JP3340658B2 - 新規な細胞内ｐｈａ分解酵素 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なポリヒドロ
キシアルカノエート（以下、PHA と略す）分解活性を有
するポリペプチドをコードするDNA 、そのDNA とベクタ
ーDNA とよりなる組換え体DNA 、その組換え体DNA で形
質転換せしめられた形質転換体、及び該形質転換体を利
用した細胞内 PHA分解酵素の製造法に関する。本発明
は、特にポリヒドロキシアルカノエートのうちポリ−３
−ヒドロキシブチレート（以下、 PHBと略す）分解活性
を有するポリペプチドをコードするDNA、そのDNA とベ
クターDNA とよりなる組換え体DNA 、その組換え体DNA
で形質転換せしめられた形質転換体、及び該形質転換体
を利用した細胞内 PHA分解酵素の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】PHA は微生物が細胞内封入体（inclusio
n body) として蓄積する脂肪族ポリエステルであり、環
境中に存在する微生物により容易に分解されることから
生分解性プラスチックとして期待されている。このPHA
を産生する微生物については様々な研究が成され、特に
そのPHA 生合成経路は比較的よく調べられているが、そ
の分解経路については不明な点が多く、細胞内 PHA分解
酵素を単離・精製しその性質等を調べるには至っていな
い。したがって、微生物において合成された脂肪族ポリ
エステルがどの様にして分解されているのか、そうした
分解はどの様にして阻止することができるのか全く研究
が進んでいない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】こうした生分解性プラ
スチックとして期待されている脂肪族ポリエステルを安
価に且つ大量に安定的に得るためにはその生産性を向上
することが必要であるが、そのためには単にPHA を産生
する微生物の生合成効率を高めるのみでなく、その分解
を抑えることが重要であると考えられる。しかし、これ
までは細胞内PHA分解酵素をコードする遺伝子の単離並
びにその解析に成功しておらず、細胞内でのPHA の分解
機構等は全くわからなかった。したがって、今迄こうし
た改良の途がなかった。また、そのPHA 産生効率の向上
のためには、細胞内PHA 分解酵素が示すPHA 分解活性を
抑えることにより、PHA を細胞内に蓄積させる方法が考
えられるが、これまでは細胞内PHA 分解酵素を得ること
ができず、細胞内PHA 分解酵素の性状等については殆ど
わかっておらず、こうした研究もできなかった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】このような状況のもと
で、本発明者らは、鋭意研究を行ない、その結果PHA の
うちの一つである PHB産生微生物の一種であるアルカリ
ゲネス・ユートロファスより細胞内 PHB分解酵素を遺伝
子組換えの手法で単離するとともに、その遺伝子を用い
た組換えDNA で形質転換せしめた細胞内 PHB分解酵素高
生産性の組換え微生物を取得した。本発明者らは更に研
究を進め、前記組換え手法で得られたPHA のうちの一つ
である PHBの細胞内分解に関与する遺伝子の塩基配列の
決定を試みそれに成功すると共に、 PHBの細胞内分解に
直接関与する遺伝子部分を特定化した。さらに本発明者
らは、このようにして育種した組換え微生物が細胞内 P
HB分解酵素を著量生産することを見出した。こうして、
本発明者らは、 PHBはPHA のうちの一つであることから
PHA 産生微生物の一種である微生物より細胞内PHA 分解
酵素を遺伝子組換えの手法で単離することができること
を認識するとともに、その遺伝子を用いた組換えDNA で
形質転換せしめた細胞内PHA 分解酵素高生産性の組換え
微生物を取得し得るとの考えに到達した。そしてPHA の
細胞内分解に関与する遺伝子の塩基配列の決定をすると
共に、PHA 細胞内分解に直接関与する遺伝子部分を特定
化することが出来ること、さらにこのようにして育種し
た組換え微生物が細胞内PHA 分解酵素を著量生産しうる
ものであるとの考えのもとに本発明を完成した。

【０００５】即ち、本発明は、 〔１〕 以下の (a)又は(b) のタンパク質をコードする
遺伝子： (a) 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
有するタンパク質、(b) アミノ酸配列 (a)において、
１〜複数個のアミノ酸の付加、除去、置換等の修飾が単
独或いは複数の組み合わせで実施されているアミノ酸配
列を含有し、且つポリヒドロキシアルカノエート分解活
性を有するタンパク質； 〔２〕 以下の (i)又は(ii)のDNA を含有する遺伝子： (i) 配列表の配列番号２で表される塩基配列を含有す
るDNA 、(ii) (i) の塩基配列を有するDNA とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし、且つポリヒドロ
キシアルカノエート分解活性を有するタンパク質をコー
ドするDNA ； 〔３〕 上記〔１〕又は〔２〕に記載の遺伝子を含有し
ている組換えベクター； 〔４〕 上記〔３〕に記載の組換えベクターを含む形質
転換体；及び 〔５〕 上記〔４〕に記載の形質転換体を培養し、次に
得られた細胞内ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素
を採取することを特徴とする細胞内ポリヒドロキシアル
カノエート分解酵素の製造法に関する。

【０００６】別の態様では、本発明は、 〔６〕 ポリヒドロキシアルカノエート（PHA ）分解活
性を有するポリペプチドをコードするDNA ； 〔７〕 上記〔６〕のDNA をベクターに組み込んでなる
組換え体DNA ； 〔８〕 上記〔７〕の組換え体DNA で形質転換せしめら
れた形質転換体；及び

〔９〕 上記〔８〕の形質転換体を培養し、得られた組
換え体から細胞内PHA 分解酵素を採取することを特徴と
する細胞内PHA 分解酵素の製造法に関する。

【０００７】特に、本発明は、 〔１０〕 配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列ま
たはそれと実質的に同等の機能を有するポリペプチドを
コードするDNA 、あるいは配列表の配列番号２に示した
塩基配列の第１番目から第１２５７番目あるいはそれら
と実質的に同等の機能を有する塩基配列を有するDNA ； 〔１１〕 上記〔１０〕のDNA をベクターに組み込んで
なる組換え体DNA ； 〔１２〕 上記〔１１〕の組換え体DNA で形質転換せし
められた形質転換体；及び 〔１３〕 上記〔１２〕の形質転換体を培養し、得られ
た組換え体から細胞内PHA 分解酵素を採取することを特
徴とする細胞内 PHB分解酵素の製造法に関する。

【０００８】ここでポリヒドロキシアルカノエート（PH
A ）とは、代表的にはヒドロキシアルカノエートモノマ
ーにおける炭素数３〜１２程度のものであり、例えばポ
リヒドロキシアルカノエートあるいはエステルが挙げら
れるほか、ポリヒドロキシアルカノエートのホモポリマ
ーのみでなく、広くその共重合体、例えば３−ヒドロキ
シブチレートと炭素数３〜１２程度のその他のヒドロキ
シアルカノエートとの共重合体などをいうことができ
る。しかし、これらに限定すること無く、本発明の目的
の範囲内であれば広く当業者に知られたものを含んでい
てよく、例えば、ポリ−３−ヒドロキシプロピオネー
ト、ポリ−３−ヒドロキシブチレート、ポリ−３−ヒド
ロキシバリレートおよびポリ−３−ヒドロキシオクタノ
エート、ポリ−４−ヒドロキシブチレートなどが挙げら
れる。また、本発明においてPHA 細胞内分解活性を有す
るタンパク質をコードする遺伝子（以下、単にPHA 分解
酵素遺伝子ともいう。）としては、一本鎖DNA 、二本鎖
DNA 、RNA 、DNA:RNA ハイブリッドなどいずれであって
もよい。

【０００９】

【発明の実施の形態】PHA 細胞内分解酵素の一つで、PH
A 細胞内分解活性を有するタンパク質、特には PHB分解
活性を有するタンパク質、あるいはそれと実質的に同等
な機能（あるいは活性）を有するタンパク質またはその
塩、そのタンパク質の特徴的な部分ペプチドまたはその
塩、それらをコードする遺伝子、例えばDNA 、RNA な
ど、その遺伝子を遺伝子組換え技術で操作することが可
能なように含有しているベクターあるいはプラスミド、
こうしたベクターなどで形質転換された宿主細胞、さら
にはその宿主細胞を培養して該タンパク質またはその塩
を製造する方法、こうして得られた該タンパク質または
その塩やそのタンパク質の特徴的な部分ペプチドまたは
その塩を用いて得られた抗体、特にはモノクローナル抗
体、その抗体を産生するハイブリドーマ細胞、該単離さ
れた遺伝子、例えばDNA 、RNA などをプローブとして用
いたり、あるいは該抗体を用いた測定手段並びに試薬が
提供される。

【００１０】より具体的には、本発明は配列表の配列番
号：１で表されるアミノ酸配列を有することを特徴とす
るタンパク質またはその塩を提供する。本発明のタンパ
ク質としては、PHA 細胞内分解活性を有することを特徴
とし、新規なアミノ酸配列を有するものであればよい。
より好ましくは本発明のタンパク質としては、配列表の
配列番号：１で表されるアミノ酸配列あるいはそれと実
質的に同等のアミノ酸配列を有するものがすべて挙げら
れる。さらに本発明のポリペプチドとしては、配列表の
配列番号：１で表されるアミノ酸配列の一部または全部
を有していてもよい。こうした配列を有するものはすべ
て包含されてよい。本発明のタンパク質は、配列表の配
列番号：２で表される塩基配列にコードされるものであ
ることができるし、また、該塩基配列と相同性を有する
が、PHA 細胞内分解活性活性能を有するタンパク質をコ
ードしているといったそれと同効の塩基配列を含有する
DNA 配列でコードされるものであることができる。該PH
A 細胞内分解酵素の塩基配列は、修飾（例えば、付加、
除去、置換など）されることもでき、そうした修飾され
たものも包含されてよい。

【００１１】以下、本発明を更に詳細に説明する。な
お、遺伝子組換え技術は、例えばT. Maniatis et al.,"
Molecular Cloning",2nd ed., Cold Spring Harbor Lab
oratory, Cold Spring Harbor, N. T. (1989)；D. M. G
lover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 t
o 4, (ThePractical Approach Series), IRL Press, Ox
ford University Press (1995) ；日本生化学会編、
「続生化学実験講座１、遺伝子研究法ＩＩ」、東京化学
同人(1986)；日本生化学会編、「新生化学実験講座２、
核酸 III（組換えDNA 技術）」、東京化学同人 (1992)
；R. Wu ed., "Methods in Enzymology", Vol. 68,Aca
demic Press, New York (1980) ; R. Wu et al. ed., "
Methods inEnzymology", Vol. 100 & 101, Academic Pr
ess, New York (1983)；R. Wu etal. ed., "Methods in
Enzymology", Vol. 153, 154 & 155, Academic Press,
New York (1987) ; J. H. Miller ed., "Methods in En
zymology", Vol. 204,Academic Press, New York (199
1) ; R. Wu et al. ed., "Methods inEnzymology", Vo
l. 218, Academic Press, New York (1993)などに記載
の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるい
はそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うこと
ができる。

【００１２】（１）細胞内PHA 分解酵素に関与する遺伝
情報を担うDNA の単離 本発明のPHA 細胞内分解活性を有するポリペプチドをコ
ードするDNA は、PHAの分解に関与する遺伝情報を担うD
NA から製造することができる。このPHA の分解に関与
する遺伝情報を担うDNA としては、例えばPHA の分解に
関与する遺伝情報を担うDNA を有する微生物、具体的に
はアルカリゲネス属細菌から得られるものが挙げられ
る。この細胞内PHA 分解酵素遺伝子は、PHA の分解に関
与する遺伝情報を担うDNA を有する微生物の染色体DNA
からライブラリーを構築し、このライブラリーをスクリ
ーニングすることから単離取得することができる。

【００１３】ライブラリー構築に用いるドナーDNA は、
例えば微生物細胞を培養して得られた培養物を遠心分離
（例えば1,500 ×g で遠心）して細胞ペレットを得、次
に緩衝液に懸濁（例えば5 〜10倍量の氷冷リン酸緩衝生
理食塩水 (PBS)などに懸濁）して遠心分離するという処
理を加えて洗浄し、次にこうして得られた細胞ペレット
をTE緩衝液〔10 mM トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン（以下トリスまたはTrisと略す）−塩酸（以下HC
l と略す）(10 mM Tris-HCl (pH 7.5)) 、1 mMエチレン
ジアミン四酢酸二ナトリウム（以下EDTAと略す）(1 mM
EDTA) 〕に完全に懸濁し、必要に応じリゾチームなどで
処理し、DNA 抽出緩衝液〔例えば、10 mM Tris-HCl (pH
8.0), 0.1 M EDTA, 0.5% SDS 〕に注意して添加した
後、必要に応じRNase などで処理し、プロティナーゼK
( 例えば、終濃度 100μg/ml) で処理し（例えば50℃で
3 時間インキュベートし）、次に抽出分離精製処理し
〔例えば、DNA 含有処理液にフェノールを加えて、液を
混合し、次いでクロロホルム／イソアミルアルコール
（例えば、24:1）を加え更に液を混合し、遠心分離機を
用いて、例えば2,500 rpm で15分間遠心し、DNA を含有
する水層( 上層) を採取するなどし、次に抽出されたDN
A を含有する水層は、例えば酢酸アンモニウムやイソプ
ロパノールを使用して処理されて、含まれるDNA は沈殿
化せしめられ、必要に応じ遠心分離機を用いて、例えば
2,500 rpm で5 分間遠心し、DNA を沈殿として得る。沈
殿として得られたDNA は、例えば70% のエタノールで洗
浄された後、TE緩衝液に溶解される。必要に応じて密度
勾配超遠心法、ゲル電気泳動法などを用いて精製され
る〕して得られる。得られた染色体DNA は、適宜適当な
制限酵素を用いて部分分解してライブラリー構築に適し
た断片（例えば、約20 kbp程度までの大きさ) にし、必
要に応じて密度勾配超遠心法、ゲル電気泳動法などを用
いて分離する。

【００１４】DNA ライブラリーは、ファージベクター、
プラスミドベクターを使用するなどして構築できる。例
えばλファージベクター、P1ファージベクター、コスミ
ドファージベクターなどを好ましく使用できる。好まし
くは市販された試薬、あるいは調製済のベクターDNA
（例えば、酵素切断され、脱リン酸化されたものな
ど）、パッケージングエキストラクト、宿主菌株、さら
には最初から最後までのステップをすべて行えるキット
などを用いて行うことができる。具体的には、DNA ライ
ブラリーは、例えば、λgt10などのファージ中に構築す
ることができ、それを大腸菌C600hfl 株などの宿主大腸
菌に感染させ、プラークを形成させて得ることができ
る。

【００１５】またファージベクターを使用する以外で、
大腸菌などの宿主細胞の形質転換をするには、例えばカ
ルシウム法、ルビジウム／カルシウム法、カルシウム／
マンガン法、TFB 高効率法、FSB 凍結コンピテント細胞
法、迅速コロニー法、エレクトロポレーションなど当該
分野で知られた方法あるいはそれと実質的に同様な方法
で行うことができる（D. Hanahan, J. Mol. Biol., 16
6: 557, 1983 など）。また、本発明のPHA 分解酵素遺
伝子であるDNA は、それが一旦単離取得されたならば、
慣用方法に従ってそのDNA 中の塩基配列の大部分あるい
は一部分を利用して、それをプローブとして用いて、他
の生物を検索して、その生物の保有する遺伝子のうち
に、PHA の分解に関与する遺伝情報を担うものを見つけ
出し、次にそのようにして同定された遺伝子を遺伝子組
換え技術の手法を応用して切り出して、それを大量に
得、それをこの当初のPHA の分解に関与する遺伝情報を
担うDNA を有する微生物に由来するものと同様に用いる
ことは、当業者であれば容易に理解し得るところのもの
である。なお、プローブなどを放射性同位体などによっ
て標識するには、市販の標識キット、例えばランダムプ
ライムドDNA ラベリングキット (Boehringer Mannhaim)
などを使用してプローブ用DNA を [α-³²P]dCTP（Amers
ham）などを用いて標識し、放射活性を持つプローブを
得ることにより行うことが出来る。

【００１６】また、本発明のPHA の細胞内分解に関与す
る遺伝情報を担うDNA 源としては、上記したような手法
の適用できるグラム陰性あるいはグラム陽性細菌であっ
て細胞内PHA 分解酵素をコードする遺伝子を有するもの
があげられる。この他にも、PHA 分解酵素遺伝子を有す
るものであれば、動物、植物、下等生物、高等生物の区
別なく利用することが可能である。PHA 分解酵素遺伝子
源として使用しうる微生物としては、アルカリゲネス
属、ズーグロエア属、ロドバクター属、あるいは、ロド
スビリルム属に属するものが挙げられる。

【００１７】（２）細胞内PHA 分解酵素をコードするDN
A の塩基配列の決定 次に単離取得されたPHA 細胞内分解活性を有するポリペ
プチドをコードするDNA 領域を含む部分は、これを当業
者によく知られたベクターに結合し大腸菌などの宿主細
胞を用い、得られた組換え体コロニーをハイブリダイゼ
ーションの手法など、例えば、コロニーハイブリダイゼ
ーション法、プラークハイブリダイゼーション法、ハイ
ブリダイゼーション・トランスレーションアッセイ法、
プラス・マイナス法などによって同定して、当該染色体
由来の細胞内PHA 分解活性を有するポリペプチドをコー
ドするDNA を大量に調製する。ハイブリダイゼーション
は、形成されたプラークをナイロンフィルターなどの膜
に転写せしめ、必要に応じ変成処理、固定化処理、洗浄
処理などを施した後、その膜に転写せしめられたもの
を、必要に応じ変成させた標識プローブDNA 断片と、ハ
イブリダイゼーション用バッファ中で反応させて行われ
る。ハイブリダイゼーション処理は、普通約40℃〜約80
℃、より好適には約55℃〜約65℃で、約15分〜約24時
間、より好適には約1 時間〜約4 時間行われるが、適宜
最適な条件を選択して行うことができる。例えば、ハイ
ブリダイゼーション処理は、約60℃で約2 時間行われ
る。ハイブリダイゼーション用バッファとしては、当該
分野で普通に使用されるものの中から選んで用いること
ができ、例えば、Rapid hybridization buffer（Amersh
am）などを用いることができる。

【００１８】転写した膜の変成処理としては、アルカリ
変性液を使用する方法が挙げられ、その処理後中和液や
緩衝液で処理するのが好ましい。また膜の固定化処理と
しては、普通約40℃〜約 100℃、より好適には約70℃〜
約90℃で、約15分〜約24時間、より好適には約1 時間〜
約4 時間ベーキングすることにより行われるが、適宜好
ましい条件を選択して行うことができる。例えば、フィ
ルターを約80℃で約2 時間ベーキングすることにより固
定化が行われる。転写した膜の洗浄処理としては、当該
分野で普通に使用される洗浄液、例えば1M NaCl 、1mM
EDTAおよび 0.1％Sodium Dodecyl sulfate (SDS) 含有
50mM Tris-HC1緩衝液，pH8.0 などで洗うことにより行
うことができる。ナイロンフィルターなどの膜として
は、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで用
いることができ、例えば、ナイロンフィルター［ハイボ
ンド（Hybond）-N、Amersham］などを挙げることができ
る。

【００１９】上記アルカリ変性液、中和液、緩衝液とし
ては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで
用いることができ、アルカリ変性液としては、例えば、
0.5MNaOH および1.5M NaCl を含有する液などを挙げる
ことができ、中和液としては、例えば、1.5M NaCl 含有
0.5M Tris−HCl 緩衝液，pH8.0 などを挙げることがで
き、緩衝液としては、例えば、 2×SSPE（0.36M NaCl、
20mM NaH₂PO₄および2mM EDTA）などを挙げることができ
る。またハイブリダイゼーション処理に先立ち、非特異
的なハイブリダイゼーション反応を防ぐために、必要に
応じて転写した膜はプレハイブリダイゼーション処理す
ることが好ましい。このプレハイブリダイゼーション処
理は、例えば、プレハイブリダイゼーション溶液［50％
formamide、 5×Denhardt's溶液（0.2 ％ウシ血清アル
ブミン、0.2 ％ polyvinylpyroldone ）、 5×SSPE、0.
1 ％ SDS、100 μg/ml 熱変性サケ精子DNA ］などに浸
し、約35℃〜50℃、好ましくは約42℃で、約 4〜24時
間、好ましくは約 6〜8 時間反応させることにより行う
ことができるが、こうした条件は当業者であれば適宜実
験を繰り返し、より好ましい条件を決めることができ
る。ハイブリダイゼーションに用いる標識プローブDNA
断片の変成は、例えば、約70℃〜100 ℃、好ましくは約
100 ℃で、約1 分間〜約60分間、好ましくは約 5分間加
熱するなどして行うことができる。

【００２０】ハイブリダイゼーション完了後、フィルタ
ーを十分に洗浄処理し、特異的なハイブリダイゼーショ
ン反応をした標識プローブDNA 断片以外の標識プローブ
を取り除く。フィルターの洗浄処理は、当該分野で普通
に使用されるものの中から選んで用いて行うことがで
き、例えば、0.1 ％ SDS含有 0.5×SSC ( O.15M NaCl、
15mM クエン酸）溶液などで洗うことにより実施でき
る。ハイブリダイズしたプラークは、代表的にはオート
ラジオグラフィーにより検出することができるが、当該
分野で用いられる方法の中から適宜選択してプラーク検
出に用いることもできる。検出したシグナルに相当する
プラークを、適切な緩衝液、例えば、SM溶液（ 100mM N
aCl および10mM MgSO₄含有50mM Tris-HCl 緩衝液、pH7.
5 ）などに懸濁し、ついでこのファージ懸濁液を適度に
希釈して、大腸菌に感染させ、得られた大腸菌を培養し
て、その培養された大腸菌から目的組換え体ファージを
得る。なお、必要に応じて上記プローブDNA を使用し
て、ハイブリダイゼーション処理により遺伝子ライブラ
リーやDNA ライブラリーから目的組換え体ファージをス
クリーニングする処理は、繰り返して行うことができ
る。また目的組換え体ファージは、培養された大腸菌か
ら抽出処理、遠心分離処理などを施して得ることができ
る。

【００２１】得られたファージ粒子は、当該分野で普通
に使用される方法で精製分離することができ、例えば、
グリセロールグラジエント超遠心分離法（Molecular cl
oning, a laboratory manual, ed. T. Maniatis, Cold
Spring Harbor Laboratory,2nd ed. 78, 1989）などに
より精製することができる。ファージ粒子からは、当該
分野で普通に使用される方法でDNA を精製分離すること
ができ、例えば、得られたファージをTM溶液（10mM MgS
O₄含有50mM Tris-HCl 緩衝液、pH7.8 ）などに懸濁し、
DNase I およびRNase A などで処理後、20mM EDTA 、50
μg/ml Proteinase K 及び0.5 ％SDS 混合液などを加
え、約65℃、約1 時間保温した後、これをフェノール抽
出ジエチルエーテル抽出後、エタノール沈殿によりDNA
を沈殿させ、次に得られたDNA を70％エタノールで洗浄
後乾燥し、TE溶液（10mM EDTA 含有10mM Tris-HC1 緩衝
液、pH8.0 ）に溶解するなどして得られる。また、目的
としているDNA は、サブクローニングなどにより大量に
得ることも可能であり、例えばサブクローニングは、宿
主として大腸菌を用いプラスミドベクターなどを用いて
行うことができる。こうしたサブクローニングにより得
られたDNA も、上記と同様にして遠心分離、フェノール
抽出、エタノール沈殿などの方法により精製分離でき
る。

【００２２】こうして得られたDNA の塩基配列、例えば
１本鎖DNA の塩基配列は、シークエンシングすることが
でき、例えば、蛍光DNA シーケンサModel 373A（Applie
d Biosystems）、Taq ダイプライマーサイクルシークエ
ンシングキット（Applied Biosystems）などを使用しそ
の配列を決定することができる。次にこうして得られた
細胞内PHA 分解活性を有するポリペプチドをコードする
DNA 部分を再度当業者によく知られたベクターに結合し
大腸菌などの宿主細胞に導入し、得られた組換え体を細
胞内PHA 分解酵素活性測定系にかけ、得られたクローン
を検定して、細胞内PHA 分解酵素活性を有する形質転換
体をうる。細胞内PHA 分解酵素活性測定系としては、例
えばSaito T. et al., FEMS Microbiol., 103, p333-
338, 1992 、Shirakura Y. et al., Biochem. Biophy
s. Acta.,784, p331-339, 1983 などの文献を参考にし
た PHB分解活性測定系を用いて組換え体の菌体内容分の
活性をみる方法が挙げられる。次にこの形質転換体から
細胞内PHA 分解活性を有するポリペプチドをコードする
DNA 領域を含む部分を制限酵素を用いて切りだす。

【００２３】上記形質転換体からの組換え体DNA および
目的のPHA 分解酵素遺伝子を持つDNA 断片の調製は通常
の方法を用いて行うことができる。例えば、培地中で増
殖させた該形質転換体を収穫し、細胞壁をリゾチーム処
理等の細胞破壊法として知られた方法により壊し、次に
核酸画分を分離した後、密度勾配遠心などの方法により
所望の画分に分ける。こうして得られたプラスミドを含
有する画分は、次に適当な制限酵素で処理することによ
り、適度な断片にすることができると共にまた選択的に
所望の細胞内PHA 分解活性を有するポリペプチドをコー
ドするDNA 断片とすることができる。得られた断片は、
例えばゲル電気泳動などにより、所望のものに分離で
き、適当なサイズのDNA 断片を含むゲルは、例えばフェ
ノール抽出−エタノール沈殿などによりDNA 抽出処理さ
れる。抽出されたDNA は必要に応じ適当な制限酵素で切
断し、さらに必要に応じ精製処理したり、また必要に応
じ5'末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼなどによりリン
酸化した後、pUC18 などのpUC 系ベクターといった適当
なプラスミドベクターにライゲーションし、適当なコン
ピテント細胞を形質転換する。クローニングされたDNA
断片はその塩基配列を解析される。

【００２４】DNA の塩基配列を決定するのに適した程度
まで断片化されたDNA は、次に当該分野でよく知られた
方法により処理されて、その塩基配列を決定することが
できる。DNA 断片のDNA 塩基配列の決定法としては、Ma
xam-Gilbert 法、ジデオキシ法、例えばジデオキシ・チ
ェイン・ターミネーション法 (Sanger, Science, 214,1
205 (1981))、M13 ジデオキシ法等が挙げられる。ま
た、市販のシークエンシングキット、例えば Taqダイプ
ライマーサイクルシークエンシングキット、Sequenase
v 2.0 kit などを用いたり、自動塩基配列決定装置、例
えば蛍光DNA シーケンサー装置などを用いて行うことが
出来る。ジデオキシ法に用いられるポリメラーゼとして
は、例えば、DNA ポリメラーゼ Iのクレノー・フラグメ
ント、AMV 逆転写酵素、Taq DNA ポリメラーゼ、T7 DNA
ポリメラーゼ、修飾 T7 DNA ポリメラーゼなどが挙げら
れる。このような方法の内には、適当な制限酵素を作用
させ、制限酵素地図を作製した上で、必要な断片をサブ
クローン化する方法や、ショットガン・クローニング
法、PCR により遺伝子を増幅する方法、核酸分解酵素に
よりディリーションする方法などの様々な手法が含まれ
ていることはもちろんである。次に、こうしてDNA 塩基
配列の決定されたDNA のうちから細胞内PHA 分解活性を
有するポリペプチドをコードしているDNA 領域を決定す
る。決定したDNA 塩基配列の中でオープン・リーディン
グ・フレームを検索する。その中で細胞内PHA 分解酵素
をコードすると思われるDNA 領域を制限酵素で切り出
し、再度これを用いて発現ベクターを構築し、それを適
当な宿主中で発現させ、こうして得られた発現物中の活
性を細胞内PHA 分解酵素活性測定系にかけて検討し、最
終的に確認される。

【００２５】また該解析された新規な細胞内PHA 分解酵
素遺伝子の有しているDNA 配列を基にセンスプライマー
とアンチセンスプライマーを合成することができる。プ
ライマーの作製は、当該分野で知られた方法で行うこと
ができ、例えば自動DNA 合成装置を用い、フォスフォジ
エステル法、フォスフォトリエステル法、フォスフォア
ミダイト法などにより合成できる。次に、鋳型遺伝子と
前記のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを
用いてポリメラーゼ・チェイン・リアクション(PCR) を
行い、DNA を増幅する。ＰＣＲ反応は、当該分野で公知
の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法によ
り行うことができるが、例えばR. Saiki, et al., Scie
nce, 230: 1350, 1985; R. Saiki, et al., Science,23
9: 487, 1985; H. A. Erlich ed., PCR Technology, St
ockton Press, 1989;D. M. Glover et al. ed., "DNA C
loning", 2nd ed., Vol. 1, (The PracticalApproach S
eries), IRL Press, Oxford University Press (1995)
;M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols", Academi
c Press, New York (1990)などに記載された方法に従っ
て行うことができる。得られた PCR産物はクローニング
されることができるし、該PCR 産物の塩基配列を決定
し、新規なPHA 分解酵素遺伝子配列を有する DNA断片を
取得することもできる。また、この DNA断片をプローブ
に同様にして種々のDNA ライブラリーをスクリーニング
し、目的とするDNA を単離することもできる。

【００２６】上記のようにして構造解析されたDNA か
ら、細胞内PHA 分解酵素をコードするDNA 以外の領域を
除くには、様々な方法でPHA の分解に不必要な領域を欠
失させることによってなすことができる。このような方
法としては、BAL31 ヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼ
III による欠失法、制限酵素切断サイトを利用した組換
え法などがあげられる。この際、本発明に従えば遺伝子
の固有のプロモーターを他のものに変更したり、部位特
異的変異を導入してプロモーターの強度を変化させるこ
とが、現在の遺伝子操作技術を用いることにより、容易
に行いうる。従って、そのように一部を変更したDNA 断
片であっても、PHA 細胞内分解活性を示すポリペプチド
をコードするDNA を含むDNA 断片であれば、全て本発明
に含まれることは明白である。また、本発明のPHA 細胞
内分解活性を示すポリペプチドをコードするDNA を含む
DNA 断片としては、細胞内PHA 分解活性を示すポリペプ
チドをコードするDNAに加えて、その遺伝子を生体内で
発現させるのに重要な役割を担う制御領域、例えば、遺
伝子の転写プロモーター、リボソーム結合部位、転写の
ターミネーターなどをコードするDNA をも含んだものが
あげられる。

【００２７】本発明に従えば、一旦その細胞内PHA 分解
活性を有するポリペプチドをコードするDNA の塩基配列
が明らかにされることにより、その塩基の置換あるいは
欠失を当該分野においてよく知られた方法を適用して容
易に行なうことができる。例えば、相当するアミノ酸を
コードする遺伝暗号の縮重を利用したもの、生物の遺伝
暗号の利用率を考慮した変換あるいはPHA 分解の機能に
悪影響を及ぼさないようなアミノ酸配列の変換のための
塩基の置換、付加または欠失処理などがあげられる。更
にまた、このような改変のうちには、PHA 分解の活性中
心のみを保存し、その他の部分を大幅に変化させるよう
にそのDNA の配列及び長さを変えることも含まれる。従
って、本発明の細胞内PHA 分解酵素をコードするDNA と
しては、以上のような改変を施したものすべてが含まれ
ることは当業者であれば容易に理解し得るところのもの
である。以上のような事情に鑑み、本発明の細胞内PHA
分解酵素をコードする遺伝子は、本発明の思想を実質的
に利用して得られ、本発明の該遺伝子と実質的に同一の
機能（あるいは活性）を有するものすべてを含有するも
のである。

【００２８】さらに、本発明に係わる細胞内PHA 分解酵
素の遺伝子塩基配列を基に遺伝子工学的に常用される方
法を用いることにより、細胞内PHA 分解酵素のアミノ酸
配列中に適宜、１個ないし複数個以上のアミノ酸の置
換、欠失、挿入、転移あるいは付加したごとき変異を導
入した相当するタンパク質を製造することができる。こ
うした変異・変換・修飾法としては、日本生化学会編、
「続生化学実験講座１、遺伝子研究法 II 」、ｐ１０５
（広瀬進）、東京化学同人（１９８６）；日本生化学会
編、「新生化学実験講座２、核酸 III（組換えDNA 技
術）」、ｐ２３３（広瀬進）、東京化学同人（１９９
２）；R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods inEnzymolo
gy", Vol. 154, p. 350 & p. 367, Academic Press, Ne
w York (1987)；R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods i
n Enzymology", Vol. 100, p. 457 & p. 468, Academic
Press, New York (1983)；J. A. Wells et al., Gen
e, 34: 315, 1985；T. Grundstroem et al., Nucleic A
cids Res., 13: 3305, 1985 ；J.Taylor et al., Nucle
ic Acids Res., 13: 8765, 1985；R. Wu ed., "Methods
in Enzymology", Vol. 155, p. 568, Academic Press,
New York（1987) ；A. R. Oliphant et al., Gene, 44:
177, 1986などに記載の方法が挙げられる。例えば合成
オリゴヌクレオチドなどを利用する位置指定変異導入法
（部位特異的変異導入法）、 Kunkel 法、 dNTP[αS]法
（Eckstein) 、亜硫酸や亜硝酸などを用いる領域指定変
異導入法等の方法が挙げられる。

【００２９】さらに得られた本発明のタンパク質は、化
学的な手法でその含有されるアミノ酸残基を修飾するこ
ともできるし、ペプチダーゼ、例えばペプシン、キモト
リプシン、パパイン、ブロメライン、エンドペプチダー
ゼ、エキソペプチダーゼなどの酵素を用いて修飾した
り、部分分解したりしてその誘導体などにすることがで
きる。また遺伝子組換え法で製造する時に融合タンパク
質として発現させ、生体内あるいは生体外で天然の細胞
内PHA 分解酵素と実質的に同等の生物学的活性を有して
いるものに変換・加工してもよい。遺伝子工学的に常用
される融合産生法を用いることができるが、こうした融
合タンパク質はその融合部を利用してアフィニティクロ
マトグラフィーなどで精製することも可能である。タン
パク質の構造の修飾・改変などは、例えば日本生化学会
編、「新生化学実験講座１、タンパク質 VII、タンパク
質工学」、東京化学同人（１９９３）を参考にし、そこ
に記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方
法、さらにはそれらと実質的に同様な方法で行うことが
できる。また下記するようにその生物学的活性のうちに
は、免疫的に活性、例えば抗原性を有するということも
含まれてよい。

【００３０】かくして本発明の細菌由来のタンパク質
は、１個以上のアミノ酸残基が同一性の点で天然のもの
と異なるもの、１個以上のアミノ酸残基の位置が天然の
ものと異なるものであってもよい。本発明のアルカリゲ
ネス属細菌由来のタンパク質は、細胞内PHA 分解酵素に
特有なアミノ酸残基が１個以上（例えば、１〜８０個、
好ましくは１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、
さらに好ましくは１〜２０個、特には１〜１０個など）
欠けている欠失類縁体、特有のアミノ酸残基の１個以上
（例えば、１〜８０個、好ましくは１〜６０個、さらに
好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個、
特には１〜１０個など）が他の残基で置換されている置
換類縁体、１個以上（例えば、１〜８０個、好ましくは
１〜６０個、さらに好ましくは１〜４０個、さらに好ま
しくは１〜２０個、特には１〜１０個など）のアミノ酸
残基が付加されている付加類縁体も包含する。細胞内PH
A 分解酵素の共通の特徴であるドメイン構造が維持され
ていれば、上記のごとき変異体は、全て本発明に包含さ
れる。また本発明の細胞内PHA 分解酵素は天然の細胞内
PHA 分解酵素と実質的に同等の一次構造コンフォメーシ
ョンあるいはその一部を有しているものも含まれてよい
と考えられ、さらに天然のアルカリゲネス属細菌由来の
PHA 分解酵素と実質的に同等の生物学的活性を有してい
るものも含まれてよいと考えられる。さらに天然に生ず
る変異体の一つであることもできる。本発明の細菌由来
のタンパク質は、例えば、配列表の配列番号：１で示さ
れるアミノ酸配列に対し、70% より高い相同性を有して
いるものが挙げられ、より好ましくは80% 以上、特に好
ましくは90% 以上の相同アミノ酸配列を有するものが挙
げられる。

【００３１】本明細書において、「実質的に同等」とは
蛋白質の活性、例えば、触媒活性、生理的な活性、生物
学的な活性が実質的に同じであることを意味する。アミ
ノ酸の置換、欠失、あるいは挿入は、しばしばポリペプ
チドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化を生ぜ
しめないし、こうした場合、その置換、欠失、あるいは
挿入を施されたポリペプチドは、そうした置換、欠失、
あるいは挿入のされていないものと実質的に同一である
とされるであろう。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質
的に同一な置換体としては、そのアミノ酸が属するとこ
ろのクラスのうちの他のアミノ酸類から選ぶことができ
うる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、ア
ラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、
バリン、プロリン、トリプトファン、メチオニンなどが
挙げられ、極性（中性）としては、グリシン、セリン、
スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グ
ルタミンなどが挙げられ、陽電荷をもつアミノ酸（塩基
性アミノ酸）としては、アルギニン、リジン、ヒスチジ
ンなどが挙げられ、陰電荷をもつアミノ酸（酸性アミノ
酸）としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙
げられる。

【００３２】（３）PHA 分解酵素遺伝子を持つ組換え体
DNA の作製 PHA の分解に関与する遺伝情報を担うDNA を含む断片か
ら、適当な手段を施してDNA 合成に不必要な領域を欠失
させたDNA は、それを適当なベクターDNA に再び組み込
むことにより、宿主細胞に再び導入することが出来る。
本発明の上記細胞内PHA 分解酵素をコードするDNA を宿
主細胞に導入し、そしてそれをその導入された宿主細胞
内で発現させるために用いられるベクターDNAとして
は、適当な宿主細胞内で、PHA 分解酵素遺伝子を発現で
きるものであれば特に制限なく使用し得る。このような
ベクターDNA としては、上記細胞内PHA 分解酵素をコー
ドするDNAを組み込むことの出来るものであり、組換え
たベクターDNA で宿主細胞を形質転換できるものであ
り、そして得られた形質転換体の細胞内で導入された細
胞内PHA 分解酵素をコードするDNA の発現ができるもの
であれば特に限定されず、如何なるものも使用すること
が出来る。このようなベクターDNA としては、宿主細胞
中で自律複製可能であり、さらに組換え宿主細胞のみを
選別できるような適当な選択マーカーなどが付与された
ものがあげられる。さらにまた、このようなベクターDN
A は公知のベクターDNA 等から当業者が容易に製造し得
るようなものであってもよい。

【００３３】このようなベクターDNA としては、例えば
プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベク
ターから選ばれたものがあげられる。また、このような
ベクターDNA は他の宿主株との間で遺伝子交換が可能な
シャトルベクターであってもよいし、ランナウェイベク
ターやスリーパーベクターなど遺伝子産物の発現効率を
向上せしめるために特別に工夫されたものであってもよ
い。さらに、このようなベクターDNA は、lacUV5プロモ
ーター、trp プロモーター、tac プロモーター、lpp プ
ロモーター、tufBプロモーター、recAプロモーター、PL
プロモーター、T7プロモーター等の制御因子を適宜付与
されたものであってもよい。このような形質発現などに
係わる因子等を導入するためには、遺伝子組換え技術の
分野でよく知られた方法を適宜選択して適用することに
より行うことができる。大腸菌を宿主とするプラスミド
としては、例えばpBR322、pUC18 、pUC19 、pUC118、pU
C119、pSP64 、pSP65 、pTZ-18R/-18U、pTZ-19R/-19U、
pGEM-3、pGEM-4、pGEM-3Z 、pGEM-4Z 、pGEM-5Zf(-) 、
pBluescript KS ^TM (Stratagene)などが挙げられる。大
腸菌での発現に適したプラスミドベクターとしては、pA
S、pKK223 (Pharmacia)、pMC1403 、pMC931、pKC30 、p
RSET-B (Invitrogen)なども挙げられる。上記ベクターD
NA に、上記細胞内PHA 分解酵素をコードするDNA を組
み込むには、まず、上記ベクターDNA に適当な制限酵素
を作用させ、得られたベクターDNA 断片を、上記細胞内
PHA 分解酵素をコードするDNA 断片とを混合し、これに
DNA リガーゼを作用させることによりなしうる。この
際、必要に応じ当該分野で知られたリンカー付与、ブラ
ントエンド化等の処理を加えることもできる。このよう
にして得られた組換え体DNA は次に適当な宿主細胞の中
に導入される。

【００３４】（４）複数のPHA 分解酵素遺伝子を持つ組
換え体DNA の作製 同一のプラスミド上に複数のPHA 分解酵素遺伝子を組み
込めば、より良好な結果が得られる。複数のPHA 分解酵
素遺伝子を組み込む際のその様式は、固有のプロモータ
ーを持つPHA 分解酵素遺伝子が複数個導入されていても
よいし、複数のPHA 分解酵素遺伝子がポリシストロニッ
クに転写されるオペロンとして導入されていてもよい
し、またこれらの組み合わせであってもよい。導入する
遺伝子の数に特に制限はなく、組換え体DNA 及びそれを
含む形質転換体の安定性を損なわない範囲であればよ
い。組換え体DNA を作製する場合、このための技術とし
ては制限酵素による切断、リガーゼによる連結、化学合
成DNA の利用、ヌクレアーゼによる欠失、部位特異的変
異による塩基置換など、通常の遺伝子操作で用いられる
技術を適宜選択して適用することにより行なうことがで
きるが、この際に、プロモーターの変更やその他のPHA
分解酵素遺伝子を発現させるための塩基配列の改変を行
ってもよい。このようにして得られた組換え体DNA は次
に適当な宿主細胞の中に導入される。

【００３５】（５）組換え体DNA の宿主細胞への導入 上記のようにして作製した組換え体DNA を導入するため
の宿主細胞としては、上記で得られた組換えベクターで
もって形質転換されて、PHA 分解酵素遺伝子を発現させ
ることができるようなものであれば、特に制限なく使用
することが出来る。このような宿主細胞としては、本発
明の目的に沿ってPHA 分解酵素遺伝子の発現を達成し得
る限り、グラム陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別な
く、さらには、下等細胞あるいは高等細胞の区別なく、
動物由来細胞であろうと植物由来細胞であろうと使用で
きる。宿主細胞としては、宿主細胞が大腸菌の場合、例
えば大腸菌K12 株に由来するものが挙げられ、例えばNM
533 XL1-Blue、C600、DH1 、DH5 、DH11S 、DH12S 、DH
5α、DH10B 、HB101 、MC1061、JM109 、STBL2 、BL21
(DE3)pLysSなどが挙げられる。組換え体DNA を導入する
ためには、組換え体DNA をコンピテント細胞に接触せし
める、エレクトロポレーション、インビトロパッケージ
ング法などを用いて適当な増殖期にある宿主に、組換え
ファージベクターを感染させる方法等など当業者によく
知られた方法から適宜選択して用いることが出来る。

【００３６】（６）形質転換体による細胞内PHA 分解酵
素の製造 本発明により得られた細胞内PHA 分解酵素産生形質転換
体は、適当な栄養培地中で培養することにより、それを
大量に得ることができる。培養に用いられる培地は微生
物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む通
常の培地である。更に、ビタミン、アミノ酸等の有機微
量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる場合が多
い。培養は、好気的条件下でpH4 〜10、温度20〜60℃の
任意の範囲に制御して１〜３日間培養を行えばよい。形
質転換体を用いる場合、使用する菌株に応じてアンピシ
リン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液に添
加してもよい。大量に培養して得た細胞内PHA 分解酵素
産生形質転換体の細胞から細胞内PHA分解酵素を単離精
製するにあたっては、従来公知の方法、例えば、まず、
生物体を機械的方法、酵素処理方法、自己溶解法、超音
波処理法などの方法によって破壊し、粗抽出液を得、つ
いでこれを硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウムなどの
塩析剤あるいはアセトン又はエタノールなどの溶媒によ
る蛋白質沈澱法、電気泳動法、セファデックスなどによ
るゲル濾過法あるいは分子ふるいクロマトグラフィー
法、限外濾過法、逆相クロマトグラフィー法、高速液体
クロマトグラフィー法、例えばジエチルアミノエチル基
あるいはカルボキシメチル基などを持つ担体などを用い
たイオン交換クロマトグラフィー法、例えばブチル基、
オクチル基、フェニル基など疎水性基を持つ担体などを
用いた疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲルクロマト
グラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、吸
着クロマトグラフィー法などの方法を単独あるいは適宜
組み合わせて用いて適用することにより行うことが出来
る。好ましくは、ポリアクリルアミド電気泳動、モノク
ローナル抗体などの抗原と特異的に反応する抗体などを
固定化したアフィニティー・クロマトグラフィーなどで
処理し精製分離処理できる。精製されたリコンビナント
PHA 分解酵素は、モノクローナル抗体作製のための免疫
抗原として好適に使用できる。

【００３７】本発明の遺伝子工学的手法においては、当
該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、逆
転写酵素、DNA 断片をクローン化するのに適した構造に
修飾したりあるいは変換するための酵素であるDNA 修飾
・分解酵素、DNA ポリメラーゼ、末端ヌクレオチジルト
ランスフェラーゼ、DNA リガーゼなどを用いることが出
来る。制限酵素としては、例えば、R. J. Roberts, Nuc
leic Acids Res., 13:r165, 1985; S. Linn et al. ed.
Nucleases, p. 109, Cold Spring Harbor Lab., Cold
Spring Harbor, New York, 1982; R. J. Roberts, D. M
acelis, Nucleic Acids Res., 19: Suppl. 2077, 1991
などに記載のものが挙げられる。逆転写酵素としては、
例えばマウスモロネイ白血病ウイルス (mouse Moloney
leukemiavirus; MMLV) 由来の逆転写酵素 (reverse tra
nscriptase)、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス (avian mye
loblastosis virus; AMV)由来の逆転写酵素などが挙げ
られる。逆転写酵素は、RNase H 欠損体などは好ましく
用いることができ、特にはRNase H 活性を欠いた修飾MM
LV RT が好ましく使用でき、さらには熱安定性の高いも
のが好ましい。適した逆転写酵素としては、MMLV RT (G
ibco-BRL) 、Superscript RT plus (Life Technologie
s) などが挙げられる。

【００３８】DNA ポリメラーゼとしては、例えば大腸菌
DNA ポリメラーゼ、その誘導体であるクレノウ・フラグ
メント、大腸菌ファージT4 DNAポリメラーゼ、大腸菌フ
ァージT7 DNAポリメラーゼ、耐熱菌DNA ポリメラーゼな
どが挙げられる。末端ヌクレオチジルトランスフェラー
ゼとしては、例えばR. Wu et al. ed., "Methods inEnz
ymology", Vol. 100, p. 96, Academic Press, New Yor
k (1983) に記載の３’−ＯＨ末端にデオキシヌクレオ
チド(dNMP)を付加するTdTaseなどが挙げられる。DNA 修
飾・分解酵素としては、エキソヌクレアーゼ、エンドヌ
クレアーゼなどが挙げられ、例えばヘビ毒ホスホジエス
テラーゼ、脾臓ホスホジエステラーゼ、大腸菌DNA エキ
ソヌクレアーゼ I、大腸菌DNA エキソヌクレアーゼIII
、大腸菌DNA エキソヌクレアーゼ VII、λエキソヌク
レアーゼ、ＤＮａｓｅ I、ヌクレアーゼＳ１、ミクロコ
ッカス (Micrococcus) ヌクレアーゼなどが挙げられ
る。DNA リガーゼとしては、例えば大腸菌DNA リガー
ゼ、T4 DNAリガーゼなどが挙げられる。DNA 遺伝子をク
ローニングしてDNA ライブラリーを構築するのに適した
ベクターとしては、プラスミド、λファージ、コスミ
ド、P1ファージ、Ｆ因子、YAC などが挙げられ、好まし
くはλファージ由来のベクターが挙げられ、例えばChar
on4A 、Charon 21A、λgt10、λgt11、λDASHII、λFIX
II 、λEMBL3 、λZAPII^TM (Stratagene) などが挙げら
れる。

【００３９】以下、本発明の細胞内PHA 分解酵素のうち
特に細胞内 PHB分解酵素を例に挙げて更に詳細に説明す
る。 （Ａ） PHB細胞内分解酵素に関与する遺伝情報を担うDN
A の単離 本発明の PHB分解活性を有するポリペプチドをコードす
るDNA （以下、単に PHB分解酵素遺伝子ともいう。）と
しては、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列また
はそれと実質的に同等の機能を有するポリペプチドをコ
ードするDNA が挙げられる。特には、配列表の配列番号
２に示した塩基配列の第１番目から第1257番目に対応し
て示されるアミノ酸配列をコードするDNA を挙げること
ができる。また配列表の配列番号２に示した塩基配列の
第１番目から第1257番目をコードするDNA が好ましい。
これらのDNA は、 PHBの分解に関与する遺伝情報を担う
DNA を、例えば染色体DNA として有する微生物、特には
細菌から取り出して製造することができる。この PHBの
分解に関与する遺伝情報を担うDNA を有する微生物とし
ては、例えばアルカリゲネス属細菌から得られたものが
挙げられる。このアルカリゲネス属細菌としては PHB産
生アルカリゲネス属細菌株であれば特に限定されない
が、特に好ましいものとしてはアルカリゲネス・ユート
ロファス (Alcaligenes eutrophus) H16 (ATCC 17699)
を挙げることができる。また、このDNA は、それが一旦
単離取得されたならば、慣用方法に従ってそのDNA 中の
塩基配列の大部分あるいは一部分を利用して、それをプ
ローブとして用いて、他の生物を検索して、その生物の
保有する遺伝子のうちに、 PHBをはじめとしてPHA の分
解に関与する遺伝情報を担うものを見つけ出し、次にそ
のようにして同定された遺伝子を遺伝子組換え技術の手
法を応用して切り出して、それを大量に得、それをこの
アルカリゲネス属細菌に由来するものと同様に用いるこ
とは、当業者であれば容易に理解し得るところのもので
あることは上記したと同じである。

【００４０】従って、本発明の PHBの細胞内分解に関与
する遺伝情報を担うDNA 源としては、アルカリゲネス属
細菌のみでなく、上記したような手法の適用できるグラ
ム陰性あるいはグラム陽性細菌であって細胞内 PHB分解
酵素をコードする遺伝子を有するものがあげられる。こ
のような細菌としては、ズーグロエラ属細菌、ロドバク
ター属細菌、あるいは、ロドスビリルム属細菌なども利
用できよう。この他にも、 PHB分解酵素遺伝子を有する
ものであれば、動物、植物、下等生物、高等生物の区別
なく利用することが可能であることは上記したと同じで
あるが、シュードモナス属細菌なども利用できよう。PH
B分解酵素遺伝子源として好ましい微生物としては上記
したアルカリゲネス属、ズーグロエア属、ロドバクター
属、あるいは、ロドスビリルム属に属するものが挙げら
れる。このようなものの代表的な例としてはアルカリゲ
ネス・ユートロファス (Alcaligenes eutrophus) H16、
ズーグロエア・ラミゲラ I-16-M 、ロドバクター・スフ
ァエロイズ (ATCC 17023) 、ロドスビリルム・ルブラム
Ha (DSM 107) 、及びロドスビリルム・ルブラム S1 (D
SM 467) などを挙げることができる。

【００４１】（Ｂ）細胞内 PHB分解酵素をコードするDN
A の塩基配列の決定 次にアルカリゲネス属細菌由来の細胞内 PHB分解に関与
する遺伝子を含むDNAを例にあげて、細胞内 PHB分解酵
素をコードするDNA の単離及びその塩基配列の決定法に
ついて説明する。ここで使用しうるアルカリゲネス属細
菌由来の細胞内 PHB分解に関与する遺伝子の供給株とし
ては、具体的にはアルカリゲネス・ユートロファスH16
よりクローン化された PHB分解酵素遺伝子を含む約1.7
kbp のDNA 断片を組み込んだプラスミドDNA をもつ形質
転換体大腸菌C600があげられる。

【００４２】上記形質転換体からの組換え体DNA および
目的の PHB分解酵素遺伝子を持つDNA 断片の調製は上記
したように通常の方法を用いて行うことができる。上記
したようにDNA の塩基配列を決定するのに適した程度ま
で断片化されたDNA は、次に当該分野でよく知られた方
法により処理されてその塩基配列を決定することができ
る。DNA 断片のDNA 塩基配列の決定法としては、前記し
た方法等があげられる。次に、こうしてDNA 塩基配列の
決定されたDNA のうちから細胞内 PHB分解活性を有する
ポリペプチドをコードしているDNA 領域を決定し、決定
したDNA 塩基配列の中でオープン・リーディング・フレ
ームを検索する。その中で細胞内 PHB分解酵素をコード
すると思われるDNA 領域を制限酵素で切り出し、再度こ
れを用いて発現ベクターを構築し、それを適当な宿主中
で発現させ、こうして得られた発現物中の活性を検討し
て最終的に確認される。上記のようにして構造解析され
たDNA から、細胞内 PHB分解酵素をコードするDNA 以外
の領域を除くには、様々な方法で PHBの分解に不必要な
領域を欠失させることによってなすことができる。この
ような方法としては、上記した方法等があげられる。こ
の際、本発明に従えば遺伝子の固有のプロモーターを他
のものに変更したり、部位特異的変異を導入してプロモ
ーターの強度を変化させることが、現在の遺伝子操作技
術を用いることにより、容易に行い得る。従って、その
ように一部を変更したDNA 断片であっても、細胞内 PHB
分解活性を示すポリペプチドをコードするDNA を含むDN
A 断片であれば、全て本発明に含まれることは明白であ
る。

【００４３】また、本発明の細胞内 PHB分解活性を示す
ポリペプチドをコードするDNA を含むDNA 断片として
は、細胞内 PHB分解活性を示すポリペプチドをコードす
るDNAに加えて、その遺伝子を生体内で発現させるのに
重要な役割を担う制御領域、例えば、遺伝子の転写プロ
モーター、リボソーム結合部位、転写のターミネーター
などをコードするDNA をも含んだものがあげられる。本
発明に従えば、一旦その細胞内 PHB分解活性を有するポ
リペプチドをコードするDNA の塩基配列が明らかにされ
ることにより、その機能を損なわない範囲でその塩基の
置換あるいは欠失を当該分野においてよく知られた方法
を適用して容易に行なうことができる。また、このよう
な改変のうちには、 PHB分解の活性中心のみを保存し、
その他の部分を大幅に変化させるようにそのDNA の配列
及び長さを変えることも含まれる。従って、本発明の細
胞内 PHB分解酵素をコードするDNA としては、以上のよ
うな改変を施したものすべてが含まれることは当業者で
あれば容易に理解し得るところのものである。以上のよ
うな事情に鑑み、本発明の細胞内 PHB分解酵素をコード
するDNA は、本発明の思想を実質的に利用して得られ、
本発明のDNA と実質的に同一の機能を有するものすべて
を含有するものである。

【００４４】（Ｃ） PHB分解酵素遺伝子を持つ組換え体
DNA の作製ならびに形質転換体の作製 PHB分解酵素遺伝子を持つ組換え体DNA の作製並びに複
数の PHB分解酵素遺伝子を持つ組換え体DNA の作製、更
には組換え体DNA の宿主細胞への導入は、前記したよう
にして行うことが出来る。上記のようにして作製した組
換え体DNA を導入するための宿主細胞としては、得られ
た組換えベクターでもって形質転換されて、 PHB分解酵
素遺伝子を発現させることができるようなものであれ
ば、特に制限なく使用することが出来る。このような宿
主細胞としては、本発明の目的に沿って PHB分解酵素遺
伝子の発現を達成し得る限り、グラム陰性菌あるいはグ
ラム陽性菌の区別なく、さらには、下等細胞あるいは高
等細胞の区別なく、動物由来細胞であろうと植物由来細
胞であろうと使用できる。 PHB分解酵素遺伝子の発現に
適した宿主細胞としては大腸菌、アルカリゲネス属細菌
などが挙げられる。

【００４５】（Ｄ）形質転換体による細胞内 PHB分解酵
素の製造 本発明により得られた細胞内 PHB分解酵素産生形質転換
体は、適当な栄養培地中で培養することにより、それを
大量に得ることができる。培養に用いられる培地は微生
物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む通
常の培地である。更に、ビタミン、アミノ酸等の有機微
量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる場合が多
い。培養は、好気的条件下でpH4 〜10、温度20〜60℃の
任意の範囲に制御して１〜３日間培養を行えばよい。形
質転換体を用いる場合、使用する菌株に応じてアンピシ
リン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液に添
加してもよい。また、大量に培養して得た PHB分解酵素
産生形質転換体の細胞から細胞内 PHB分解酵素を単離精
製するにあたっては、上記した方法のいずれもが利用で
きる。こうして得られた本発明のPHA 分解酵素（特には
PHB 分解酵素）タンパク質あるいはそれと実質的に同等
な機能（あるいは活性）を有することを特徴とするタン
パク質またはその塩、あるいはその部分ペプチドは、そ
れを用いて酵素阻害剤の開発や探索などの研究、生体分
解性のプラスチック材料の開発研究、PHA 分解酵素（特
にはPHB 分解酵素）が関与すると考えられる生物的な現
象や反応の研究においてそれを利用して研究を行うこと
ができるし、さらには該タンパク質に対する抗体を作成
するのに用いることができるし、特定の分析あるいは測
定対象物を調査研究するのに使用することもできる。

【００４６】かくして、別の態様の一つでは、本発明
は、 〔Ｉ〕 以下の (a)又は(b) のタンパク質と免疫学的に
反応するモノクローナル抗体： (a) 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
有するタンパク質、(b) アミノ酸配列 (a)において、
１〜複数個のアミノ酸の付加、除去、置換等の修飾が単
独或いは複数の組み合わせで実施されているアミノ酸配
列を含有し、且つポリヒドロキシアルカノエート分解活
性を有するタンパク質； 〔ＩＩ〕 上記〔１〕の遺伝子の発現系を用い、測定対
象化合物を含有する試料の存在下並びに非存在下に、該
遺伝子を発現せしめ、該遺伝子の発現により得られるタ
ンパク質のポリヒドロキシアルカノエート分解活性を測
定することを特徴とする細胞内ポリヒドロキシアルカノ
エート分解酵素をコードする遺伝子制御物質のスクリー
ニング法； 〔ＩＩＩ〕 以下の (a)又は(b) のタンパク質： (a) 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
有するタンパク質、(b) アミノ酸配列 (a)において、
１〜複数個のアミノ酸の付加、除去、置換等の修飾が単
独或いは複数の組み合わせで実施されているアミノ酸配
列を含有し、且つポリヒドロキシアルカノエート分解活
性を有するタンパク質；及び 〔ＩＶ〕 測定対象化合物を含有する試料の存在下並び
に非存在下に、上記〔ＩＩＩ〕記載のタンパク質のポリ
ヒドロキシアルカノエート分解活性を測定することを特
徴とする細胞内ポリヒドロキシアルカノエート分解酵素
阻害剤のスクリーニング法を提供する。

【００４７】本発明に係わるモノクローナル抗体などの
抗体は、本発明により得られる細胞内 PHA分解酵素ある
いはその断片を免疫原として公知の方法で動物を免疫し
たり、当該分野で知られたあるいは汎用されている方
法、例えばミルシュタインらの方法 (Nature, 256: 495
-97, 1975)により製造することができる。この方法にお
いて、免疫原としては、天然型細胞内 PHA分解酵素、リ
コンビナント PHA分解酵素及び適切な領域から選択され
たアミノ酸配列を有する合成ペプチドあるいはタンパク
質から得られた断片、例えば連続した少なくとも８個の
アミノ酸からなる細胞内 PHA分解酵素の一部のアミノ酸
配列を有する合成ペプチド、例えば１４個のアミノ酸残
基を有するアミノ酸配列を有する合成ペプチド、好まし
くは細胞内 PHA分解酵素において特徴的な配列部分を有
するペプチド等の何れでも使用することができる。精製
されたリコンビナント細胞内 PHA分解酵素は、モノクロ
ーナル抗体作製のための免疫抗原として好適に使用でき
る。また本発明で得られた細胞内 PHA分解酵素遺伝子の
情報を基にペプチドを合成して、その合成ペプチドをモ
ノクローナル抗体作製のための免疫抗原として好適に使
用できる。

【００４８】本発明のモノクローナル抗体およびその抗
体を産生するハイブリドーマ細胞は、ミエローマ細胞を
用いての細胞融合技術〔例えば、ミルシュタインらの方
法 (Nature, 256: 495-97, 1975)〕を利用して得られた
モノクローナル抗体、あるいはそれを産生する融合細胞
であってよいことはいうまでもない。本発明のモノクロ
ーナル抗体は、例えば次のような工程で作製できる。 （１）．免疫原性抗原の調製、（２）．免疫原性抗原に
よる動物の免疫、（３）．ミエローマ細胞（骨髄腫細
胞）の調製、（４）．抗体産生細胞とミエローマ細胞と
の細胞融合、（５）．ハイブリドーマ（融合細胞）の選
択及びモノクローン化、（６）．モノクローナル抗体の
製造 さらに該モノクローナル抗体は、常用される方法によっ
て適宜標識することができる。標識としては、酵素、放
射性同位体（放射性物質）、化学ルミネッセンス化合物
などの発光性物質、螢光性物質、金属コロイド、補欠分
子類、色素物質及びビオチン等を使用することができ
る。一方では、こうして本発明は上記したポリペプチド
をコードするDNA 配列、そして天然の特性の全部あるい
は一部を有するPHA 分解酵素（特にはPHB 分解酵素）の
ポリペプチド、さらにその類縁体あるいは誘導体をコー
ドするDNA 配列も包含する。

【００４９】本発明のDNA 配列は、これまで知られてい
なかった微生物の酵素のタンパク質のアミノ酸配列に関
する情報を提供しているから、こうした情報を利用する
ことも本発明に包含される。こうした利用としては、例
えば他の微生物由来のPHA 分解酵素及び関連タンパク質
をコードするゲノムDNA 及びcDNAの単離及び検知のため
のプローブの設計などが挙げられる。本発明の前述した
種々の態様を利用することにより、 PHB分解酵素産生系
の研究開発手段、該 PHB分解酵素生成に関わる研究に有
用な検査・測定の手段として、あるいはその他の生分解
プラスチックに関連した技術に適用される種々の技術手
段を提供することができる。以下に実施例を掲げ、本発
明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定
されず、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能
であることは理解されるべきである。なお、明細書及び
図面において、用語は、IUPAC-IUB Commission on Bioc
hemical Nomenclatureによるか、あるいは当該分野にお
いて慣用的に使用される用語の意味に基づくものであ
る。後述の実施例１（３）に記載の細胞内 PHB分解酵素
をコードする塩基配列を挿入したベクター(pUC19）を保
有する大腸菌株JM109 は、平成９年９月３０日から茨城
県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５）の通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（NIBH）に受
託番号 FERM P-16452 として寄託されている。

【００５０】

【実施例】以下にPHA のうちの一つである PHBの分解活
性に関与した細胞内 PHB分解酵素遺伝子についてクロー
ニングした例を具体的に示して本発明を説明するが、本
発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。 実施例１ （１）細胞内 PHB分解酵素をコードする遺伝子のクロー
ニング 以下、アルカリゲネス・ユートロファスH16 株 (ATCC 1
7699) をDNA 供与体として用い、該菌体の細胞内 PHB分
解酵素遺伝子を大腸菌の宿主、ベクター系を利用してク
ローニングした。染色体DNA の調製は Davern 法 (C.
I. Davern, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A., 55, 792
(1966) を改良して行った。即ち、DNA 供与体であるア
ルカリゲネス・ユートロファス H16を100 mlの完全培地
(0.2% K₂HPO₄, 0.1% KH₂PO₄, 0.5% カザミノ酸, 0.5%
酵母エキス；pH7.0)で約18時間培養し、培養液から菌体
を集菌した後、TE緩衝液 (10 mM トリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン（以下トリスまたはTrisと略す）、
1 mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（以下EDTAと
略す）；pH8.0)で洗浄した。10 ml のリゾチーム溶液
(50 mM グルコース、25 mM トリス、10 mM EDTA、4mg/m
l リゾチーム; pH8.0)に懸濁した後、37℃で60分間反応
させた。10% のドデシル硫酸ナトリウム（以下SDS と略
す）水溶液１ ml を添加して55℃で10分間加温した。20
ml のTE緩衝液を加えた後、1.5 mlのRNase 溶液 (1mg/
ml) を加え37℃で15分間反応させた。更にプロテアーゼ
Ｋを1 mg加え、45分間反応させた。Molecular Clonin
g, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 198
2記載の方法に従い、これからエチジウム・ブロマイド
−塩化セシウム密度勾配超遠心法により染色体DNA を精
製した。

【００５１】Molecular Cloning, Cold Spring Harb
or Laboratory, New York 1982記載の方法に従い、染
色体DNA 10μｇを制限酵素 Sau3AI (5 unit)で37℃１時
間部分切断し、蔗糖密度勾配遠心により約10 kbpの大き
さのDNA 断片を分画後、シャロミドベクター（例えば、
シャロミド 9-36 ニッポンジーン社製）に連結し、大
腸菌（キットに添付のもの；大腸菌DH5 株）に形質導入
してライブラリーを構築した。操作は、キットのプロト
コールに従って行った。このライブラリーをスクリーニ
ングするために個々の組換え体を培養し、超音波破砕し
た後遠心分離(10,000 rpm, 10 min) により得られた菌
体内容分の PHB分解活性を測定した。PHB 分解活性測定
は公知文献記載の方法 (Saito, T., H. Saegusa, Y. Mi
yataand T. Fukui, FEMS Microbiol. Rev. 103: 333-33
8, 1992 "Intracellular degradation of poly(3-hydro
xybuyrate)granules of Zoogloea ramigera I-16-M")
に従って実施できる。 PHB分解活性測定は、ズーグロエ
ラ・ラミゲラあるいはアルカリゲネス・ユートロファス
から得られた PHB顆粒をプロテアーゼ（例えば、アルカ
ラーゼ）処理したものを基質として用いた。活性の値と
しては、 PHB顆粒から遊離した３−ヒドロキシ酪酸の量
で表わした (Shirakura Y. et al., Biochem. Biophy
s. Acta., 784, p331-339, 1983)。このスクリーニング
で目的のDNA 断片を持つ組換え体を得た。この組換え体
の菌体内溶分の PHB分解活性の結果を表１に示した。

【００５２】（２）サブクローニング 上記（１）で得られた約13 kbpのDNA 断片の制限地図を
作成した。その結果を図１に示した。該制限地図の作製
は、図１に示された制限酵素を使用し、完全に分解した
り、部分分解して得られた断片を、アガロースゲル電気
泳動等で測定する等して行った。この制限地図を基にサ
ブクローニングを行って最終的に約1.7kbp のDNA 断片
を得、次にこれを pUC19に連結した。連結には、T4 DNA
Ligase(DNA Ligation Kit: 宝社製) を用いた。ベク
ターとして pUC18を用いても行った。サブクローニング
にあたっては、上記で得られた制限地図を基に DNA断片
に大きさ、位置などを考慮し、目的断片をアガロースゲ
ル電気泳動等で分離し、ゲルから所要の DNA断片を抽出
し、この抽出した断片をベクターに連結した。 （３）遺伝子の発現及び PHB分解活性測定 上記（２）で得られたサブクローンをコンペテント細胞
である大腸菌JM109 に導入した後、これをLB培地で培養
し、実施例１（１）の様にして、超音波破砕法で菌体を
破砕し、遠心分離により菌の菌体内溶分を得た。この菌
体内溶分の PHB分解活性の結果を表１に示した。宿主細
胞の形質転換は、Transformation kit (ニッポンジーン
社製) を用いて行なわれたが、その方法は、塩化カルシ
ウム等の処理により調製されたコンペテント細胞大腸菌
とDNA とを氷中で混合し、20分間氷冷し、その後、37℃
で１時間振盪培養し、そしてこれを選択培地に塗布して
37℃で１昼夜培養するものである。

【００５３】実施例２ 細胞内 PHB分解酵素遺伝子の塩基配列の決定 実施例１で得られた約1.7 kbp のDNA 断片を M13ファー
ジを用いたジデオキシ法により塩基配列を決定した。配
列決定は、ジデオキシ・チェイン・ターミネーション法
により、AutoCycle Sequencing Kit (ファルマシア社
製) 及び ALF IIDNA Sequencer ( ファルマシア社製)
を用いて行った。決定した1732塩基対からなる塩基配列
中には、配列表の配列番号２に示した1257 塩基対のオ
ープンリーディングフレームが存在した。このオープン
リーディングフレームに対応したアミノ酸配列を有する
ポリペプチドが PHB分解酵素活性を示すことは、実施例
１（２）において得られた組換えベクターを用いた実施
例１（３）記載の実験の結果からも支持されている。こ
の決定された塩基配列とコードされているアミノ酸配列
とを配列表の配列番号３に示した。

【００５４】実施例３ 形質転換体による細胞内 PHB分解酵素の製造 実施例１（２）で得られたサブクローン〔例えば、約1.
7 kbp のDNA 断片（制限酵素 Pst I による部分分解に
より調製した Pst I−Pst I 断片) を有する組換えベク
ター〕を大腸菌JM109 に導入した後、LB培地で37℃一晩
前培養した。次に600 nmの吸光度が0.1 になるように本
培養液に植菌した。600 nmの吸光度が0.6 付近になった
ところでIPTGによるインダクションを行い、その後９時
間培養を続けた。培養終了後集菌し、Tris緩衝液（ｐＨ
７．５）による洗浄後超音波破砕を行った後遠心分離よ
り得られた菌体内容分の PHB分解活性を表１に示した。

【００５５】

【表１】 また、図１に示されている制限酵素切断地図、さらに約
1.7 kbp のDNA 断片位置並びにオープンリーディングフ
レームの位置と PHB分解活性の有無とからも、上記形質
転換体による細胞内 PHB分解酵素の産生が確認できる。

【００５６】

【発明の効果】微生物より単離したPHA 分解酵素遺伝子
を含むDNA の塩基配列を解析することにより細胞内PHA
分解酵素の必須領域をベクターDNA に組み込み細胞内PH
A 分解酵素大量に得ることが出来た。これにより、これ
迄全くわからなかった細胞内でのPHA の分解機構等を解
明する途がひらかれ、さらに細胞内PHA 分解酵素の性質
を検討することが可能になり、PHA の産生効率の向上に
役立てることが出来る。また、こうして得られた分解酵
素の性質を検討し、その有効な阻害剤を見出し、それを
培養液中に添加することにより、PHA 産生効率を高めら
れることが期待される。同時に細胞内PHA 分解酵素をコ
ードするDNA を用いて、その欠損株を取得することも容
易に行うことができる。

【００５７】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：419 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Leu Tyr Gln Leu His Glu Phe Gln Arg Ser Ile Leu His Pro Leu 1 5 10 15 Thr Ala Trp Ala Gln Ala Thr Ala Lys Thr Phe Thr Asn Pro Leu Ser 20 25 30 Pro Leu Ser Leu Val Pro Gly Ala Pro Arg Leu Ala Ala Gly Tyr Glu 35 40 45 Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Lys Glu Tyr Glu Lys Pro Ala Phe Asp Ile 50 55 60 Lys Ser Val Arg Ser Asn Gly Arg Asp Ile Pro Ile Val Glu Gln Thr 65 70 75 80 Val Leu Glu Lys Pro Phe Cys Lys Leu Val Arg Phe Lys Arg Tyr Ala 85 90 95 Asp Asp Pro Glu Thr Ile Lys Leu Leu Lys Asp Glu Pro Val Val Leu 100 105 110 Val Ala Ala Pro Leu Ser Gly His His Ala Thr Leu Leu Arg Asp Thr 115 120 125 Val Arg Thr Leu Leu Gln Asp His Lys Val Tyr Val Thr Asp Trp Ile 130 135 140 Asp Ala Arg Met Val Pro Val Glu Glu Gly Ala Phe His Leu Ser Asp 145 150 155 160 Tyr Ile Tyr Tyr Ile Gln Glu Phe Ile Arg His Ile Gly Ala Glu Asn 165 170 175 Leu His Val Ile Ser Val Cys Gln Pro Thr Val Pro Val Leu Ala Ala 180 185 190 Ile Ser Leu Met Ala Ser Ala Gly Glu Lys Thr Pro Arg Thr Met Thr 195 200 205 Met Met Gly Gly Pro Ile Asp Ala Arg Lys Ser Pro Thr Ala Val Asn 210 215 220 Ser Leu Ala Thr Asn Lys Ser Phe Glu Trp Phe Glu Asn Asn Val Ile 225 230 235 240 Tyr Thr Val Pro Ala Asn Tyr Pro Gly His Gly Arg Arg Val Tyr Pro 245 250 255 Gly Phe Leu Gln His Ala Gly Phe Val Ala Met Asn Pro Asp Arg His 260 265 270 Leu Ser Ser His Tyr Asp Phe Tyr Leu Ser Leu Val Glu Gly Asp Ala 275 280 285 Asp Asp Ala Glu Ala His Val Arg Phe Tyr Asp Glu Tyr Asn Ala Val 290 295 300 Leu Asp Met Ala Ala Glu Tyr Tyr Leu Asp Thr Ile Arg Glu Val Phe 305 310 315 320 Gln Glu Phe Arg Leu Ala Asn Gly Thr Trp Ala Ile Asp Gly Asn Pro 325 330 335 Val Arg Pro Gln Asp Ile Lys Ser Thr Ala Leu Met Thr Val Glu Gly 340 345 350 Glu Leu Asp Asp Ile Ser Gly Ala Gly Gln Thr Ala Ala Ala His Asp 355 360 365 Leu Cys Ala Gly Ile Pro Lys Ile Arg Lys Gln His Leu Asn Ala Ala 370 375 380 His Cys Gly His Tyr Gly Ile Phe Ser Gly Arg Arg Trp Arg Glu Glu 385 390 395 400 Ile Tyr Pro Gln Leu Arg Asp Phe Ile Arg Lys Tyr His Gln Ala Ser 405 410 415 Ala Thr Arg 419

【００５８】配列番号：2 配列の長さ：1257 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アルカリケ゛ネス・ユートロファス 株名：H16 配列 ATGCTCTACC AATTGCATGA GTTCCAGCGC TCGATCCTGC ACCCGCTGAC CGCGTGGGCC 60 CAGGCGACCG CCAAGACCTT CACCAACCCC CTCAGCCCGC TCTCGCTGGT TCCCGGCGCA 120 CCCCGCCTGG CTGCCGGCTA TGAACTGCTG TACCGGCTCG GCAAGGAATA CGAAAAGCCG 180 GCATTCGACA TCAAGTCGGT GCGCTCCAAC GGGCGCGACA TCCCCATCGT CGAGCAGACC 240 GTGCTTGAAA AGCCGTTCTG CAAGCTGGTG CGCTTCAAGC GCTATGCCGA CGACCCGGAG 300 ACCATCAAGC TGCTCAAGGA TGAGCCGGTG GTGCTGGTGG CCGCGCCGCT GTCGGGCCAC 360 CATGCCACGC TGCTGCGCGA CACGGTGCGC ACGCTGCTGC AGGACCACAA GGTCTACGTC 420 ACCGACTGGA TCGACGCACG CATGGTGCCG GTCGAGGAAG GCGCGTTCCA CCTGTCGGAC 480 TACATCTACT ACATCCAGGA ATTCATCCGC CATATCGGCG CCGAGAACCT GCATGTGATC 540 TCGGTATGCC AGCCCACCGT GCCGGTGCTG GCCGCGATCT CGCTGATGGC CTCGGCCGGC 600 GAGAAGACGC CGCGCACCAT GACCATGATG GGCGGCCCGA TCGACGCCCG CAAGAGCCCC 660 ACCGCGGTCA ACTCGCTGGC GACCAACAAG TCGTTCGAGT GGTTCGAGAA CAACGTCATC 720 TACACCGTGC CGGCCAACTA CCCCGGCCAC GGCCGCCGCG TCTACCCGGG CTTTTTGCAG 780 CATGCCGGTT TCGTGGCGAT GAACCCGGAC CGGCACCTTT CCTCGCACTA TGACTTCTAC 840 CTGAGCCTGG TCGAGGGCGA TGCGGATGAC GCCGAAGCCC ACGTGCGCTT CTACGACGAA 900 TACAACGCGG TGCTCGACAT GGCCGCCGAG TACTACCTCG ACACCATCCG CGAGGTGTTC 960 CAGGAATTCC GCCTGGCCAA CGGCACCTGG GCCATCGACG GCAATCCGGT GCGGCCGCAG 1020 GACATCAAGA GCACCGCGCT GATGACCGTC GAGGGCGAAC TGGACGACAT CTCGGGCGCG 1080 GGCCAGACCG CCGCGGCGCA CGACCTGTGC GCCGGCATCC CGAAAATCCG CAAGCAGCAC 1140 CTGAACGCGG CACACTGCGG CCACTACGGC ATCTTCTCGG GCCGGCGCTG GCGCGAAGAG 1200 ATCTACCCGC AGCTGCGCGA CTTTATCCGC AAGTACCACC AGGCCTCGGC CACCAGG 1257

【００５９】配列番号：3 配列の長さ：1691 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：アルカリケ゛ネス・ユートロファス 株名：H16 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：130..1386 特徴を決定した方法：E 配列 CTGCAGAGCA AGATCGTTAG CACGGTCGTT CGGTTAAAGG CATAATCGGC GCCACGATCC 60 CCCGGTGTAT TGTCAGTACA TTAGTACTTG GTAGTACGTA CCTCTTAGCT AGACCCAGGC 120 AGAAAAGGC ATG CTC TAC CAA TTG CAT GAG TTC CAG CGC TCG ATC CTG CAC 171 Met Leu Tyr Gln Leu His Glu Phe Gln Arg Ser Ile Leu His 5 10 CCG CTG ACC GCG TGG GCC CAG GCG ACC GCC AAG ACC TTC ACC AAC CCC 219 Pro Leu Thr Ala Trp Ala Gln Ala Thr Ala Lys Thr Phe Thr Asn Pro 15 20 25 30 CTC AGC CCG CTC TCG CTG GTT CCC GGC GCA CCC CGC CTG GCT GCC GGC 267 Leu Ser Pro Leu Ser Leu Val Pro Gly Ala Pro Arg Leu Ala Ala Gly 35 40 45 TAT GAA CTG CTG TAC CGG CTC GGC AAG GAA TAC GAA AAG CCG GCA TTC 315 Tyr Glu Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Lys Glu Tyr Glu Lys Pro Ala Phe 50 55 60 GAC ATC AAG TCG GTG CGC TCC AAC GGG CGC GAC ATC CCC ATC GTC GAG 363 Asp Ile Lys Ser Val Arg Ser Asn Gly Arg Asp Ile Pro Ile Val Glu 65 70 75 CAG ACC GTG CTT GAA AAG CCG TTC TGC AAG CTG GTG CGC TTC AAG CGC 411 Gln Thr Val Leu Glu Lys Pro Phe Cys Lys Leu Val Arg Phe Lys Arg 80 85 90 TAT GCC GAC GAC CCG GAG ACC ATC AAG CTG CTC AAG GAT GAG CCG GTG 459 Tyr Ala Asp Asp Pro Glu Thr Ile Lys Leu Leu Lys Asp Glu Pro Val 95 100 105 110 GTG CTG GTG GCC GCG CCG CTG TCG GGC CAC CAT GCC ACG CTG CTG CGC 507 Val Leu Val Ala Ala Pro Leu Ser Gly His His Ala Thr Leu Leu Arg 115 120 125 GAC ACG GTG CGC ACG CTG CTG CAG GAC CAC AAG GTC TAC GTC ACC GAC 555 Asp Thr Val Arg Thr Leu Leu Gln Asp His Lys Val Tyr Val Thr Asp 130 135 140 TGG ATC GAC GCA CGC ATG GTG CCG GTC GAG GAA GGC GCG TTC CAC CTG 603 Trp Ile Asp Ala Arg Met Val Pro Val Glu Glu Gly Ala Phe His Leu 145 150 155 TCG GAC TAC ATC TAC TAC ATC CAG GAA TTC ATC CGC CAT ATC GGC GCC 651 Ser Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ile Gln Glu Phe Ile Arg His Ile Gly Ala 160 165 170 GAG AAC CTG CAT GTG ATC TCG GTA TGC CAG CCC ACC GTG CCG GTG CTG 699 Glu Asn Leu His Val Ile Ser Val Cys Gln Pro Thr Val Pro Val Leu 175 180 185 190 GCC GCG ATC TCG CTG ATG GCC TCG GCC GGC GAG AAG ACG CCG CGC ACC 747 Ala Ala Ile Ser Leu Met Ala Ser Ala Gly Glu Lys Thr Pro Arg Thr 195 200 205 ATG ACC ATG ATG GGC GGC CCG ATC GAC GCC CGC AAG AGC CCC ACC GCG 795 Met Thr Met Met Gly Gly Pro Ile Asp Ala Arg Lys Ser Pro Thr Ala 210 215 220 GTC AAC TCG CTG GCG ACC AAC AAG TCG TTC GAG TGG TTC GAG AAC AAC 843 Val Asn Ser Leu Ala Thr Asn Lys Ser Phe Glu Trp Phe Glu Asn Asn 225 230 235 GTC ATC TAC ACC GTG CCG GCC AAC TAC CCC GGC CAC GGC CGC CGC GTC 891 Val Ile Tyr Thr Val Pro Ala Asn Tyr Pro Gly His Gly Arg Arg Val 240 245 250 TAC CCG GGC TTT TTG CAG CAT GCC GGT TTC GTG GCG ATG AAC CCG GAC 939 Tyr Pro Gly Phe Leu Gln His Ala Gly Phe Val Ala Met Asn Pro Asp 255 260 265 270 CGG CAC CTT TCC TCG CAC TAT GAC TTC TAC CTG AGC CTG GTC GAG GGC 987 Arg His Leu Ser Ser His Tyr Asp Phe Tyr Leu Ser Leu Val Glu Gly 275 280 285 GAT GCG GAT GAC GCC GAA GCC CAC GTG CGC TTC TAC GAC GAA TAC AAC 1035 Asp Ala Asp Asp Ala Glu Ala His Val Arg Phe Tyr Asp Glu Tyr Asn 290 295 300 GCG GTG CTC GAC ATG GCC GCC GAG TAC TAC CTC GAC ACC ATC CGC GAG 1083 Ala Val Leu Asp Met Ala Ala Glu Tyr Tyr Leu Asp Thr Ile Arg Glu 305 310 315 GTG TTC CAG GAA TTC CGC CTG GCC AAC GGC ACC TGG GCC ATC GAC GGC 1131 Val Phe Gln Glu Phe Arg Leu Ala Asn Gly Thr Trp Ala Ile Asp Gly 320 325 330 AAT CCG GTG CGG CCG CAG GAC ATC AAG AGC ACC GCG CTG ATG ACC GTC 1179 Asn Pro Val Arg Pro Gln Asp Ile Lys Ser Thr Ala Leu Met Thr Val 335 340 345 350 Glu Gly Glu Leu Asp Asp Ile Ser Gly Ala Gly Gln Thr Ala Ala Ala 355 360 365 CAC GAC CTG TGC GCC GGC ATC CCG AAA ATC CGC AAG CAG CAC CTG AAC 1275 His Asp Leu Cys Ala Gly Ile Pro Lys Ile Arg Lys Gln His Leu Asn 370 375 380 GCG GCA CAC TGC GGC CAC TAC GGC ATC TTC TCG GGC CGG CGC TGG CGC 1323 Ala Ala His Cys Gly His Tyr Gly Ile Phe Ser Gly Arg Arg Trp Arg 385 390 395 GAA GAG ATC TAC CCG CAG CTG CGC GAC TTT ATC CGC AAG TAC CAC CAG 1371 Glu Glu Ile Tyr Pro Gln Leu Arg Asp Phe Ile Arg Lys Tyr His Gln 400 405 410 GCC TCG GCC ACC AGG TAAGAAAACG CCCGCGATTG CGGGCGTTTC TTCTTGCGGG 1426 Ala Ser Ala Thr Arg 415 GCCGGGATGC TCAGTGCTTC TTCAGGTAGC TGAGCAGCAT TTCCGAGTGC AGCTCGGCAA 1486 AGCGCTCATG CTCCTGCTGC GAGGCCACGT CGCGGCCGAT CACGGCACTG ATGGTATAGC 1546 GGTTGGACAG CACGTAGTAG CCCAGCGCGG AAATCGTCAG GTAGAACTGC GGCACGTCGA 1606 TATCGTCGCG GAACACGCCT TGTTCCTGCC CGCGCCGGAT CACGTCGGCC AGCACATCCA 1666 CCACCGGGTT GATCAGCTGC TGCAG 1691

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１（１）で得られた約１３ｋｂｐのDNA
断片の制限酵素切断地図とサブクローングで得られた各
DNA 断片と PHB分解活性の有無、１．７ｋｂｐの位置と
オープンリーディングフレームの位置を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/18 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:05） (72)発明者 三枝 治久 東京都港区西新橋２丁目８番11号 第７ 東洋海事ビル８階 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（1986）Ｖｏ ｌ．880，Ｎｏ．１，ｐ．46−53 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/18 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の (a)又は(b) のタンパク質をコー
   ドする遺伝子： (a) 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列を含
   有するタンパク質、 (b) アミノ酸配列 (a)において、１〜複数個のアミノ
   酸の付加、除去及び置換から成る群から選ばれた修飾が
   単独或いは複数の組み合わせで実施されているアミノ酸
   配列を含有し、且つ細胞内ポリ−３−ヒドロキシブチレ
   ート又は３−ヒドロキシブチレートと炭素数３〜１２程
   度のその他のヒドロキシアルカノエートとの共重合体の
   分解活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 以下の (i)又は(ii)のDNA を含有する請
   求項１記載の遺伝子： (i) 配列表の配列番号２で表される塩基配列を含有す
   るDNA 、 (ii) (i) の塩基配列を有するDNA とストリンジェント
   な条件下でハイブリダイズし、且つポリヒドロキシアル
   カノエート分解活性を有するタンパク質をコードするDN
   A 。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載の遺伝子を含有し
   ている組換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の組換えベクターを含む
   形質転換体。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の形質転換体を培養し、
   次に得られた細胞内ポリヒドロキシアルカノエート分解
   酵素を採取することを特徴とする細胞内ポリヒドロキシ
   アルカノエート分解酵素の製造法。