luteolumの酵素を大腸菌で発現させた例(非特許文献7)が知られているが、酵素の生産量、比活性などの点で、工業的な利用面で満足いくものではなかった。
4-ピリドキシン酸あるいは4-ピリドキソラクトンが、蛍光強度が強いことを利用し、ピリドキサール4-デヒドロゲナーゼを使用したピリドキサールなどのビタミンB6の高感度測定法が提案されている(非特許文献9)が、従来の微生物ピリドキサール4-デヒドロゲナーゼ活性は検査試薬を工業的に生産するには十分でなかった。
さらに、取得した遺伝子を含む組換えDNAを保持した微生物を培養することにより、本酵素を効率的に生産できることを見出した。
これらの酵素あるいは組換えDNAを保持した微生物を4−ピリドキソラクトンの合成に利用できることを確認した。また本酵素がビタミンB6の定量に利用できる事を確認した。
かくして、本発明では、以下のような好ましい態様が提供される。
〔1〕
(1)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(2) 配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び
(3) 配列番号2に記載のアミノ酸配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも50%の同一性、少なくとも60%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも93%の同一性、少なくとも96%の同一性、あるいは少なくとも98%の同一性を持つアミノ酸配列からなり、かつ、ピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
からなる群から選択されたものであることを特徴とするタンパク質。
〔2〕
上記〔1〕に記載のタンパク質をコードする塩基配列を有することを特徴とする核酸。
〔3〕
配列番号1に記載の塩基配列を有するDNAであることを特徴とする上記〔2〕に記載の核酸。
〔4〕
下記(a)又は(b)に示すDNA
(a)配列番号1に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号28〜174及び/又は塩基番号394〜678からなる塩基配列を含むDNA
(b)配列番号1に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号28〜174及び/又は塩基番号394〜678からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
であることを特徴とする上記〔2〕に記載の核酸。
〔5〕
前記ストリンジェントな条件が、1×SSC及び0.1%SDSに相当する塩濃度で60℃で洗浄が行われる条件である上記〔4〕に記載の核酸。
〔6〕
上記〔2〕〜〔5〕のいずれか一に記載の核酸を含むことを特徴とする組換えプラスミド又はベクター。
〔7〕
上記〔2〕〜〔5〕のいずれか一に記載の核酸あるいは上記〔6〕に記載の組換えプラスミド又はベクターで宿主細胞が形質転換されていることを特徴とする形質転換体。
〔8〕
上記〔7〕に記載の形質転換体によって生産されることを特徴とするピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ又はピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
〔9〕
上記〔7〕に記載の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とするピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ又はピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
〔10〕
上記〔1〕に記載のタンパク質又は上記〔7〕に記載の形質転換体とピリドキサール若しくはその誘導体、又はそれらの塩とを接触せしめることを特徴とする4-ピリドキソラクトン若しくはその誘導体、又はそれらの塩の製造方法。
〔11〕
上記〔1〕に記載のタンパク質又は上記〔7〕に記載の形質転換体を用いることを特徴とするビタミンB6の定量方法。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び/又は改変(あるいは修飾)をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
1)DNAの抽出および目的遺伝子のクローニング方法
4-ピリドキソラクトンを生産できる微生物、例えば、Mesorhizobium lotiを培養して得られる培養物から遠心分離などで菌体を回収し、常法によりDNAを抽出する。DNA源としては、Agrobacterium tumefaciensを使用することもできる。
2)形質転換体の作成
本酵素を生産する形質転換体は、上記遺伝子を含む組換えDNAを用いて宿主を形質転換することにより作製される。当該組換えDNAは宿主微生物で自律的に増殖し得るプラスミドベクターあるいはファージベクターに本遺伝子を挿入することにより作製できる。
宿主‐ベクター系は、当該組換えDNAが自律的に増殖可能で安定に保持され、形質が発現可能なものであればよい。宿主微生物に組換えDNAを導入して形質転換する方法としては、公知の方法を用いることができ、たとえば塩化カルシウム法やエレクトロポーション法によって組換えDNAを導入することができる。
上記方法で作成した形質転換体を培養し、培養物からピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼを採取することができる。
培養条件については宿主やベクターの種類に応じ適宜決定する。
たとえば大腸菌を宿主とする場合の培養条件は、LB培地、YT培地、M9培地などを用いて、培養温度20〜40℃で培養時間4〜48時間である。
得られた培養物からの本酵素の採取は常法により行うことができ、たとえば、培養物から遠心分離により菌体を回収し、超音波処理、フレンチプレス等の方法で菌体細胞を破壊し、細胞残渣を遠心分離により除き、本酵素を採取することができる。菌体外に酵素を蓄積する場合には、培養上清をそのまま、あるいは濃縮し、本酵素を採取できる。
本酵素をさらに精製する場合には、硫安分画、透析、各種クロマトグラフィーなどの公知の方法を組み合わせる方法が挙げられる。
(a)作用
ピリドキサールから4-ピリドキソラクトンを生成する。
(b)基質特異性
ピリドキサールに対するKm値は0.091mMである。
ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール5'-リン酸、ピリドキサミン5'-リン酸、4-ピリドキシン酸には作用しない。
L‐フコース、D‐アラビノース、L‐キシロースには作用しない。
NAD+に対するKmは0.28mMである。NADP+も基質として用いることも可能でその際の相対活性は0.16%である。
(c)反応至適pH 9.2
(d)反応至適温度 50℃
(e)温度安定性 40℃以下
(f)分子量 97kDa(ゲル濾過法による)
(g)サブユニット数 4(25kDaのテトラマー)
本明細書中、「ピリドキサール」とは、ピリドキサール及び/又はその塩を包含すると考えてよく、その塩としては、公知のものがすべて包含されてよく、例えば、好ましいものとしてはピリドキサール塩酸塩などが挙げられる。
使用する触媒:本発明の形質転換体、形質転換体の加工物(凍結乾燥菌体、アセトンパウダーなど)、固定化菌体、粗ピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ、精製ピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ、固定化ピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼなど)
補酵素:NAD+またはNADP+
基質:ピリドキサール
基質濃度:0.001%から20%、好ましくは0.01%から5%
温度:20℃から60℃、好ましくは30℃から50℃
pH:6−11、好ましくは7−10、適当な緩衝液を用いる
反応時間:5分から72時間、好ましくは8−48時間
このとき用いる補酵素としてはNAD+またはNADP+を単独あるいは混合して用いる。NAD+またはNADP+は、形質転換体が菌体内に含むものを用いても良いし、微生物が生合成するものを用いてもよい。また、それぞれの還元型のもの(NADHまたはNADPH)を酵素や形質転換体や別に添加した微生物で酸化し用いてもよい。基質であるピリドキサールを、以下のようにビタミンB6関連物質から化学的あるいは酵素的に転換することにより供給してもよい。すなわちピリドキシンあるいはピリドキシン塩酸塩をピリドキサールに転換する場合、ピリドキシン4−オキシダーゼやピリドキシン4−デヒドロゲナーゼなどを添加すればよい。ピリドキサミンあるいはピリドキサミン二塩酸塩をピリドキサールに転換する場合、ピリドキサミン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼやピリドキサミン−2-オキソ酸アミノトランスフェラーゼなどを添加すればよい。
10pmolから1000pmolの濃度範囲でピリドキサールを含むサンプルに、本酵素と、ピリドキサールを4-ピリドキソラクトンに転換するのに十分量のNAD+またはNADP+を加え、温度20-50℃で5分‐12時間、加温し、その後、分光蛍光光度計、あるいは蛍光検出器のついたHPLCで測定することにより、ピリドキサールを定量できる。
また、ピリドキシンを定量するには、化学的あるいは酵素(ピリドキシン 4-オキシダーゼやピリドキシン 4-デヒドロゲナーゼなど)的にピリドキシンをピリドキサールに転換すればよく、ピリドキサミンを定量するには、化学的あるいは酵素的(ピリドキサールレダクターゼなど)にピリドキサミンをピリドキサールに転換すればよく、ピリドキサール5'−リン酸を測定するには、化学的あるいは酵素的(フォスファターゼなど)にリン酸を加水分解しピリドキサールに転換すればよい。
ピリドキサミン 5'-リン酸を測定するには、化学的あるいは酵素(ピリドキサミン 5'-リン酸オキシダーゼやホスファターゼ)的にピリドキサミン5'−リン酸をピリドキサールに変換すればよい。
(1)ピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は既に知られているが、本発明の酵素は、既知の同活性を有する酵素と比べ、比活性が非常に高く、諸性質が既知酵素と異なるため、明らかに新規な酵素である。
(2) ピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼと呼ばれる酵素は、ピリドキサールから4-ピリドキソラクトンを生成する反応を触媒するものを指している。4-ピリドキソラクトンは、ビタミンB6の体内代謝物として知られている物質であるが、キレート能があり、特許などによって、化粧品分野などで有効な効能が示されているものである(B6活性自体はない)。
(3)4-ピリドキソラクトンの化学的な合成法は、煩雑である。酵素的な合成法が非常にシンプルであり、製法が確立されればコスト低減が予測される。
(4) ピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼを用いるとビタミンB6類を高感度で検出できることが知られており、食品、血中のB6定量に有効である。本発明の酵素は比活性が高いため、この定量法を改良できる。
上記微生物は、TY培地等の微生物の培養に用いられる一般的な培地で培養される。培養培地は、該菌が増殖し得るものである限り特に限定されないが、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素等を含有する液体栄養培地などが使用できる。十分に増殖させた後に菌体を回収し(例えば、遠心分離などして回収し)、緩衝液中で破砕等(例えば、ガラスビーズを使用した物理的破砕、超音波処理あるいは酵素などによる生化学的手法)して無細胞抽出液とする。無細胞抽出液から、蛋白質の溶解度による分画(有機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など)、透析、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水性クロマトグラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィニティー・クロマトグラフィーなどを単独あるいは適宜組み合わせることにより精製する事ができる。例えば、DEAE-セファロース(Sepharose)などを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、ブルー-セファロースを用いたアフィニティー・クロマトグラフィー、Mono Q HR 5/5(FPLCシステム、アマシャム・ファルマシアバイオテク)などの高性能液体クロマトグラフィーシステム等を経て電気泳動的にほぼ単一バンドにまで精製することができる。
本発明のPLDHは、それを生産し得る微生物から得ることができ、該微生物は野生株又は変異株のいずれであってもよい。さらに、細胞融合又は遺伝子組換え技術等の遺伝子操作や遺伝学的な手法により誘導される微生物あるいはそれ以外の細胞(例えば、形質転換された細胞を含む)も用いられる。
PCR 反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行うことができるが、上記文献の他、例えばR. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki, et al., Science, 239: 487, 1988; D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols: a guide to methods and applications", Academic Press, New York (1990)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor (Ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988)などに記載された方法あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことができる。また、PCR 法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施することもできる。
宿主細胞が、例えばエシェリヒア属、特に大腸菌の場合、例えば大腸菌K12株に由来するものが挙げられ、例えばM15, C600, DH1, DH5, DH11S, DH12S, DH5α, DH10B, HB101, MC1061, JM109, STBL2, STBL4, XL1-Blue系株, BL21(DE3)pLysSなどが挙げられる。メソリゾビウム(Mesorhizobium)属菌、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属菌、例えば、メソリゾビウム ロティ(Mesorhizobium loti)、アグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)なども好適な宿主細胞である。
タンパク質・ポリペプチドの構造の修飾・改変などは、例えば日本生化学会編、「新生化学実験講座1、タンパク質 VII、タンパク質工学」、東京化学同人(1993)を参考にし、そこに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法、さらにはそれらと実質的に同様な方法で行うことができる。またその生物学的活性のうちには、免疫的に活性、例えば抗原性を有するということも含まれてよい。該修飾・改変のうちには、アミノ基、SH基及び/又はカルボキシル基の導入、シリル化、脱アミノ化、ヒドロキシル化、リン酸化、メチル化、アセチル化などのアシル化、酸化、還元、開環、閉環、D−体アミノ酸残基への置換などであってもよい。それらの方法は、当該分野で知られている。
本明細書において、「実質的に同等」とはポリペプチドの活性、例えば、ピリドキサールに作用し、4-ピリドキソラクトンを生成する点で高い選択性、高い酵素活性、高い安定性などのいずれかの活性、それに対応する生理的な活性、生物学的な活性が実質的に同じであることを意味する。さらにまた、その用語の意味の中には、実質的に同質の活性を有する場合を包含していてよく、該実質的に同質の活性としては、例えば、高い生産性、ピリドキサールに作用し、4-ピリドキソラクトンを生成する従来に比較して高い酵素活性などを挙げることができる。該実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に同質であることを示し、例えば、生理的に、脱水素反応的に、あるいは生物学的に同質であることを示す。例えば、該PLDH活性などの活性が、同等(例えば、約1〜10000倍、好ましくは約1〜1000倍、より好ましくは約1〜200倍、さらに好ましくは約1〜10倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的な要素は異なっていてもよい。
アミノ酸配列に関しては:
A:アラニン(Ala) M:メチオニン(Met)
C:システイン(Cys) N:アスパラギン(Asn)
D:アスパラギン酸(Asp) P:プロリン(Pro)
E:グルタミン酸(Glu) Q:グルタミン(Gln)
F:フェニルアラニン(Phe) R:アルギニン(Arg)
G:グリシン(Gly) S:セリン(Ser)
H:ヒスチジン(His) T:スレオニン(Thr)
I:イソロイシン(Ile) V:バリン(Val)
K:リジン(Lys) W:トリプトファン(Trp)
L:ロイシン(Leu) Y:チロシン(Tyr)
ヌクレオチド配列に関しては:
A,a:アデニン G,g:グアニン
C,c:シトシン T,t:チミン
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。以下の実施例における通常慣用されるDNAクローニングを含めた技術としては、標準的な実験マニュアル、例えばJ. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) & J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)に記載されるように実施できる。また特にPCR法では、R. Saiki et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Saiki et al., Science, 239: 487, 1988; H. A. Erlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press, 1989 ; D. M. Glover et al. (ed.), "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); M. A. Innis et al. (ed.), "PCR Protocols: a guide to methods and applications", Academic Press, New York (1990)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor (ed.), PCR: a practical approach, IRL Press, Oxford (1991)などに記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるいはキットを用いている場合はそれらに添付の指示書(protocols)や添付の薬品などを使用している。
後述の実施例1(c)に記載のMesorhizobium loti PLDH(配列番号2)をコードするDNA配列(配列番号1)をpET21a (Novagen)に挿入して得られたプラスミドpET6807でE. coli BL21(DE3)を形質転換して得られた形質転換体(発現株)BL21(DE3)/pET6807は、平成17年2月18日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(郵便番号 305-8566)の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary: IPOD)に寄託されて保管されている(受領番号 FERM AP-20410、受領日: 平成17年2月18日)。
(1)DNA抽出
TY培地(0.5% トリプトン、0.3% 酵母エキス、0.1% 塩化カルシウム2水和物、pH 6.8)で培養したMesorhizobium loti菌体からApuapure genomic DNA isolation kit (Bio-Rad)を用いて、染色体DNAを抽出した。
(2)クローニング
(a)PCRによる本酵素遺伝子の増幅
上記(1)で得られた染色体DNAをPCRにより増幅した。PCR反応(50 ml)は、0.2 mM dNTPs、2.5 mM 塩化マグネシウム、鋳型DNA, 20 pmol各プライマー、1.25 units LA Taq ポリメラーゼを含むLA PCR buffer(TaKaRa Bio)中で行った。プライマーは、
5’-GGAGACAUATGACTGAACGGCTTGCGGGAAAG-3’(センス;配列番号3)と
5’-GGGAAAGUCCACTATCCGACTTAGTGCCTGACCATC-3’(アンチセンス;配列番号4)を用いた(Uはデオキシウリジンを示している。)。反応条件は、94℃、5分間処理後、94℃ 1分間、57℃1分間、72℃2分間というサイクルを30回繰り返した。最後に72℃で5分間加熱した。
(b)pNEB205Aベクターへの連結
増幅した断片は、USER (Uracil-Specific Excision Reagent) friendly cloning kit (New England BioLabs)のプロトコールに従い、pNEB205Aベクターに連結後、E. coli JM109を形質転換した。構築したプラスミドpNEB6807は、DNAシークエンスにより、変異の無いことを確認した。解析はABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems)を用いて行った。DNA配列を配列番号:1に示した。また、推定されるアミノ酸配列を配列番号:2に示した。
(c)pET21aベクターへの連結
pNEB6807をNdeI、EcoRIで処理し、同制限酵素で処理したpET21aベクターに連結した。(EcoRIサイトはpNEB205Aベクター上に存在する。)構築したプラスミドpET6807を用いて、E. coli BL21(DE3)を形質転換した。この株を発現株BL21(DE3)/pET6807として用いた。本発現株BL21(DE3)/pET6807は、平成17年2月18日から茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6(〒305-8566)の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託され、保管されている(受領番号FERM AP-20410、受領日: 平成17年2月18日)。
実施例1(2)で得られた発現株0.9 gを12 mLの0.1% (v/v) 2-メルカプトエタノール、10% (w/v) グリセロール、1 mM EDTA、1 mM フェニルメチルスルホニルフルオリドを含む20 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 8.0)に懸濁した(1 mM フェニルメチルスルホニルフルオリドを除いた緩衝液をBuffer Aとする)。Heat Systems-Ultrasonics sonicator W-220を用いて、氷中で3分間菌体を破砕した。遠心分離. (10,000 × g、4℃、20分)によって得られた上清(12 mL)を粗抽出液として用いた。(比活性13U/mgタンパク質)なお、pH9.2、30℃の条件で1分間に1μmolのNADH量を生成する酵素量を1Uとした。
粗抽出液に 40%飽和となるよう硫酸アンモニウムを加え、氷中で2時間静置した後、遠心分離(10,000 × g、4℃、20分)した。得られた上清に70%飽和となるよう硫酸アンモニウムを加え、氷中で2時間静置した後、遠心分離 (10,000 × g、4℃、20分) した。得られた沈殿を14 mLのBuffer Aに溶解し、硫安分画画分とした。
硫安分画画分に最終濃度1.5 Mとなるように硫安を加えた。あらかじめ1.5 M 硫安を含むBuffer Aで平衡化したButyl-Toyopearl(Tosoh, 1.5 × 15 cm)カラムにサンプルをアプライした。非吸着タンパク質の溶出がみられなくなるまで(波長280 nmの値が0.1以下)Buffer Aを流した。溶出は1.5−0 M 硫安のグラジエントにより行った。
Butyl-toyopearl溶出画分(94.5 mL)を上記のように70%飽和硫安により濃縮した。濃縮した酵素は0.1% (v/v) 2-メルカプトエタノール、10% (w/v) グリセロール、1 mM EDTA を含む20 mM 炭酸ナトリウム緩衝液(pH 9.0)(Buffer B) に透析した。あらかじめBuffer Bで平衡化したQA52カラム(Whatman, 1.8 × 6.5 cm)にサンプルをアプライした。非吸着タンパク質の溶出がみられなくなるまで(波長280 nmの値が0.1以下)Buffer Bを流した。溶出は0-0.4 M KClのグラジエントにより行った。(比活性88U/mgタンパク質)
得られたピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼは、SDS−PAGEで単一バンドであり、以下の性質を示した。
(a)作用
ピリドキサールから4−ピリドキソラクトンを生成する。
(b)基質特異性
ピリドキサールに対するKm値は0.091mMである。
ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール5'-リン酸、ピリドキサミン5'-リン酸、4-ピリドキシン酸には作用しない。
L‐フコース、D‐アラビノース、L‐キシロースには作用しない。
NAD+に対するKmは0.28mMである。NADP+も基質として用いることも可能でその際の相対活性は0.16%である。
(c)反応至適pH9.2(図1)
(d)反応至適温度 50℃(図2)
(e)温度安定性 40℃以下(図3)
(f)分子量 97kDa(ゲル濾過法による)
(g)サブユニット数 4(25kDaのテトラマー)
これらの性質は既知のピリドキサール 4−デヒドロゲナーゼとは、4量体であること、至適温度が50℃と高いこと、L-フコースを基質としない点で大きく異なっている。また比活性が格段に高い点でも異なっている。本酵素と同一オリジンのL-フコースデヒドロゲナーゼ(非特許文献10)とはL-フコースを基質としない点、精製後の比活性で明らかに異なり、新規な酵素であることがわかる。
組換え大腸菌10 mg(湿重)と10 mM ピリドキサールを含む1mLのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を37℃、24 hrインキュベーションし、4-ピリドキソラクトンをHPLCで定量した。その結果、モル収率50 %で4-ピリドキソラクトンが得られた。
0−1000pmolのピリドキサールを含む150μLのサンプルを10μmolのリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)、0.2μmolのNAD+、40μUのピリドキサール4-デヒドロゲナーゼを含む液50μLと混合し、30℃で2時間インキュベートした。10μLの20%(w/v)SDSを添加し、反応をとめ、800μLの50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)を加えて、蛍光強度を測定した。(励起波長356nm, 測定波長432nm)サンプル中にピリドキサールが10pmol以上あれば測定可能であり、10−1000pmolの間で蛍光強度との間で高い相関性があった。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
SEQ ID NO: 4, Oligonucleotide to act as a primer for PCR, wherein n stands for deoxyuridine
Claims (11)
- (1)配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、
(2) 配列番号2に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、及び
(3) 配列番号2に記載のアミノ酸配列に対してアミノ酸レベルで少なくとも50%の同一性、少なくとも60%の同一性、少なくとも70%の同一性、少なくとも80%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも93%の同一性、少なくとも96%の同一性、あるいは少なくとも98%の同一性を持つアミノ酸配列からなり、かつ、ピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
からなる群から選択されたものであることを特徴とするタンパク質。 - 請求項1に記載のタンパク質をコードする塩基配列を有することを特徴とする核酸。
- 配列番号1に記載の塩基配列を有するDNAであることを特徴とする請求項2に記載の核酸。
- 下記(a)又は(b)に示すDNA
(a)配列番号1に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号28〜174及び/又は塩基番号394〜678からなる塩基配列を含むDNA
(b)配列番号1に記載の塩基配列のうち、少なくとも塩基番号28〜174及び/又は塩基番号394〜678からなる塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA
であることを特徴とする請求項2に記載の核酸。 - 前記ストリンジェントな条件が、1×SSC及び0.1%SDSに相当する塩濃度で60℃で洗浄が行われる条件である請求項4に記載の核酸。
- 請求項2〜5のいずれか一に記載の核酸を含むことを特徴とする組換えプラスミド又はベクター。
- 請求項2〜5のいずれか一に記載の核酸あるいは請求項6に記載の組換えプラスミド又はベクターで宿主細胞が形質転換されていることを特徴とする形質転換体。
- 請求項7に記載の形質転換体によって生産されることを特徴とするピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ又はピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質。
- 請求項7に記載の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とするピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ又はピリドキサール 4-デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
- 請求項1に記載のタンパク質又は請求項7に記載の形質転換体とピリドキサール若しくはその誘導体、又はそれらの塩とを接触せしめることを特徴とする4-ピリドキソラクトン若しくはその誘導体、又はそれらの塩の製造方法。
- 請求項1に記載のタンパク質又は請求項7に記載の形質転換体を用いることを特徴とするビタミンB6の定量方法。
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