JP2003000289A - トランスアミナーゼ及びアミノトランスフェラーゼ - Google Patents

トランスアミナーゼ及びアミノトランスフェラーゼ

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Ronald V Swanson
スワンソン，ロナルド，ブイ．
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規なアミノトランスフェラーゼの提供 【解決手段】 種々のammonifex、aquifex、およびpyro
baculum生物由来の熱安定トランスアミナーゼおよびア
ミノトランスフェラーゼ酵素を開示する。これらの酵素
は、天然または組換え宿主細胞から製造され、医薬、農
業および他の産業において利用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本出願は、1996年２月９日出
願の係属中の米国特許出願第08/599,171号の一部継続出
願である1996年5月8日出願の係属中の米国特許出願第08
/646,590号の一部継続出願である。
【０００２】本発明は、新たに同定されたポリヌクレオ
チド、そのようなポリヌクレオチドによりコードされる
ポリペプチド、そのようなポリヌクレオチド及びポリペ
プチドの使用、並びにそのようなポリヌクレオチド及び
ポリペプチドの製造及び単離に関する。特に、本発明の
ポリヌクレオチド及びポリペプチドは、トランスアミナ
ーゼ及び／またはアミノトランスフェラーゼとして推定
的に同定された。アミノトランスフェラーゼは、α-ア
ミノ酸からα-ケト酸へのアミノ基の転移を触媒する酵
素である。これらはトランスアミナーゼとも呼ばれる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】タンパク質中に共通し
て見られる20種のL-アミノ酸のα-アミノ基はアミノ酸
の酸化的分解の間に除去される。殆どのL-アミノ酸の異
化における最初の段階であるα-アミノ基の除去は、ア
ミノトランスフェラーゼ(またはトランスアミナーゼ)に
より促進される。これらのアミノ基転移反応において
は、α-アミノ基はα-ケトグルタル酸のα-炭素原子に
転移され、対応するアミノ酸のα-ケト酸類似体を残
す。そのような反応においては正味の脱アミノ化(すな
わちアミノ基の喪失)はなく、これはα-アミノ酸が脱ア
ミノ化される間に前記α-ケトグルタル酸がアミノ化さ
れるからである。アミノ基転移反応の効果は、多数の種
類のアミノ酸からアミノ基を一つの形態、すなわちL-グ
ルタミン酸として集めることである。グルタミン酸は生
合成経路あるいは窒素排出産物を形成し排泄する最終的
な一連の反応へとアミノ基を送り込む。
【０００４】細胞はいくつかの異なるアミノトランスフ
ェラーゼを含み、多くはアミノ基受容体としてα-ケト
グルタル酸に特異的である。アミノトランスフェラーゼ
は、もう一方の基質、すなわちアミノ基を供与するL-ア
ミノ酸についての特異性において異なり、そのアミノ基
供与体に従って命名される。アミノトランスフェラーゼ
により触媒される反応は自由に可逆的であり、約1.0
(ΔG0’≒0 kJ/mol)の平衡定数を有する。
【０００５】アミノトランスフェラーゼは二分子ピンポ
ン反応を触媒する酵素の古典的な例である。そのような
反応においては、第一の基質は第二の基質が結合できる
前に活性部位から離れなければならない。すなわち、入
ってくるアミノ酸は活性部位に結合し、そのアミノ基を
ピリドキサールリン酸に与え、α-ケト酸の形態で離れ
る。その後入ってくるα-ケト酸が結合し、ピリドキサ
ミンリン酸からアミノ基を受け取り、アミノ酸の形態で
離れる。
【０００６】血清中のアラニンアミノトランスフェラー
ゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼレベル
の測定は医療における重要な診断方法であり、心臓障害
の指標として、また障害からの回復をモニターするため
に使用されている。
【０００７】
【発明を解決するための手段】本発明のポリヌクレオチ
ド及びポリペプチドは、それらの酵素活性の結果、トラ
ンスアミナーゼ及び／またはアミノトランスフェラーゼ
として同定された。
【０００８】本発明の一つの態様によれば、新規な酵
素、並びにそれらの活性な断片、類似体及び誘導体が提
供される。
【０００９】本発明の別の態様によれば、本発明の酵素
並びにそのような酵素の活性な類似体及び断片をコード
する、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡを含む単離さ
れた核酸分子が提供される。
【００１０】本発明のさらに別の態様によれば、組換え
技術によりそのようなポリペプチドを生産する方法であ
って、本発明の核酸配列を含む組換え原核生物及び／ま
たは真核生物宿主細胞を、前記酵素の発現とその後の前
記酵素の回収を促進する条件下で培養することを含む方
法が提供される。
【００１１】本発明のさらに別の態様によれば、α-ア
ミノ酸からα-ケト酸へアミノ基を転移させるために、
そのような酵素あるいはそのような酵素をコードするポ
リヌクレオチドを使用する方法が提供される。殆どのト
ランスアミナーゼはL-アミノ酸を基質として使用する
が、以下に記載するように本発明のトランスアミナーゼ
はD-アミノ酸を基質として使用するように変換すること
ができ、これにより例えば合成ピレスロイドの製造、及
びβ-ラクタム抗生物質の構成成分として等、その用途
が拡大されるものである。本発明のトランスアミナーゼ
は高温下、及び有機溶媒中で安定であり、従って医薬、
農薬及びその他の化学産業で使用される光学的に純粋な
キラル化合物の生産のためにL-及び／またはD-アミノ酸
とともに使用するのに優れている。
【００１２】本発明のさらに別の態様によれば、本発明
の核酸配列にハイブリダイズするのに十分な長さの核酸
分子を含む核酸プローブも提供される。
【００１３】本発明のさらに別の態様によれば、例え
ば、ヌクレオチド配列の特定の領域すなわち保存配列領
域を使用することにより異なった生物からの類似酵素を
コードする可能性のある類似した配列を同定するための
プローブを生成することのような科学研究に関連したin
vitroの目的のために前述の酵素、あるいは前述の酵素
をコードするポリヌクレオチドを使用する方法が提供さ
れる。
【００１４】本発明のこれらの態様及びその他の態様は
本明細書の教示から当業者に明らかであろう。
【００１５】
【発明の実施の形態】用語「遺伝子」は、ポリペプチド
鎖生産に関与するＤＮＡのセグメントを意味するもので
あり、コード領域に先行あるいは後続する領域(リーダ
ー及びトレイラー)並びに個々のコードセグメント(エキ
ソン)の間の介在配列(イントロン)を含む。
【００１６】ＲＮＡポリメラーゼが二つのコード配列を
単一のｍＲＮＡに転写し、これが両方のコード配列に由
来するアミノ酸を有する単一のポリペプチドに翻訳され
る場合は、コード配列がもう一つのコード配列に「作動
可能に結合」されている。コード配列は、発現された配
列が最終的にプロセシングされて所望のタンパク質を生
成する限り、互いに隣接している必要はない。
【００１７】「組換え」酵素とは、組換えＤＮＡ技術に
より生産された酵素、すなわち所望の酵素をコードする
外来ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から生産さ
れた酵素をいう。「合成」酵素は、化学合成により製造
されたものである。
【００１８】特定の酵素のＤＮＡ「コード配列」あるい
は特定の酵素を「コードするヌクレオチド配列」は、適
当な調節配列の制御下に置かれたときに転写され、酵素
に翻訳されるＤＮＡ配列である。
【００１９】本発明の一つの態様によれば、図1〜8の推
定アミノ酸配列(配列番号17〜32)を有する成熟酵素をコ
ードする、単離された核酸(ポリヌクレオチド)が提供さ
れる。
【００２０】本発明の別の態様によれば、本発明の酵素
をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供され
る。寄託物は本発明の酵素をコードするＤＮＡを含むゲ
ノムクローンの混合物である。それぞれのＤＮＡを含む
各ゲノムクローンをpQEベクター(Quiagen, Inc., Chats
worth, CA)に挿入した。寄託物はAmerican Type Cultur
e Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Mar
yland 20852, USAに1995年12月13日に寄託し、ATCC受託
番号 を得た。
【００２１】寄託は特許手続きのための微生物の寄託の
国際的承認に関するブダペスト条約の条件下で行われ
た。これらの株は特許発行に際し、無効にされることな
く、制限あるいは条件なしに公衆に分譲される。これら
の寄託は単に当業者の便宜のために行われたものであ
り、35 U.S.C §112により寄託が必要であると認めたも
のではない。寄託物に含まれるポリヌクレオチドの配
列、並びにそれによりコードされるポリペプチドのアミ
ノ酸配列は、本明細書の配列の記載と矛盾する場合に優
先するものである。寄託物を製造し、使用し、販売する
ためにはライセンスを必要とするが、ここでそのような
ライセンスを認可するものではない。
【００２２】本発明のポリヌクレオチドは、以下の生物
に由来するゲノムＤＮＡライブラリーから初めて回収さ
れた。
【００２３】Aquifex VF5はイタリアのVulcanoで単離さ
れた真生細菌である。これは、グラム陰性、桿状の化学
合成無機力源無機栄養海洋生物で、基質としてO2、気体
相にH2/CO2＋0.5% O2を含む高塩濃度培地中で約85〜90
℃(Tmax=95℃)においてpH 6.8で最適に増殖する。
【００２４】Ammonifex degensii KC4は、インドネシア
のJavaで単離された新規な真生細菌生物である。このグ
ラム陰性の化学合成無機力源無機栄養生物は三つの呼吸
系を有する。この細菌は硝酸塩、硫酸塩、及び硫黄を利
用できる。この生物は基質として0.2%硝酸塩、気体相に
H2/CO2を含む低塩濃度培地中で70℃においてpH 7.0で最
適に増殖する。
【００２５】Pyrobaculum aerophilium IM2は、イタリ
アのIschia Marontiで単離された好熱性硫黄古細菌(Cre
narchaeota)である。基質として硝酸塩、酵母エキス、
ペプトン及びO2、気体相にN2/CO2、O2を含む低塩濃度培
地中で100℃においてpH 7.0で最適に増殖する桿状生物
である。
【００２６】従って、前記ポリヌクレオチド及びそれに
よりコードされる酵素はそれらが単離された生物により
同定され、以下の記載において、「VF5/ATA」(図1及び配
列番号17及び25)、「VF5/AAB」(図2及び配列番号18及び2
6)、「VF5/A87A」(図3及び配列番号19及び27)、「VF5/AOA
」(図4及び配列番号20及び28)、「KC4/AA」 (図5及び配列
番号21及び29)、「VF5/GF6PA」(図6及び配列番号22及び3
0)、「VF5/HPA」(図7及び配列番号23及び31)、「IM2/BCA」
(図8及び配列番号24及び32)、「KC4/HPA」(図9及び配列番
号35及び36)、及び「VF5/AA」(図10及び配列番号39及び4
0)と記載する場合がある。
【００２７】本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチ
ドは、表1に示すように、公知の遺伝子及びそれにより
コードされるタンパク質にヌクレオチド及びタンパク質
レベルで同一性を示す。
【００２８】
【表１】 表1に特定した全てのクローンは、トランスアミナーゼ
あるいはアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードする。
【００２９】本発明の酵素をコードする核酸分子を単離
する一つの手段は、当分野で認知された方法を使用し
て、天然または人工的に設計されたプローブにより遺伝
子ライブラリーを検索することである（例えば、Curren
t Protocols in Molecular Biology, Ausubel F.M.ら
(EDS.) Green Publishing Company Assoc. and John Wi
ley Interscience, New York, 1989, 1992参照）。配列
番号17〜24、35及び39のポリヌクレオチド及びそれらの
断片(連続した少なくとも12個のヌクレオチドを含む)が
特に有用なプローブであることは当業者に理解されるで
あろう。この目的に特に有用なその他のプローブは、配
列番号1〜9、33〜34及び37〜38の配列のハイブリダイズ
可能な断片である(すなわち、連続した少なくとも12個
のヌクレオチドを含む)。
【００３０】本明細書に開示した特定の核酸配列にハイ
ブリダイズする核酸配列については、ハイブリダイゼー
ションは低いストリンジェンシー、中程度のストリンジ
ェンシー、あるいは高いストリンジェンシーの条件下で
行い得る。オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション
の例として、固定した変性核酸を含むポリマーメンブラ
ンを最初に、0.9 M NaCl、50 mM NaH2PO4、pH 7.0、5.0
mM Na2EDTA、0.5% SDS、10 × Denhard’s及び0.5 mg/
mLポリリボアデニル酸を含む溶液中で45℃で30分間プレ
ハイブリダイズさせる。その後、約2 × 107 cpm (比活
性4-9 × 108 cpm/ug)の32P末端標識オリゴヌクレオチ
ドプローブを溶液に加える。12〜16時間インキュベート
した後、メンブランを0.5% SDSを含む1 × SET (150 mM
NaCl、20 mMトリス塩酸塩、pH 7.8、1 mM Na2EDTA)中
で室温で30分間洗浄し、その後新しい1 × SET中でオリ
ゴヌクレオチドプローブのためにTm-10℃(Tmは-10℃)で
30分間洗浄する。ハイブリダイゼーションシグナルの検
出のために面ブランをオートラジオグラフィーフィルム
に露光する。
【００３１】ストリンジェントな条件とは、少なくとも
90%の同一性、好ましくは少なくとも95%の同一性、最も
好ましくは少なくとも97%の同一性が配列間に存在する
ときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味
する。本明細書においてその全体が参考のために援用さ
れるJ. Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (19
89)を参照のこと。
【００３２】本明細書で使用するように、第一のＤＮＡ
(ＲＮＡ)配列ともう一つのＤＮＡ(ＲＮＡ)配列とを例え
ばBLASTNにより互いに適切に整列させたときに、第一の
配列の塩基と他方の配列の塩基との間にそれぞれ少なく
とも70%、及び好ましくは少なくとも80%もしくは90%の
同一性がある場合に、第一のＤＮＡ(ＲＮＡ)配列は他方
のＤＮＡ(ＲＮＡ)配列に少なくとも70%、好ましくは少
なくとも80%同一であるものとする。
【００３３】本発明は、参照ポリヌクレオチドとは異な
るポリヌクレオチドであるが、その変化がサイレント変
化、例えば該ポリヌクレオチドによりコードされるアミ
ノ酸配列を変えないような変化であるポリヌクレオチド
に関する。本発明はまた、参照ポリヌクレオチドにより
コードされたポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付
加、欠失、融合及び切断を起こすようなヌクレオチド変
化に関する。本発明の好ましい態様においては、これら
のポリペプチドは、参照ポリペプチドによりコードされ
たポリペプチドと同じ生物学的活性を保持する。
【００３４】本発明のポリヌクレオチドは、表1に挙げ
た生物からのゲノム遺伝子ライブラリーから回収された
ものである。遺伝子ライブラリーはλZAP IIクローニン
グベクター(Stratagene Cloning Systems)中に生成させ
た。これらのライブラリーについて集団切り出しを行
い、pBluescriptファージミド中にライブラリーを生成
した。本明細書に以下に記載するプロトコール／方法に
従ってライブラリーを生成し、切り出しを行った。
【００３５】本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡある
いはＤＮＡの形態であり得、ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを包含する。このＤＮＡは二本
鎖あるいは一本鎖であってよく、一本鎖である場合コー
ド鎖、あるいは非コード鎖(アンチセンス)であってもよ
い。成熟酵素をコードするコード配列は、図1〜8に記載
したコード配列(配列番号17〜24)に同一であってもよ
く、あるいは遺伝子コードの重複もしくは縮重の結果と
して図1〜10のＤＮＡ(配列番号17〜24、35及び39)と同
じ成熟酵素をコードする異なるコード配列であってもよ
い。
【００３６】図1〜10の成熟酵素をコードするポリヌク
レオチド(配列番号25〜32、36及び40)は、限定するもの
ではないが、成熟酵素のコード配列のみ；成熟酵素のコ
ード配列及び、リーダー配列またはプロタンパク質配列
のような追加のコード配列；成熟酵素のコード配列(及
び任意に追加のコード配列)及び、イントロンや成熟酵
素のコード配列の非コード配列5’及び／または3’のよ
うな非コード配列を包含し得る。
【００３７】従って、用語「酵素(タンパク質)をコード
するポリヌクレオチド」は、酵素のコード配列のみを含
むポリヌクレオチド、並びに追加のコード配列及び／ま
たは非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含するも
のである。
【００３８】本発明はさらに、図1〜10の推定アミノ酸
配列(配列番号25〜32、36及び40)を有する酵素の断片、
類似体、及び誘導体をコードする上記したポリヌクレオ
チドの変異体に関する。前記ポリヌクレオチドの変異体
は、前記ポリヌクレオチドの天然の対立遺伝子変異体、
あるいは前記ポリヌクレオチドの非天然の変異体であっ
てよい。
【００３９】従って本発明は、図1〜10に示したものと
同じ成熟酵素をコードするポリヌクレオチド(配列番号1
7〜24、35及び39)、並びに図1〜10の酵素の断片、誘導
体あるいは類似体をコードする、そのようなポリヌクレ
オチド(配列番号17〜24、35及び39)の変異体を包含す
る。そのようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置
換変異体、及び付加あるいは挿入変異体を包含する。
【００４０】上記に示したように、前記ポリヌクレオチ
ドは、図1〜10に示したコード配列(配列番号17〜24、35
及び39)の天然の対立遺伝子変異体であるコード配列を
有し得る。当分野で知られるように、対立遺伝子変異体
はポリヌクレオチド配列の代替的な形態であり、コード
された酵素の機能を実質的に変えることのない１個以上
のヌクレオチドの置換、欠失、あるいは付加を有し得る
ものである。また、特異的な方法やその他の進化的(evo
lution)方法を使用して、機能において大きな変化を生
じ得るＤＮＡ配列のごくわずかな変化を生成することが
できる。
【００４１】本発明の完全長遺伝子の断片は、ｃＤＮＡ
またはゲノムライブラリーのハイブリダイゼーションプ
ローブとして使用して完全長ＤＮＡを単離し、また前記
遺伝子に対して高い配列類似性を有するかあるいは類似
した生物学的活性を有するその他のＤＮＡを単離するこ
とができる。このタイプのプローブは好ましくは少なく
とも10、好ましくは少なくとも15、さらにより好ましく
は少なくとも30塩基を含み、例えば少なくとも50の塩基
を含んでもよい。このプローブは、完全長転写体に対応
するＤＮＡクローン、並びに調節領域及びプロモーター
領域、エキソン及びイントロンを含む完全な遺伝子を含
むゲノムクローンを同定するのにも使用し得る。スクリ
ーニングは例えば、公知のＤＮＡ配列を使用してオリゴ
ヌクレオチドプローブを合成し、遺伝子のコード領域を
単離することを含む。本発明の前記遺伝子もしくは遺伝
子配列の部分に相補的であるか又は同一の配列を有する
標識されたオリゴヌクレオチドを使用してゲノムＤＮＡ
のライブラリーをスクリーニングしてライブラリーのど
のメンバーにプローブがハイブリダイズするかを判定す
る。
【００４２】また、そのようなプローブは分析的に検出
可能な試薬により標識でき、そして好ましくはそのよう
に標識して、プローブの同定を容易にすることもでき
る。有用な試薬としては、限定するものではないが、放
射能、蛍光染料あるいは検出可能な産物の形成を触媒す
ることができる酵素等が挙げられる。前記プローブはこ
のように他のソースからのＤＮＡの相補的コピーを単離
するため、あるいは関連する配列についてそのようなソ
ースをスクリーニングするのに有用である。
【００４３】本発明はさらに、少なくとも70%、好まし
くは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%の同
一性が配列間にある場合に、上記した配列にハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ス
トリンジェントな条件下で上記したポリヌクレオチドに
ハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細
書で使用するように、用語「ストリンジェントな条件」
は、配列間に少なくとも95%の同一性、好ましくは少な
くとも97%の同一性が存在するときにのみハイブリダイ
ゼーションが起こることを意味する。好ましい態様にお
ける上記したポリヌクレオチドにハイブリダイズするポ
リヌクレオチドは、図1〜10のＤＮＡ(配列番号17〜24、
35及び39)によりコードされた成熟酵素と実質的に同じ
生物学的機能あるいは活性を有する酵素をコードするも
のである。
【００４４】あるいは、前記ポリヌクレオチドは少なく
とも15塩基、好ましくは少なくとも30塩基、より好まし
くは少なくとも50塩基を有し得、本発明のポリヌクレオ
チドのいずれの部分にもハイブリダイズし得、上記した
ようにそれに対して同一性を有し、そして活性を保持し
ていてもよく、していなくてもよい。例えばそのような
ポリヌクレオチドは、配列番号17〜24、35及び39のポリ
ヌクレオチドのためのプローブとして、例えばポリヌク
レオチドを回収するために使用でき、あるいは診断プロ
ーブ、あるいはPCRプライマーとして使用できる。
【００４５】従って本発明は、配列番号25〜32、36及び
40の酵素をコードするポリヌクレオチドに少なくとも70
%の同一性、好ましくは少なくとも90%の同一性、より好
ましくは95%の同一性を有するポリヌクレオチド、並び
にその断片に関し、これらの断片は少なくとも15塩基、
好ましくは少なくとも30塩基、最も好ましくは少なくと
も50塩基を有し、本発明のポリヌクレオチドの任意の部
分に対してストリンジェントな条件下で少なくとも90%
同一、好ましくは少なくとも95%同一、最も好ましくは
少なくとも97%同一である。
【００４６】本発明はさらに、図1〜10(配列番号17〜2
4、35及び39)の推定アミノ酸配列を有する酵素、並びに
そのような酵素の断片、類似体、及び誘導体に関する。
【００４７】図1〜10の酵素(配列番号25〜32、36及び4
0)をいう場合の用語「断片」、「誘導体」及び「類似
体」は、そのような酵素と実質的に同じ生物学的機能ま
たは活性を保持する酵素を意味する。従って類似体は、
プロタンパク質部分を切断することにより活性化されて
活性な成熟酵素を生成することができるプロタンパク質
を包含する。
【００４８】本発明の酵素は、組換え酵素、天然酵素、
あるいは合成酵素であってよく、好ましくは組換え酵素
である。
【００４９】図1〜10の酵素(配列番号25〜32、36及び4
0)の断片、誘導体、または類似体は、(i) 1以上のアミ
ノ酸残基が保存もしくは非保存アミノ酸残基(好ましく
は保存アミノ酸残基)により置換され、そのような置換
アミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされていても
いなくてもよいもの、あるいは(ii) 1以上のアミノ酸残
基が置換基を含むもの、あるいは(iii) 成熟酵素が別の
化合物、例えば酵素の半減期を延長するための化合物
(例えばポリエチレングリコール)に融合したもの、ある
いは(vi) 追加的なアミノ酸、例えばリーダー配列もし
くは分泌配列、または成熟酵素もしくはプロタンパク質
配列の精製に使用される配列が成熟酵素に融合されたも
のであってよい。そのような断片、誘導体、及び類似体
は、本明細書の記載から当業者の理解の範囲にあるもの
とみなされる。
【００５０】本発明の酵素及びポリヌクレオチドは好ま
しくは単離された形態で提供され、好ましくは均質なも
のに精製されたものである。
【００５１】用語「単離された」は、物質が最初にあっ
た環境(天然物の場合はその天然の環境)から取り出され
ていることを意味する。例えば、生きた動物中に存在す
る天然のポリヌクレオチドまたは酵素は単離されたもの
ではないが、天然系において共存する物質の一部あるい
は全部から分離された同じポリヌクレオチドまたは酵素
は単離されたものである。そのようなポリヌクレオチド
はベクターの部分であってもよく、及び／またはそのよ
うなポリヌクレオチドまたは酵素は組成物の一部であっ
てもよく、そのようなベクターまたは組成物がその天然
の環境の一部でなくても単離されたものである。
【００５２】本発明の酵素は、配列番号25〜32、36及び
40の酵素(特に成熟酵素)、並びに配列番号25〜32、36及
び40の酵素に少なくとも70%の類似性(好ましくは少なく
とも70%の同一性)、より好ましくは配列番号25〜32、36
及び40の酵素に少なくとも90%の類似性(より好ましくは
少なくとも90%の同一性)、さらに好ましくは配列番号25
〜32、36及び40の酵素に少なくとも95%の類似性(さらに
好ましくは少なくとも95%の同一性)を有する酵素を包含
し、さらに少なくとも30アミノ酸、より好ましくは少な
くとも50アミノ酸を一般的に含むそのような酵素の部分
を包含する。
【００５３】当該技術分野において公知のように、２種
類の酵素の間の“類似性”は、一方の酵素のアミノ酸配
列及びその保存アミノ酸の置換を第２の酵素の配列と比
較することにより決定する。
【００５４】変異体、すなわち“断片”、“類似”もし
くは“誘導”ポリペプチド、と参照ポリペプチドとは、
いかなる組み合わせで存在していてもよい１以上の置
換、付加、欠失、融合及びトランケーションによってア
ミノ酸配列が異なり得るものである。
【００５５】好ましい変異体の中には、保存アミノ酸の
置換により参照とは異なるものがある。このような置換
は、ポリペプチド中の所定のアミノ酸を類似の特徴を有
する別のアミノ酸で置換するものである。保存的置換と
して典型的に見られるものは、脂肪族アミノ酸Ala、Va
l、Leu及びIleの中でのあるものの別のものへの置き換
え；ヒドロキシル残基Ser及びThrの交換、酸性残基Asp
及びGluの交換、アミド残基Asn及びGlnの間での置換、
塩基性残基Lys及びArgの交換並びに芳香族残基Phe、Tyr
の間での置き換えである。
【００５６】最も好ましい変異体は、参照ポリペプチド
と異なるが、それと同じ生物学的機能及び活性を保持す
るものである。
【００５７】本発明の酵素の断片又は部分はペプチド合
成による対応全長酵素の製造に用いることができ、した
がって、これらの断片は全長酵素を製造するための中間
体として用いることができる。本発明のポリヌクレオチ
ドの断片又は部分は本発明の全長ポリヌクレオチドの合
成に用いることができる。
【００５８】また、本発明は、本発明のポリヌクレオチ
ドを含むベクター、本発明のベクターを用いて遺伝子工
学的に処理された宿主細胞及び組換え技術による本発明
の酵素の製造にも関する。
【００５９】宿主細胞は本発明のベクターを用いて遺伝
子工学的に処理（遺伝子導入、又は形質転換、又はトラ
ンスフェクション）され、ここで、ベクターは例えば発
現ベクターのようなクローニングベクターであり得る。
このベクターは、例えば、プラスミド、ファージ等の形
態であり得る。工学的に処理された宿主細胞は、プロモ
ーターの活性化、形質転換体の選択又は本発明の遺伝子
の増幅に適するように改変された通常の栄養培地におい
て培養することができる。温度、pH等の培養条件は発現
用に選択された宿主細胞に関して従来用いられるもので
あり、当業者には明らかであろう。
【００６０】本発明のポリヌクレオチドは組換え技術に
よる酵素の製造に用いることができる。このため、例え
ば、このポリヌクレオチドは酵素を発現させるための様
々な発現ベクターのいずれかに含有させることができ
る。このような発現ベクターには、染色体、非染色体及
び合成DNA配列、例えば、SV40の誘導体；細菌プラスミ
ド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミ
ド；プラスミドとファージDNA、ウイルスDNA（例えばワ
クシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、及び仮性狂
犬病ウィルスのＤＮＡ）との組み合わせに由来するベク
ターが含まれる。しかしながら、宿主細胞において複製
可能かつ生存可能である限り、他のいかなるベクターを
も用いることができる。
【００６１】適切なDNA配列を様々な手順によりこのベ
クターに挿入することができる。一般には、DNA配列は
当該技術分野において公知の手順により適切な制限エン
ドヌクレアーゼ部位（1ヶ所もしくは複数箇所）に挿入
する。このような手順及びその他の手順は当業者の範囲
内にあるものと認められる。
【００６２】この発現ベクター中のDNA配列は、mRNAの
合成を指令するための適切な発現制御配列（1つもしく
は複数）（プロモーター）に作動可能に連結する。この
ようなプロモーターの代表的な例としては、LTR又はSV4
0プロモーター、大腸菌lac又はtrp、ファージラムダPL
プロモーター、及び原核もしくは真核細胞又はそれらの
ウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが知られ
る他のプロモーターを挙げることができる。また、発現
ベクターは、翻訳を開始させるためのリボソーム結合部
位及び転写ターミネーターをも含む。また、このベクタ
ーは発現を増幅させるのに適する配列を含んでいてもよ
い。
【００６３】加えて、発現ベクターは、好ましくは、形
質転換宿主細胞を選択するための表現型形質を付与する
1以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、真核細胞
の培養についてはジヒドロ葉酸還元酵素もしくはネオマ
イシン耐性、又は大腸菌におけるテトラサイクリンもし
くはアンピシリン耐性を含む。
【００６４】上述の適切なDNA配列及び適切なプロモー
ター又は制御配列を含むベクターは、適切な宿主の形質
転換に用いてその宿主にタンパク質を発現させることが
できる。
【００６５】適切な宿主の代表的な例として、細菌細
胞、例えば、大腸菌、ストレプトマイセス、枯草菌；真
菌細胞、例えば、酵母；昆虫細胞、例えば、ドロソフィ
ラ（Drosophila）S2及びスポドプテラ（Spodoptera）Sf
9；動物細胞、例えば、CHO、COSもしくはボウズ（Bowe
s）メラノーマ；アデノウイルス；植物細胞等を挙げる
ことができる。
【００６６】特には、本発明は、上に広範に記述される
配列の1以上を含む組換え構築体をも包含する。この構
築体は、本発明の配列が挿入されているプラスミドもし
くはウイルスベクターのようなベクターを順方向又は逆
方向に含む。この実施態様の好ましい態様においては、
この構築体は、その配列に作動可能に連結する、例えば
プロモーターを含む調節配列をさらに含む。多数の適切
なベクター及びプラスミドが当業者に公知であり、かつ
商業的に利用可能である。例として以下のベクター、即
ち、細菌性：pQE70、pQE60、pQE−9（キアジェン（Qiag
en））、pBluescript II KS、ptrc99a、pKK223−3、pDR
540、pRIT2T（ファルマシア（Pharmacia））；真核性：
pXT1、pSG5（ストラタジーン（Stratagene）pSVK3、pBP
V、pMSG、pSVL SV40（ファルマシア）が提供される。し
かしながら、宿主細胞において複製可能かつ生存可能で
ある限り、他のいかなるプラスミド又はベクターをも用
いることができる。
【００６７】プロモーター領域は、CAT（クロラムフェ
ニコール転移酵素）ベクター又は選択可能なマーカーを
有する他のベクターを用いて、あらゆる所望の遺伝子か
ら選択することができる。適切なベクターの2つはpKK23
2−8及びpCM7である。特定の命名された細菌性プロモー
ターには、lacI、lacZ、T3、T7、gpt、ラムダPR、PL及
びtrpが含まれる。真核性プロモーターには、CMV最初
期、HSVチミジンキナーゼ、初期及び後期SV40、レトロ
ウイルスに由来するLTR、及びマウスメタロチオネイン
−Iが含まれる。適切なベクター及びプロモーターの選
択は十分に当該技術分野における通常の技術の水準内に
ある。
【００６８】さらなる実施態様においては、本発明は上
述の構築体を含む宿主細胞に関する。この宿主細胞は哺
乳類動物細胞のような高等真核生物細胞であっても酵母
細胞のような下等真核生物細胞であってもよく、あるい
は宿主細胞は細菌細胞のような原核生物細胞であっても
よい。宿主細胞への構築体の導入は、リン酸カルシウム
トランスフェクション、DEAE−デキストラン介在トラン
スフェクション、又は電気穿孔法によって行うことがで
きる（Davis, L., Dibner, M., Battey, I.,分子生物学
における基本的方法（Basic Methods in Molecular Bio
logy）, (1986)）。
【００６９】宿主細胞中の構築体は通常の方法でその組
換え配列によってコードされる遺伝子産物の製造に用い
ることができる。あるいは、本発明の酵素は通常のペプ
チド合成機によって合成により製造することができる。
【００７０】成熟タンパク質は、哺乳類動物細胞、酵
母、細菌、又は他の細胞中で、適切なプロモーターの制
御の下において発現させることができる。本発明のDNA
構築体から誘導されるRNAを用いて、細胞非含有翻訳系
をこのようなタンパク質の製造に用いることも可能であ
る。原核性及び真核性宿主と共に用いるのに適するクロ
ーニング及び発現ベクターは、Sambrookら,分子クロー
ニング；実験マニュアル（Molecular Cloning; A Labor
atory Manual）, 第2版, Cold Spring Harbor, N.Y.,
(1989)に記述されており、その開示は参考として本明細
書に組み込まれる。
【００７１】高等真核生物による本発明の酵素をコード
するDNAの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入
することにより増加する。エンハンサーは、プロモータ
ーに作用してその転写を増大させる、通常約10ないし30
0bpの、DNAのシス作用性要素である。その具体例には、
複製起点の100ないし270bp後期側のSV40エンハンサー、
サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、
複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデ
ノウイルスエンハンサーが含まれる。
【００７２】一般に、組換え発現ベクターは、複製起点
及び宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカ
ー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子及びS．セ
レビシエ（S. cerevisiae）TRP1遺伝子、並びに下流構
造遺伝子の転写を指令するための高発現遺伝子に由来す
るプロモーターを含む。このようなプロモーターは、3
−ホスホグリセレートキナーゼ（PGK）のような解糖酵
素、α−因子、酸ホスホターゼ、又は熱ショックタンパ
ク質をコードするオペロンから誘導することができる。
異種構造配列を、適切な位相において、転写開始及び終
止配列、並びに好ましくは、翻訳された酵素の分泌を導
くことが可能なリーダー配列で組み立てる。場合によ
り、この異種配列はN−末端同定ペプチドを含む融合酵
素をコードしてもよく、このN−末端同定ペプチドは所
望の特徴、例えば発現した組換え産物の安定化もしくは
単純化された精製、を付与する。
【００７３】細菌用に有用な発現ベクターは、所望のタ
ンパク質をコードする構造DNA配列を、適切な翻訳開始
及び終止シグナルと共に、機能的プロモーターを含む作
動可能な読み取り相に挿入することにより構築する。こ
のベクターは、そのベクターの維持を確実なものとし、
かつ、所望であれば、宿主内での増幅をもたらすため
に、1以上の表現型選択可能マーカー及び複製起点を有
する。形質転換に適切な原核生物宿主には、他のものも
選択材料として用いることができるが、大腸菌、枯草
菌、ネズミチフス菌、並びにシュードモナス属、ストレ
プトマイセス属、及びスタフィロコッカス属内の様々な
種が含まれる。
【００７４】代表的かつ非限定的な例として、細菌用に
有用な発現ベクターは、公知のクローニングベクターpB
R322（ATCC37017）の遺伝的要素を含む市販のプラスミ
ドに由来する細菌複製起点及び選択可能マーカーを含ん
でもよい。このような商業的なベクターには、例えば、
pKK223−3（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Pha
rmacia Fine Chemicals）、ウプサラ（Uppsala）、スウ
ェーデン）及びpGEM1（プロメガ・バイオテック（Prome
ga Biotec）、マジソン、WI、USA）が含まれる。これら
のpBR322“主鎖”部を適切なプロモーター及び発現させ
ようとする構造配列に結合させる。
【００７５】適切な宿主株を形質転換し、その宿主株を
適切な細胞密度まで成長させた後、選択されたプロモー
ターを適切な手段（例えば、温度シフト及び化学的誘
発）により誘発させ、細胞をさらなる期間培養する。
【００７６】細胞を、典型的には遠心によって回収し、
物理的もしくは化学的手段によって破壊し、それにより
生じた粗製抽出物をさらなる精製のために保持する。
【００７７】タンパク質の発現において用いられる微生
物細胞は、凍結−解凍サイクル処理、超音波処理、機械
的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含むあらゆる都合の良
い方法で破壊することができ、そのような方法は当業者
には公知である。
【００７８】様々な哺乳類動物細胞培養系も組換えタン
パク質の発現に用いることができる。哺乳類動物発現系
の例には、Gluzman, Cell, 23:175 (1981)に記述される
サル腎臓線維芽細胞のCOS−7系、並びに適合するベクタ
ーを発現させることが可能な他の細胞系、例えば、C12
7、3T3、CHO、HeLa及びBHK細胞系が含まれる。哺乳類動
物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター及び
エンハンサーを含み、かつあらゆる必要なリボソーム結
合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与及び受容
部位、転写終止配列、並びに5′隣接非転写配列をも含
む。必要とされる非転写遺伝的要素を提供するのにSV40
由来のDNA配列及びポリアデニル化部位を用いることが
できる。
【００７９】酵素は、組換え細胞の培養物から、硫酸ア
ンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン
もしくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセル
ロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグ
ラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキ
シルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマ
トグラフィーを含む方法によって回収及び精製すること
ができる。必要に応じて、成熟タンパク質の高次構造を
完成させるに当たり、タンパク質の再折り畳み工程を用
いることができる。最後に、高速液体クロマトグラフィ
ー（HPLC）を最終精製工程に用いることができる。
【００８０】本発明の酵素は、天然から精製された生成
物であっても、化学合成法の生成物であっても、組換え
技術によって原核生物もしくは真核生物宿主から（例え
ば、培養中の細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳類動
物細胞により）産生されるものであってもよい。組換え
体産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明
の酵素はグリコシル化されたものでも、非グリコシル化
のものであってもよい。また、本発明の酵素は開始メチ
オニンアミノ酸残基を含んでいてもいなくてもよい。
【００８１】トランスアミナーゼはアミノ酸及びアミノ
糖の代謝における一群の鍵酵素であり、微生物から哺乳
類動物までの全ての生物において見出される。このアミ
ノ基転移反応において、アミノ基はアミノ酸からα−ケ
ト酸に転移される。アンモニアを放出することなくアミ
ノ基の転移に介在するのに、ピリドキサールリン酸が補
因子として必要である。
【００８２】アミノ酸には、現在、動物飼料の添加物、
ヒトの栄養補助剤、輸液の成分、並びに医薬及び農業用
製品を製造するための合成中間体としての用途がある。
例えば、L−グルタミン酸はヒトの食物の香味増強剤と
して知られる最良のものである。L−リジン及びL−メチ
オニンは動物飼料及びヒトの補助剤に対する大容量添加
物である。L−トリプトファン及びL−トレオニンは同じ
ような潜在的な用途を有する。L−フェニルアラニン及
びL−アスパラギン酸は、低カロリー甘味料アスパルテ
ーム及び特定のアミノ酸をも含む組成を有する他の見込
みのある低カロリー甘味料の製造における鍵化合物とし
て、非常に重要な市場潜在力を有する。輸液では、ヒト
の食餌において必須のものを含む広範囲のアミノ酸が必
要とされる。
【００８３】トランスアミナーゼは高度に立体選択的で
あり、基質としてL−アミノ酸を最も用いる。1995年12
月7日に出願され、“組み合わせ酵素の開発”と題す
る、通常に譲渡された係属する米国仮出願第60／008,31
6号（その開示の全体は参考として本明細書に組み込ま
れる）に開示されるアプローチを用いて、本発明のトラ
ンスアミナーゼを、D−アミノ酸を基質として用いるよ
うに変換することができる。そのような変換は、多数の
広範なトランスアミナーゼ応用を可能にする。例えば、
D−バリンを合成ピレスロイドの製造において用いるこ
とができる。D−フェニルグリシン及びその誘導体はβ
−ラクタム抗生物質の成分として有用であり得る。さら
に、この熱安定性トランスアミナーゼは高温及び有機溶
媒中で優れた安定性を有する。したがって、これらは、
医薬、農業、及び他の化学的な製造において用いられる
光学的に純粋なキラル化合物の製造にL−及び／又はD−
アミノ酸のいずれかを用いるのにより適している。
【００８４】アミノ酸及びそれらの誘導体の工業的規模
での製造においてトランスアミナーゼを用いるのには多
くの理由がある。
【００８５】1） トランスアミナーゼは対応するα−
ケト酸からのD−もしくはL−アミノ酸の立体選択的な合
成を触媒することができる。従って、Ｌ−もしくはＤ−
異性体は全く生成されず、また分割は必要ない。
【００８６】2） トランスアミナーゼは均一に高い触
媒速度を有し、酵素１mg当たり毎分400μモル以下の基
質を変換することができる。
【００８７】3） 必要とされる多くのα−ケト酸類は
化学合成により低コストで都合よく製造することができ
る。
【００８８】4） トランスアミナーゼを用いる固定化
酵素法のための資本投資は大規模発酵法のためのものよ
りも非常に低く、そのバイオリアクターの生産性はしば
しば１桁高いオーダーである。
【００８９】5） この技術は、様々な特異性を持つト
ランスアミナーゼが存在するため、一般に広範囲のD−
もしくはL−アミノ酸に適用することができる。このよ
うな広い範囲は、同じ装置及び、しばしば、同じ生体触
媒を用いて、多くの異なるL−もしくはD−アミノ酸を製
造することを可能にする。
【００９０】本発明の配列に相当する酵素に対して生じ
る抗体は、その酵素を動物に直接注射することにより、
又はその酵素を動物、好ましくは非ヒトに投与すること
により得ることができる。次に、そのようにして得られ
た抗体を酵素自体と結合させる。このようにして、酵素
の断片のみをコードする配列でさえも天然型酵素全体を
結合する抗体の産生に用いることができる。次いで、こ
のような抗体を、その酵素を発現する細胞からの酵素の
単離に用いることができる。
【００９１】モノクローナル抗体を調製するには、連続
細胞系培養によって産生される抗体をもたらすあらゆる
技術を用いることができる。具体例には、ハイブリドー
マ技術（Kohler及びMilstein, Nature, 256：495−497,
1975）、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技
術（Kozborら, Immunology Today 4：72, 1983）、及び
ヒトモノクローナル抗体を産生させるためのEBV−ハイ
ブリドーマ技術（モノクローナル抗体及び癌治療（Mono
clonal Antibodies and Cancer Therapy）におけるCole
ら，Alan R. Liss, Inc., pp.77−96, 1985）が含まれ
る。
【００９２】一本鎖抗体の製造について記述される技術
（米国特許第4,946,778号）を本発明の免疫学的酵素産
生物に対する一本鎖抗体の製造に適用することができ
る。また、遺伝子導入マウスを本発明の免疫学的酵素産
生物に対するヒト化抗体の発現に用いることもできる。
【００９３】本発明の酵素に対して産生させた抗体は他
の生物及び試料からの類似の酵素のスクリーニングにお
いて用いることができる。このようなスクリーニング技
術は当該技術分野において公知であり、例えば、そのよ
うなスクリーニング検定の1つがSambrook及びManiatis,
分子クローニング；実験マニュアル（第2版）, 第2巻,
8.49項, Cold Spring Harbor, 1989に記述されてお
り、これは参考としてその全体がここに組み込まれる。
【００９４】以下の実施例を参照して本発明をさらに説
明するが、本発明はこのような実施例に限定されるもの
ではないことは理解される。全ての部又は量は、他に指
定されない限り、重量基準である。
【００９５】以下の実施例の理解を容易にするため、特
定の頻繁に現れる方法及び／又は用語を説明する。
【００９６】“プラスミド”は大文字及び／又は数字に
先行し、及び／又はそれが続く小文字の“p”で表され
る。本明細書における出発プラスミドは、商業的に入手
可能であるか、無制限に公的に入手可能であるか、ある
いは入手可能なプラスミドから公表された手順に従って
構築することができる。加えて、説明されるものと等価
のプラスミドが当該技術分野において公知であり、当業
者には明らかであろう。
【００９７】DNAの“消化”は、DNAの特定の配列でのみ
作用する制限酵素を用いるDNAの触媒的開裂を指す。本
明細書で用いられる様々な制限酵素は商業的に入手可能
であり、それらの反応条件、補因子及び他の要件は当業
者に公知のものを用いた。分析の目的では、典型的には
1μgのプラスミド又はDNA断片を、約20μlのバッファー
溶液中の約2単位の酵素と共に用いる。プラスミドを構
築するためのDNA断片を単離する目的では、典型的には5
ないし50μgのDNAをより大容積中の20ないし250単位の
酵素で消化する。特定の制限酵素に適切なバッファー及
び基質の量はその製造者によって指定される。37℃で約
1時間のインキュベーション時間を通常用いるが、供給
者の指示に従って変動し得る。消化の後、その反応物を
ポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動して所望の断
片を単離する。
【００９８】開裂した断片のサイズ分離は、Goeddelら,
Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)に記述される8パ
ーセントポリアクリルアミドゲルを用いて行う。
【００９９】“オリゴヌクレオチド”は一本鎖ポリデオ
キシヌクレオチド又は2本の相補的ポリデオキシヌクレ
オチド鎖を指し、これは化学的に合成されたものでもよ
い。このような合成オリゴヌクレオチドには5′リン酸
がなく、したがって、キナーゼの存在下においてATPを
用いてリン酸を付加することなしに別のオリゴヌクレオ
チドに連結することはない。合成オリゴヌクレオチドは
脱リン酸化されていない断片に連結する。
【０１００】“連結”は、2つの二本鎖核酸断片の間に
リン酸ジエステルを形成するプロセスを指す（Maniati
s, T.ら, 同著, p.146）。特に断らない限り、連結は、
ほぼ等モル量の連結しようとするDNA断片0.5μg当たり1
0単位のT4 DNAリガーゼ（“リガーゼ”）と共に公知の
バッファー及び条件を用いて達成することができる。
【０１０１】特に断らない限り、形質転換はSambrook及
びManiatis, 分子クローニング；実験マニュアル, Cold
Spring Harbor, 1989に記述される通りに行った。
【０１０２】
【実施例】実施例1 トランスアミナーゼ及びアミノトランスフェラーゼの細
菌性発現及び精製 本発明の酵素をコードするDNA、配列番号(SEQ ID NO:)2
5ないし32、36及び40を、このDNAを含むpBluescriptベ
クターから、本明細書に注記されるプライマーを用いる
PCR技術によって最初に増幅した。次に、増幅した配列
をこれらのプライマーの配列の下にリストされたそれぞ
れのPQEベクターに挿入し、本明細書で説明されるプロ
トコルに従って酵素を発現させた。また、ゲノムDNAもP
CR増幅の鋳型として用いられており、すなわち、陽性ク
ローンが同定され、かつプライマーの配列がcDNAを用い
て決定されると、それをゲノムDNAに戻し、所望の配列
（1つもしくは複数）を直接増幅することが可能であっ
た。それぞれの遺伝子の5′及び3′プライマー配列及び
ベクターは以下の通りである：Aquifexアスパラギン酸トランスフェラーゼA ベクター：pQET1Aquifexアスパラギン酸トランスフェラーゼB ベクター：pQET1Aquifexアデノシル−8−アミノ−7−オキソノナノエー
トアミノトランスフェラーゼ ベクター：pQET12Aquifexアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ ベクター：pQET12Ammonifex degensiiアスパラギン酸アミノトランスフェ
ラーゼ ベクター：pQET12 Aquifexグルコサミン：フルクトース−6−リン酸アミノ
トランスフェラーゼ ベクター：pQET1Aquifexヒスタジン−リン酸アミノトランスフェラーゼ ベクター：pQET1Pyrobacullum aerophilum分枝鎖アミノトランスフェラ
ーゼ ベクター：pQET1Ammonifex degensii hpアミノトランスフェラーゼ ベクター：pQET1 Aquifexアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ ベクター：pQET1 指示される制限酵素部位はそれぞれの遺伝子について指
示される細菌性発現ベクター上の制限酵素部位に相当す
る（キアジェン社、チャッツワース、CA）。pQEベクタ
ーは抗生物質耐性（Ampr）、細菌性複製起点（ori）、I
PTG−調節可能プロモーターオペレーター（P／O）、リ
ボソーム結合部位（RBS）、6−His タグ及び制限酵素部
位をコードする。
【０１０３】pQEベクターを指示される制限酵素で消化
した。増幅した配列をそれぞれのpQEベクターに連結
し、RBSをコードする配列を有する枠中に挿入した。次
に、この連結混合物を電気穿孔法による大腸菌M15／pRE
P4株（キアジェン社）の形質転換に用いた。M15／pREP4
はプラスミドpREP4の複数のコピーを有し、このプラス
ミドはlacIリプレッサーを発現し、かつカナマイシン耐
性（Kanr）をも付与する。形質転換体をLBプレート上で
成長するそれらの能力により同定し、アンピシリン／カ
ナマイシン耐性コロニーを選択した。プラスミドDNAを
単離し、制限分析により確認した。所望の構築体を含む
クローンを、Amp（100μg／ml）及びKan（25μg／ml）
の両者を補充したLB培地における液体培養で一晩（O／
N）増殖させた。このO／N培養物を用いて、大量培養物
に1：100ないし1：250の比で接種した。これらの細胞を
0.4ないし0.6の光学密度600（O.D.600）まで増殖させ
た。その後、IPTG（“イソプロピル−β−D−チオガラ
クトピラノシド”）を1mMの最終濃度まで添加した。IPT
GはlacIリプレッサーを不活性化することによりP／Oの
一掃を誘発し、これは遺伝子の発現の増加につながる。
細胞をさらに3ないし4時間増殖させた。その後、遠心に
より細胞を回収した。
【０１０４】上に詳述されるプライマー配列は、以下に
説明されるハイブリダイゼーション技術による寄託物か
らの標的遺伝子の単離に用いることもできる。
【０１０５】実施例2 寄託されたゲノムクローンからの選択クローンの単離 目的の遺伝子に対応する2つのオリゴヌクレオチドプラ
イマーを、寄託物からのその遺伝子の増幅に用いる。ポ
リメラーゼ連鎖反応を、0.1μgの目的の遺伝子のDNAを
含む 25μlの反応混合物中において行う。この反応混合
物は1.5〜5mM MgCl2、0.01％（w／v）ゼラチン、dATP、
dCTP、dGTP、dTTPの各々20μM、各々のプライマー25ピ
コモル及び1.25単位のTaqポリメラーゼである。30サイ
クルのPCR（94℃で1分間の変性；55℃で1分間のアニー
リング；72℃で1分間の伸長）をパーキン−エルマー・
シータス（Perkin-Elmer Cetus）9600サーマルサイクラ
ーを用いて行う。増幅した産生物をアガロースゲル電気
泳動により分析し、期待される分子量を有するDNAバン
ドを切り出して精製する。このPCR産生物を、そのDNA産
生物のサブクローン化及び配列決定により、目的の遺伝
子であることを立証する。
【０１０６】本発明の多くの変更及び変形が上述の教示
に照らして可能であり、したがって、添付の請求の範囲
の範囲内で、本発明は特に説明されたものとは別の方法
で実施することができる。
【０１０７】
【配列表】
配列番号：1 配列の長さ：52 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：2 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：3 配列の長さ：52 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：4 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：5 配列の長さ：52 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：6 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：7 配列の長さ：52 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：8 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：9 配列の長さ：52 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：10 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：11 配列の長さ：52 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：12 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：13 配列の長さ：52 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：14 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：15 配列の長さ：52 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：16 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：17 配列の長さ：1245 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 配列番号：18 配列の長さ：1122 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 配列番号：19 配列の長さ：1359 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 配列番号：20 配列の長さ：1032 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 配列番号：21 配列の長さ：1197 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 配列番号：22 配列の長さ：1779 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 配列番号：23 配列の長さ：1065 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 配列番号：24 配列の長さ：912 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 配列番号：25 配列の長さ：414 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：26 配列の長さ：373 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：27 配列の長さ：453 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：28 配列の長さ：343 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：29 配398 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：30 配列の長さ：592 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：31 配列の長さ：354 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：32 配列の長さ：303 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：33 配列の長さ：52 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：34 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：35 配列の長さ：1092 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 配列番号：36 配列の長さ：363 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：37 配列の長さ：52 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：38 配列の長さ：31 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 配列 配列番号：39 配列の長さ：1085 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：核酸 配列 配列番号：40 配列の長さ：394 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明のAquifexアスパラギン酸トランスア
ミナーゼAの完全長ＤＮＡ(配列番号17)及び対応する推
定アミノ酸配列(配列番号25)を示す図である。配列決定
は本発明の全ての配列について378自動ＤＮＡシークエ
ンサー(AppliedBiosystems, Inc.)を使用して行った。
【図２】 Aquifexアスパラギン酸アミノトランスフェ
ラーゼBの完全長ＤＮＡ(配列番号18)及び対応する推定
アミノ酸配列(配列番号26)を示す図である。
【図３】 Aquifexアデノシル-8-アミノ-7-オキソノナ
ノエートアミノトランスフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配
列番号19)及び対応する推定アミノ酸配列(配列番号27)
を示す図である。
【図４】 Aquifexアセチルオルニチンアミノトランス
フェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号20)及び対応する推
定アミノ酸配列(配列番号28)を示す図である。
【図５】 Ammonifex degensiiアスパラギン酸アミノト
ランスフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号21)及び対応
する推定アミノ酸配列(配列番号29)を示す図である。
【図６】 Aquifexグルコサミン:フルクトース-6-リン
酸アミノトランスフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号2
2)及び対応する推定アミノ酸配列(配列番号30)を示す図
である。
【図７】 Aquifexヒスチジノールリン酸アミノトラン
スフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号23)及び対応する
推定アミノ酸配列(配列番号31)を示す図である。
【図８】 Pyrobacullum aerophilum分枝鎖アミノトラ
ンスフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号24)及び対応す
る推定アミノ酸配列(配列番号32)を示す図である。
【図９】 Ammonifex degensiiヒスチジノールリン酸ア
ミノトランスフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号35)及
び対応する推定アミノ酸配列(配列番号36)を示す図であ
る。
【図１０】 Aquifexアスパラギン酸アミノトランスフ
ェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号39)及び対応する推定
アミノ酸配列(配列番号40)を示す図である。
【図１１】 グルタミン酸デヒドロゲナーゼを使用して
タンパク質のアミノトランスフェラーゼ活性を調べるた
めに使用したアッセイの説明図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年６月２６日（２００２．６．２
６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Aと図１Bは連続した配列を表し、本発明
のAquifexアスパラギン酸トランスアミナーゼAの完全長
ＤＮＡ(配列番号17)及び対応する推定アミノ酸配列(配
列番号25)を示す図である。配列決定は本発明の全ての
配列について378自動ＤＮＡシークエンサー(Applied Bi
osystems, Inc.)を使用して行った。
【図２】 図２Aと図２Bは連続した配列を表し、Aquife
xアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼBの完全長Ｄ
ＮＡ(配列番号18)及び対応する推定アミノ酸配列(配列
番号26)を示す図である。
【図３】 図３Aと図３Bは連続した配列を表し、Aquife
xアデノシル-8-アミノ-7-オキソノナノエートアミノト
ランスフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号19)及び対応
する推定アミノ酸配列(配列番号27)を示す図である。
【図４】 図４Aと図４Bは連続した配列を表し、Aquife
xアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼの完全
長ＤＮＡ(配列番号20)及び対応する推定アミノ酸配列
(配列番号28)を示す図である。
【図５】 図５Aと図５Bは連続した配列を表し、Ammoni
fex degensiiアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ
の完全長ＤＮＡ(配列番号21)及び対応する推定アミノ酸
配列(配列番号29)を示す図である。
【図６】 図６Aと図６Bと図６Cは連続した配列を表
し、Aquifexグルコサミン:フルクトース-6-リン酸アミ
ノトランスフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号22)及び
対応する推定アミノ酸配列(配列番号30)を示す図であ
る。
【図７】 図７Aと図７Bは連続した配列を表し、Aquife
xヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼの完
全長ＤＮＡ(配列番号23)及び対応する推定アミノ酸配列
(配列番号31)を示す図である。
【図８】 図８Aと図８Bは連続した配列を表し、Pyroba
cullum aerophilum分枝鎖アミノトランスフェラーゼの
完全長ＤＮＡ(配列番号24)及び対応する推定アミノ酸配
列(配列番号32)を示す図である。
【図９】 Ammonifex degensiiヒスチジノールリン酸ア
ミノトランスフェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号35)及
び対応する推定アミノ酸配列(配列番号36)を示す図であ
る。
【図１０】 Aquifexアスパラギン酸アミノトランスフ
ェラーゼの完全長ＤＮＡ(配列番号39)及び対応する推定
アミノ酸配列(配列番号40)を示す図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１Ｂ】
【図１Ａ】
【図８Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図４Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図９】
【図１０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 13/04 5/00 Ａ (72)発明者 スワンソン，ロナルド，ブイ. アメリカ合衆国 19063 ペンシルバニア 州，メディア，レモン ストリート 309, アパートメント エイ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 AA11 BA10 BA71 CA04 DA06 EA04 GA14 HA01 4B050 CC03 DD02 LL01 LL02 LL03 4B064 AE03 CA02 CA19 CC24 DA01 DA10 DA13 DA16 4B065 AA01Y AA26X AB01 BA02 BA03 CA17 CA29 CA41 CA44 CA46

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 (a) 配列番号３２に示されるアミノ酸配
    列を含み、かつアミノトランスフェラーゼ活性を有する
    酵素をコードするポリヌクレオチドと少なくとも70％の
    同一性を有するポリヌクレオチド；および (b) 配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む酵素を
    コードするポリヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチ
    ド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
    し、かつアミノトランスフェラーゼ活性を有するタンパ
    ク質をコードするポリヌクレオチドからなる群より選択
    されたメンバーを含む単離されたポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、
    請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドがＲＮＡである、
    請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 配列番号３２のアミノ酸１〜303を含む
    酵素をコードする、請求項２に記載のポリヌクレオチ
    ド。
  5. 【請求項５】 請求項２に記載のＤＮＡを含むベクタ
    ー。
  6. 【請求項６】 請求項５に記載のベクターを含む宿主細
    胞。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載の宿主細胞から前記ＤＮ
    Ａにコードされたポリペプチドを発現することを含む、
    該ポリペプチドの製造方法。
  8. 【請求項８】 該細胞が請求項５に記載のベクターに含
    まれるＤＮＡによってコードされたポリペプチドを発現
    するように該細胞を該ベクターで形質転換またはトラン
    スフェクトすることを含む、細胞の製造方法。
  9. 【請求項９】 （a） 配列番号２４に示される配列と少
    なくとも70%同一であるヌクレオチド配列によりコード
    され、かつアミノトランスフェラーゼ活性を有するアミ
    ノ酸配列を含む酵素；および （b） 配列番号２４に示されるポリヌクレオチド配列に
    相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下
    でハイブリダイズするヌクレオチド配列にコードされる
    アミノ酸配列を含み、かつアミノトランスフェラーゼ活
    性を有する酵素からなる群から選択されたメンバーを含
    む酵素。
  10. 【請求項１０】 アミノ酸を、α-ケト酸の存在下で、
    配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有する酵素と接
    触させることを含む、アミノ基をアミノ酸からα-ケト
    酸に転移する方法。
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