JP3414405B2

JP3414405B2 - トランスアミナーゼ及びアミノトランスフェラーゼ

Info

Publication number: JP3414405B2
Application number: JP52852797A
Authority: JP
Inventors: ウォーレン，パトリック，ブイ．; スワンソン，ロナルド，ブイ．
Original assignee: ディベルサコーポレーション
Priority date: 1996-02-09
Filing date: 1997-01-21
Publication date: 2003-06-09
Anticipated expiration: 2017-01-21
Also published as: AU718147B2; JP2000505291A; AU1836797A; IL125704A0; JP2003000288A; EP1015563A4; US5962283A; US6268188B1; WO1997029187A1; EP1015563A1; CA2246243A1; JP2003000289A

Description

【発明の詳細な説明】本出願は、1996年２月９日出願の係属中の米国特許出
願第08/599,171号の一部継続出願である1996年５月８日
出願の係属中の米国特許出願第08/646,590号の一部継続
出願である。

本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、その
ようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチ
ド、そのようなポリヌクレオチド及びポリペプチドの使
用、並びにそのようなポリヌクレオチド及びポリペプチ
ドの製造及び単離に関する。特に、本発明のポリヌクレ
オチド及びポリペプチドは、トランスアミナーゼ及び／
またはアミノトランスフェラーゼとして推定的に同定さ
れた。アミノトランスフェラーゼは、α−アミノ酸から
α−ケト酸へのアミノ基の転移を触媒する酵素である。
これらはトランスアミナーゼとも呼ばれる。

タンパク質中に共通して見られる20種のＬ−アミノ酸
のα−アミノ基はアミノ酸の酸化的分解の間に除去され
る。殆どのＬ−アミノ酸の異化における最初の段階であ
るα−アミノ基の除去は、アミノトランスフェラーゼ
（またはトランスアミナーゼ）により促進される。これ
らのアミノ基転移反応においては、α−アミノ基はα−
ケトグルタル酸のα−炭素原子に転移され、対応するア
ミノ酸のα−ケト酸類似体を残す。そのような反応にお
いては正味の脱アミノ化（すなわちアミノ基の喪失）は
なく、これはα−アミノ酸が脱アミノ化される間に前記
α−ケトグルタル酸がアミノ化されるからである。アミ
ノ基転移反応の効果は、多数の種類のアミノ酸からアミ
ノ基を一つの形態、すなわちＬ−グルタミン酸として集
めることである。グルタミン酸は生合成経路あるいは窒
素排出産物を形成し排泄する最終的な一連の反応へとア
ミノ基を送り込む。

細胞はいくつかの異なるアミノトランスフェラーゼを
含み、多くはアミノ基受容体としてα−ケトグルタル酸
に特異的である。アミノトランスフェラーゼは、もう一
方の基質、すなわちアミノ基を供与するＬ−アミノ酸に
ついての特異性において異なり、そのアミノ酸供与体に
従って命名される。アミノトランスフェラーゼにより触
媒される反応は自由に可逆的であり、約1.0（ΔG⁰'≒0k
J/mol）の平衡定数を有する。

アミノトランスフェラーゼは二分子ピンポン反応を触
媒する酵素の古典的な例である。そのような反応におい
ては、第一の基質は第二の基質が結合できる前に活性部
位から離れなければならない。すなわち、入ってくるア
ミノ酸は活性部位に結合し、そのアミノ基をピリドキサ
ールリン酸に与え、α−ケト酸の形態で離れる。その後
入ってくるα−ケト酸が結合し、ピリドキサミンリン酸
からアミノ基を受け取り、アミノ酸の形態で離れる。

血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ及びアス
パラギン酸アミノトランスフェラーゼレベルの測定は医
療における重要な診断方法であり、心臓障害の指標とし
て、また障害からの回復をモニターするために使用され
ている。

本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、それ
らの酵素活性の結果、トランスアミナーゼ及び／または
アミノトランスフェラーゼとして同定された。

本発明の一つの態様によれば、新規な酵素、並びにそ
れらの活性な断片、類似体及び誘導体が提供される。

本発明の別の態様によれば、本発明の酵素並びにその
ような酵素の活性な類似体及び断片をコードする、mRN
A、cDNA、ゲノムDNAを含む単離された核酸分子が提供さ
れる。

本発明のさらに別の態様によれば、組換え技術により
そのようなポリペプチドを生産する方法であって、本発
明の核酸配列を含む組換え原核生物及び／または真核生
物宿主細胞を、前記酵素の発現とその後の前記酵素の回
収を促進する条件下で培養することを含む方法が提供さ
れる。

本発明のさらに別の態様によれば、α−アミノ酸から
α−ケト酸へアミノ基を転移させるために、そのような
酵素あるいはそのような酵素をコードするポリヌクレオ
チドを使用する方法が提供される。殆どのトランスアミ
ナーゼはＬ−アミノ酸を基質として使用するが、以下に
記載するように本発明のトランスアミナーゼはＤ−アミ
ノ酸を基質として使用するように変換することができ、
これにより例えば合成ピレスロイドの製造、及びβ−ラ
クタム抗生物質の構成成分として等、その用途が拡大さ
れるものである。本発明のトランスアミナーゼは高温
下、及び有機溶媒中で安定であり、従って医薬、農薬及
びその他の化学産業で使用される光学的に純粋なキラル
化合物の生産のためにＬ−及び／またはＤ−アミノ酸と
ともに使用するのに優れている。

本発明のさらに別の態様によれば、本発明の核酸配列
にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸分子を含む
核酸プローブも提供される。

本発明のさらに別の態様によれば、例えば、ヌクレオ
チド配列の特定の領域すなわち保存配列領域を使用する
ことにより異なった生物からの類似酵素をコードする可
能性のある類似した配列を同定するためのプローブを生
成することのような科学研究に関連したin vitroの目的
のために前述の酵素、あるいは前述の酵素をコードする
ポリヌクレオチドを使用する方法が提供される。

本発明のこれらの態様及びその他の態様は本明細書の
教示から当業者に明らかであろう。

添付の図面は本発明の態様を例示するものであり、請
求の範囲により画定される本発明の範囲を限定すること
を意図するものではない。

図１は、本発明のAquifexアスパラギン酸トランスア
ミナーゼＡの完全長DNA（配列番号17）及び対応する推
定アミノ酸配列（配列番号25）を示す。配列決定は本発
明の全ての配列について378自動DNAシークエンサー（Ap
plied Biosystems,Inc.）を使用して行った。

図２は、Aquifexアスパラギン酸アミノトランスフェ
ラーゼＢの完全長DNA（配列番号18）及び対応する推定
アミノ酸配列（配列番号26）を示す。

図３は、Aquifexアデノシル−８−アミノ−７−オキ
ソノナノエートアミノトランスフェラーゼの完全長DNA
（配列番号19）及び対応する推定アミノ酸配列（配列番
号27）を示す。

図４は、Aquifexアセチルオルニチンアミノトランス
フェラーゼの完全長DNA（配列番号20）及び対応する推
定アミノ酸配列（配列番号28）を示す。

図５は、Ammonifex degensiiアスパラギン酸アミノト
ランスフェラーゼの完全長DNA（配列番号21）及び対応
する推定アミノ酸配列（配列番号29）を示す。

図６は、Aquifexグルコサミン：フルクトース−６−
リン酸アミノトランスフェラーゼの完全長DNA（配列番
号22）及び対応する推定アミノ酸配列（配列番号30）を
示す。

図７は、Aquifexヒスチジノールリン酸アミノトラン
スフェラーゼの完全長DNA（配列番号23）及び対応する
推定アミノ酸配列（配列番号31）を示す。

図８は、Pyrobacullum aerophilum分枝鎖アミノトラ
ンスフェラーゼの完全長DNA（配列番号24）及び対応す
る推定アミノ酸配列（配列番号32）を示す。

図９は、Ammonifex degensiiヒスチジノールリン酸ア
ミノトランスフェラーゼの完全長DNA（配列番号35）及
び対応する推定アミノ酸配列（配列番号36）を示す。

図10は、Aquifexアスパラギン酸アミノトランスフェ
ラーゼの完全長DNA（配列番号39）及び対応する推定ア
ミノ酸配列（配列番号40）を示す。

図11は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼを使用してタ
ンパク質のアミノトランスフェラーゼ活性を調べるため
に使用したアッセイの説明図である。

用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖生産に関与するDN
Aのセグメントを意味するものであり、コード領域に先
行あるいは後続する領域（リーダー及びトレイラー）並
びに個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配
列（イントロン）を含む。

RNAポリメラーゼが二つのコード配列を単一のmRNAに
転写し、これが両方のコード配列に由来するアミノ酸を
有する単一のポリペプチドに翻訳される場合は、コード
配列がもう一つのコード配列に「作動可能に結合」され
ている。コード配列は、発現された配列が最終的にプロ
セシングされて所望のタンパク質を生成する限り、互い
に隣接している必要はない。

「組換え」酵素とは、組換えDNA技術により生産され
た酵素、すなわち所望の酵素をコードする外来DNA構築
物により形質転換された細胞から生産された酵素をい
う。「合成」酵素は、化学合成により製造されたもので
ある。

特定の酵素のDNA「コード配列」あるいは特定の酵素
を「コードするヌクレオチド配列」は、適当な調節配列
の制御下に置かれたときに転写され、酵素に翻訳される
DNA配列である。

本発明の一つの態様によれば、図１〜８の推定アミノ
酸配列（配列番号17〜32）を有する成熟酵素をコードす
る、単離された核酸（ポリヌクレオチド）が提供され
る。

本発明の別の態様によれば、本発明の酵素をコードす
る単離されたポリヌクレオチドが提供される。寄託物は
本発明の酵素をコードするDNAを含むゲノムクローンの
混合物である。それぞれのDNAを含む各ゲノムクローン
をpQEベクター（Quiagen,Inc.,Chatsworth,CA）に挿入
した。寄託物はAmerican Type Culture Collection,123
01 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,USAに19
95年12月13日に寄託し、ATCC受託番号___を得た。

寄託は特許手続きのための微生物の寄託の国際的承認
に関するブダペスト条約の条件下で行われた。これらの
株は特許発行に際し、無効にされることなく、制限ある
いは条件なしに公衆に分譲される。これらの寄託は単に
当業者の便宜のために行われたものであり、35U.S.C§1
12により寄託が必要であると認めたものではない。寄託
物に含まれるポリヌクレオチドの配列、並びにそれによ
りコードされるポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細
書の配列の記載と矛盾する場合に優先するものである。
寄託物を製造し、使用し、販売するためにはライセンス
を必要とするが、ここでそのようなライセンスを認可す
るものではない。

本発明のポリヌクレオチドは、以下の生物に由来する
ゲノムDNAライブラリーから初めて回収された。

Aquifex VF5はイタリアのVulcanoで単離された真生細
菌である。これは、グラム陰性、桿状の化学合成無機力
源無機栄養海洋生物で、基質としてO₂、気体相にH₂/CO₂
＋0.5％O₂を含む高塩濃度培地中で約85〜90℃（T_max＝9
5℃）においてpH6.8で最適に増殖する。

Ammonifex degensii KC4は、インドネシアのJavaで単
離された新規な真生細菌生物である。このグラム陰性の
化学合成無機力源無機栄養生物は三つの呼吸系を有す
る。この細菌は硝酸塩、硫酸塩、及び硫黄を利用でき
る。この生物は基質として0.2％硝酸塩、気体相にH₂/CO
₂を含む低塩濃度培地中で70℃においてpH7.0で最適に増
殖する。

Pyrobaculum aerophilium IM2は、イタリアのIschia
Marontiで単離された好熱性硫黄古細菌（Crenarchaeot
a）である。基質として硝酸塩、酵母エキス、ペプトン
及びO₂、気体相にN₂/CO₂、O₂を含む低塩濃度培地中で10
0℃においてpH7.0で最適に増殖する桿状生物である。

従って、前記ポリヌクレオチド及びそれによりコード
される酵素はそれらが単離された生物により同定され、
以下の記載において、「VF5/ATA」（図１及び配列番号1
7及び25）、「VF5/AAB」（図２及び配列番号18及び2
6）、「VF5/A87A」（図３及び配列番号19及び27）、「V
F5/AOA」（図４及び配列番号20及び28）、「KC4/AA」
（図５及び配列番号21及び29）、「VF5/GF6PA」（図６
及び配列番号22及び30）、「VF5/HPA」（図７及び配列
番号23及び31）、「IM2/BCA」（図８及び配列番号24及
び32）、「KC4/HPA」（図９及び配列番号35及び36）、
及び「VF5/AA」（図10及び配列番号39及び40）と記載す
る場合がある。

本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、表１
に示すように、公知の遺伝子及びそれによりコードされ
るタンパク質にヌクレオチド及びタンパク質レベルで同
一性を示す。

表１に特定した全てのクローンは、トランスアミナー
ゼあるいはアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードする。

本発明の酵素をコードする核酸分子を単離する一つの
手段は、当分野で認知された方法を使用して、天然また
は人工的に設計されたプローブにより遺伝子ライブラリ
ーを検索することである（例えば、Current Protocols
in Molecular Biology,Ausubel F.M.ら（EDS.）Green P
ublishing Company Assoc.and John Wiley Interscienc
e,New York,1989,1992参照）。配列番号17〜24、35及び
39のポリヌクレオチド及びそれらの断片（連続した少な
くとも12個のヌクレオチドを含む）が特に有用なプロー
ブであることは当業者に理解されるであろう。この目的
に特に有用なその他のプローブは、配列番号１〜９、33
〜34及び37〜38の配列のハイブリダイズ可能な断片であ
る（すなわち、連続した少なくとも12個のヌクレオチド
を含む）。

本明細書に開示した特定の核酸配列にハイブリダイズ
する核酸配列については、ハイブリダイゼーションは低
いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、
あるいは高いストリンジェンシーの条件下で行い得る。
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションの例とし
て、固定した変性核酸を含むポリマーメンブランを最初
に、0.9M NaCl、50mM NaH₂PO₄、pH7.0、5.0mM Na₂EDT
A、0.5％SDS、10×Denhard's及び0.5mg/mLポリリボアデ
ニル酸を含む溶液中で45℃で30分間プレハイブリダイズ
させる。その後、約２×10⁷cpm（比活性４−９×10⁸cpm
/ug）の³²P末端標識オリゴヌクレオチドプローブを溶液
に加える。12〜16時間インキュベートした後、メンブラ
ンを0.5％SDSを含む１×SET（150mM NaCl、20mMトリス
塩酸塩、pH7.8、1mM Na₂EDTA）中で室温で30分間洗浄
し、その後新しい１×SET中でオリゴヌクレオチドプロ
ーブのためにTm−10℃（Tmは−10℃）で30分間洗浄す
る。ハイブリダイゼーションシグナルの検出のために面
ブランをオートラジオグラフィーフィルムに露光する。

ストリンジェントな条件とは、少なくとも90％の同一
性、好ましくは少なくとも95％の同一性、最も好ましく
は少なくとも97％の同一性が配列間に存在するときにの
みハイブリダイゼーションが起こることを意味する。本
明細書においてその全体が参考のために援用されるJ.Sa
mbrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d
Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）を参照の
こと。

本明細書で使用するように、第一のDNA（RNA）配列と
もう一つのDNA（RNA）配列とを例えばBLASTNにより互い
に適切に整列させたときに、第一の配列の塩基と他方の
配列の塩基との間にそれぞれ少なくとも70％、及び好ま
しくは少なくとも80％もしくは90％の同一性がある場合
に、第一のDNA（RNA）配列は他方のDNA（RAN）配列に少
なくとも70％、好ましくは少なくとも80％同一であるも
のとする。

本発明は、参照ポリヌクレオチドとは異なるポリヌク
レオチドであるが、その変化がサイレント変化、例えば
該ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を
変えないような変化であるポリヌクレオチドに関する。
本発明はまた、参照ポリヌクレオチドによりコードされ
たポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失、
融合及び切断を起こすようなヌクレオチド変化に関す
る。本発明の好ましい態様においては、これらのポリペ
プチドは、参照ポリペプチドによりコードされたポリペ
プチドと同じ生物学的活性を保持する。

本発明のポリヌクレオチドは、表１に挙げた生物から
のゲノム遺伝子ライブラリーから回収されたものであ
る。遺伝子ライブラリーはλZAP IIクローニングベクタ
ー（Stratagene Cloning Systems）中に生成させた。こ
れらのライブラリーについて集団切り出しを行い、pBlu
escriptファージミド中にライブラリーを生成した。本
明細書に以下に記載するプロトコール／方法に従ってラ
イブラリーを生成し、切り出しを行った。

本発明のポリヌクレオチドは、RNAあるいはDNAの形態
であり得、DNAはcDNA、ゲノムDNA、及び合成DNAを包含
する。このDNAは二本鎖あるいは一本鎖であってよく、
一本鎖である場合コード鎖、あるいは非コード鎖（アン
チセンス）であってもよい。成熟酵素をコードするコー
ド配列は、図１〜８に記載したコード配列（配列番号17
〜24）に同一であってもよく、あるいは遺伝子コードの
重複もしくは縮重の結果として図１〜10のDNA（配列番
号17〜24、35及び39）と同じ成熟酵素をコードする異な
るコード配列であってもよい。

図１〜10の成熟酵素をコードするポリヌクレオチド
（配列番号25〜32、36及び40）は、限定するものではな
いが、成熟酵素のコード配列のみ；成熟酵素のコード配
列及び、リーダー配列またはプロタンパク質配列のよう
な追加のコード配列；成熟酵素のコード配列（及び任意
に追加のコード配列）及び、イントロンや成熟酵素のコ
ード配列の非コード配列5'及び／または3'のような非コ
ード配列を包含し得る。

従って、用語「酵素（タンパク質）をコードするポリ
ヌクレオチド」は、酵素のコード配列のみを含むポリヌ
クレオチド、並びに追加のコード配列及び／または非コ
ード配列を含むポリヌクレオチドを包含するものであ
る。

本発明はさらに、図１〜10の推定アミノ酸配列（配列
番号25〜32、36及び40）を有する酵素の断片、類似体、
及び誘導体をコードする上記したポリヌクレオチドの変
異体に関する。前記ポリヌクレオチドの変異体は、前記
ポリヌクレオチドの天然の対立遺伝子変異体、あるいは
前記ポリヌクレオチドの非天然の変異体であってよい。

従って本発明は、図１〜10に示したものと同じ成熟酵
素をコードするポリヌクレオチド（配列番号17〜24、35
及び39）、並びに図１〜10の酵素の断片、誘導体あるい
は類似体をコードする、そのようなポリヌクレオチド
（配列番号17〜24、35及び39）の変異体を包含する。そ
のようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異
体、及び付加あるいは挿入変異体を包含する。

上記に示したように、前記ポリヌクレオチドは、図１
〜10に示したコード配列（配列番号17〜24、35及び39）
の天然の対立遺伝子変異体であるコード配列を有し得
る。当分野で知られるように、対立遺伝子変異体はポリ
ヌクレオチド配列の代替的な形態であり、コードされた
酵素の機能を実質的に変えることのない１個以上のヌク
レオチドの置換、欠失、あるいは付加を有し得るもので
ある。また、特異的な方法やその他の進化的（evolutio
n）方法を使用して、機能において大きな変化を生じ得
るDNA配列のごくわずかな変化を生成することができ
る。

本発明の完全長遺伝子の断片は、cDNAまたはゲノムラ
イブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして使
用して完全長DNAを単離し、また前記遺伝子に対して高
い配列類似性を有するかあるいは類似した生物学的活性
を有するその他のDNAを単離することができる。このタ
イプのプローブは好ましくは少なくとも10、好ましくは
少なくとも15、さらにより好ましくは少なくとも30塩基
を含み、例えば少なくとも50の塩基を含んでもよい。こ
のプローブは、完全長転写体に対応するDNAクローン、
並びに調節領域及びプロモーター領域、エキソン及びイ
ントロンを含む完全な遺伝子を含むゲノムクローンを同
定するのにも使用し得る。スクリーニングは例えば、公
知のDNA配列を使用してオリゴヌクレオチドプローブを
合成し、遺伝子のコード領域を単離することを含む。本
発明の前記遺伝子もしくは遺伝子配列の部分に相補的で
あるか又は同一の配列を有する標識されたオリゴヌクレ
オチドを使用してゲノムDNAのライブラリーをスクリー
ニングしてライブラリーのどのメンバーにプローブがハ
イブリダイスするかを判定する。

また、そのようなプローブは分析的に検出可能な試薬
により標識でき、そして好ましくはそのように標識し
て、プローブの同定を容易にすることもできる。有用な
試薬としては、限定するものではないが、放射能、蛍光
染料あるいは検出可能な産物の形成を触媒することがで
きる酵素等が挙げられる。前記プローブはこのように他
のソースからのDNAの相補的コピーを単離するため、あ
るいは関連する配列についてそのようなソースをスクリ
ーニングするのに有用である。

本発明はさらに、少なくとも70％、好ましくは少なく
とも90％、より好ましくは少なくとも95％の同一性が配
列間にある場合に、上記した配列にハイブリダイズする
ポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジ
ェントな条件下で上記したポリヌクレオチドにハイブリ
ダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書で使用
するように、用語「ストリンジェントな条件」は、配列
間に少なくとも95％の同一性、好ましくは少なくとも97
％の同一性が存在するときにのみハイブリダイゼーショ
ンが起こることを意味する。好ましい態様における上記
したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレ
オチドは、図１〜10のDNA（配列番号17〜24、35及び3
9）によりコードされた成熟酵素と実質的に同じ生物学
的機能あるいは活性を有する酵素をコードするものであ
る。

あるいは、前記ポリヌクレオチドは少なくとも15塩
基、好ましくは少なくとも30塩基、より好ましくは少な
くとも50塩基を有し得、本発明のポリヌクレオチドのい
ずれの部分にもハイブリダイズし得、上記したようにそ
れに対して同一性を有し、そして活性を保持していても
よく、していなくてもよい。例えばそのようなポリヌク
レオチドは、配列番号17〜24、35及び39のポリヌクレオ
チドのためのプローブとして、例えばポリヌクレオチド
を回収するために使用でき、あるいは診断プローブ、あ
るいはPCRプライマーとして使用できる。

従って本発明は、配列番号25〜32、36及び40の酵素を
コードするポリヌクレオチドに少なくとも70％の同一
性、好ましくは少なくとも90％の同一性、より好ましく
は95％の同一性を有するポリヌクレオチド、並びにその
断片に関し、これらの断片は少なくとも15塩基、好まし
くは少なくとも30塩基、最も好ましくは少なくとも50塩
基を有し、本発明のポリヌクレオチドの任意の部分に対
してストリンジェントな条件下で少なくとも90％同一、
好ましくは少なくとも95％同一、最も好ましくは少なく
とも97％同一である。

本発明はさらに、図１〜10（配列番号17〜24、35及び
39）の推定アミノ酸配列を有する酵素、並びにそのよう
な酵素の断片、類似体、及び誘導体に関する。

図１〜10の酵素（配列番号25〜32、36及び40）をいう
場合の用語「断片」、「誘導体」及び「類似体」は、そ
のような酵素と実質的に同じ生物学的機能または活性を
保持する酵素を意味する。従って類似体は、プロタンパ
ク質部分を切断することにより活性化されて活性な成熟
酵素を生成することができるプロタンパク質を包含す
る。

本発明の酵素は、組換え酵素、天然酵素、あるいは合
成酵素であってよく、好ましくは組換え酵素である。

図１〜10の酵素（配列番号25〜32、36及び40）の断
片、誘導体、または類似体は、（ｉ）１以上のアミノ酸
残基が保存もしくは非保存アミノ酸残基（好ましくは保
存アミノ酸残基）により置換され、そのような置換アミ
ノ酸残基は遺伝子コードによりコードされていてもいな
くてもよいもの、あるいは（ii）１以上のアミノ酸残基
が置換基を含むもの、あるいは（iii）成熟酵素が別の
化合物、例えば酵素の半減期を延長するための化合物
（例えばポリエチレングリコール）に融合したもの、あ
るいは（vi）追加的なアミノ酸、例えばリーダー配列も
しくは分泌配列、または成熟酵素もしくはプロタンパク
質配列の精製に使用される配列が成熟酵素に融合された
ものであってよい。そのような断片、誘導体、及び類似
体は、本明細書の記載から当業者の理解の範囲にあるも
のとみなされる。

本発明の酵素及びポリヌクレオチドは好ましくは単離
された形態で提供され、好ましくは均質なものに精製さ
れたものである。

用語「単離された」は、物質が最初にあった環境（天
然物の場合はその天然の環境）から取り出されているこ
とを意味する。例えば、生きた動物中に存在する天然の
ポリヌクレオチドまたは酵素は単離されたものではない
が、天然系において共存する物質の一部あるいは全部か
ら分離された同じポリヌクレオチドまたは酵素は単離さ
れたものである。そのようなポリヌクレオチドはベクタ
ーの部分であってもよく、及び／またはそのようなポリ
ヌクレオチドまたは酵素は組成物の一部であってもよ
く、そのようなベクターまたは組成物がその天然の環境
の一部でなくても単離されたものである。

本発明の酵素は、配列番号25〜32、36及び40の酵素
（特に成熟酵素）、並びに配列番号25〜32、36及び40の
酵素に少なくとも70％の類似性（好ましくは少なくとも
70％の同一性）、より好ましくは配列番号25〜32、36及
び40の酵素に少なくとも90％の類似性（より好ましくは
少なくとも90％の同一性）、さらに好ましくは配列番号
25〜32、36及び40の酵素に少なくとも95％の類似性（さ
らに好ましくは少なくとも95％の同一性）を有する酵素
を包含し、さらに少なくとも30アミノ酸、より好ましく
は少なくとも50アミノ酸を一般的に含むそのような酵素
の部分を包含する。

当該技術分野において公知のように、２種類の酵素の
間の“類似性”は、一方の酵素のアミノ酸配列及びその
保存アミノ酸の置換を第２の酵素の配列と比較すること
により決定する。

変異体、すなわち“断片”、“類似”もしくは“誘
導”ポリペプチド、と参照ポリペプチドとは、いかなる
組み合わせで存在していてもよい１以上の置換、付加、
欠質、融合及びトランケーションによってアミノ酸配列
が異なり得るものである。

好ましい変異体の中には、保存アミノ酸の置換により
参照とは異なるものがある。このような置換は、ポリペ
プチド中の所定のアミノ酸を類似の特徴を有する別のア
ミノ酸で置換するものである。保存的置換として典型的
に見られるものは、脂肪族アミノ酸Ala、Val、Leu及びI
leの中でのあるものの別のものへの置き換え；ヒドロキ
シル残基Ser及びThrの交換、酸性残基Asp及びGluの交
換、アミド残基Asn及びGlnの間での置換、塩基性残基Ly
s及びArgの交換並びに芳香族残基Phe、Tyrの間での置き
換えである。

最も好ましい変異体は、参照ポリペプチドと異なる
が、それと同じ生物学的機能及び活性を保持するもので
ある。

本発明の酵素の断片又は部分はペプチド合成による対
応全長酵素の製造に用いることができ、したがって、こ
れらの断片は全長酵素を製造するための中間体として用
いることができる。本発明のポリヌクレオチドの断片又
は部分は本発明の全長ポリヌクレオチドの合成に用いる
ことができる。

また、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベ
クター、本発明のベクターを用いて遺伝子工学的に処理
された宿主細胞及び組換え技術による本発明の酵素の製
造にも関する。

宿主細胞は本発明のベクターを用いて遺伝し工学的に
処理（遺伝子導入、又は形質転換、又はトランスフェク
ション）され、ここで、ベクターは例えば発現ベクター
のようなクローニングベクターであり得る。このベクタ
ーは、例えば、プラスミド、ファージ等の形態であり得
る。工学的に処理された宿主細胞は、プロモーターの活
性化、形質転換体の選択又は本発明の遺伝子の増幅に適
するように改変された通常の栄養培地において培養する
ことができる。温度、pH等の培養条件は発現用に選択さ
れた宿主細胞に関して従来用いられるものであり、当業
者には明らかであろう。

本発明のポリヌクレオチドは組換え技術による酵素の
製造に用いることができる。このため、例えば、このポ
リヌクレオチドは酵素を発現させるための様々な発現ベ
クターのいずれかに含有させることができる。このよう
な発現ベクターには、染色体、非染色体及び合成DNA配
列、例えば、SV40の誘導体；細菌プラスミド；ファージ
DNA;バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドと
ファージDNA、ウイルスDNA（例えばワクシニア、アデノ
ウイルス、鶏痘ウイルス、及び仮性狂犬病ウィルスのDN
A）との組み合わせに由来するベクターが含まれる。し
かしながら、宿主細胞において複製可能かつ生存可能で
ある限り、他のいかなるベクターをも用いることができ
る。

適切なDNA配列を様々な手順によりこのベクターに挿
入することができる。一般には、DNA配列は当該技術分
野において公知の手順により適切な制限エンドヌクレア
ーゼ部位（１ヶ所もしくは複数箇所）に挿入する。この
ような手順及びその他の手順は当業者の範囲内にあるも
のと認められる。

この発現ベクター中のDNA配列は、mRNAの合成を指令
するための適切な発現制御配列（１つもしくは複数）
（プロモーター）に作動可能に連結する。このようなプ
ロモーターの代表的な例としては、LTR又はSV40プロモ
ーター、大腸菌lac又はtrp、ファージラムダP_Lプロモー
ター、及び原核もしくは真核細胞又はそれらのウイルス
において遺伝子の発現を制御することが知られる他のプ
ロモーターを挙げることができる。また、発現ベクター
は、翻訳を開始させるためのリボソーム結合部位及び転
写ターミネーターをも含む。また、このベクターは発現
を増幅させるのに適する配列を含んでいてもよい。

加えて、発現ベクターは、好ましくは、形質転換宿主
細胞を選択するための表現型形質を付与する１以上の選
択可能なマーカー遺伝子、例えば、真核細胞の培養につ
いてはジヒドロ葉酸還元酵素もしくはナオマイシン耐
性、又は大腸菌におけるテトラサイクリンもしくはアン
ピシリン耐性を含む。

上述の適切なDNA配列及び適切なプロモーター又は制
御配列を含むベクターは、適切な宿主の形質転換に用い
てその宿主にタンパク質を発現させることができる。

適切な宿主の代表的な例として、細菌細胞、例えば、
大腸菌、ストレプトマイセス、枯草菌；真菌細胞、例え
ば、酵母；昆虫細胞、例えば、ドロソフィラ（Drosophi
la）S2及びスポドプテラ（Spodoptera）Sf9;動物細胞、
例えば、CHO、COSもしくはボウズ（Bowes）メラノー
マ；アデノウイルス；植物細胞等を挙げるこたができ
る。

特には、本発明は、上に広範に記述される配列の１以
上を含む組換え構築体をも包含する。この構築体は、本
発明の配列が挿入されているプラスミドもしくはウイル
スベクターのようなベクターを順方向又は逆方向に含
む。この実施態様の好ましい態様においては、この構築
体は、その配列に作動可能に連結する、例えばプロモー
ターを含む調節配列をさらに含む。多数の適切なベクタ
ー及びプラスミドが当業者に公知であり、かつ商業的に
利用可能である。例として以下のベクター、即ち、細菌
性:pQE70、pQE60、pQE−９（キアジェン（Qiagen））、
pBluescript II KS、ptrc99a、pKK223−３、pDR540、pR
IT2T（ファルマシア（Pharmacia））；真核性:pXT1、pS
G5（ストラタジーン（Stratagene）pSVK3、pBPV、pMS
G、pSVL、SV40（ファルマシア）が提供される。しかし
ながら、宿主細胞において複製可能かつ生存可能である
限り、他のいかなるプラスミド又はベクターをも用いる
ことができる。

プロモーター領域は、CAT（クロラムフェニコール転
移酵素）ベクター又は選択可能なマーカーを有する他の
ベクターを用いて、あらゆる所望の遺伝子から選択する
ことができる。適切なベクターの２つはpKK232−８及び
pCM7である。特定の命名された細菌性プロモーターに
は、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダP_R、P_L及びtrpが
含まれる。真核性プロモーターには、CMV最初期、HSVチ
ミジンキナーゼ、初期及び後期SV40、レトロウイルスに
由来するLTR、及びマウスメタロチオネイン−Ｉが含ま
れる。適切なベクター及びプロモーターの選択は十分に
当該技術分野における通常の技術の水準内にある。

さらなる実施態様においては、本発明は上述の構築体
を含む宿主細胞に関する。この宿主細胞は哺乳類動物細
胞のような高等真核生物細胞であっても酵母細胞のよう
な下等真核生物細胞であってもよく、あるいは宿主細胞
は細菌細胞のような原核生物細胞であってもよい。宿主
細胞への構築体の導入は、リン酸カルシウムトランスフ
ェクション、DEAE−デキストラン介在トランスフェクシ
ョン、又は電気穿孔法によって行うことができる（Davi
s,L.,Dibner,M.,Battey,I.,分子生物学における基本的
方法（Basic Methods in Molecular Biology），（198
6））。

宿主細胞中の構築体は通常の方法でその組換え配列に
よってコードされる遺伝子産物の製造に用いることがで
きる。あるいは、本発明の酵素は通常のペプチド合成機
によって合成により製造することができる。

成熟タンパク質は、哺乳類動物細胞、酵母、細菌、又
は他の細胞中で、適切なプロモーターの制御の下におい
て発現させることができる。本発明のDNA構築体から誘
導されるRNAを用いて、細胞非含有翻訳系をこのような
タンパク質の製造に用いることも可能である。原核性及
び真核性宿主と共に用いるのに適するクローニング及び
発現ベクターは、Sambrookら，分子クローニング；実験
マニュアル（Molecular Cloning;A Laboratory Manua
l），第２版,Cold Spring Harbor,N.Y.,（1989）に記述
されており、その開示は参考として本明細書に組み込ま
れる。

高等真核生物による本発明の酵素をコードするDNAの
転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することに
より増加する。エンハンサーは、プロモーターに作用し
てその転写を増大させる、通常約10ないし300bpの、DNA
のシス作用性要素である。その具体例には、複製起点の
100ないし270bp後期側のSV40エンハンサー、サイトメガ
ロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の
後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルス
エンハンサーが含まれる。

一般に、組換え発現ベクターは、複製起点及び宿主細
胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカー、例えば
大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子及びS.セレビシエ（S.
cerevisiae）TRP1遺伝子、並びに下流構造遺伝子の転写
を指令するための高発現遺伝子に由来するプロモーター
を含む。このようなプロモーターは、３−ホスホグリセ
レートキナーゼ（PGK）のような解糖酵素、α−因子、
酸ホスホターゼ、又は熱ショックタンパク質をコードす
るオペロンから誘導することができる。異種構造配列
を、適切な位相において、転写開始及び終始配列、並び
に好ましくは、翻訳された酵素の分泌を導くことが可能
なリーダー配列で組み立てる。場合により、この異種配
列はＮ−末端同定ペプチドを含む融合酵素をコードして
もよく、このＮ−末端同定ペプチドは所望の特徴、例え
ば発現した組換え産物の安定化もしくは単純化された精
製、を付与する。

細菌用に有用な発現ベクターは、所望のタンパク質を
コードする構造DNA配列を、適切な翻訳開始及び終止シ
グナルと共に、機能的プロモーターを含む作動可能な読
み取り相に挿入することにより構築する。このベクター
は、そのベクターの維持を確実なものとし、かつ、所望
であれば、宿主内での増幅をもたらすために、１以上の
表現型選択可能マーカー及び複製起点を有する。形質転
換に適切な原核生物宿主には、他のものも選択材料とし
て用いることができるが、大腸菌、枯草菌、ネズミチフ
ス菌、並びにシュードモナス属、ストレプトマイセス
属、及びスタフィロコッカス属内の様々な種が含まれ
る。

代表的かつ非限定的な例として、細菌用に有用な発現
ベクターは、公知のクローニングベクターpBR322（ATCC
37017）の遺伝的要素を含む市販のプラスミドに由来す
る細菌複製起点及び選択可能マーカーを含んでもよい。
このような商業的なベクターには、例えば、pKK233−３
（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fi
ne Chemicals）、ウプサラ（Uppsala）、スウェーデ
ン）及びpGEM1（プロメガ・バイオテック（Promega Bio
tec）、マジソン、WI、USA）が含まれる。これらのpBR3
22“主鎖”部を適切なプロモーター及び発現させようと
する構造配列に結合させる。

適切な宿主株を形質転換し、その宿主株を適切な細胞
密度まで成長させた後、選択されたプロモーターを適切
な手段（例えば、温度シフト及び化学的誘発）により誘
発させ、細胞をさらなる期間培養する。

細胞を、典型的には遠心によって回収し、物理的もし
くは化学的手段によって破壊し、それにより生じた粗製
抽出物をさらなる精製のために保持する。

タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、
凍結−解凍サイクル処理、超音波処理、機械的破壊、又
は細胞溶解剤の使用を含むあらゆる都合の良い方法で破
壊することができ、そのような方法は当業者には公知で
ある。

様々な哺乳類動物細胞培養系も組換えタンパク質の発
現に用いることができる。哺乳類動物発現系の例には、
Gluzman,Cell,23:175（1981）に記述されるサル腎臓線
維芽細胞のCOS−７系、並びに適合するベクターを発現
させることが可能な他の細胞系、例えば、C127、3T3、C
HO、HeLa及びBHK細胞系が含まれる。哺乳類動物発現ベ
クターは、複製起点、適切なプロモーター及びエンハン
サーを含み、かつあらゆる必要なリボソーム結合部位、
ポリアデニル化部位、スプライス供与及び受容部位、転
写終止配列、並びに５′隣接非転写配列をも含む。必要
とされる非転写遺伝的要素を提供するのにSV40由来のDN
A配列及びポリアデニル化部位を用いることができる。

酵素は、組換え細胞の培養物から、硫酸アンモニウム
もしくはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンもしくはカ
チオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロ
マトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、
アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタ
イソクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィ
ーを含む方法によって回収及び精製することができる。
必要に応じて、成熟タンパク質の高次構造を完成させる
に当たり、タンパク質の再折り畳み工程を用いることが
できる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）
を最終精製工程に用いることができる。

本発明の酵素は、天然から精製された生成物であって
も、化学合成法の生成物であっても、組換え技術によっ
て原核生物もしくは真核生物宿主から（例えば、培養中
の細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳類動物細胞によ
り）産生されるものであってもよい。組換え体産生手順
において用いられる宿主に依存して、本発明の酵素はグ
リコシル化されたものでも、非グリコシル化のものであ
ってもよい。また、本発明の酵素は開始メチオニンアミ
ノ酸残基を含んでいてもいなくてもよい。

トランスアミナーゼはアミノ酸及びアミノ糖の代謝に
おける一群の鍵酵素であり、微生物から哺乳類動物まで
の全ての生物において見出される。このアミノ基転移反
応において、アミノ基はアミノ酸からα−ケト酸に転移
される。アンモニアを放出することなくアミノ基の転移
に介在するのに、ピリドキサールリン酸が補因子として
必要である。

アミノ酸には、現在、動物飼料の添加物、ヒトの栄養
補助剤、輸液の成分、並びに医薬及び農業用製品を製造
するための合成中間体としての用途がある。例えば、Ｌ
−グルタミン酸はヒトの食物の香味増強剤として知られ
る最良のものである。Ｌ−リジン及びＬ−メチオニンは
動物飼料及びヒトの補助剤に対する大容量添加物であ
る。Ｌ−トリプトファン及びＬ−トレオニンは同じよう
な潜在的な用途を有する。Ｌ−フェニルアラニン及びＬ
−アルパラギン酸は、低カロリー甘味料アスパルテーム
及び特定のアミノ酸をも含む組成を有する他の見込みの
ある低カロリー甘味料の製造における鍵化合物として、
非常に重要な市場潜在力を有する。輸液では、ヒトの食
餌において必須のものを含む広範囲のアミノ酸が必要と
される。

トランスアミナーゼは高度に立体選択的であり、基質
としてＬ−アミノ酸を最も用いる。1995年12月７日に出
願され、“組み合わせ酵素の開発”と題する、通常に譲
渡された係属する米国仮出願第60/008,316号（その開示
の全体は参考として本明細書に組み込まれる）に開示さ
れるアプローチを用いて、本発明のトランスアミナーゼ
を、Ｄ−アミノ酸を基質として用いるように変換するこ
とができる。そのような変換は、多数の広範はトランス
アミナーゼ応用を可能にする。例えば、Ｄ−パリンを合
成ピレスロイドの製造において用いることができる。Ｄ
−フェニルグリシン及びその誘導体はβ−ラクタム抗生
物質の成分として有用であり得る。さらに、この熱安定
性トランスアミナーゼは高温及び有機溶媒中で優れた安
定性を有する。したがって、これらは、医薬、農業、及
び他の化学的な製造において用いられる光学的に純粋な
キラル化合物の製造にＬ−及び／又はＤ−アミノ酸のい
ずれかを用いるのにより適している。

アミノ酸及びそれらの誘導体の工業的規模での製造に
おいてトランスアミナーゼを用いるのには多くの理由が
ある。

１）トランスアミナーゼは対応するα−ケト酸からの
Ｄ−もしくはＬ−アミノ酸の立体選択的な合成を触媒す
ることができる。従って、Ｌ−もしくはＤ−異性体は全
く生成されず、また分割は必要ない。

２）トランスアミナーゼは均一に高い触媒速度を有
し、酵素1mg当たり毎分400μモル以下の基質を変換する
ことができる。

３）必要とされる多くのα−ケト酸類は化学合成によ
り低コストで都合よく製造することができる。

４）トランスアミナーゼを用いる固定化酵素法のため
の資本投資は大規模発酵法のためのものよりも非常に低
く、そのバイオリアクターの生産性はしばしば１桁高い
オーダーである。

５）この技術は、様々な特異性を持つトランスアミナ
ーゼが存在するため、一般に広範囲のＤ−もしくはＬ−
アミノ酸に適用することができる。このような広い範囲
は、同じ装置及び、しばしば、同じ生体触媒を用いて、
多くの異なるＬ−もしくはＤ−アミノ酸を製造すること
を可能にする。

本発明の配列に相当する酵素に対して生じる抗体は、
その酵素を動物に直接注射することにより、又はその酵
素を動物、好ましくは非ヒトに投与することにより得る
ことができる。次に、そのようにして得られた抗体を酵
素自体と結合させる。このようにして、酵素の断片のみ
をコードする配列でさえも天然型酵素全体を結合する抗
体の産生に用いることができる。次いで、このような抗
体を、その酵素を発現する細胞からの酵素の単離に用い
ることができる。

モノクローナル抗体を調製するには、連続細胞系培養
によって産生される抗体をもたらすあらゆる技術を用い
ることができる。具体例には、ハイブリドーマ技術（Ko
hler及びMilstein,Nature,256:495−497,1975）、トリ
オーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor
ら,Immunology Today 4:72,1983）、及びヒトモノクロ
ーナル抗体を産生させるためのEBV−ハイブリドーマ技
術（モノクローナル抗体及び癌治療（Monoclonal Antib
odies and Cancer Therapy）におけるColeら,Alan R.Li
ss,Inc.,pp.77−96,1985）が含まれる。

一本鎖抗体の製造について記述される技術（米国特許
第4,946,778号）を本発明の免疫学的酵素産生物に対す
る一本鎖抗体の製造に適用することができる。また、遺
伝子導入マウスを本発明の免疫学的酵素産生物に対する
ヒト化抗体の発現に用いることもできる。

本発明の酵素に対して産生させた抗体は他の生物及び
試料からの類似の酵素のスクリーニングにおいて用いる
ことができる。このようなスクリーニング技術は当該技
術分野において公知であり、例えば、そのようなスクリ
ーニング検定の１つがSambrook及びManiatis,分子クロ
ーニング；実験マニュアル（第２版），第２巻,8.49項,
Cold Spring Harbor,1989に記述されており、これは参
考としてその全体がここに組み込まれる。

以下の実施例を参照して本発明をさらに説明するが、
本発明はこのような実施例に限定されるものではないこ
とは理解される。全ての部又は量は、他に指定されない
限り、重量基準である。

以下の実施例の理解を容易にするため、特定の頻繁に
現れる方法及び／又は用語を説明する。

“プラスミド”は大文字及び／又は数字に先行し、及
び／又はそれが続く小文字の“p"で表される。本明細書
における出発プラスミドは、商業的に入手可能である
か、無制限に公的に入手可能であるか、あるいは入手可
能なプラスミドから公表された手順に従って構築するこ
とができる。加えて、説明されるものと等価のプラスミ
ドが当該技術分野において公知であり、当業者には明ら
かであろう。

DNAの“消化”は、DNAの特定の配列でのみ作用する制
限酵素を用いるDNAの触媒的開裂を指す。本明細書で用
いられる様々な制限酵素は商業的に入手可能であり、そ
れらの反応条件、補因子及び他の要件は当業者に公知の
ものを用いた。分析の目的では、典型的には１μｇのプ
ラスミド又はDNA断片を、約20μｌのバッファー溶液中
の約２単位の酵素と共に用いる。プラスミドを構築する
ためのDNA断片を単離する目的では、典型的には５ない
し50μｇのDNAをより大容積中の20ないし250単位の酵素
で消化する。特定の制限酵素に適切なバッファー及び基
質の量はその製造者によって指定される。37℃で約１時
間のインキュベーション時間を通常用いるが、供給者の
指示に従って変動し得る。消化の後、その反応物をポリ
アクリルアミドゲル上で直接電気泳動して所望の断片を
単離する。

開裂した断片のサイズ分離は、Goeddelら,Nucleic Ac
ids Res.,8:4057（1980）に記述される８パーセントポ
リアクリルアミドゲルを用いて行う。

“オリゴヌクレオチド”は一本鎖ポリデオキシヌクレ
オチド又は２本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を
指し、これは化学的に合成されたものでもよい。このよ
うな合成オリゴヌクレオチドには５′リン酸がなく、し
たがって、キナーゼの存在下においてATPを用いてリン
酸を付加することなしに別のオリゴヌクレオチドに連結
することはない。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化
されていない断片に連結する。

“連結”は、２つの二本鎖核酸断片の間にリン酸ジエ
ステルを形成するプロセスを指す（Maniatis,T.ら，同
著,p.146）。特に断らない限り、連結は、ほぼ等モル量
の連結しようとするDNA断片0.5μｇ当たり10単位のT4 D
NAリガーゼ（“リガーゼ”）と共に公知のバッファー及
び条件を用いて達成することができる。

特に断らない限り、形質転換はSambrook及びManiati
s,分子クローニング；実験マニュアル,Cold Spring Har
bor,1989に記述される通りに行った。

実施例１トランスアミナーゼ及びアミノトランスフェラーゼの細
菌性発現及び精製本発明の酵素をコードするDNA、配列番号（SEQ ID N
O:）25ないし32、36及び40を、このDNAを含むpBluescri
ptベクターから、本明細書に注記されるプライマーを用
いるPCR技術によって最初に増幅した。次に、増幅した
配列をこれらのプライマーの配列の下にリストされたそ
れぞれのPQEベクターに挿入し、本明細書で説明される
プロトコルに従って酵素を発現させた。また、ゲノムDN
AもPCR増幅の鋳型として用いられており、すなわち、陽
性クローンが同定され、かつプライマーの配列がcDNAを
用いて決定されると、それをゲノムDNAに戻し、所望の
配列（１つもしくは複数）を直接増幅することが可能で
あった。それぞれの遺伝子の５′及び３′プライマー配
列及びベクターは以下の通りである： Aquifexアスパラギン酸トランスフェラーゼＡ Aquifexアスパラギン酸トランスフェラーゼＢ Aquifexアデノシル−８−アミノ−７−オキソノナノエ
ートアミノトランスフェラーゼ Aquifexアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ Ammonifex degensiiアスパラギン酸アミノトランスフェ
ラーゼ Aquifexグルコサミン：フルクトース−６−リン酸アミ
ノトランスフェラーゼ Aquifexヒスタジン−リン酸アミノトランスフェラーゼ Pyrobacullum aerophilum分枝鎖アミノトランスフェラ
ーゼ Ammonifex degensii hpアミノトランスフェラーゼ Aquifexアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ指示される制限酵素部位はそれぞれの遺伝子について
指示される細菌性発現ベクター上の制限酵素部位に相当
する（キアジェン社、チャッツワース、CA）。pQEベク
ターは抗生物質耐性（Amp^r）、細菌性複製起点（or
i）、IPTG−調節可能プロモーターオペレーター（P/
O）、リボソーム結合部位（RBS）、６−Hisタグ及び制
限酵素部位をコードする。

pQEベクターを指示される制限酵素で消化した。増幅
した配列をそれぞれのpQEベクターに連結し、RBSをコー
ドする配列を有する枠中に挿入した。次に、この連結混
合物を電気穿孔法による大腸菌M15/pREP4株（キアジェ
ン社）の形質転換に用いた。M15/pREP4はプラスミドpRE
P4の複数のコピーを有し、このプラスミドはlac Iリプ
レッサーを発現し、かつカナマイシン耐性（Kan^r）をも
付与する。形質転換体をLBプレート上で成長するそれら
の能力により同定し、アンピシリン／カナマイシン耐性
コロニーを選択した。プラスミドDNAを単離し、制限分
析により確認した。所望の構築体を含むクローンを、Am
p（100μg/ml）及びKan（25μg/ml）の両者を補充したL
B培地における液体培養で一晩（O/N）増殖させた。この
O/N培養物を用いて、大量培養物に1:100ないし1:250の
比で接種した。これらの細胞を0.4ないし0.6の光学密度
600（O.D.⁶⁰⁰）まで増殖させた。その後、IPTG（“イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド”）を1mM
の最終濃度まで添加した。IPTGはlac Iリプレッサーを
不活性化することによりP/Oの一掃を誘発し、これは遺
伝子の発現の増加につながる。細胞をさらに３ないし４
時間増殖させた。その後、遠心により細胞を回収した。

上に詳述されるプライマー配列は、以下に説明される
ハイブリダイゼーション技術による寄託物からの標的遺
伝子の単離に用いることもできる。

実施例２寄託されたゲノムクローンからの選択クローンの単離目的の遺伝子に対応する２つのオリゴヌクレオチドプ
ライマーを、寄託物からのその遺伝子の増幅に用いる。
ポリメラーゼ連鎖反応を、0.1μｇの目的の遺伝子のDNA
を含む25μｌの反応混合物中において行う。この反応混
合物は1.5〜5mM MgCl₂、0.01％（w/v）ゼラチン、dAT
P、dCTP、dGTP、dTTPの各々20μＭ、各々のプライマー2
5ピコモル及び1.25単位のTaqポリメラーゼである。30サ
イクルのPCR（94℃で１分間の変性;55℃で１分間のアニ
ーリング;72℃で１分間の伸長）をパーキン−エルマー
・シータス（Perkin−Elmer Cetus）9600サーマルサイ
クラーを用いて行う。増幅した産生物をアガロースゲル
電気泳動により分析し、期待される分子量を有するDNA
バンドを切り出して精製する。このPCR産生物を、そのD
NA産生物のサブクローン化及び配列決定により、目的の
遺伝子であることを立証する。

本発明の多くの変更及び変形が上述の教示に照らして
可能であり、したがって、添付の請求の範囲の範囲内
で、本発明は特に説明されたものとは別の方法で実施す
ることができる。

配列表配列番号:1 配列の長さ:52 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:2 配列の長さ:31 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:3 配列の長さ:52 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:4 配列の長さ:31 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:5 配列の長さ:52 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:6 配列の長さ:31 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:7 配列の長さ:52 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:8 配列の長さ:31 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:9 配列の長さ:52 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:10 配列の長さ:31 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:11 配列の長さ:52 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:12 配列の長さ:31 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:13 配列の長さ:52 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:14 配列の長さ:31 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:15 配列の長さ:52 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:16 配列の長さ:31 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:17 配列の長さ:1245 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:Genomic DNA 配列配列番号:18 配列の長さ:1122 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:Genomic DNA 配列配列番号:19 配列の長さ:1359 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:Genomic DNA 配列配列番号:20 配列の長さ:1032 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:Genomic DNA 配列配列番号:21 配列の長さ:1197 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:Genomic DNA 配列配列番号:22 配列の長さ:1779 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:Genomic DNA 配列配列番号:23 配列の長さ:1065 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:Genomic DNA 配列配列番号:24 配列の長さ:912 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:Genomic DNA 配列配列番号:25 配列の長さ:414 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号:26 配列の長さ:373 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号:27 配列の長さ:453 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号:28 配列の長さ:343 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号:29 配列の長さ:398 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号:30 配列の長さ:592 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号:31 配列の長さ:354 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列配列番号:32 配列の長さ:303 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列番号:33 配列の長さ:52 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:34 配列の長さ:31 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:35 配列の長さ:1092 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:Genomic DNA 配列配列番号:36 配列の長さ:363 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:37 配列の長さ:52 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:38 配列の長さ:31 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類:cDNA 配列配列番号:39 配列の長さ:1085 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：核酸配列配列番号:40 配列の長さ:394 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ポリペプチド配列

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01）前置審査 (56)参考文献ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，1996年１月１日，Ｖｏｌ．119，Ｎｏ．１，ｐ．135−144 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 9/10 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）配列番号25〜28、30、31および40に
示されるアミノ酸配列を含む酵素をコードするポリヌク
レオチド；および（ｂ）配列番号25〜28、30、31および40に示されるアミ
ノ酸配列を含む酵素をコードするポリヌクレオチド配列
に相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし、かつアミノトランスフェラーゼ
活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群より選択されたメンバーを含む単離されたポ
リヌクレオチド。
【請求項２】前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求
項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求
項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】配列番号25のアミノ酸１〜414を含む酵素
をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】配列番号26のアミノ酸１〜373を含む酵素
をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】配列番号27のアミノ酸１〜453を含む酵素
をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】配列番号28のアミノ酸１〜343を含む酵素
をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】配列番号30のアミノ酸１〜592を含む酵素
をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】配列番号31のアミノ酸１〜354を含む酵素
をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】配列番号40のアミノ酸１〜394を含む酵
素をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】請求項２に記載のDNAを含むベクター。
【請求項１２】請求項11に記載のベクターを含む宿主細
胞。
【請求項１３】請求項12に記載の宿主細胞から前記DNA
にコードされたポリペプチドを発現することを含む、該
ポリペプチドの製造方法。
【請求項１４】該細胞が請求項11に記載のベクターに含
まれるDNAによってコードされたポリペプチドを発現す
るように該細胞を該ベクターで形質転換またはトランス
フェクトすることを含む、細胞の製造方法。
【請求項１５】（ａ）配列番号17〜20、22、23および39
に示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ
酸配列を含む酵素；および（ｂ）配列番号17〜20、22、23および39に示されるポリ
ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリ
ンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド
配列にコードされるアミノ酸配列を含み、かつアミノト
ランスフェラーゼ活性を有する酵素からなる群より選択されたメンバーを含む酵素。
【請求項１６】アミノ酸を、α−ケト酸の存在下で、配
列番号25〜28、30、31および40に示されるアミノ酸配列
を有する酵素からなる群より選択された酵素と接触させ
ることを含む、アミノ基をアミノ酸からα−ケト酸に転
移する方法。