JPH099977A - ラクト−ｎ−ビオシダーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するポ
リペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を有する
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する単離され
た遺伝子、該遺伝子を含んでなる組換えＤＮＡ、該組換
えＤＮＡを挿入されてなる発現ベクター、該発現ベクタ
ーにより形質転換されてなる形質転換体、ラクト−Ｎ−
ビオシダーゼ活性を有するポリペプチド又はその活性と
機能的に同等の活性を有するポリペプチドの製造方法。 【効果】本発明によりラクト−Ｎ−ビオシダーゼのアミ
ノ酸配列及び塩基配列が初めて明らかとなり、これによ
りラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するポリペプチド
又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチ
ドの工業的に有利な遺伝子工学的製造方法が提供され
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はラクト−Ｎ−ビオシ
ダーゼ活性を有するポリペプチド又はその活性と機能的
に同等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝
子、及び該遺伝子を用いるラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活
性を有するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の
活性を有するポリペプチドの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、動物細胞の表層に存在する糖蛋白
質や糖脂質等の、いわゆる複合糖質と呼ばれる分子の糖
鎖部分が持つ様々な生理機能が注目されている。糖鎖の
構造及びその生物活性を解明してゆく上で、特異性の高
い糖質分解酵素は非常に有用な研究手段となっている。
糖蛋白質のＮ−結合型糖鎖やＯ−結合型糖鎖、あるいは
糖脂質の糖鎖中には、しばしば１型構造 (Gal β1-3Glc
NAc β1-) や２型構造 (Gal β1-4GlcNAc β1-) が見い
だされる。これらの糖鎖構造の解析にはラクト−Ｎ−ビ
オシダーゼが極めて有用な試薬として用いられている。
ラクト−Ｎ−ビオシダーゼが１型糖鎖に特異的に作用し
て、その糖鎖の非還元末端からラクト−Ｎ−ビオース
(Gal β1-3GlcNAc)を遊離するからである。

【０００３】ラクト−Ｎ−ビオシダーゼとしては、スト
レプトマイセス (Streptomyces) 由来のもの [プロシー
ディングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンシーズ オブ ザ USA (Proceedings of th
e National Academy of Sciences of the USA 、第89
巻、第8512−8516頁 (1992) 、ジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー (Journal of Biological Ch
emistry)、第 268巻、第18560-18566頁 (1993)]が知ら
れている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ラクト
−Ｎ−ビオシダーゼを産生するストレプトマイセス属放
線菌を培養してラクト−Ｎ−ビオシダーゼを生産する方
法は、同時にプロテアーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニダーゼ、α-1,3/4- フコシダーゼなどの酵素が産生
されるため、目的のラクト−Ｎ−ビオシダーゼを単離す
るには、極めて厄介なこれらの酵素との分離精製が必要
となる。また、酵素の生産を誘導するために培養時に培
地に L- フコース或いは豚胃ムチン等を添加する必要も
ある。従って、より安価に高純度なラクト−Ｎ−ビオシ
ダーゼを製造する方法が求められている。従来、ラクト
−Ｎ−ビオシダーゼをストレプトマイセス属放線菌から
精製する方法は知られている（特開平６−１５３９４４
号公報）が、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼのアミノ酸配列
や遺伝子構造は全く知られておらず、ラクト−Ｎ−ビオ
シダーゼを遺伝子工学的に製造する方法についても知ら
れていない。

【０００５】従って、本発明の第１の目的は、ラクト−
Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するポリペプチド又はその活
性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコード
する遺伝子を提供することにある。本発明の第２の目的
は、該遺伝子を含んでなる組換えＤＮＡを提供すること
にある。本発明の第３の目的は、該組換えＤＮＡを挿入
されてなる発現ベクターを提供することにある。本発明
の第４の目的は、該発現ベクターにより形質転換されて
なる形質転換体を提供することにある。本発明の第５の
目的は、該遺伝子を用いてラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活
性を有するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の
活性を有するポリペプチドを工業的に有利に製造する方
法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】一般に、放線菌の遺伝子
はＧＣ含量が高いため、目的の遺伝子を取り出すことは
極めて困難であることが知られている。事実、放線菌の
遺伝子でその塩基配列が確定されたものは、細菌等に比
べて著しく少ない。しかし、本発明者らは、ラクト−Ｎ
−ビオシダーゼのアミノ酸配列及び塩基配列を明らかに
するため、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼを産生する放線菌
（Streptomyces sp142）のラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺
伝子について鋭意研究を進めた結果、遂にその全塩基配
列を確定すると共に、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼのアミ
ノ酸配列を初めて明らかにすることに成功した。さら
に、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子を用いてラクト−
Ｎ−ビオシダーゼを工業的に有利に生産する方法をも開
発することに成功した。本発明はかかる事実に基づいて
完成するに至ったものである。

【０００７】即ち、本発明の要旨は、（１） ラクト−
Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するポリペプチド又はその活
性と機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡ配列を有する単離された遺伝子、（２） ポ
リペプチドがストレプトマイセス属由来のものである前
記（１）記載の遺伝子、（３） 配列表の配列番号：１
に記載したアミノ酸配列をコードすることを特徴とする
前記（１）又は（２）記載の遺伝子、（４） アミノ酸
配列をコードするＤＮＡが、配列番号：２に記載したＤ
ＮＡ配列を有することを特徴とする前記（３）記載の遺
伝子、（５） 配列番号：１に記載したアミノ酸配列の
一部を含むラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するポリ
ペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポ
リペプチドをコードする遺伝子、（６） 配列番号：２
に記載したＤＮＡ配列の一部を含む遺伝子であって、か
つラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するポリペプチド
又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチ
ドをコードする遺伝子、（７） 配列表の配列番号：１
に記載したアミノ酸配列に、１個もしくは複数のアミノ
酸残基が欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１
つがされており、かつラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を
有するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（８） 前
記（１）〜（７）いずれか記載の遺伝子とハイブリダイ
ズすることができる、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を
有するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（９） 前
記（１）〜（８）いずれか記載の遺伝子を含んでなる組
換えＤＮＡ、（１０） 前記（９）記載の組換えＤＮＡ
を挿入されてなる、微生物、動物細胞又は植物細胞を宿
主細胞とする発現ベクター、（１１） 前記（１０）記
載の発現ベクターにより形質転換されてなる形質転換
体、並びに（１２） 前記（１）〜（８）いずれか記載
の遺伝子を含むポリヌクレオチドを挿入した発現ベクタ
ーを導入して得られる形質転換体を培養し、該培養物よ
りラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するポリペプチド
又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチ
ドを採取することを特徴とする、ラクト−Ｎ−ビオシダ
ーゼ活性を有するポリペプチド又はその活性と機能的に
同等の活性を有するポリペプチドの製造方法、に関す
る。

【０００８】

【発明の実施の形態】本明細書において、ラクト−Ｎ−
ビオシダーゼとは、Gal β1-3GlcNAc β1-Ｒ（Ｒは糖残
基を示す）で表される糖鎖に作用してラクト−Ｎ−ビオ
シド結合のみを加水分解する酵素をいい、プロシーディ
ングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サ
イエンシーズ オブ ザ USA 、第89巻、第 8512-8516
頁 (1992) に記載の方法（具体的には後述の実施例２の
(5) に記載の方法）で測定した場合に１×１０^-7ミリユ
ニット以上の活性を示すものをラクト−Ｎ−ビオシダー
ゼ活性を有するものと判定する。また、ラクト−Ｎ−ビ
オシダーゼ活性を有するポリペプチドとは、天然型のラ
クト−Ｎ−ビオシダーゼのみならず、ラクト−Ｎ−ビオ
シダーゼ活性を有する限り天然型のアミノ酸配列におい
てアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加等によりアミノ酸
配列が改変されたポリペプチドをも本発明に含む意味で
ある。また、ここで言う天然型ラクト−Ｎ−ビオシダー
ゼとしては、例えばストレプトマイセス属放線菌由来の
ものが挙げられるが、本発明においてはこれに限定され
るものではなく、その他の放線菌類はもちろん、細菌
類、酵母類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物
由来のもの、あるいは植物、動物等の生物体由来のもの
も含まれる。

【０００９】本明細書において、機能的に同等の活性を
有するポリペプチドとは、以下のようなものをいう。天
然に存在するタンパク質にはそれをコードする遺伝子の
多形や変異の他に、生成後のタンパク質の生体内および
精製中の修飾反応などによって、そのアミノ酸配列中に
アミノ酸残基の欠失、付加、挿入、置換等の変異が起こ
りうるが、それにも関わらず変異を有しないタンパク質
と実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがある
ことが知られている。このように構造的に差異があって
も、その機能については大きな違いが認められないもの
を機能的に同等の活性を有するポリペプチドと呼ぶ。

【００１０】人為的にタンパク質のアミノ酸配列に上記
のような変異を導入した場合でも同様であり、この場合
はさらに多種多様の変異体を作製することが可能である
が、変異を有しないものと実質的に同等の生理活性を示
す限り、これらの変異体は機能的に同等の活性を有する
ポリペプチドと解釈される。例えば、大腸菌で発現され
たタンパク質のＮ末端に存在するメチオニン残基は、多
くの場合、メチオニンアミノペプチダーゼの作用により
除去されるとされているが、タンパク質の種類によって
はメチオニン残基を持つもの、持たないものの両方が生
成される。しかしながら、このメチオニン残基の有無は
タンパク質の活性には影響を与えない場合が多い。ま
た、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配
列中の、あるシステイン残基をセリンに置換したポリペ
プチドがインターロイキン２活性を保持することが知ら
れている［サイエンス（Science)、第２２４巻、１４３
１頁（１９８４）］。

【００１１】さらに、遺伝子工学的にタンパク質の生産
を行う際には、融合タンパク質として発現させることが
しばしば行われる。例えば、目的のタンパク質の発現量
を増加させるために、目的のタンパク質のＮ末端に他の
タンパク質由来のＮ末端ペプチド鎖を付加したり、目的
タンパク質のＮ末端、あるいはＣ末端に適当なペプチド
鎖を付加して発現させ、この付加したペプチド鎖に親和
性を持つ担体を使用することにより、目的タンパク質の
精製を容易にすることなどが行われている。また、遺伝
子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合
わせ）は、アミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在
することが知られている。したがって、アミノ酸配列を
コードする遺伝子はそのアミノ酸配列にもよるが、多数
存在することができる。遺伝子は自然界において決して
安定に存在しているものではなく、その核酸に変異が起
こることはまれではない。遺伝子上に起こった変異がコ
ードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイ
レント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミ
ノ酸配列をコードする異なる遺伝子が生じたといえる。
したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする遺伝
子が単離されても、それを含有する生物が継代されてい
くうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子
ができていく可能性は否定できない。

【００１２】さらに、同じアミノ酸配列をコードする多
種類の遺伝子を人為的に作製することは、種々の遺伝子
工学的手法を用いれば困難なことではない。例えば、遺
伝子工学的なタンパク質生産において、目的のタンパク
質をコードする本来の遺伝子上で使用されているコドン
が、使用している宿主中では使用頻度の低いものであっ
た場合、タンパク質の発現量が低いことがある。このよ
うな場合には、コードされているアミノ酸配列に変化を
与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに
人為的に変換することにより、目的のタンパク質の高発
現を図ることが行われている。このように特定のアミノ
酸配列をコードする遺伝子を、人為的に多種類作製する
ことが可能なことは言うまでもない。したがって、これ
らの人為的に作製された異なるポリヌクレオチドであっ
ても、本発明に開示されたアミノ酸配列がコードされて
いる限り、本発明に包含されるものである。さらに、目
的のタンパク質のアミノ酸配列に１個もしくは複数個の
アミノ酸残基を欠失、付加、挿入、もしくは置換の少な
くとも１つを行ったポリペプチドも目的のタンパク質と
機能的に同等の活性を有する場合が少なくないが、この
ようなポリペプチドをコードする遺伝子も、天然由来の
単離されたものであれ人為的に作製されたものであれ、
本発明に包含される。一般に、機能的に同等の活性を有
するポリペプチドは、それをコードする遺伝子が相同性
を有することが多い。したがって、本発明に用いる遺伝
子とハイブリダイズすることができ、ラクト−Ｎ−ビオ
シダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子
も本発明に含まれる。

【００１３】以下にストレプトマイセス sp142に由来す
るラクト−Ｎ−ビオシダーゼを例として本発明を詳細に
説明する。この菌株は、Streptomyces sp142と表示さ
れ、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に、
FERM BP-4569として寄託されている。

【００１４】まず、プロシーディングス オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ
ザ USA 、第89巻、第 8512-8516頁 (1992) に記載の
方法に従って、ストレプトマイセス sp142を培養し、つ
いでその培養液から、例えばジャーナル オブ バイオ
ロジカル ケミストリー、第 268巻、第 18560-18566頁
(1993) に記載の方法で、ストレプトマイセス sp142の
産生したラクト−Ｎ−ビオシダーゼを単離精製する。

【００１５】次に、精製されたラクト−Ｎ−ビオシダ
ーゼについて、その部分アミノ酸配列に関する情報を得
る。部分アミノ酸配列を決定するには、例えば精製ラク
ト−Ｎ−ビオシダーゼを直接常法に従ってエドマン分解
法によるアミノ酸配列分析（プロテインシーケンサ４７
６Ａ、アプライド バイオシステムズ社製）に供するこ
とにより、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼのＮ末端アミノ酸
配列の１０〜２０残基を決定する。あるいは、特異性の
高い蛋白質加水分解酵素、例えばアクロモバクター(Ach
romobacter) プロテアーゼＩ、Ｎ−トシル−Ｌ−フェ
ニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）−トリプ
シン等を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプ
チド断片を逆相系 HPLC を用いて分離精製した後、精製
ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが効果
的である。

【００１６】こうして得られる部分アミノ酸配列の情
報をもとにラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子をクローニ
ングする。そのためには、一般的に用いられる PCR法あ
るいはハイブリダイゼーション法を利用する。 ａ）部分アミノ酸配列の情報をもとに、サザンハイブリ
ダイゼーション用のプローブとして合成オリゴヌクレオ
チドをデザインする。 ｂ）一方、ストレプトマイセス sp142のゲノムＤＮＡを
適当な制限酵素で完全消化し、アガロースゲル電気泳動
で分離した後、常法に従いナイロン膜にブロッティング
する。 ｃ）分離されたＤＮＡ断片と、部分アミノ酸配列の情報
を基にデザインされた合成オリゴヌクレオチドとのハイ
ブリダイゼーションは、一般的に用いられる条件で行
う。例えば鮭精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーシ
ョン溶液中でナイロン膜をブロッキングし、³²P でラベ
ルした各合成オリゴヌクレオチドを加えて一晩保温す
る。このナイロン膜を洗浄した後、オートラジオグラフ
ィーをとって合成オリゴヌクレオチドプローブとハイブ
リダイズするＤＮＡ断片を検出する。検出されたバンド
に相当するＤＮＡ断片をゲルから抽出、精製する。

【００１７】ｄ）こうして得られた合成オリゴヌクレオ
チドプローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を通常用
いられる方法によってプラスミドベクターに組み込む。
プラスミドベクターとしては pUC18、pUC19 、pUC119、
pTV118N などが好適に使用できるが、特にこれらに限定
されるものではない。 ｅ）次いで組換えプラスミドを宿主に導入し、宿主を形
質転換するが、宿主として大腸菌を使用する場合、宿主
大腸菌としては形質転換能を有するものであれば野生
株、変異株何れも使用できる。導入の方法は通常用いら
れる方法、例えばモレキュラー クローニング ア ラ
ボラトリー マニュアル (Molecular Cloning, A Labor
atory Manual) [T. マニアティス (T. Maniatis)他著、
コールド スプリング ハーバー ラボラトリー社、19
82年発行] 第 250頁に記載の方法を用いることができ
る。

【００１８】ｆ）次に、目的のＤＮＡ断片を有する形質
転換体を選別する。そのためには、プラスミドベクター
の特性を利用する。例えば pUC19の場合、アンピシリン
を含むプレート上でアンピシリン耐性を有するコロニー
を、あるいはアンピシリン、５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド (X-Gal)及びイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド (IPTG)
を含むプレート上で、アンピシリン耐性を示しかつ白色
を呈するコロニーを選択することにより外来遺伝子を導
入されたコロニーを選別する。 ｇ）次に上記集団のなかから目的のＤＮＡ断片を含むベ
クターを有するコロニーを選択する。選択の方法はベク
ターの種類によってコロニーハイブリダイゼーション、
プラークハイブリダイゼーションを適宜用いる。また、
PCR 法を用いることもできる。

【００１９】ｈ）目的のＤＮＡ断片を含むベクターが選
別できればこのベクターに挿入されている目的のＤＮＡ
断片の塩基配列を通常の方法、例えばジデオキシチェー
ンターミネーター法〔プロシーディングス オブ ザ
ナショナル アカデミー オブサイエンシーズ オブ
ザ ＵＳＡ、第７４巻、第５４６３頁（１９７７）〕に
より決定する。決定された塩基配列と、ラクト−Ｎ−ビ
オシダーゼのＮ末端分析、部分アミノ酸配列、分子量な
どと比較することによって目的のラクト−Ｎ−ビオシダ
ーゼ遺伝子の全部またはその一部であるか否かを決定す
る。こうして得られるラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子
を含むＤＮＡ断片からラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子
の構造およびラクト−Ｎ−ビオシダーゼの全アミノ酸配
列を決定する。 ｉ）目的のＤＮＡ断片を含むベクターがラクト−Ｎ−ビ
オシダーゼ遺伝子の全長を含まない場合は、得られたＤ
ＮＡ断片の一部をプローブとして用い、ストレプトマイ
セス sp142のゲノムＤＮＡを他の制限酵素で消化したも
のから同様にしてハイブリダイゼーション法等によって
欠損している部分を得た後、つなぎ合わせれば目的のラ
クト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子の全長を得ることができ
る。

【００２０】なお、放線菌ストレプトマイセスｓｐ１４
２由来のラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子のクローニン
グにおいては、以下に述べるような種々の方法を試みた
が、これらの方法では目的の遺伝子をクローニングする
ことができなかった。 １）カセットＤＮＡを用いるＰＣＲ法 この方法は、ストレプトマイセス ｓｐ１４２から常法
に従って抽出したゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化
した後、既知の配列を有する合成ＤＮＡ（カセットＤＮ
Ａ）を連結したものを鋳型として、部分アミノ酸配列の
情報をもとに常法に従ってデザインした合成オリゴヌク
レオチドプライマーとカセットＤＮＡに相補的な合成オ
リゴヌクレオチドプライマー（カセットプライマー）を
用いてＰＣＲ反応を行い目的のＤＮＡ断片を増幅するア
プローチである。

【００２１】カセットＤＮＡあるいはカセットプライマ
ーとしては、例えば宝酒造社製のものを利用することが
できる。カセットＤＮＡは２種類のカセットプライマー
に対応する配列を含んでおり、まず制限酵素サイトから
遠い方のプライマーを用いて１回目のＰＣＲ反応を行
い、その反応液の一部を鋳型として更に制限酵素サイト
に近い方のプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うと効果
的に目的のＤＮＡ断片を増幅することができることが知
られている。本発明者らはこの方法にしたがって本発明
の遺伝子の取得を試みた。まず、Ｎ末端配列ＬＮ−Ｎ２
（配列番号：３）から合成オリゴヌクレオチドプライマ
ーＬＮ−ＰＮ２−１（配列番号：４）及びＬＮ−ＰＮ２
−２（配列番号：５）を合成した。ストレプトマイセス
ｓｐ１４２から常法に従って抽出したゲノムＤＮＡを制
限酵素Ｓａｕ３ＡＩ、ＢｍａＨＩ、ＰｓｔＩ、及びＳａ
ｌＩで消化し、対応するカセットＤＮＡ（宝酒造社製）
をそれぞれ連結した。これを鋳型としてＬＮ−ＰＮ２−
１とＣ１プライマー（宝酒造社製）の組み合わせでＰＣ
Ｒ反応を行った。ＰＣＲはＰＣＲテクノロジー〔PCRTec
hnology、エルリッヒ ＨＡ (Erlich) 編集、ストック
トンプレス社、１９８９年発行〕に記載の方法に準じ
て、例えばパーキンエルマー・シータス・インスツルメ
ント社製、ジーンアンプリエージェントキット（Gene A
mp Reagent Kit)を用いて行った。９４℃：３０秒、５
５℃：２分、７２℃：２分のサイクルを３０サイクル行
い、この反応液の一部を用いてＬＮ−ＰＮ２−２とＣ２
プライマー（宝酒造社製）の組み合わせで同様の条件で
さらにＰＣＲ反応を行った。アガロースゲル電気泳動で
反応液を分析し、増幅したＤＮＡ断片について通常用い
られる方法で塩基配列を決定したが、合成ＤＮＡの配列
以外に目的の遺伝子と考えられる配列は見出すことがで
きなかった。

【００２２】２）カセットＤＮＡを用いるＰＣＲ法
（２’−デオキシ−７−デアザグアノシントリフォスフ
ェート（ｄｃ⁷ ＧＴＰ））を用いるアプローチ １）と同じ鋳型を用い、ＬＮ−ＰＮ２−１とＣ１プライ
マー（宝酒造社製）の組み合わせでＰＣＲ反応を行っ
た。ＰＣＲは、ジーンアンプリエージェントキットを用
いて、ｄＮＴＰと混合液の代わりにｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄｃ⁷ ＧＴＰの混合液を用い
て、９４℃：３０秒、５５℃：２分、７２℃：３分のサ
イクルを２５サイクルを行った。この反応液の一部を鋳
型としてＬＮ−ＰＮ２−２とＣ２プライマー（宝酒造社
製）の組み合わせで、今度は通常のｄＮＴＰ混合液を基
質として再度同じサイクルＰＣＲ反応を行った。アガロ
ースゲル電気泳動で反応液を分析し、増幅したＤＮＡ断
片について通常用いられる方法で塩基配列を決定した
が、合成ＤＮＡの配列以外に目的の遺伝子と考えられる
配列は見出すことができなかった。

【００２３】３）合成ＤＮＡハイブリダイゼーション法 アミノ酸配列の情報をもとに、常法に従って合成オリゴ
ヌクレオチドをデザインし、ハイブリダイゼーションに
よって目的のＤＮＡを検出する方法も一般的に用いられ
る。本発明者らはこの方法に従って本発明の遺伝子の検
出を試みた。サザンハイブリダイゼーション用のプロー
ブとして、Ｎ末端配列ＬＮ−Ｎ２（配列番号：３）から
合成したオリゴヌクレオチドＬＮ−ＰＮ２−２（配列番
号：５）およびＬＮ−ＰＮ２−３（配列番号：６）を用
いる。ストレプトマイセスｓｐ１４２のゲノムＤＮＡを
制限酵素、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ
で完全消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後、常法
に従いナイロン膜にブロッティングした。ハイブリダイ
ゼーションは一般的に用いられる条件で行った。６ｘＳ
ＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５ｘデンハルト、１００μｇ／
ｍｌ鮭精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶
液中６０℃でナイロン膜をブロッキングし、³²Ｐでラベ
ルした各合成オリゴヌクレオチドを加えてＬＮ−ＰＮ２
−２の場合は４０℃で、ＬＮ−ＰＮ２−３の場合は５０
℃で一晩保温した。このナイロン膜を０．１％ＳＤＳを
含む２ｘＳＳＣで、室温で３０分間２回洗浄した後、オ
ートラジオグラフィーをとって合成オリゴヌクレオチド
プローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検出した。
どちらのプローブを用いた場合にも各制限酵素消化物の
レーン上に複数のバンドが検出された。これらのプロー
ブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を、通常用いられる
方法によってゲルから抽出し、プラスミドベクターに組
み込んだ後、通常用いられる方法で塩基配列を決定した
が、合成ＤＮＡの配列にホモロジーを示す配列は得られ
るものの、アミノ酸配列のホモロジーはなく、目的の遺
伝子と考えられる配列を見出すことができなかった。

【００２４】以上に述べたように、ストレプトマイセス
ｓｐ１４２のゲノムＤＮＡから本発明のラクト−Ｎ−ビ
オシダーゼ遺伝子をクローニングすることは非常に難し
い。ストレプトマイセスｓｐ１４２のゲノム遺伝子はＧ
＋Ｃ含量が高いため二次構造を取りやすく、それゆえポ
リメラーゼ反応の進行が阻害されたり非特異的なアニー
リングが起こるなどして、ＰＣＲ法においては非特異的
ＤＮＡ断片の増幅が起こったり、また、ハイブリダイゼ
ーション法においても非特異的ハイブリッドの形成など
が起こる可能性が考えられる。本発明者らはこれらの点
を考慮し鋭意検討を重ねた結果、ハイブリダイゼーショ
ン法を行うに際して、プローブとしてラクト−Ｎ−ビオ
シダーゼの内部部分アミノ酸配列からデザインし、合成
した特定のオリゴヌクレオチドを用いることによって、
目的のラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子の一部が初めて
ハイブリダイズすることを見出したのである。

【００２５】以下、より詳細に説明すれば、プローブと
して新たに部分アミノ酸配列ＬＮ−７（配列番号：８）
から合成オリゴヌクレオチドＬＮ−Ｐ７（配列番号：１
１）、部分アミノ酸配列ＬＮ−４６（配列番号：１０）
から合成オリゴヌクレオチドＬＮ−Ｐ４６−２（配列番
号：１２）をそれぞれ合成して、ハイブリダイゼーショ
ンを行う。ストレプトマイセスｓｐ１４２のゲノムＤＮ
Ａを制限酵素、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、Ｓａ
ｌＩで完全消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後常
法に従いナイロン膜にブロッティングする。ハイブリダ
イゼーションは一般的に用いられる条件で行うことがで
きるが、例えば６ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５ｘデン
ハルト、１００μｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含むプレ
ハイブリダイゼーション溶液中６５℃でナイロン膜をブ
ロッキングした後、³²Ｐでラベルした各合成オリゴヌク
レオチドを加えて６５℃で一晩保温する。このナイロン
膜を６ｘＳＳＣ中で、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳ
を含む２ｘＳＳＣ中で、室温で１０分間、０．１％ＳＤ
Ｓを含む０．２ｘＳＳＣ中で、４５℃で３０分間洗浄し
た後、オートラジオグラフィーをとって合成オリゴヌク
レオチドプローブとハイブリダイズするＤＮＡ断片を検
出する。その結果、それぞれのプローブに対して、Ｂａ
ｍＨＩ消化物で約８ｋｂ、ＰｓｔＩ消化物で約３ｋｂ、
ＳａｃＩ消化物で約７．５ｋｂ、ＳａｌＩ消化物で約
１．８ｋｂの位置に、プローブとハイブリダイズするバ
ンドを認めた。これらのＤＮＡ配列を通常用いられる方
法によってゲルから抽出し、プラスミドベクターに組み
込んだ後、これらの塩基配列を通常用いられる方法、例
えばジデオキシチェーンターミネーター法で決定したと
ころ、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼの部分アミノ酸配列に
対応する配列が見出され、目的のラクト−Ｎ−ビオシダ
ーゼ遺伝子の一部を取得することに成功した。もちろん
得られた遺伝子断片をプローブとしてさらにハイブリダ
イゼーション法を行うことによってラクト−Ｎ−ビオシ
ダーゼ全長をコードする遺伝子をクローニングすること
ができる。

【００２６】以上のようにして得られる、放線菌ストレ
プトマイセス sp142の産生するラクト−Ｎ−ビオシダー
ゼの遺伝子の全塩基配列は、配列番号：２に記載したも
のであり、これにより帰納される全アミノ酸配列は配列
番号：１に記載したものであると決定された。なお、ア
ミノ酸配列が配列番号：１に記載したものに対応する塩
基配列は配列番号：２に記載したもの以外に無数にある
が、これらはすべて本発明の範囲に含まれる。又、本発
明の遺伝子は、配列番号：１に記載したアミノ酸配列の
一部を含むラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードする遺伝子、配列番号：２に記載した
ＤＮＡ配列の一部を含む遺伝子であって、かつラクト−
Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードす
る遺伝子、さらにこれらの遺伝子とハイブリダイズする
ことができる、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードする遺伝子をも含むものである。

【００２７】このようにして全塩基配列が明らかにされ
たラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子の全体あるいは一部
分をハイブリダイゼーション用のプローブとして用い
て、ストレプトマイセス sp142以外の生物体から得たゲ
ノムＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーから、ラクト
−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するラクト−Ｎ−ビオシダ
ーゼ遺伝子と相同性の高いＤＮＡを選別することができ
る。ハイブリダイゼーションは既に述べたような一般的
に用いられる条件で行うことが出来るが、洗いなどの条
件を変えることによって様々な相同性を示す遺伝子を得
ることができる。

【００２８】目的のラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性また
は機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードす
る遺伝子をハイブリダイゼーションにより得る方法とし
ては、例えば以下の方法が適用できる。まず目的の遺伝
子源から得た染色体ＤＮＡ、あるいはｍＲＮＡより逆転
写酵素により作製したｃＤＮＡを常法に従いプラスミド
やファージベクターに接続して宿主に導入し、ライブラ
リーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養
し、生育したコロニー又はプラークをニトロセルロース
やナイロンの膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜
に固定する。この膜をあらかじめ³²Ｐ等で標識したプロ
ーブ（使用するプローブとしては、配列表の配列番号：
１に記載したアミノ酸配列、またはその一部をコードす
る遺伝子であればよく、例えば、配列表の配列番号：２
に記載した遺伝子、またはその一部を使用することがで
きる）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブ
との間でハイブリッドを形成させる。例えばＤＮＡを固
定化した膜を、６×ＳＳＣ、１％ラウリル硫酸ナトリウ
ム、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハル
ツ（ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィ
コールをそれぞれ０．１％の濃度で含む）を含む溶液中
で６５℃で２０時間、プローブとハイブリダイゼーショ
ンを行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着を
洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブと
ハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作を
ハイブリット形成したクローンが単一になるまで繰り返
す。こうして得られたクローンの中には、目的のタンパ
ク質をコードする遺伝子が挿入されている。

【００２９】得られた遺伝子は、例えば次のように塩基
配列を決定し、得られた遺伝子が目的のラクト−Ｎ−ビ
オシダーゼ活性または機能的に同等の活性を有するポリ
ペプチドをコードする遺伝子であるかを確認する。塩基
配列の決定は、ハイブリダイゼーションにより得られた
クローンの場合、組換体が大腸菌であれば試験管等で培
養を行い、プラスミドを常法に従い抽出する。これを制
限酵素により切断し挿入断片を取り出し、Ｍ１３ファー
ジベクター等にサブクローニングし、ジデオキシ法によ
り塩基配列を決定する。組換体がファージの場合も基本
的に同様のステップにより塩基配列を決定することがで
きる。これらの培養から塩基配列決定までの基本的な実
験法については、例えば、モレキュラー・クローニング
・ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｔ．マニアティス他
著、コールドスプリングハーバーラボラトリー社、１９
８９年発行）等に記載されている。

【００３０】得られた遺伝子が目的のラクト−Ｎ−ビオ
シダーゼ活性または機能的に同等の活性を有するポリペ
プチドをコードする遺伝子であるかどうかを確認するに
は、決定された塩基配列を本発明のラクト−Ｎ−ビオシ
ダーゼ遺伝子および配列表の配列番号：１に記載したア
ミノ酸配列と比較する。得られた遺伝子がラクト−Ｎ−
ビオシダーゼ活性または機能的に同等の活性を有するポ
リペプチドをコードする領域のすべてを含まない場合に
は、得られた遺伝子を基にして合成ＤＮＡプライマーを
作製し、ＰＣＲにより足りない領域を増幅したり、得ら
れた遺伝子の断片をプローブとして、さらにＤＮＡライ
ブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
することにより、本発明のラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺
伝子にハイブリダイズするラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活
性または機能的に同等の活性を有するポリペプチドの全
コード領域の塩基配列を決定することができる。

【００３１】一方、本発明の遺伝子の塩基配列から PCR
反応用のプライマーをデザインすることができる。この
プライマーを用いて PCR反応を行うことによって本発明
の遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出したり、さら
にはその遺伝子全体を得ることもできる。

【００３２】本発明のラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子
を用いてラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するポリペ
プチドを生産するには、以下の方法が便宜である。ま
ず、目的のラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子を含むベク
ターを用いて宿主の形質転換を行い、次いでこの形質転
換体の培養を通常用いられる条件で行うことによって、
ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するポリペプチドを
産生させることができる。場合によっては該ポリペプチ
ドが封入体 (inclusion body) の形で産生されることも
ある。宿主としては微生物、動物細胞、植物細胞等を用
いることができる。

【００３３】発現の確認は、例えばラクト−Ｎ−ビオシ
ダーゼ活性を測定することにより行うのが便宜である。
活性測定は、前記のように例えば組換え体大腸菌の細胞
抽出液を酵素液としてプロシーディングス オブ ザ
ナショナル アカデミー オブ サイエンシーズ オブ
ザ USA 、第89巻、第 8512-8516頁 (1992) に記載の
方法で行うことができる。

【００３４】目的のラクト−Ｎ−ビオシダーゼの発現が
認められた場合は、例えば形質転換体が大腸菌であれ
ば、培地組成、培地のｐＨ、培養温度、インデューサー
の使用量・使用時期、培養時間等につき、ラクト−Ｎ−
ビオシダーゼ発現の最適条件を決定することによって効
率よくラクト−Ｎ−ビオシダーゼを生産させることがで
きる。

【００３５】形質転換体の培養物からラクト−Ｎ−ビオ
シダーゼを精製するには通常の方法が用いられる。形質
転換体が大腸菌の場合のように細胞内にラクト−Ｎ−ビ
オシダーゼが蓄積するときは、培養終了後遠心分離によ
って形質転換体を集め、これを超音波処理などによって
破砕した後、遠心分離等によって、無細胞抽出液を得
る。これを、塩析や、イオン交換、ゲル濾過、疎水、ア
フィニティーなどの各種クロマトグラフィー等の一般的
な蛋白質精製法により精製することができる。用いる宿
主ーベクター系によっては発現産物が形質転換体外に分
泌される場合があるが、この場合は培養上清から同様に
精製を行えばよい。

【００３６】形質転換体が産生するラクト−Ｎ−ビオシ
ダーゼは、それが菌体内に産生されるときは菌体内の諸
酵素が共存するが、これらはラクト−Ｎ−ビオシダーゼ
の量に比べ微量に過ぎないため、その精製は極めて容易
である。また、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼが菌体外に分
泌される場合は、培地成分等が共存するが、これらは通
常ラクト−Ｎ−ビオシダーゼの精製の妨げとなるような
蛋白質成分をほとんど含まないため、ストレプトマイセ
スsp142 の培養物（ラクト−Ｎ−ビオシダーゼと分離の
困難なα−１，３／４−フコシダーゼやβ−Ｎアセチル
グルコサミニダーゼ等を含む）からのラクト−Ｎ−ビオ
シダーゼの精製に必要な煩雑な分離操作を必要としない
利点がある〔ジャーナル オブ バイオロジカル ケミ
ストリー、第 257巻、第 8205-8210頁 (1982) 〕。

【００３７】また、例えば宿主が大腸菌の場合、発現産
物が不溶性の封入体として形成されることがある。この
場合、培養終了後遠心分離によって菌体を集め、これを
超音波処理などによって破砕した後、遠心分離等を行う
ことにより封入体を含む不溶性画分を集める。封入体を
洗浄した後、通常用いられる蛋白質可溶化剤、例えば尿
素やグアニジン塩酸塩等で可溶化し、必要に応じてこれ
をイオン交換、ゲル濾過、疎水、アフィニティーなどの
各種クロマトグラフィーを行うことにより精製した後、
透析法あるいは希釈法などを用いたリホールディング操
作を行うことによって活性を保持した目的のラクト−Ｎ
−ビオシダーゼ活性を有するポリペプチドを得ることが
できる。必要に応じてこの標品を更に各種クロマトグラ
フィーによって精製すれば、高純度のラクト−Ｎ−ビオ
シダーゼ活性を有するポリペプチドを得ることができ
る。尚、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性と機能的に同等
の活性を有するポリペプチドを生産する場合も同様の生
産方法、精製方法を用いればよい。

【００３８】このように本発明により、ストレプトマイ
セスsp142 由来のラクト−Ｎ−ビオシダーゼの一次構造
及び遺伝子構造が提供される。また、ラクト−Ｎ−ビオ
シダーゼ活性を有するポリペプチド又はその活性と機能
的に同等の活性を有するポリペプチドの遺伝子工学的な
製造が可能となる。本発明の遺伝子工学的製造法を用い
れば安価に高純度なラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有
するポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を
有するポリペプチドを得ることが可能となる。

【００３９】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【００４０】実施例１．ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ構造
遺伝子のクローニング (1) ゲノムＤＮＡの抽出精製 ラクト−Ｎ−ビオシダーゼの生産菌株であるストレプト
マイセス sp142（FERMBP-4569) をＬ−フコース１％、
酵母エキス0.01％、ペプトン0.03％、MgSO₄ 7H₂O 0.05
％、KH₂PO₄ 0.1％（pH 7.0）からなる培地20mlに接種
し、30℃で44時間培養した。培養終了後、培養液を遠心
分離して菌体を集め、液体窒素中に投入して乳鉢で完全
に粉砕した。これを湿菌体容量に対し、10倍量の抽出緩
衝液〔10mMトリス−HCl (pH 8.0)、100mM EDTA、20μｇ
／ml RNase A、0.5 ％ SDS〕中に穏やかに攪拌しながら
少量ずつ添加し、10mg／mlのプロテイナーゼ K 100μｌ
を添加した後、37℃で１時間保温した。この後室温に戻
し、等容のＴＥ緩衝液 (10mMトリス-HCl、1mM EDTA（pH
8.0）飽和フェノール/ クロロホルム１：１を加えて穏
やかに攪拌し、3000rpm で10分間遠心した後上層を回収
した (以下、フェノール抽出と略す) 。これを２回繰り
返し、水層に 0.6等量のイソプロピルアルコールを加え
て14000rpmで１分間遠心した後、70％エタノールでリン
スして軽く風乾した。以上の操作により、ゲノムＤＮＡ
約 440μｇを得た。

【００４１】(2) ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ部分アミノ
酸配列の決定 ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第
268巻、第 18560-18566頁 (1993) に記載の方法で精製
したストレプトマイセス sp142のラクト−Ｎ−ビオシダ
ーゼを、直接常法に従って気相エドマン分解法によるア
ミノ酸配列分析（プロテインシーケンサ４７６Ａ、アプ
ライド バイオシステムズ社製）に供してＮ末端アミノ
酸配列LN-N2 （配列番号：３) を決定した。さらに、酵
素蛋白質をピリジルエチル化（ラクト−Ｎ−ビオシダー
ゼタンパク質１ｎｍｏｌを４５０ｍＭ、Ｎ−エチルモル
フォリン／ぎ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化した脱塩
用のカラム（ファーストデソルティングカラムＰＣ３．
２／１０、ファルマシア社製）にアプライし、同緩衝液
で溶出した。溶出液をガラスバイアルに集め濃縮乾固す
る。一回り大きなガラス試験管の中にピリジン１０μ
ｌ、４−ビニルピリジン２μｌ、トリ−Ｎ−ブチルフォ
スフィン２μｌ、水１０μｌを入れる。このガラス試験
管の中に試料の入ったガラスバイアルを入れ、ガラス試
験管を封管した後、１００℃で５分間反応させる。反応
終了後ガラスバイアルを取り出しよく乾燥させる。こう
して得られるピリジルエチル化物をトリプシン消化に用
いる）した後、TPCKトリプシンで消化し（ガラスバイア
ルに４Ｍ尿素を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）、４０μｌ、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ
７．５、５０μｌ、０．１Ｍ塩化カルシウム、１０μｌ
及びＴＰＣＫトリプシン、２ｐｍｏｌを加え、３７℃で
一晩反応を行った。）、得られた消化物からペプチド断
片をHPLC（スマートシステム、ファルマシア社製、カラ
ム：ｍＲＰＣ Ｃ２／Ｃ１８、ＳＣ２．１／１０、流
速：１ｍｌ／ｍｉｎ、溶出液Ａ：０．１％ トリフルオ
ロ酢酸溶液、溶出液Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸を含
むアセトニトリル、溶出：サンプルアプライ時は溶出液
Ｂの割合を０％に、サンプルアプライ終了時に溶出液Ｂ
の割合を１０％に、さらに８５分間で溶出液Ｂの割合を
６０％にまであげる。）で分離精製した。各ペプチド画
分についてアミノ酸配列分析を行い、部分アミノ酸配列
LN-6（配列番号：７) 、LN-7 (配列番号：８) 、LN-29
(配列番号：９) 、LN-46(配列番号：１０) を決定し
た。

【００４２】(3) ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子を含
むＤＮＡ断片のクローニング (1) で調製したゲノムＤＮＡ 50mgを制限酵素 BamHI、
PstI、SacI、SalI各 120ユニットで各々37℃で２時間消
化し、60ユニットの酵素を追加してさらに４時間反応さ
せた。この反応液からフェノール抽出で得られたＤＮＡ
10mg 相当について 0.7％アガロースゲル電気泳動を行
った。泳動後、サザンブロット法 (文献：遺伝子研究法
II、第 218〜221 頁、東京化学同人) により、ナイロン
膜〔ハイボンドＮ＋ (Hybond-N+)、アマシャム社製〕に
ＤＮＡを転写した。このフィルターは同じものを二枚用
意した。

【００４３】ハイブリダイゼーションのプローブとして
は、(2) で決定した部分アミノ酸配列LN-7 (配列番号：
８) から合成オリゴヌクレオチドLN-P7(配列番号：１
１) 、部分アミノ酸配列 LN-46 (配列番号：１０) から
合成オリゴヌクレオチド LN-P46-2(配列番号：１２) を
それぞれ合成して用いた。これらの合成オリゴヌクレオ
チド５pmolをメガラベルキット（宝酒造社製）を用いて
³²P で標識した。

【００４４】上記調製したフィルター二枚をそれぞれ 6
x SSC [1xSSC は、8.77ｇのNaCl、及び4.41ｇのクエン
酸ナトリウムを１０００ｍｌの水に溶解したもの] 、0.
5 ％SDS、100 μｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡ、5xデンハ
ルト (Denhaldt's、ウシ血清アルブミン、ポリビニルピ
ロリドン、フィコールをそれぞれ 0.1％濃度で含む）を
含む溶液中、65℃で３時間プレハイブリダイゼーション
を行った後、標識プローブをそれぞれ 0.5 pmol/mlの濃
度になるように加え、65℃で一晩ハイブリダイゼーショ
ンを行った。次に 6xSSC中、室温で10分間、2xSSC 、0.
1 ％ SDS中、室温で10分間、0.2 x SSC 、0.1 ％ SDS
中、45℃で30分間洗浄し、余分な水分を除いた後、富士
フィルム社製イメージングプレートに45分間当てた後、
富士フィルム社製 BAS 2000 イメージングアナライザー
によって検出した。その結果、それぞれのプローブに対
して、BamHI 消化物で約８Kb、PstI消化物で約 3Kb、Sa
cI消化物で約 7.5Kb、SalI消化物で約 1.8Kbの位置に、
プローブとハイブリダイズするバンドを認めた。

【００４５】以後の実験は、取り扱いの簡便さから Pst
I 、及び SalI 消化物について進めた。先に制限酵素で
消化したゲノムＤＮＡ 10 mgの 0.7％アガロースゲル電
気泳動を行い、上述のハイブリダイゼーションで認めら
れたバンドに相当する部分を切り出した。これを EASYT
RAP キット（宝酒造社製）を用いて抽出精製を行い、得
られたＤＮＡ断片を pUC19のPstI、あるいはSalIサイト
に挿入した。

【００４６】このプラスミドで大腸菌 JM109を形質転換
して一晩培養し、直径 8.5cmの丸シャーレ３枚に、１枚
当たり 200〜1000個のコロニーを形成させ、培地プレー
ト上においたナイロン膜（ハイボンドＮ＋、アマシャム
社製）上に写した。37℃で 4.5時間保温した後、このナ
イロン膜を 0.5 M NaOH 、1.5 M NaClの溶液に浸したろ
紙上で５分間変性処理し、0.5Mトリス-HCl緩衝液 (pH7.
0)、3 M NaClの溶液に浸したろ紙上で 5分間中和処理し
た後、2xSSC でリンスした。このナイロン膜と合成オリ
ゴヌクレオチド LN-P7 (配列番号：１１) を用い、前述
と同じ条件でハイブリダイゼーションを行ったところ、
それぞれ数個のポジティブシグナルが得られた。次に、
元のプレートよりポジティブシグナル付近の大腸菌を新
しいプレートに塗布し直してコロニーを形成させ、同様
の操作を繰り返すことにより、ポジティブシグナルを与
えるコロニー６個を単離した。そのうちの２個は PstI
断片を含み (P44 、P80 と命名) 、４個はSalI断片を含
んでいた (S6、S39 、S63、S100と命名) 。

【００４７】アルカリ溶菌法により、得られたクローン
のプラスミドＤＮＡを調製し、それぞれ pULNBP44 、pU
LNBP80、pULNBS6 、pULNBS39、pULNBS63、pULNBS100 と
命名した。これを数種の制限酵素で消化し、電気泳動に
より切断パターンを解析した。その結果、pULNBP44、pU
LNBP80にはHincII、KpnI、SalIをはじめ計14種類の制限
酵素サイトの存在を確認した。また、pULNBS6 、pULNBS
39、pULNBS63、pULNBS100 にはHincII、KpnI、SalIなど
の制限酵素サイトの存在を確認した。なお、この解析に
よりプラスミド pULNBP44 と pULNBP80 、pULNBS6 、pU
LNBS39、pULNBS63および pULNBS100はその挿入ＤＮＡ断
片は同一であることが判明し、さらに、PstI断片とSalI
断片はほとんどが重なり合うことが判明した。したがっ
て以後の解析はpULNBP80を主に行い、pULNBP80ではカバ
ー出来ない範囲について pULNBS6を用いて行った。これ
らのクローンを適当な制限酵素で消化し、ライゲーショ
ンキット（宝酒造社製）でセルフライゲーションを行っ
て、各種の欠失変異体を作製した。ジデオキシ法によっ
てこれらの変異体の塩基配列を決定した結果、2 つのク
ローンの挿入断片にわたってラクト−Ｎ−ビオシダーゼ
の一部をコードする配列が見いだされた。すなわちこの
中に、部分アミノ酸配列LN-7（配列番号：８) 、LN-29
(配列番号：９) およびLN-46(配列番号：１０) をコー
ドする塩基配列が見いだされたが、Ｎ末端アミノ酸配列
LN-N2 (配列番号：３) および部分アミノ酸配列LN-6
（配列番号：７) をコードする塩基配列は見いだされな
かった。

【００４８】(4) ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ全長遺伝子
を含むＤＮＡ断片のクローニング ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子の全長をカバーするた
めに、pULNBP80では欠損していた N末端付近をコードす
るＤＮＡ断片をスクリーニングするため、さらに上記
(3)と同様にしてサザンハイブリダイゼーション法を行
った。pULNBP80と pULNBS6では、pULNBS6 の方が約100
bp多くラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子のＮ末端近くの
ＤＮＡ配列を含んでいることが塩基配列分析の結果明ら
かとなったので、この約100 bpの部分をプローブとして
用いた。すなわち pULNBS6をPstIとSalIで消化し、３％
アガロースゲル電気泳動を行い、遊離する約100bp のＤ
ＮＡ断片を切り出した。これを Suprec 01（宝酒造社
製）を用いて抽出精製を行い、得られたＤＮＡ断片をメ
ガラベルキット（宝酒造社製）を用いて³²P で標識し
た。上記 (3)と同様に調製したフィルター二枚をそれぞ
れ 6xSSC（ 1xSSCは、8.77g のNaCl、及び 4.41 g のク
エン酸ナトリウムを１リットルの水に溶解したもの）、
0.5 ％ SDS、100 μｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡ、 5x デ
ンハルト(Denhaldt's 、ウシ血清アルブミン、ポリビニ
ルピロリドン、フィコールをそれぞれ0.1 ％濃度で含
む）を含む溶液中、68℃で 3時間プレハイブリダイゼー
ションを行った後、標識プローブを 0.1 pmol/mlの濃度
になるように加え、68℃で一晩ハイブリダイゼーション
を行った。次に 6xSSC中、室温で 10 分間、2xSSC およ
び 0.1％ SDS中、室温で10分間、0.2xSSC 、0.1 ％SDS
中、50℃で20時間洗浄し、余分な水分を除いた後、富士
フィルム社製イメージングプレートに45分間当てた後、
富士フィルム社製 BAS 2000 イメージングアナライザー
にて検出した。その結果、BamHI 消化物で約 8Kb、PstI
消化物で約 3Kb、SacI消化物で約 7.5Kb、SalI消化物で
約 1.8Kbの位置に、プローブとハイブリダイズするバン
ドを認めた。以後の実験は、取り扱いの簡便さから Pst
I 消化物について進めた。

【００４９】上記 (3)と同様に PstI 消化したゲノムＤ
ＮＡ 10mg を 0.7％アガロースゲル電気泳動に付し、上
述のハイブリダイゼーションで認められたバンドに相当
する部分を切り出した。これを EASYTRAP キット（宝酒
造社製）を用いて抽出精製し、得られたＤＮＡ断片を p
UC19の PstI サイトに挿入した。

【００５０】このプラスミドで大腸菌 JM109を形質転換
して一晩培養し、直径 8.5 cm の丸シャーレ 3枚に、1
枚当たり 200〜1000個のコロニーを形成させ、培地プレ
ート上においたナイロン膜（ハイボンドＮ＋、アマシャ
ム社製）上に写した。37℃で4.5時間保温した後、この
ナイロン膜を 0.5 M NaOH 、1.5 M NaClの溶液に浸した
ろ紙上で 5分間変性し、0.5 M トリス-HCl緩衝液 (pH7.
0)、3 M NaClの溶液に浸したろ紙上で 5分間中和処理し
た後、2xSSC でリンスした。このナイロン膜とpULNBS6
の約 100 bp の PstI-SalIＤＮＡ断片を用い、前述と同
じ条件でハイブリダイゼーションを行ったところ、それ
ぞれ数個のポジティブシグナルが得られた。次に、元の
プレートよりポジティブシグナル付近の大腸菌を新しい
プレートに塗布し直してコロニーを形成させ、同様の操
作を繰り返すことにより PstI 断片を含む6 個 (P2-17
、P2-37 、P2-47 、P2-67 、P2-77 、P2-87 と命名)
のポジティブシグナルを与えるコロニーを単離した。

【００５１】アルカリ溶菌法により、得られたクローン
のプラスミドＤＮＡを取得し、それぞれ pULNBP2-17 、
pULNBP2-37、pULNBP2-47、pULNBP2-67、pULNBP2-77、pU
LNBP2-87と命名した。これを数種の制限酵素で消化し、
電気泳動により切断パターンを解析した。その結果、こ
れらプラスミドの挿入 PstI 断片には HincII 、SacI、
SalI、SmaI、XhoIをはじめ計15種類の制限酵素サイトが
存在し、pULNBP2-17、pULNBP2-37、pULNBP2-67、pULNBP
2-87とpULNBP2-47、pULNBP2-67、pULNBP2-77とはそれぞ
れ逆向きにPstI断片が挿入されているものの、全く同じ
制限酵素切断パターンを示すことから同一遺伝子断片で
あることが推定された。したがって以後の解析は pULNB
P2-17 についてのみ行った。

【００５２】pULNBP2-17 をその両末端から消化し、あ
るいは適当な制限酵素で消化し、ついでライゲーション
キット（宝酒造社製）でセルフライゲーションを行って
各種の欠失変異体を作製したのち、ジデオキシ法によっ
てこれらの塩基配列を決定した。その結果、pULNBS6 の
約 100 bｐの PstI-SalI間の塩基配列が現われ、さらに
N末端アミノ酸配列 LN-N2 (配列番号：３) および部分
アミノ酸配列 LN-6(配列番号：７) をコードする塩基配
列も含まれていることが明かとなった。さらに、上記
(3)で決定した pULNBP80 挿入 PstI 断片と pULNBP2-17
の挿入 PstI 断片にわたって、1920 bp の読み取り枠
が見いだされた。この読み取り枠中に、上記 (2)で決定
したラクト−Ｎ−ビオシダーゼのアミノ酸配列分析によ
り得られた配列が全て見出された。以上のようにして、
ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子の全塩基配列が決定さ
れた。その結果を図１に示す。すなわちＡは pULNBP80
の挿入 PstI 断片中の PstI - KpnI領域及びＢは pULNB
P2-17 の挿入 PstI 断片中のMluI - PstI領域の制限酵
素地図とラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子の位置を示し
た図である。図中矢印はラクト−Ｎ−ビオシダーゼの翻
訳開始点、太線はラクト−Ｎ−ビオシダーゼのコード領
域を示す。ＡとＢを合わせることにより、ラクト−Ｎ−
ビオシダーゼ遺伝子の全長を知ることができる。ラクト
−Ｎ−ビオシダーゼをコードする塩基配列の一例を配列
表の配列番号：２に、この塩基配列がコードし得るアミ
ノ酸配列を配列番号：１に示す。

【００５３】実施例２．ラクト−Ｎ−ビオシダーゼの発
現プラスミドの構築 （１）ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子全長を含むプラ
スミドの構築 まず、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子全長を含むプラ
スミドを構築するために、実施例１で得られたプラスミ
ド pULNBP2-17 を PstI で消化した後１％アガロースゲ
ル電気泳動を行い、PstIフラグメントを切り出して抽出
精製した。次に実施例１で得られたプラスミド pULNBP8
0 を KpnI で消化し、ライゲーションキット（宝酒造社
製）でセルフライゲーションを行った後、大腸菌 JM109
株へ形質転換させた。培養菌体からアルカリ溶菌法によ
りプラスミドＤＮＡ、pULNBP80Kpn を調製した。これを
PstI で消化し、プラスミド pULNBP2-17 から得た Pst
Iフラグメントを挿入した後、大腸菌 JM109株へ形質転
換させた。培養菌体からアルカリSDS 法によりプラスミ
ドＤＮＡを単離し、PstI消化による挿入断片の確認、及
び SacI 消化による挿入断片の方向確認を行った。こう
して得られたラクト−Ｎ−ビオシダーゼ遺伝子全長を含
むプラスミドを pLNBP-Kと命名した。

【００５４】pLNBP-K を導入した大腸菌 JM109株を Esc
herichia coli JM109/pLNBP-K と表示する。また、pLNB
P-K を導入した大腸菌 JM109株は、 Escherichia coli
JM109/pLNBP-K と表示して、通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に FERMBP-5333 として寄託されて
いる。

【００５５】(2) ラクト−Ｎ−ビオシダーゼを発現する
発現プラスミドの構築 次にラクト−Ｎ−ビオシダーゼを発現する発現プラスミ
ドを構築するために合成オリゴヌクレオチドプライマ
ー、LNBP-M (配列番号：１３）、LNB-SRV(配列番号：１
４）をデザインし、合成した。プライマー LNBP-M は配
列番号：２の塩基配列番号 106-129の 5'-3'の向きに相
当する 24merの上流に HindIII及びNcoIサイトをデザイ
ンした 39merであり、プライマー LNB-SRVは配列番号：
２の塩基配列番号 301-321の 3'-5'の向きに相当する 2
1merの合成ＤＮＡである。

【００５６】テンプレートとして、実施例１で得られた
プラスミド pULNBP2-17MluE （実施例１で得られたプラ
スミドｐＵＬＮＢ２−１７をＭｌｕＩ及びＥｃｏＲＩで
消化した後、平滑末端化したものをセルフライゲーショ
ンして得られたｐＵＬＮＢ２−１７ＭｌｕＥ）約10ngを
ジーンアンプキット中の10μｌの10倍濃度増幅用緩衝
液、16μｌの1.25mM dNTP 混合液、20pmolのプライマー
LNBP-M 、20pmolのプライマー LNB-SRV、2.5 ユニット
のタカラタック（Takara Taq、宝酒造社製）と混合し、
さらに滅菌水を加えて100 μｌの溶液にした。この混合
液を自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラー（DNA Ther
mal Cycler 480、宝酒造社製）による増幅反応に供し
た。PCR 反応は、94℃で１分間の変性、60℃で２分間の
プライマーアニーリング、72℃で 1.5分間の合成反応の
サイクルを25サイクル行った。反応液の10μｌについて
３％ アガロースゲル電気泳動を行った後エチジウムブ
ロミドでＤＮＡを染色し、予想される 231 bp の増幅Ｄ
ＮＡ断片を確認した。PCR 反応液の残りをエタノール沈
殿により濃縮後 HindIII、SmaIによって消化した後、実
施例 2-(1)で得られたプラスミド pLNBP-Kの HindIII-S
maI サイトに挿入し、これを JM109株へ形質転換させ
た。培養菌体からアルカリSDS 法によりプラスミドＤＮ
Ａを調製し、HindIII 、SmaI消化による挿入断片の確
認、及びジデオキシ法による挿入断片の塩基配列の確認
を行った。こうして得られたラクト−Ｎ−ビオシダーゼ
の発現プラスミドを pLNBMと命名した。

【００５７】こうして得られた大腸菌 Escherichia col
i JM109/pLNBM を 100μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む
Ｌ培地５mlに接種して37℃で振とう培養し、濁度が O.
D. 600 ＝ 0.5の段階で、終濃度１mMのIPTGを加え、37
℃で一晩振とう培養を行った。培養終了後、培養液１ml
を遠心分離して菌体を集め、50mMリン酸カリ緩衝液（pH
6.0）で洗浄した。次に、同緩衝液 0.5mlに懸濁し、超
音波処理により菌体を破砕した。これを遠心分離して上
清を回収し、大腸菌抽出液とした。この抽出液及び沈殿
を SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結
果、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼに相当するバンドを検出
することはできず、また、抽出液中の活性をプロシーデ
ィングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ
サイエンシーズ オブ ザ USA 、第89巻、第 8512-85
16頁 (1992) に記載の方法で測定したが、ラクト−Ｎ−
ビオシダーゼ活性は検出できなかった。

【００５８】別の発現用プラスミドの構築を試みた。プ
ラスミド pLNBMをKpnIで消化後、平滑末端化してさらに
HindIIIで消化した後１％アガロースゲル電気泳動を行
い、HindIII-KpnIフラグメントを切り出して抽出精製し
た。Ｔ７プロモーターを使った発現ベクターであるpET2
3d (ノヴァジェン社製) をNotIで消化後、平滑末端化し
てさらに HindIII消化したものに、プラスミド pLNBMの
HindIII-KpnIフラグメントを挿入し、これを HB101株
（大腸菌ＨＢ１０１株、宝酒造社製）へ形質転換させ
た。培養菌体からアルカリSDS 法によりプラスミドＤＮ
Ａを調製し、HindIII 、XhoI消化による挿入断片の確
認、及びジデオキシ法による挿入断片の塩基配列の確認
を行った。こうして得られたラクト−Ｎ−ビオシダーゼ
発現用のプラスミドをpELNB101と命名した。

【００５９】このようにして得られたプラスミド pELNB
101 を大腸菌 BL21 (DE3) 株へ形質転換させた。得られ
た大腸菌 Escherichia coli BL21 (DE3)/pELNB101 を 1
00μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む L培地 5 ml に接種
して 37 ℃で振とう培養し、濁度が O.D. 600 ＝ 0.5の
段階で、終濃度 1 mM の IPTG を加え、37℃で一晩振と
う培養を行った。培養終了後、培養液 1 ml を遠心分離
して菌体を集め、50 mM リン酸緩衝液（pH 6.0）で洗浄
した。次に、同緩衝液 0.5 ml に懸濁し、超音波処理に
より菌体を破砕した。これを遠心分離して上清を回収
し、大腸菌抽出液とした。この抽出液及び沈殿を SDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、分子量
60,000 のラクト−Ｎ−ビオシダーゼと考えられるバン
ドが観察され、抽出液中にラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活
性を検出することができた。従って、大腸菌 Escherich
ia coli BL21 (DE3)/pELNB101 はラクト−Ｎ−ビオシダ
ーゼ蛋白質を発現することが確認できた。Escherichia
coli BL21 (DE3)/pELNB101が生産するラクト−Ｎ−ビオ
シダーゼの大部分は封入体の形で不溶化している可能性
がある。

【００６０】(3) ラクト−Ｎ−ビオシダーゼの大腸菌に
おける発現と封入体の精製 大腸菌 Escherichia coli BL21 (DE3)/pELNB101 を 100
μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む L培地５ml、２本に接
種して37℃で５時間振とう培養し、これを500ml の2 x
YT培地の入った 2０００ｍｌ三角フラスコ２本に５mlず
つ接種し、37℃、100rpmにて一晩回転振盪培養した。培
養終了後遠心分離によって菌体を集め、これを0.1M NaC
l 、１mM EDTA を含む10mMトリス- 塩酸緩衝液 (STE)の
25mlに懸濁し、超音波処理を行って菌体を破砕した。破
砕液を遠心分離して封入体を含む不溶性画分を集めた
後、30mlの STEで洗浄、遠心分離して沈殿を30mlの１M
蔗糖溶液に懸濁した。これを18,000 x gで30分間遠心分
離して封入体を含む沈殿を得た。これを10mM EDTA を含
む２％ トリトン X-100溶液40mlに懸濁し、一晩４℃に
静置した。遠心分離により不溶物を集めてから再度同じ
操作を繰り返し封入体を洗浄した。得られた封入体の一
部をSDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結
果、半分以上の蛋白質は分子量約60,000の位置に泳動さ
れており、得られた封入体画分の半分以上の蛋白質は組
換え体ラクト−Ｎ−ビオシダーゼであると推定された。
またこの組換え体ラクト−Ｎ−ビオシダーゼの蛋白質量
は、同時に分析した牛血清アルブミンのバンドの濃さと
比較して、培養液 100ml当たりおおよそ10mg得られたと
考えられる。

【００６１】(4) 封入体の可溶化とリフォールディング 得られた封入体約10mg (培養液100ml 相当) を８M 尿
素、10 mM ジチオスレイトール、0.5 M KCl を含む20mM
酢酸カリウム緩衝液（pH 5.5）の３mlに懸濁し、室温で
１時間攪拌して可溶化した。遠心分離により残った不溶
物を除去した後、上清の50μｌを５mlの20mM酢酸カリウ
ム緩衝液（pH 5.5）で希釈し、そのまま15℃で一晩放置
した。

【００６２】(5) ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性の測定 この溶液のラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性をプロシーデ
ィングス オブ ザナショナル アカデミー オブ サ
イエンシーズ オブ ザ USA 、第89巻、第8512-8516
頁 (1992) に記載の方法で測定した。即ち、酵素標品
を、0.1 Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）の10μ
ｌ中、２μｍ濃度のＰＡ−ラクト−Ｎ−テトラオース(G
alβ１−３GlcNAcβ１−3Galβ１−4Glc−PA、宝酒造社
製）と共に20分間、37℃でインキュベートした。次い
で、反応を停止させるため、反応混合物に１％トリフル
オロ酢酸40μｌを添加した。次に、ＰＡ−オリゴサッカ
ライドの10ｐｍｏｌ相当部分をアミノ−シリカカラムま
たはＣ₁₈−シリカカラムのＨＰＬＣで分析し、標識され
た生成物を蛍光により検出した。

【００６３】加水分解の程度は、基質とこの生成物のピ
ーク面積を対応するＰＡ−オリゴサッカライド標準品の
ピーク面積と比較することにより計算した。酵素活性の
１ユニットは、上記条件下で１分間当たり１μｍｏｌの
生成物を遊離させるのに必要な酵素量と定義する。この
溶液中のラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性は 0.06mU/mlで
あることが分かった。すなわち、本発明の遺伝子を持つ
大腸菌 Escherichia coli BL21 (DE3)/pELNB101 の培養
液１リットルから約１８０mUの組換え体ラクト−Ｎ−ビ
オシダーゼが得られたことが分かる。

【００６４】

【発明の効果】本発明によりラクト−Ｎ−ビオシダーゼ
のアミノ酸配列及び塩基配列が初めて明らかとなり、こ
れによりラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するポリペ
プチド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリ
ペプチドの工業的に有利な遺伝子工学的製造方法が提供
される。

【００６５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：639 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Asp Met Arg Met Ala Arg Arg Arg Thr Ile Gly Ala Val Val 1 5 10 15 Thr Ala Leu Ala Ala Ala Leu Leu Pro Trp Gln Ser Ala Thr Ala 20 25 30 Glu Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Pro Pro Glu Val Leu Pro Thr 35 40 45 Leu Arg Glu Trp Gln Gly Gly Gln Gly Glu Phe Thr Leu Thr Asp 50 55 60 Arg Ala Gly Ile Val Leu Asp Gly Val Arg Asp Ser Arg Thr Ala 65 70 75 Ala Asp Ala Arg Arg Phe Ala Gly Glu Leu Asn Gly Lys Ala Ser 80 85 90 Val Ser Gln Gly Arg Ala Ala Arg Pro Gly Asp Ile Val Leu Arg 95 100 105 Gln Asp Pro Ala Gln Lys Gly Leu Leu Gly Ala Glu Gly Tyr Arg 110 115 120 Leu Thr Val Gly Thr Arg Ile Thr Val Thr Ala Ala Thr Ser Thr 125 130 135 Gly Val Phe Tyr Gly Thr Arg Thr Val Leu Gln Leu Leu Asn Asp 140 145 150 Asp Gly Arg Ala Ala Arg Gly Ser Ala Thr Asp Val Pro Ala Tyr 155 160 165 Arg Glu Arg Gly Val Gly Val Cys Ala Cys Tyr Ile Asn Ile Ser 170 175 180 Thr Gln Trp Phe Glu Arg Leu Met Lys Asp Met Ala Ser Gln Lys 185 190 195 Leu Asn Gln Leu Trp Ile Glu Ala Lys Val Lys Ser Asp Thr Asp 200 205 210 Pro Ala Ser Ala Phe Trp Gly Tyr Tyr Thr Lys Pro Gln Val Arg 215 220 225 Thr Leu Val Ala Met Ala Arg Lys Tyr His Ile Glu Leu Val Pro 230 235 240 Glu Ile Asn Ser Pro Gly His Met Asp Thr Tyr Leu Glu Asn His 245 250 255 Pro Glu Leu Gln Leu Lys Asp Arg Asp Gly Val Ala Ser Pro Pro 260 265 270 Arg Leu Asp Ile Ser Arg Pro Glu Ala Leu Ala Tyr Tyr Thr Ser 275 280 285 Met Val Asp Glu Ala Leu Lys Val Trp Asp Ser Arg Tyr Trp His 290 295 300 Met Gly Ala Asp Glu Tyr Met Ile Gly Ser Ser Tyr Pro Asp Tyr 305 310 315 Pro Gln Leu Gln Ala Ala Ala Arg Ala Lys Phe Gly Ala Ser Ala 320 325 330 Thr Pro Asp Asp Leu Phe Thr Asp Phe Ile Asn Gln Val Asn Ala 335 340 345 His Val Lys Ala Asp Gly Arg Ser Leu Arg Ile Trp Asn Asp Gly 350 355 360 Leu Ala Gly Lys Asn Ala Val Val Pro Leu Asp Arg Asp Ile Thr 365 370 375 Val Glu His Trp Leu Ser Gly Gly Ser Ile Gln Gln Pro Ser Ser 380 385 390 Leu Leu Ala Glu Gly Arg Pro Val Met Asn Ser Ala Tyr Ser Leu 395 400 405 Tyr Leu Val Arg Gly Gly Phe Thr Met Gln Thr Gln Lys Leu Tyr 410 415 420 Glu Ser Asp Trp Thr Pro Leu Arg Phe Glu Gly Gln Thr Leu Thr 425 430 435 Gln Gly Ala Ala Asn Leu Thr Gly Ala Lys Ile Ser Leu Trp Pro 440 445 450 Asp Ser Ala Ala Ala Glu Thr Glu Asn Glu Val Glu Thr Lys Val 455 460 465 Phe Met Pro Leu Arg Phe Val Ala Gln Ala Thr Trp Gly Gly Pro 470 475 480 Lys Pro Ser Pro Thr Tyr Ala Gly Phe Glu Ala Leu Ala Arg Lys 485 490 495 Ile Gly His Ala Pro Gly Trp Glu Asn Thr Asp Arg Thr Pro Leu 500 505 510 Ala Asp Gly Thr Tyr Arg Leu Thr Thr Gly Ala Lys Ala Leu Ala 515 520 525 Pro Thr Ala Asp Ala Gly Val Ser Leu Val Lys Asn Ser Ala Ala 530 535 540 Ser Trp Ala Leu Thr Ala Thr Ala Asp Gly Tyr Tyr Thr Val Arg 545 550 555 Ser Thr Glu Ser Gly Gln Cys Leu Asp Ala Val Arg Gly Lys Lys 560 565 570 Tyr Leu Gly Ala Pro Leu Glu Val Gly Ala Glu Leu Ser Leu Ala 575 580 585 Asn Cys Ser Thr Thr Ala Arg Thr Gln Arg Trp Gln Leu Asp Thr 590 595 600 Gly Ala Gly Ala Leu Thr Leu Arg Asn Ala Ile Ser Gln Leu His 605 610 615 Leu Thr Glu Arg Ala Ser Asp Gly Ala Ala Val Gln Thr Thr Gly 620 625 630 Ala Thr Arg Leu Thr Ala Arg Ala Ala 635

【００６６】配列番号：２ 配列の長さ：1917 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：ストレプトマイセス スピーシーズ(Streptomy
ces sp.) 株名：142 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1917 特徴を決定した方法：E 配列： ATGGACATGC GGATGGCAAG ACGAAGGACC ATCGGAGCCG TGGTGACGGC GCTCGCCGCC 60 GCGCTGCTGC CCTGGCAGAG CGCGACGGCC GAGGGCGGCT CGGCCGCCGC GGCCCCGCCC 120 GAGGTGCTGC CCACGCTCCG CGAATGGCAA GGCGGTCAGG GCGAGTTCAC GCTCACCGAT 180 CGGGCCGGAA TCGTGCTGGA CGGGGTGCGG GACAGTCGTA CGGCCGCCGA CGCACGCCGA 240 TTCGCCGGCG AACTGAACGG CAAGGCGTCG GTGTCACAGG GCCGCGCGGC CCGTCCCGGG 300 GACATCGTGC TGCGCCAGGA CCCGGCCCAG AAGGGTCTGT TGGGCGCGGA AGGCTACCGG 360 CTCACGGTCG GCACCCGTAT CACTGTCACC GCCGCGACCT CCACCGGCGT GTTCTACGGC 420 ACCCGGACCG TCCTCCAGCT GCTGAACGAC GACGGCCGCG CCGCGCGGGG TTCGGCGACC 480 GACGTACCCG CGTACCGCGA GCGCGGAGTC GGGGTCTGCG CCTGCTACAT CAACATATCG 540 ACACAGTGGT TCGAGCGGCT GATGAAGGAC ATGGCGTCGC AGAAGCTCAA CCAGCTGTGG 600 ATCGAGGCCA AGGTCAAGAG CGACACCGAC CCGGCTTCGG CGTTCTGGGG CTACTACACC 660 AAGCCGCAGG TCCGCACGCT GGTCGCGATG GCCCGGAAGT ACCACATCGA GCTCGTGCCG 720 GAGATCAACT CGCCCGGCCA CATGGACACC TACCTGGAGA ACCACCCGGA GCTCCAGCTC 780 AAGGACCGGG ACGGTGTCGC CTCCCCGCCC CGGCTCGACA TCTCCCGGCC CGAGGCGCTG 840 GCGTACTACA CCTCGATGGT CGACGAGGCG CTGAAGGTCT GGGACAGCCG GTACTGGCAC 900 ATGGGCGCCG ACGAGTACAT GATCGGCTCC TCCTACCCGG ACTACCCCCA GCTGCAGGCC 960 GCGGCACGCG CGAAGTTCGG TGCGTCGGCG ACCCCCGACG ATCTCTTCAC CGACTTCATC 1020 AACCAGGTCA ACGCGCATGT GAAGGCGGAC GGCAGGTCGC TGCGGATCTG GAACGACGGG 1080 CTCGCCGGCA AGAACGCCGT TGTCCCGCTG GACCGTGACA TCACCGTCGA GCACTGGCTG 1140 AGCGGCGGCT CCATCCAGCA GCCGTCCTCG CTGCTCGCCG AGGGGCGGCC GGTCATGAAC 1200 TCCGCCTACT CCCTCTACCT GGTGCGCGGC GGATTCACGA TGCAGACCCA GAAGCTGTAC 1260 GAGAGCGACT GGACGCCGTT GCGCTTCGAG GGGCAGACGC TGACCCAGGG GGCGGCGAAC 1320 CTCACCGGCG CGAAGATCAG CCTGTGGCCG GACAGTGCGG CGGCCGAGAC GGAGAACGAG 1380 GTCGAGACGA AGGTCTTCAT GCCGCTGCGT TTCGTGGCGC AGGCGACCTG GGGCGGCCCG 1440 AAGCCGAGCC CGACGTACGC CGGTTTCGAG GCGCTCGCCC GGAAGATCGG TCACGCGCCG 1500 GGCTGGGAGA ACACCGACCG CACGCCGCTC GCCGACGGTA CGTACCGGCT GACCACGGGC 1560 GCGAAGGCGC TGGCCCCCAC GGCGGACGCG GGCGTGTCCC TGGTCAAGAA CAGCGCGGCC 1620 TCCTGGGCGC TGACGGCGAC CGCCGACGGG TACTACACGG TGCGGTCCAC GGAGAGCGGT 1680 CAGTGCCTGG ACGCGGTGCG CGGCAAGAAG TACCTGGGCG CGCCGCTGGA GGTGGGGGCG 1740 GAGCTGTCAC TCGCGAACTG CTCGACGACG GCACGTACCC AGCGCTGGCA GCTGGACACC 1800 GGGGCGGGTG CGCTGACGCT GCGCAACGCG ATCTCGCAGC TGCATCTGAC GGAGCGGGCG 1860 TCGGACGGCG CCGCGGTGCA GACGACGGGA GCGACCCGGC TGACGGCGCG CGCCGCC 1917

【００６７】配列番号：３ 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列： Ala Ala Arg Pro His Glu Val Leu Pro Thr Leu Arg Glu Trp Gln 1 5 10 15 Gly Gly Thr

【００６８】配列番号：４ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GCSMGSCCSC AYGARGT 17

【００６９】配列番号：５ 配列の長さ：17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： CCSCAYGARG TSCWNCC 17

【００７０】配列番号：６ 配列の長さ：44 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GCCGCCCGCC CSCACGARGT CCTSCCSACC CTSGACGAGG CCCA 44

【００７１】配列番号：７ 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント

【００７２】配列番号：８ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント

【００７３】配列番号：９ 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Ser Gln Leu Asp Thr Gly Ala Gly Ala Leu Thr Leu 1 5 10

【００７４】配列番号：10 配列の長さ：24 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Asp Ile Thr Val Glu His Ala Leu Ser Gly Gly Ser Ile Gln Gln 1 5 10 15 Pro Ser Ser Leu Leu Ala Glu Gly Pro 20

【００７５】配列番号：11 配列の長さ：27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： CARTGGAAYG AYGGNYTNGC NGGNAAR 27

【００７６】配列番号：12 配列の長さ：72 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GAYATHACNG TNGARCAYGC NYTNWSNGGN GGNWSNATHC ARCARCCNWS NWSNYTNYTN 60 GCNGARGGNC CN 72

【００７７】配列番号：13 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： AGAAGCTTGG CCATGGCCGC GGCCCCGCCC GAGGTGCTG 39

【００７８】配列番号：14 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GTCCTGGCGC AGCACGATGT C 21

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、pULNBP80の挿入PstI断片中の PstI-Kp
nI領域（Ａ）及びpULNBP2-17の挿入PstI断片中の MluI-
PstI領域（Ｂ）の制限酵素地図、およびラクト−Ｎ−ビ
オシダーゼ遺伝子（太線部分）の位置を示した図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有する
   ポリペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を有す
   るポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する単離さ
   れた遺伝子。
2. 【請求項２】 ポリペプチドがストレプトマイセス属由
   来のものである請求項１記載の遺伝子。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号：１に記載したアミノ
   酸配列をコードすることを特徴とする請求項１又は請求
   項２記載の遺伝子。
4. 【請求項４】 アミノ酸配列をコードするＤＮＡが、配
   列番号：２に記載したＤＮＡ配列を有することを特徴と
   する請求項３記載の遺伝子。
5. 【請求項５】 配列番号：１に記載したアミノ酸配列の
   一部を含むラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するポリ
   ペプチド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポ
   リペプチドをコードする遺伝子。
6. 【請求項６】 配列番号：２に記載したＤＮＡ配列の一
   部を含む遺伝子であって、かつラクト−Ｎ−ビオシダー
   ゼ活性を有するポリペプチド又はその活性と機能的に同
   等の活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号：１に記載したアミノ
   酸配列に、１個もしくは複数のアミノ酸残基が欠失、付
   加、挿入もしくは置換の少なくとも１つがされており、
   かつラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するポリペプチ
   ド又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプ
   チドをコードする遺伝子。
8. 【請求項８】 請求項１〜請求項７いずれか１項記載の
   遺伝子とハイブリダイズすることができる、ラクト−Ｎ
   −ビオシダーゼ活性を有するポリペプチド又はその活性
   と機能的に同等の活性を有するポリペプチドをコードす
   る遺伝子。
9. 【請求項９】 請求項１〜請求項８いずれか１項記載の
   遺伝子を含んでなる組換えＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の組換えＤＮＡを挿入さ
    れてなる、微生物、動物細胞又は植物細胞を宿主細胞と
    する発現ベクター。
11. 【請求項１１】 請求項１０記載の発現ベクターにより
    形質転換されてなる形質転換体。
12. 【請求項１２】 請求項１〜請求項８いずれか１項記載
    の遺伝子を含むポリヌクレオチドを挿入した発現ベクタ
    ーを導入して得られる形質転換体を培養し、該培養物よ
    りラクト−Ｎ−ビオシダーゼ活性を有するポリペプチド
    又はその活性と機能的に同等の活性を有するポリペプチ
    ドを採取することを特徴とする、ラクト−Ｎ−ビオシダ
    ーゼ活性を有するポリペプチド又はその活性と機能的に
    同等の活性を有するポリペプチドの製造方法。