JP4306802B2

JP4306802B2 - アミダーゼ

Info

Publication number: JP4306802B2
Application number: JP50301198A
Authority: JP
Inventors: マーフィー，デニス; レイド，ジョン，シー．; ロバートソン，ダン
Original assignee: ヴェレニウムコーポレーション
Priority date: 1996-06-17
Filing date: 1997-06-17
Publication date: 2009-08-05
Anticipated expiration: 2017-06-17
Also published as: CA2258512C; AU3372897A; WO1997048794A1; DE69730514D1; CA2258512A1; DE69730514T2; ES2227701T3; US5985646A; EP0937139A4; US6500659B1; AU723433B2; US6525190B1; US6429004B1; EP0937139A1; US6004796A; JP2000512849A; US6465204B1; EP0937139B1; US5877001A; ATE275205T1

Description

本発明は、新しく同定されたポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド、かかるポリヌクレオチド及びポリペプチドの使用、並びにかかるポリヌクレオチドとポリペプチドの産生と単離に関する。更に特定すると、本発明のポリペプチドはアミダーゼ、特にペプチドまたはペプチドミメティック（peptidomimetic）合成においてペプチドのＮ末端からのアルギニン、フェニルアラニンまたはメチオニンの除去に活性を有する酵素として同定された。
好熱菌は高活性で熱に安定な酵素の供給源として大きな注目を受けている（Bronneomeier, K. and Staudenbauer, W.L., D.R. Woods（ed.）, The Clostridia and Biotechnology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA（1993））。最近、現在知られる最も極度に好熱的な臓器親和性真性細菌が単離され特性決定された。テルモトガ（Thermotoga）属に属するこれらの細菌は、各種の炭水化物を代謝する発酵性微生物類である（Huber, R. and Stetter, K.O., in Ballowsら編, The Procaryotes, 2nd Ed., Springer-Verlaz, New York, pgs. 3809-3819（1992））。
今まで始原生物圏（archaeal domain）から同定された殆どの生物は好熱性または超好熱性であるので、古細菌（achaeal bacteria）もまた好熱酵素の産生源と考えられる。
発明の概要
本発明の一つの面によれば、新規の酵素及びその活性断片、類似体及び誘導体が提供される。
本発明の他の面によれば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含む本発明の酵素をコードする単離された核酸分子並びにかかる酵素の活性類似体及び断片が提供される。
本発明のさらに他の面によれば、本発明の酵素をコードする核酸配列を含有する組換え原核及び／または真核宿主細胞を、上記酵素の発現を促進する条件下で培養し、その後に上記酵素を回収することを含んでなる、かかるポリペプチドを組換え技術により産生する方法が提供される。
本発明のさらに他の面によれば、かかる酵素、またはかかる酵素をコードするポリヌクレオチドを利用する方法が提供される。本酵素はペプチドまたはペプチドミメティック合成においてペプチドのＮ末端からアルギニン、フェニルアラニン、またはメチオニンのアミノ酸を除去するのに有用である。本酵素はアミノ酸誘導体のL体すなわち「天然」エナンチオマーに選択的であり、それ故に、光学活性化合物の産生に有用である。これらの反応は非酵素法では達成が非常に困難な工程である化学的により反応性のあるエステル官能基の存在で実施することができる。本酵素はまた高温（少なくとも70℃）、及び高濃度の有機溶媒（＞40%DMSO）に耐えることができ、これらはいずれもペプチド中の二次構造を破壊し、そうでなければ抵抗性ある結合の開裂を可能とする。
本発明のさらに他の面によれば、本発明の核酸配列と特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブもまた提供される。
本発明のさらに他の面によれば、かかる酵素、またはかかる酵素をコードするポリヌクレオチドを、科学研究に関係するin vitroの目的で、例えば、他生物由来の同様な酵素をコードし得る同様な配列を同定するためのプローブを作製させるために利用する方法が提供される。
本発明のこれら及び他の面は、当業者には本明細書の教示から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
以下の図面は本発明の実施様態を説明するものであり、請求項により包含される本発明の範囲を限定することを意図しない。
図１は、本発明の酵素の全長ＤＮＡ及び対応する推定アミノ酸配列を示す。配列決定は378自動ＤＮＡシーケンサー（Applied Biosystems, Inc.）を使って実施した。
図２は、蛍光対DMSO濃度を示す。黒四角と白四角は、実施例３からの個々のアッセイを示す。
図３は、実施例３からの、より反応性の高いCBZ−L−arg−AMCに対しての相対初期直線速度（毎分当りの蛍光増加、すなわち「活性」）対DMF濃度を示す。
発明の詳細な説明
用語「遺伝子」はポリペプチド鎖の産生にかかわるＤＮＡのセグメントを意味し；コード領域の上流及び下流領域（リーダー及びトレーラー）及び個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
ＲＮＡポリメラーゼが二つのコード配列を単一のｍＲＮＡに転写し、その後、両方のコード配列から誘導されたアミノ酸を有する単一のポリペプチドに翻訳される時、一つのコード配列は他のコード配列に「作動可能的（operably）に結合されて」いるという。発現された配列が最終的にプロセシングされて所望のタンパク質を産生する限り、これらのコード配列は互いに隣接している必要はない。「組換え」酵素は組換えＤＮＡ技術により産生された酵素；すなわち、所望酵素をコードする外因性ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から産生された酵素を指す。「合成」酵素は化学合成により調製されたものである。
本発明は実質的に純粋なアミダーゼ酵素を提供する。本明細書では用語「実質的に純粋な」は、自然に付随している他のタンパク質、脂質、炭水化物、核酸及び他の生物学的物質を実質的に含まないポリペプチド（例えば、アミダーゼポリペプチド、又はその断片）のごとき分子を記述するために用いた。例えば、実質的に純粋な分子は、ポリペプチドでは乾燥重量で60％以上の対象の分子であり得る。ポリペプチドの純度は標準法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、SDS−PAGE）、カラムクロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー（HPLC））、及びアミノ末端アミノ酸配列分析を使って定量することができる。
特定酵素のＤＮＡ「コード配列」、または、特定酵素「をコードするヌクレオチド配列」は、適切な調節配列の制御下におかれた時に転写された酵素に翻訳されるＤＮＡ配列である。「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３′方向）コード配列の転写を開始する能力のあるＤＮＡ調節領域である。プロモーターはＤＮＡ配列の部分である。この配列領域はその３′末端に開始コドンを有する。プロモーター配列は最小数の塩基を含み、そのエレメントはバックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するために必要である。しかし、ＲＮＡポリメラーゼがこの配列に結合し、転写が開始コドン（プロモーターの３′末端）で開始されると、転写は３′方向の下流に進行する。プロモーター配列内には転写開始部位（ヌクレアーゼS1マッピングにより簡便に規定される）及びＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出されるであろう。
本発明はペプチドまたはペプチドミメティック合成におけるペプチドのＮ末端からのアルギニン、フェニルアラニンまたはメチオニンのアミノ酸の除去に触媒作用を果す精製された熱安定性酵素を提供する。精製酵素は、本明細書では「テルモコッカス（Thermococcus）GU5L5」と呼ぶ生物に由来するアミダーゼであり、この生物は非常に高温に適性を有する好熱始原生物である。この生物は厳密に嫌気性であり、55と90℃の間（最適には85℃）で増殖する。GU5L5はイタリアのVulcanoの浅い海洋水熱域で発見された。この生物はシングレットまたはペアで存在する球菌様（coccoid）細胞を有する。GU5L5は最適には85℃、pH6.0、海水培地中でペプトンを基質として窒素気相で増殖する。
本発明のポリヌクレオチドは、以下に記載した通り、本来、テルモコッカス（Thermococcus）GU5L5から誘導したゲノム遺伝子ライブラリーから回収された。これは622個のアミノ酸残基のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含有する。
好ましい実施様態では、本発明のアミダーゼ酵素は、この遺伝子のヌクレオチド配列から推定されるごとく約68.5キロダルトンの分子量である。
本発明のある面によれば、図１（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有する成熟酵素をコードする単離された核酸分子（ポリヌクレオチド）が提供される。
本発明は、図１（配列番号１）に開示されたアミダーゼ酵素をコードする単離された核酸分子に加えて、また実質的に類似した配列も提供する。単離された核酸配列は、もし（i）それらが以下に記載されるストリンジェントの条件下で配列番号１とハイブリダイズする能力があるか；または（ii）それらが配列番号１に縮重しているＤＮＡ配列をコードするならば、実質的に類似している。縮重ＤＮＡ配列は配列番号２のアミノ酸配列をコードするが、ヌクレオチドコード配列には変化がある。本明細書で使われる「実質的に類似した」は本発明の配列に対して類似した同一性を有する配列を指す。実質的に類似したヌクレオチド配列はハイブリダイゼーションまたは配列比較により同定することができる。実質的に類似した酵素配列は次の一つ以上の方法により同定することができる。すなわち、タンパク質分解消化、ゲル電気泳動及び／またはミクロ配列決定である。
アミダーゼ酵素をコードする核酸分子を単離する一つの方法は、当業界で認められている方法を使い天然または人工的に設計したプローブにより遺伝子ライブラリーを探索することである（例えば、次を参照すること：Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel F. M. ら（EDS.）Green Publishing Company Assoc. and John Wiley Interscience, New York, 1989, 1992）。当業者であれば、配列番号１、またはその断片（少なくとも15個の連続ヌクレオチドからなる）は特に有用なプローブであることが認められる。この目的のために他の特に有用なプローブは配列番号１の配列（すなわち、少なくとも15個の連続ヌクレオチドからなる）とハイブリダイゼーションが可能な断片である。
本明細書で開示される特定の核酸配列とハイブリダイズする核酸配列について、ハイブリダイゼーションは軽度のストリンジェンシー、中度のストリンジェンシーまたは高度のストリンジェンシーの条件下で実施することができる。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの一例として、固定化変性核酸を含有する高分子膜を最初に、30分間、45℃で0.9M NaCl、50mM NaH₂PO₄、pH7.0、5.0mM Na₂EDTA、0.5% SDS、10×デンハルツ（Denhardt’s）試薬、及び0.5mg/mLポリリボアデニル酸からなる溶液中で、プレハイブリダイズする。その後、ほぼ2×10⁷cpm（比活性4〜9×10⁸cpm/ug）の³²P末端標識オリゴヌクレオチドプローブを溶液に加える。12〜16時間のインキュベーション後、膜を30分間室温で0.5%SDSを含有する1×SET（150mM NaCl、20mMトリス塩酸、pH7.8、1mM Na₂EDTA）中で洗浄し、その後、30分間、新しい1×SET中で、Tm-10℃でオリゴ−ヌクレオチドプローブを洗浄する。それから、この膜をオートラジオグラフフィルムに曝露してハイブリダイゼーションシグナルを検出する。
ストリンジェントの条件とは、配列間に少なくとも90%の同一性、好ましくは少なくとも95%の同一性そして最も好ましくは少なくとも97%の同一性が存在する時にのみ、ハイブリダイゼーションが起ることを意味する。J. Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual（2d Ed. 1989）（Cold Spring Harbor Laboratory）を参照すること、なお、この全文を参考として本明細書に組み入れる。
本明細書で用語として使われる「同一性」は、基準ポリヌクレオチド（配列番号１）と同じ塩基の百分率を有するポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、基準ポリヌクレオチドに対して少なくとも90%の同一性があるポリヌクレオチドは、基準ポリヌクレオチドを構成する塩基の90%において同一であるポリヌクレオチド塩基を有し、そのポリヌクレオチド配列を構成する塩基の10%は異なる塩基であってよい。
本発明はまた、基準ポリヌクレオチドと異なるがその変化がサイレントな変化である（例えばその変化はポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を改変しない）ポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、基準ポリヌクレオチド（配列番号１）によりコードされる酵素中のアミノ酸の置換、付加、欠失、融合及び末端切断をもたらすヌクレオチド変化に関する。本発明の好ましい面では、これらの酵素は基準ポリヌクレオチドによりコードされる酵素と同じ生物学的作用を保持する。
プローブの同定を容易にするため、かかるプローブは分析的に検出可能な試薬で標識され得るし、好ましくは標識されることもまた理解される。有用な試薬は、放射能、蛍光染料または検出可能な生成物の形成を触媒する能力がある酵素を含むが、これらに限らない。かくして、このプローブは他の動物源からＤＮＡの相補的コピーを単離し、または関係する配列についてかかる源をスクリーニングするために有用である。
本発明のアミダーゼ酵素に対するコード配列はテルモコッカス（Thermococcus）GU5L5ゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、そのライブラリーをアミダーゼ活性を有するクローンに対してスクリーニングすることにより同定された。ゲノム遺伝子ライブラリーを構築するかかる方法は当業界では周知である。例えば、一つの方法は、GU5L5から単離したＤＮＡを物理的破壊により切断することを含む。小量の切断ＤＮＡをアガロースゲル上でチェックして、大部分のＤＮＡが所望のサイズ範囲（およそ３〜６kb）であることを確認する。このＤＮＡはその後、ムング・ビーン（Mung Bean）ヌクレアーゼを使い平滑末端化し、37℃でインキュベーションし、フェノール／クロロホルムで抽出する。このＤＮＡはその後、Eco RIメチラーゼを使ってメチル化する。その後、Eco RIリンカーを、T4ＤＮＡリガーゼを使い4℃でインキュベーションして平滑末端に連結する。その後、連結反応を終結させ、このＤＮＡをEco RI制限酵素で切断する。その後、このＤＮＡを当業界で周知の方法に従い、ショ糖密度勾配でサイズ分画する；例えば、Maniatis, T. ら, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press, New York, 1982を参照すること、なおこの全文を参考として本明細書に組み入れる。
その後、ＤＮＡのおよその濃度を得るためにプレートアッセイを行う。その後、連結反応を行い、1μlの連結反応物をパッケージしてライブラリーを構築する。パッケージングは例えば、Eco RIにより切断した精製λgt11ファージアーム及びEco RIリンカー結合後にEco RIにより切断したＤＮＡを使って行うことができる。ＤＮＡとλgt11アームをＤＮＡリガーゼにより連結する。その後、連結されたＤＮＡを感染性ファージ粒子にパッケージする。パッケージされたファージを使い大腸菌（E. coli）培養物に感染させ、感染細胞を寒天プレート上にまき、数千の個々のファージプラークを担持するプレートを得る。その後、ライブラリーを増幅する。
本発明の全長遺伝子の断片はｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー用のハイブリダイゼーションプローブとして、全長ＤＮＡを単離し、及びこの遺伝子に高い配列類似性または同様な生物学的活性を有する他のＤＮＡを単離するために使用することができる。このタイプのプローブは少なくとも10個、好ましくは少なくとも15個、そして更に好ましくは少なくとも30個の塩基を有し、例えば、50個以上の塩基を含有することもあり得る。このプローブはまた、全長転写産物に対応するＤＮＡクローン、及び調節領域とプロモーター領域、エキソン、及びイントロンを含む完全遺伝子を含有するゲノムクローンを同定するために使うこともできる。
単離された核酸配列と他の酵素はその後、本発明の酵素に特徴的な生物学的活性の保持を、例えば酵素アミダーゼ活性を検出するアッセイで測定することができる。かかる酵素はアミダーゼの末端切断型、及び欠失及び挿入変異体のごとき変異体を含む。
本発明のポリヌクレオチドはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを含むＤＮＡの形態であってよい。前記ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であってよく、もし一本鎖の場合はコードしている鎖またはコードしていない（アンチセンス）鎖であってよい。この成熟酵素をコードするコード配列は、図１（配列番号１）に示されたコード配列及び／または寄託クローンのそれと同じであるか、または異なっていても遺伝子コードの重複または縮重の結果として図１（配列番号１）のＤＮＡと同じ成熟酵素をコードするコード配列であることもあり得る。
図１（配列番号２）の成熟酵素をコードするポリヌクレオチドは、限定するものではないが、成熟酵素に対するコード配列のみ；成熟酵素に対するコード配列及びリーダー配列またはプロタンパク質配列のごとき追加のコード配列；成熟酵素に対するコード配列（及び任意の追加コード配列）並びにイントロンのごとき非コード配列または成熟酵素に対するコード配列の非コード配列５′及び／または３′を含むことができる。
この様に、用語「酵素（タンパク質）をコードするポリヌクレオチド」は、酵素に対するコード配列のみを含有するポリヌクレオチド及び追加のコード及び／または非コード配列を含有するポリヌクレオチドを包含する。
本発明は更に図１（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有する酵素の断片、類似体及び誘導体をコードする上記ポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、該ポリヌクレオチドの天然に存在する対立遺伝子変異体または該ポリヌクレオチドの非天然に生成する変異体でありうる。
この様に、本発明は、図１（配列番号２）に示されるのと同じ成熟酵素をコードするポリヌクレオチド、及び、図１（配列番号２）の酵素の断片、誘導体または類似体をコードするポリヌクレオチドのそうした変異体を含む。かかるヌクレオチド変異体は欠失変異体、置換変異体及び付加または挿入変異体を含む。
以上示したように、このポリヌクレオチドは図１（配列番号１）に示されるコード配列の天然に存在する対立遺伝子変異体のコード配列を有することができる。当業者に周知である通り、対立遺伝子変異体は一つ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得るが、コードされた酵素の機能を実質的に改変しないポリヌクレオチド配列の代替形態である。
本発明はまた、成熟酵素に対するコード配列が同じリーディングフレーム中で宿主細胞からの酵素の発現と分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば細胞からの酵素の輸送を制御するために機能するリーダー配列に融合されている可能性のあるポリヌクレオチドを含む。リーダー配列を有する酵素はプレタンパク質であり、宿主細胞により該リーダー配列が開裂されて酵素の成熟形態を形成することができる。このポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質に追加５′アミノ酸残基を加えたプロタンパク質をコードすることができる。プロ配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質であり、該タンパク質の不活性型である。プロ配列が開裂されると、活性のある成熟タンパク質が残る。
この様に、例えば、本発明のポリヌクレオチドは成熟酵素、またはプロ配列を有する酵素、またはプロ配列とプレ配列（リーダー配列）の両方を有する酵素をコードすることができる。
本発明は更に、もし配列間に少なくとも70%、好ましくは少なくとも90%、そして更に好ましくは95%の同一性がある場合に上記配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェントの条件下で上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書中で使用する場合、用語「ストリンジェントの条件」は、もし配列間に少なくとも95%で、好ましくは少なくとも97％で同一性がある時にのみハイブリダイゼーションが起るであろうことを意味する。上記ポリヌクレオチドに好ましい実施様態でハイブリダイズするポリペプチドは、図１（配列番号１）のＤＮＡによりコードされる成熟酵素と実質的に同じ生物学的機能または活性を保持する酵素をコードする。
代替として、このポリヌクレオチドは、少なくとも15個の塩基、好ましくは少なくとも30個の塩基、そして更に好ましくは50個の塩基を有し、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズし、かつ上述のようにそれらに同一性を有し、そして活性を保持していてもまたは保持していなくてもよい。例えば、かかるポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチド用のプローブとして、例えば、このポリヌクレオチドの回収用にまたはPCRのプライマーとして使用することができる。
この様に、本発明は、配列番号２の酵素をコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも70％の同一性、好ましくは少なくとも90％の同一性、そして更に好ましくは95％の同一性を有するポリヌクレオチド、及び少なくとも30個の塩基、好ましくは少なくとも50個の塩基を有するその断片、及び、かかるポリヌクレオチドによりコードされる酵素を目的としている。
本発明は更に図１（配列番号２）の推定アミノ酸配列を有する酵素並びにかかる酵素の断片、類似体及び誘導体に関する。
用語「断片」、「誘導体」および「類似体」とは、図１（配列番号２）の酵素を指す場合、かかる酵素と本質的に同じ生物学的機能または活性を保持する酵素を意味する。従って、類似体はプロタンパク質部分の開裂により活性化されて活性成熟酵素を産生することができるプロタンパク質を含む。
本発明の酵素は組換え酵素、天然酵素または合成酵素、好ましくは組換え酵素であることができる。
図１（配列番号２）の酵素の断片、類似体および誘導体は（i）一つ以上のアミノ酸残基が保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換されており、かかる置換アミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされているかまたはコードされていないもの、または（ii）一つ以上のアミノ酸残基が置換基を含んでいるもの、または（iii）成熟酵素は他の化合物、例えば酵素の半減期を増加させる化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合しているもの、または（iv）リーダーもしくは分泌配列、成熟酵素の生成のために使われる配列またはプロタンパク質配列のような追加のアミノ酸が成熟酵素に融合しているものであってよい。かかる断片、誘導体または類似体は本明細書内の教示から当業者の理解できる範囲内にあるとみなされる。
本発明の酵素とポリヌクレオチドは好ましくは単離された形態で提供され、好ましくは精製されて均質となっているものである。
用語「単離された」とは、物質がその本来の環境（例えばもし天然に存在するものであれば自然環境）から取り出されたことを意味する。例えば、生きている動物の体内に存在する天然ポリヌクレオチドまたは酵素は単離されてないが、自然系で共存する物質のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたは酵素は単離されている。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部であることができ、および／または、かかるポリヌクレオチドまたは酵素は組成物の一部であることができるが、それでもかかるベクターまたは組成物はその自然環境の一部ではない点において単離されている。
本発明の酵素には、配列番号２の酵素（特に成熟酵素）、並びに、配列番号２の酵素に対し少なくとも70%の類似性（好ましくは少なくとも70%の同一性）、より好ましくは配列番号２の酵素に対し少なくとも90%の類似性（より好ましくは少なくとも90%の同一性）、更に好ましくは配列番号２の酵素に対し少なくとも95%の類似性（更に好ましくは少なくとも95%の同一性）を有する酵素が含まれ、そしてまた、かかる酵素の部分（但し、該酵素の部分とは、通常、少なくとも30個のアミノ酸、更に好ましくは少なくとも50個のアミノ酸を含んでいる）も含まれる。
当業で周知の通り、２つの酵素の間の「類似性」は一つの酵素のアミノ酸配列とその保存アミノ酸置換体を第二の酵素の配列と比較して決定される。類似性は、当業で周知の方法、例えばBLASTプログラム（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information）により決定することができる。
変異体、すなわち「断片」、「類似体」または「誘導体」酵素と参照酵素は、一つ以上の置換、付加、欠失、融合および末端切断（これはどの組合わせで存在してもよい）によりアミノ酸配列が異なり得る。
好ましい変異体は保存的アミノ酸置換により参照とは異なるものである。かかる置換は、ポリペプチド中の所与のアミノ酸を似た特性の他のアミノ酸により置換するものである。保存的置換として典型的に見られるのは、脂肪族アミノ酸Ala、Val、LeuおよびIle間で一つと他との置き換え；ヒドロキシル残基SerとThrの相互交換、酸性残基AspおよびGluの交換、アミド残基AsnおよびGln間の置換、塩基残基LysおよびArgの交換および芳香族残基Phe、Tyr間の置き換えである。
最も好ましいのは、変異する前に元の参照ポリペプチドと同じ生物学的機能と活性を保持する変異体である。
本発明の酵素の断片または部分は、対応する全長酵素をペプチド合成により生産するために用いることができる。したがって、断片は全長酵素を生産するための中間体として用いることができる。本発明のポリヌクレオチドの断片または部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使うことができる。
本発明はまた本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターにより遺伝子工学的に操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明の酵素の生産に関する。
宿主細胞は本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターを用いて遺伝子工学的な操作（形質導入または形質転換またはトランスフェクション）を受ける。かかるベクターは例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターである。該ベクターは例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態である。遺伝子工学的に操作された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、または本発明の遺伝子を増幅するために適切に改変された通常の栄養培地中で培養することができる。温度、pHなどのごとき培養条件は、発現のために選ばれた宿主細胞で以前から使われていたものであり、通常の熟練技術者には明らかであろう。
本発明のポリヌクレオチドを組換え技術により酵素を生産するために使うことができる。かくして、例えば、このポリヌクレオチドは酵素を発現する様々な発現ベクターのいずれかの一つに含ませることができる。かかるベクターは染色体の、非染色体のおよび合成のＤＮＡ配列、例えばSV40の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡ、ワクシニア、アデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、および偽性狂犬病のごときウイルスＤＮＡの組合わせから導入されるベクターを含む。しかし、宿主内で複製可能で生存し得る限りいずれの他のベクターも使うことができる。
適切なＤＮＡ配列を様々な方法によりベクター中に挿入することができる。通常、当業界周知の方法でＤＮＡ配列は適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。かかる方法などは当業技術の範囲内にあるとみなされる。
発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指令する適切な発現調節配列（プロモーター）に作動的に連結されている。かかるプロモーターの代表例として挙げられるのは、LTRまたはSV40プロモーター、大腸菌（E. coli）lacまたはtrp、ファージλＰ_Lプロモーター、および原核または真核細胞またはそれらのウイルス中の遺伝子発現を制御することが知られる他のプロモーターである。発現ベクターはまた翻訳開始および転写ターミネーターのリボソーム結合部位も含有する。このベクターはまた発現を増幅するための適切な配列も含む。
更に、発現ベクターは好ましくは、真核細胞培養に対するジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性のごとき、または大腸菌（E. coli）中のテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性のごとき形質転換された宿主細胞の選択に対する表現型特性（phenotypic trait）を提供する1個以上の選択可能な標識遺伝子を含有する。
以上記載した適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含有するベクターは、適切な宿主な形質転換して宿主がそのタンパク質を発現することを可能とする。
適切な宿主の代表例として挙げられるのは、大腸菌（E. coli）、ストレプトミセス（Streptomyces）、枯草菌（Bacillus subtilis）のごとき細菌細胞；酵母のごとき真菌細胞；ショウジョウバエ（Drosophila）S2およびスポドプテラ（Spodoptera）Sf9のごとき昆虫細胞；CHO、COSまたはボウズ（Bowes）黒色腫のごとき動物細胞；アデノウイルス；植物細胞などである。適切な宿主の選択は本明細書の教示からの当業技術の範囲内であるとみなされる。
更に特に、本発明はまた、以上広く記載された配列の一つ以上からなる組換え構築物を含む。この構築物は本発明の配列が前または逆配向に挿入されたプラスミドまたはウイルスベクターのごときベクターを含む。この実施様態の好ましい面では、この構築物は更に例えば配列に作動可能的に連結されたプロモーターを含む調節配列を含む。多数の適切なベクターとプロモーターが当業者には周知であり、それらは市販されている。例として、次のベクターが提供される；細菌系：pQE70、pQE60、pQE-9（Qiagen）、pBluescript II（Stratagene）；pTRC99a、pKK223-3、pDR540、pRIT2T（Pharmacia）；真核系：pXT1、pSG5（Stratagene）pSVK3、pBPV、pMSG、pSVLSV40（Pharmacia）。しかし、他のプラスミドまたはベクターも宿主内で複製可能であり生存可能である限り使用することができる。
プロモーター部位はどの所望の遺伝子からでも、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択可能な標識を有する他のベクターを使って、選択することができる。２つの適切なベクターはpKK232-8およびpCM7である。特に著名な細菌プロモーターは、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λP_R、P_Lおよびtrpがある。真核プロモーターには、CMV極初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTR、およびマウスメタロチオネイン−Iが含まれる。適切なベクターとプロモーターの選択は通常の当業技術の水準内にある。
更なる実施様態において、本発明は以上記載した構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞のごとき高等な真核細胞、または酵母細胞のごとき下等の真核細胞であることができるし、また宿主細胞は細菌細胞のごとき原核細胞であることができる。構築物の宿主細胞への導入は燐酸カルシウムトランスフェクション、DEAE−デキストラン介在トランスフェクション、または電気穿孔法により行うことができる（Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology,（1986））。
宿主細胞中の構築物は、通常のやり方で組換え配列によりコードされた遺伝子生成物を産生するために使用することができる。あるいはまた、本発明の酵素は通常のペプチド合成により合成的に生成することができる。
成熟タンパク質は適切なプロモーターの制御により、哺乳動物、酵母、細菌、または他の細胞中で発現することができる。無細胞翻訳系はまた、本発明のＤＮＡ構築物から導入したＲＮＡを使い、かかるタンパク質を産生するために用いることができる。原核および真核宿主と共に使う適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y.,（1989）により記載されており、この開示は本明細書に参照として組込まれる。
高等な真核細胞により本発明の酵素をコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより促進される。エンハンサーはＤＮＡのcis−作用性エレメントで、通常、約10から300bpであり、プロモーターに作用して転写を促進する。例としては、複製起点bp100から270の後記側（late side）にあるSV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複写起点の後記側にあるポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。
通常、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択可能な標識、例えば大腸菌（E. coli）のアンピシリン耐性遺伝子およびＳ・セレビジア（S.cerevisiae）TRP1遺伝子を含み、また下流構造配列の直接転写を指揮する高度に発現した遺伝子から導入したプロモーターを含む。かかるプロモーターはとりわけ、３−ホスホングリセラートキナーゼ（PGK）のごとき解糖酵素、α−因子、酸ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから誘導することができる。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列、および好ましくは、翻訳酵素の分泌の指揮を可能とするリーダー配列により適切な読み枠で組立てられる。最適には、異種配列は所望の特性、例えば発現された組換え産物の安定化または精製の容易性を付与するＮ−末端同定ペプチドを含む融合酵素をコードすることができる。
細菌用途に有用な発現ベクターは、機能的プロモーターを持つ作動可能な読取り相に、所望のタンパク質と一緒に適切な翻訳開始および終結スグナルをコードする構造ＤＮＡ配列を挿入することにより構築される。このベクターは一つ以上の表現型選択可能標識と複製起点を含んで、ベクターの維持を確実にし、所望により宿主内で増殖をもたらす。形質転換のための適切な原核宿主は大腸菌（E. coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurim）、および、シュードモナス（Pseudomonas）、ストレプトミセス（Streptomyces）およびスタフィロコッカス（Staphylococcus）属内の様々な種を含み、その他にもまた選択の問題として使用することができる。
代表的な、しかし非限定的な例として、細菌用に有用な発現ベクターは、周知のクローニングベクターpBR322（ATCC 37017）の遺伝子エレメントを有する市販のプラスミドから導入される選択可能な標識および細菌複製起点を含むことができる。かかる市販のベクターは例えば、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）およびGEM1（Promega Biotec, Madison, WI, USA）を含む。これらのpBR322「骨格」部は適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配列と組合わせられている。
適切な宿主株を形質転換し宿主株を適切な細胞密度まで増殖させた後で、選択されたプロモーターは適切な手段（例えば、温度シフトまたは化学誘導）により誘導され、細胞はさらに培養される。
細胞は典型的には遠心分離により回収され、物理的または化学的手段により破壊され、そして生じた粗抽出物は更なる精製のため保持される。
タンパク質発現に使われた微生物細胞は、凍結融解サイクリング、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含むいずれかの便宜的な方法により破壊することができ、かかる方法は当業者にとって周知である。
様々な哺乳動物細胞培養系もまた組換えタンパク質の発現に使用することができる。哺乳動物発現系の例は、Gluzman, Cell, 23:175（1981）に記載されたサル腎繊維芽細胞COS-7系、および適合ベクターを発現することができる他の細胞系、例えば、C127、3T3、CHO、HelaおよびBHK細胞系を含む。哺乳動物発現ベクターは複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、さらに必要とされるあらゆるリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、転写終結配列、および５′フランキング非転写配列も含む。SV40スプライスから誘導されるＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位は必要な非転写遺伝子エレメントを与えるために使うことができる。
酵素は組換え細胞培養物から、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーと、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む方法により回収、精製することができる。必要であれば、成熟タンパク質の立体配置を完成するためにタンパク質再生（protein refolding）工程を使うことができる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を最終精製工程で使うことができる。
本発明の酵素は天然精製産物、または化学的合成方法の生成物であるか、また組換え技術により原核または真核宿主から（例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞により培養において）産生されてもよい。組換え産生方法で使われた宿主に応じて、本発明の酵素はグリコシル化されてもよいし、またはグリコシル化されていなくてもよい。本発明の酵素はまた、最初のメチオニンアミノ残基を含んでいてもよいし、または含んでいなくてもよい。
酵素、その断片または他の誘導体、またはその類似体、またはそれらを発現する細胞はこれらに対して抗体を産生する免疫抗原として使うことができる。これらの抗体は例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明はまた、キメラ、一本鎖、およびヒト化抗体、およびFab断片またはFab発現ライブラリーの産生物を含む。当業で周知の様々な方法をかかる抗体と断片の産生に使うことができる。
本発明の配列に対応する酵素に対する抗体は、該酵素の動物への直接注射により、または該酵素を動物、好ましくは非ヒト動物に投与することにより得ることができる。そうして得た抗体はその後、酵素自身と結合する。このやり方で、酵素の断片のみをコードする配列であっても、元来の酵素全体と結合する抗体を作製するために使うことができる。かかる抗体はその後、酵素を発現する細胞から酵素を単離するために使うことができる。
モノクローナル抗体を調製する場合には、連続細胞系培養物から産生する抗体を与える技術のいずれかを使うことができる。この例にはハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497）、トリオーマ（trioma）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら, 1983, Immunology Today 4:72）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Coleら, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）を含む。
一本鎖抗体の作製のために記載されている技術（米国特許第4,946,778号）は本発明の免疫抗原酵素産物に対する一本鎖抗体を産生するために適用することができる。また、トランスジェニックマウスを本発明の免疫抗原酵素の産生物に対するヒト化抗体を発現するために使うことができる。
本発明の酵素に対する抗体を他の生物およびサンプルからの同様な酵素のスクリーニングに使うことができる。かかるスクリーニング技術は当業では周知であり、例えば、かかるスクリーニングアッセイの一つは“Methods for Measuring Cellulase Activities”, Methods in Enzymology, Vol 160, pp.87-116に記載されており、その全文を本明細書中に参照として組み入れるものとする。抗体は、これまたは他の生物から発生した遺伝子ライブラリーをスクリーニングしてこれまたは交差反応活性を同定するためのプローブとして使うことができる。
本明細書で使われる用語「抗体」は、アミダーゼポリペプチドのエピトープと結合する能力のある無傷の免疫グロブリン分子並びにFab、Fab’、（Fab’）₂、Fv、およびSCA断片のごとき免疫グロブリン分子の断片を意味する。抗体を誘導する抗原（例えばアミダーゼ抗原）に選択的に結合するなんらかの能力を保持するこれらの抗体断片は、当業で周知の方法を用いて作製することができ（例えばHarlow and Lane, 前掲を参照）、以下においてさらに詳細に記載される。
（１） Fab断片は、抗体分子の一価の抗原結合断片からなり、抗体分子全体の酵素パパインによる消化により作製することができ、無傷の軽鎖と重鎖の部分とからなる断片を生じる。
（２）抗原分子のFab’断片は、抗体分子全体をペプシンにより処理し、その後還元して得ることができ、無傷の軽鎖と重鎖の部分とからなる分子を生じる。このやり方で処理した抗体1分子当り2個のFab’断片が得られる。
（３）抗体の（Fab’）₂断片は、抗体分子全体を酵素ペプシンで処理し、その後還元を行わずに得ることができる。（Fab’）₂断片は2個のFab’断片の二量体であり、2個のジスルフィド結合によりお互いに結ばれている。
（４） Fv断片は、2本の鎖として発現された軽鎖の可変部位と重鎖の可変部位を含む遺伝子工学的に操作された断片として定義される。
（５）一本鎖抗体（「SCA」）は、適切で柔軟なポリペプチドリンカーにより結合された軽鎖の可変部位と重鎖の可変部位を含む遺伝子工学的に操作された一本鎖分子である。
この発明で使われる用語「エピトープ」は、アミダーゼ−特異抗体のごとき抗体のパラトープが結合するアミダーゼポリペプチドのごとき抗原上の抗原決定基を意味する。抗原決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖のごとき分子の化学的に活性な表面グルーピング（grouping）からなり、特異的三次元構造特性および特異的電荷特性を有することができる。
本発明は更に以下の実施例を参照して記述される；しかし、本発明はこれらの実施例により制限されるものでないことは理解されるべきである。他に記載がなければ、全ての部または量は重量基準である。
以下の実施例の理解を容易にするために、いくつかのしばしば現れる方法および／または用語を記載する。
「プラスミド」は以下の事例では、先行するpおよび／または後続の大文字および／または数字で表される。本明細書の出発プラスミドは、市販されているか、または無制限に一般に利用可能なものであるか、あるいは入手可能なプラスミドから公表された手法により構築することができる。更に、記載されたものと等価のプラスミドは当業で周知であり通常の当業技術者であれば明らかである。
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中のある特定の配列にのみ作用する制限酵素によるＤＮＡの触媒的開裂を意味する。本明細書で使われる様々な制限酵素は市販されており、それらの反応条件、補因子および他の要件は通常の技術者に知られているものを使った。分析目的の場合には、典型的には1μgのプラスミドまたはＤＮＡ断片を20μ1の緩衝液中の約２単位の酵素と共に使った。プラスミド構築のためのＤＮＡ断片単離の目的の場合には、典型的にはより大容量で5〜50μgのＤＮＡを20〜250単位の酵素により消化した。特定の制限酵素に対する適切な緩衝液および基質の量は製造業者により明示されている。37℃で約1時間のインキュベーション時間を通常使用するが、供給元の説明書に従って変化させてもよい。消化の後、反応物は直接ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動して所望の断片を単離する。
切断断片のサイズ分離はGoeddel, D.ら, Nucleic Acids Res., 8:4057（1980）に記載された8%ポリアクリルアミドゲルを使い実施した。
「オリゴヌクレオチド」は、化学的に合成し得る一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは2本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を意味する。このような合成オリゴヌクレオチドは５′リン酸を有していてもよいし、または有して否か打てもよい。有しないものは、キナーゼの存在下でＡＴＰと共にホスフェートを加えなければ他のオリゴヌクレオチドに連結しないであろう。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されてない断片に連結するであろう。
「連結反応（ligation）」は2本の二重鎖核酸断片の間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを意味する（Maniatisら, Id., p.146）。他に条件が与えられなければ、連結反応は公知の緩衝液と条件を用いて、連結すべきＤＮＡ断片のおよそ等モル量の0.5μg当り、10単位のT4 ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を使って実施した。
他に記載されない限り、形質変換はSambrook, Fritsch and Maniatus, 1989の方法に記載されたごとく実施した。
実施例１
細菌発現とアミダーゼの精製
テルモコッカス（Thermococcus）GU5L5遺伝子ライブラリーをアミダーゼ活性に対して実施例２に記載した通りスクリーニングして、ｓ陽性クローンを同定し単離した。このクローンのＤＮＡを次のプライマー配列を使う100μl PCR反応液中で、テンプレートとして使用した：

タンパク質を大腸菌（E. coli）中で発現した。その遺伝子をPCRを使い上記プライマーにより増幅した。
増幅の後、PCR産物をpQET1のEcoRIおよびBamHI部位にクローニングし、電気穿孔法により大腸菌（E. coli）M15（pREP4）中に形質転換した。得られた形質転換体を3ml培地で増殖させ、この培養の一部分を誘導した。誘導しないおよび誘導した培養の一部分をZ-L-Phe-AMC（以下参照）を使いアッセイした。
上記のプライマー配列はまた、標的遺伝子を沈積物（deposit material）から上記のハイブリダイゼーション技術により単離するために使うことができる。
実施例２
テルモコッカス（Thermococcus）GU5L5からのアミダーゼの発見
発現ジーンバンクの作製
生物テルモコッカス（Thermococcus）GU5L5由来のランダム挿入物を有するpBluescriptプラスミドを含有するコロニーをHayおよびSortの方法（Hay, B. and Short, J. Strategies. 1992, 5, 16.）によって得た。生じたコロニーを滅菌楊子で拾い、これを使って96ウエルマイクロタイタープレートのそれぞれに単独接種した。ウエルは100μg/mLアンピシリン、80μg/mLメチシリン、および10%v/vグリセロール（LB AMP/Meth、グリセロール）による250μLのLB培地を含有していた。細胞を37℃で一夜攪拌せずに増殖した。これにより「ソースジーンバンク（SourceGeneBank）」が作製された；この様にソースジーンバンクの各ウエルは、それぞれユニークなＤＮＡが挿入されたpBluescriptプラスミドを含有する大腸菌（E. coli）細胞のストック培養物を含有した。
アミダーゼ活性のスクリーニング
ソースジーンバンクのプレートを使って、各ウエルに200μLのLB AMP/Meth、グリセロールを含有する単一プレート（「濃厚プレート」）を多重接種した。この工程は、各接種間に1%ブリーチ、水、イソプロパノール、空気乾燥滅菌サイクルを行うBeckman Biomekの高密度複製ツール（HDRT）で実施した。この様にして、濃厚プレートはそれぞれのソースジーンバンクからの10〜12個ｓの異なるpBluescriptクローンを含有した。濃厚プレートを16時間、37℃で増殖し、その後これを使い、各ウエルに250μのLB AMP/Meth（グリセロールなし）を含有する2枚の白色96ウエルPolyfiltronicsマイクロタイター娘プレートを接種した。元の濃厚プレートは、-80℃で貯蔵した。2つの濃厚娘プレートを37℃で18時間インキュベーションした。
「600μM基質ストック溶液」を次の通り調製した：25mgのＮ−モルホウレア−Ｌ−フェニルアラニル−７−アミド−４−トリフルオロメチルクマリン（Mu-Phe-AFC, Enzye Systems Products, Dublin, CA）を適切な容量のDMSOに溶解して25.2mM溶液を作った。250μLのDMSO溶液を0.6mg/mLのドデシルマルトシドを含む50mM（pH7.5）Hepes緩衝液約9mLに加えた。その容量を上記Hepes緩衝液で10.5mLにして曇った溶液を得た。
Mu-Phe-AFC
50μLの「600μM基質貯蔵溶液」を白色濃厚プレートのウエルのそれぞれにBiomekを使って加え、約100μMの基質の最終濃度とした。基質の添加直後にプレート読取り蛍光計で蛍光発光値を記録した（励起＝400nm、放出＝505nm）。プレートを70℃で60分間インキュベーションし、蛍光発光値を再び記録した。初期と最後の蛍光値を差引いて、蛍光発光の増加が大多数の他のウエルについてみられるかどうかにより活性クローンが存在するかどうかを調べた。
活性クローンの単離
活性を有する個々のクローンを単離する目的で、ソースジーンバンクプレートを解凍し、個々のウエルを使いてLB AMP/Methを含有する新しいプレートに単独接種した。上記のごとく、プレートを37℃で接種し、細胞を増殖し、50μlの600μM基質ストック溶液をBiomekを使って加えた。ソースプレートから活性ウエルを同定すれば、ソースプレートからの細胞を使いLB AMP/Methの3mL培地に接種、一夜増殖した。プラスミドＤＮＡを培養から単離し、発現サブクローンの配列決定と構築に使った。
実施例３
テルモコッカス（Thermococcus）GU5L5アミダーゼの特性決定
基質特異性
次の基質（略語の定義は下記を参照）：CBZ-L-ala-AMC、CBZ-L-arg-AMC、CBZ-L-met-AMC、CBZ-L-phe-AMC、および７−メチル−ウンベリフェリルヘプタノアートを使い、100μｍで1時間70℃で、クローン発見の節で記載したアッセイで、化合物CBZ-L-arg-AMC：CBZ-L-phe-AMC：CBZ-L-met-AMC：CBZ-L-ala-AMC：７−メチル−ウンベリフェリルヘプタノアートに対するアミダーゼの相対活性はそれぞれ3：3：1：＜0.1：＜0.1であった。励起および放出波長は７−アミド−４−メチルクマリンに対して各380および460nM、メチルウンベリフェロンに対して326および450であった。
略語は次の化合物に対して使用した。
CBZ-L-ala-AMC＝Ｎα−カルボニルベンジルオキシ−Ｌ−アラニン−７−アミド−４−メチルクマリン
CBZ-L-arg-AMC＝Ｎα−カルボニルベンジルオキシ−Ｌ−アルギニン−７−アミド−４−メチルクマリン
CBZ-D-arg-AMC＝Ｎα−カルボニルベンジルオキシ−Ｄ−アルギニン−７−アミド−４−メチルクマリン
CBZ-L-met-AMC＝Ｎα−カルボニルベンジルオキシ−Ｌ−メチオニン−７−アミド−４−メチルクマリン
CBZ-L-phe-AMC＝Ｎα−カルボニルベンジルオキシ−Ｌ−フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン
有機溶媒感度
ジメチルスルホキシド（DMSO）の濃度を増加してアミダーゼ活性を次の通り試驗した：マイクロタイタープレートの各ウエルにDMSO中の3mM CBZ-L-phe-AMC溶液10μL、アミダーゼ活性を有する細胞溶解液25μL、およびDMSO：pH7.5、50mM Hepes緩衝液の各種混合物250μLを加えた。反応物を1時間、70℃で加熱し、その蛍光発光を測定した。図２は蛍発光vs DMSO濃度を示す。黒い四角および白い四角は個々のアッセイを表す。
ジメチルホルムアミド（DMF）を増加してアミダーゼの活性とエナンチオ選択性を次の通り試験した：マイクロタイタープレートの各ウエルにDMF中1mM CBZ-L-arg-AMCまたはCBZ-D-arg-AMC溶液30μL、アミダーゼ活性を有する細胞1溶解液30μL、およびDMF：pH7.5、50mM Hepes緩衝液の各種混合物240μLを加えた。反応物を室温で1時間インキュベーションし、蛍光発光を1分間隔で測定した。図３は、より反応性の高いCBZ-L-arg-AMCに対しての相対初期直線速度（1分当りの蛍光発光の増加、すなわち「活性」）vs DMF濃度を示す。
LおよびＤ CBZ-D-arg-AMC基質の初期線形速度（「活性」）を以下の表１および表２に示す。

上記のデータは、この酵素が誘導体化されたアミノ酸基質のL体、または「天然」エナンチオマーに対して優れた選択性を表すことを示す。
以上の教示に照らして本発明の数多くの修正と改変が可能であり、従って添付した請求の範囲内で本発明は特に記載した以外の他のやり方で実施することができる。
配列表
配列番号：１：
(i)配列の特色：
(A)配列の長さ：１８６９ヌクレオチド
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ＤＮＡ
(xi)配列：

配列番号：２：
(i)配列の特色：
(A)配列の長さ：６２２アミノ酸
(B)配列の型：アミノ酸
(C)鎖の数：
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：タンパク質
(xi)配列：

配列番号：３：
(i)配列の特色：
(A)配列の長さ：５０ヌクレオチド
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：オリゴヌクレオチド
(xi)配列：

配列番号：４：
(i)配列の特色：
(A)配列の長さ：３３ヌクレオチド
(B)配列の型：核酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：オリゴヌクレオチド
(xi)配列：

Claims

下記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される、ポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜622を含む酵素をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１のヌクレオチド１〜1869に示す配列を含む前記（ａ）のポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１に示す核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、かつアミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）ＴがＵであってもよい前記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチド；
（ｇ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリヌクレオチドに対してその配列が相補的なポリヌクレオチド；および
（ｈ）配列番号１に示す核酸配列に、45℃で0.9M NaCl、50mM NaH₂PO₄、pH7.0、5.0mM Na₂EDTA、0.5％ SDS、10×デンハルツ試薬および0.5mg/mLポリリボアデニル酸を含む溶液中でハイブリダイスし、続いて30分間室温で0.5%SDSを含有する1×SET（150mM NaCl、20mMトリス塩酸、pH7.8、1mM Na ₂ EDTA）で洗浄し、その後、30分間、新しい1×SET中でTm-10℃で洗浄することを含むハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列を含み、かつアミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
前記（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに融合する付加的アミノ酸をコードする配列をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、当該付加的アミノ酸はリーダー配列、分泌アミノ酸配列、またはプロ配列を含む、前記ポリヌクレオチド。
配列番号１に示す核酸配列に対して95％の配列同一性を有する配列を含み、かつアミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
前記アミダーゼ活性が、ペプチドのＮ末端からアルギニン、フェニルアラニン、またはメチオニンを除去する活性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
単離または組換えまたは合成ポリヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
原核生物から単離されたものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
発現ベクターである、請求項７に記載のベクター。
クローニングベクターである、請求項７に記載のベクター。
プラスミドである、請求項７〜９のいずれか１項に記載のベクター。
ファージ由来である、請求項７〜９のいずれか１項に記載のベクター。
ウイルス由来である、請求項７〜９のいずれか１項に記載のベクター。
請求項７〜12のいずれか１項に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
原核細胞である、請求項13に記載の宿主細胞。
動物細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、酵母細胞および細菌細胞からなる群より選択される細胞である、請求項13記載の宿主細胞。
アデノウイルス、枯草菌（Bacillus subtilis）またはストレプトミセス（Streptomyces）である、請求項13に記載の宿主細胞。
細菌細胞が大腸菌（E. coli）である、請求項15に記載の宿主細胞。
真菌細胞が酵母細胞である、請求項15に記載の宿主細胞。
昆虫細胞が、ショウジョウバエS2またはスポドプテラSf9である、請求項15に記載の宿主細胞。
動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、COS細胞、またはボウズ（Bowes）黒色腫細胞である、請求項15に記載の宿主細胞。
下記（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される、ポリペプチド：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
（ｃ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアミダーゼ活性を有するポリペプチド；および
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するポリペプチド。
配列番号２に示すアミノ酸配列に対して95％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつアミダーゼ活性を有する、請求項21に記載のポリペプチド。
前記アミダーゼ活性が、ペプチドのＮ末端からアルギニン、フェニルアラニン、またはメチオニンを除去する活性である、請求項21または22に記載のポリペプチド。
単離または組換えまたは合成ポリペプチドである、請求項21〜23のいずれか１項に記載のポリペプチド。
配列番号２に示すアミノ酸配列を有する元来の酵素全体と結合する抗体を作成するために用いる、請求項21〜24のいずれか１項に記載のポリペプチド。
請求項21〜25のいずれか１項に記載のポリペプチドに結合する抗体。
ポリクローナルである、請求項26に記載の抗体。
モノクローナルである、請求項26に記載の抗体。
配列番号２に示すアミノ酸配列由来の、請求項13〜20のいずれか１項に記載の宿主細胞中で発現される単離または組換えアミダーゼポリペプチド。
請求項13〜20のいずれか１項に記載の宿主細胞中で発現されうる配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする単離または組換えポリヌクレオチド。
ポリペプチドを製造する方法であって、請求項21〜25のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが発現される条件下で、請求項13〜20のいずれか１項に記載の宿主細胞を増殖させ、そして該ポリペプチドを単離することを含み、但し該ポリペプチドがアミダーゼ活性を有する酵素である、前記方法。
請求項７〜12いずれか１項に記載のベクターで細胞を形質転換またはトランスフェクトして、該細胞が該ベクターに含まれる請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現するようにすることを含んでなる、組換え細胞の製造方法。
ペプチドまたはペプチドミメティック合成においてペプチドのＮ末端からアルギニン、フェニルアラニンまたはメチオニンを除去する方法であって、ペプチドまたはペプチドミメティック合成においてペプチドのＮ末端からアルギニン、フェニルアラニンまたはメチオニンを除去するのに有効な量の請求項21〜25および29のいずれか１項に記載のポリペプチドを投与することを含む、前記方法。