CN1314911A - 用dna改组优化害虫抗性基因 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了获得用于赋予植物抗害虫抗性的比天然存在基因改善的害虫抗性基因的方法。该方法包括利用害虫抗性基因的DNA改组来产生重组害虫抗性基因文库,然后筛选该文库,鉴定出显示感兴趣的性能有所改善的那些基因。

Description

用DNA改组优化害虫抗性基因
                         相关申请交叉文献
本申请要求了1998年5月1日提交的(转变为临时申请No.60/122,054)09/071,816以及1998年7月28日提交的临时申请60/094,462的优先权。
                            发明领域
本发明涉及开发能赋予植物对昆虫、线虫、真菌和其它害虫抗性的优化基因的领域。
                            发明背景
编码具有杀虫活性的蛋白质的基因目前用于农业防治特定的害虫(AsgrowReports-《防治害虫的基因工程改造》-Len Copping,2.1-2.4章)。例如，编码苏云金芽孢杆菌(Bt)晶体蛋白的基因已被稳定地掺入几种作物中，并广泛用作昆虫防治剂(Pest.Sci.(1998)52:165-175,Asgrow Reports,同上)。编码杀虫活性的其它几个不同的基因也是已知的(Asgrow Reports，同上)。然而，使用的许多这类基因的最大限制是缺乏足够的活性(强效性)和/或缺乏有用的活性谱。例如，即使是使用最广泛的编码晶体蛋白的基因家族，在害虫防治以及对各种经济上重要的害虫的效果方面有局限性(Asgrow Reports,同上)。例如Bt毒素对玉米根蠕虫和其它鞘翅目害虫的作用微弱。
因此，需要具有抗各种植物害虫性能改进的毒素，以及获得这种毒素的方法。本发明令人惊奇地提供了解决上述各问题的一种策略，并提供了其它各种性能，在参阅了以下全部材料后将会明了这些内容。
                            发明概述
本发明提供了获得优化的重组害虫抗性基因的方法，该方法可赋予表达该基因的植物对害虫的抗性。该方法包括(1)重组多种形式的核酸，这些核酸含有衍生自能赋予植物对害虫抗性的基因的片段，其中多种形式的核酸彼此有两个或多个核苷酸不同，从而产生了重组害虫抗性基因文库；和(2)筛选该文库，以鉴定出至少一种与非重组害虫抗性基因相比表现出抵抗害虫能力有所改进的优化的重组害虫抗性基因。
在一些实施方案中，该方法还包括(3)将至少一种优化的重组害虫抗性基因与另一种形式的害虫抗性基因重组，后者与(1)中的一种或多种核酸形式相同或不同，从而产生另一个重组害虫抗性基因文库；(4)筛选该文库，鉴定出至少一种与非重组害虫抗性基因相比表现出抵抗害虫能力进一步改进的进一步优化的重组害虫抗性基因；和(5)按需重复(3)和(4)，直至进一步优化的重组载体组件与非重组害虫抗性基因相比抵抗害虫能力有进一步改善。
本发明还提供了含有多个重组害虫抗性基因的文库，其中每个重组害虫抗性基因含有能赋予植物对害虫抗性的基因片段的不同交换。
                            附图简述
图1显示了体外改组的方案，即基因的“递推序列重组”。
图2显示了苏云金芽孢杆菌毒素基因的树状图。
图3显示了更多数目的Bt毒素基因的树状图。
图4显示的树状图表明各种类型的Cry1、Cry3、Cry7、Cry8、Cry14和Cry18毒素之间的相似性。
图5显示了用发根土壤杆菌(A.rhizogenes)将改组的毒素基因插入发根中，然后筛选对感兴趣害虫的毒素活性的存在。
定义
术语“筛选”通常描述的是一个两步骤过程，其中首先确定那些细胞表达和不表达筛选标记，然后物理分离具有所需性能的细胞。选择是筛选的一种形式，其中通过选择标记的表达同时实现鉴定和物理分离，该选择标记在一些遗传情况下允许表达该标记的细胞存活而其它细胞死亡(或相反)。筛选标记包括萤光素酶、β-半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白。选择标记包括药物和毒素抗性基因。尽管在自然进化过程中能够并确实发生自发选择，但是在本发明方法中是由人来进行选择的。
本文所用的术语“外源DNA片段”、“异源序列”或“异源核酸”是指对特定宿主细胞而言是外来来源的，或，如果来自相同来源，是从其最初形式修饰得来的。因此，宿主细胞中的异源基因包括特定宿主细胞的内源性但已修饰过的基因。在本文描述的申请中，异源序列的修饰通常通过使用DNA改组来产生。因此，该术语指对于细胞是外源或异源的DNA片段，或与细胞同源但在宿主细胞核酸中的位置不是通常所能见到的。外源DNA片段表达产生外源多肽。
术语“基因”广泛地用来指与某生物功能有关的任何DNA片段。因此，基因包括编码序列和/或其表达所需的调控序列。基因还包括例如形成其它蛋白识别序列的不表达的DNA片段。基因可从各种来源获得，包括从感兴趣的来源克隆，或从已知的或预计的序列信息合成，并可包括设计的具有所需性能的序列。
害虫抗性基因的“杀虫有效部分”指这样一种DNA序列，它编码的多肽具有的氨基酸少于害虫抗性基因编码的各全长多肽，但是仍对害虫靶标有毒性。
术语“分离的”当应用于核酸或蛋白质时指，该核酸或蛋白质基本上不含天然状态下与其结合的其它细胞组分。它宜为均一状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一度通常用分析化学技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱来测定。在一制备物中占优势的蛋白质是基本上纯化的。具体地说，分离的基因与侧接该基因并编码非所述基因的蛋白质的开放读框分开。术语“纯化的”表示某核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上形成一条带。它尤其指核酸或蛋白质至少约50％纯，以至少85％纯为佳，至少99％纯为更佳。
术语“天然存在”用来描述某物体可在自然界中找到，与人工产生的不同。例如，存在于生物体(包括病毒)中的能从自然来源分离出、并且未经实验室人员有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
术语“核酸”指脱氧核糖核酸或核糖核酸及其单链或双链形式的聚合物。除非另有特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，该核酸具有与参比核酸相似的结合性能，并以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另有所述，特定的核酸序列也含蓄地包括其保守性修饰的变体(如简并密码子取代物)和互补序列，以及明显表示的序列。具体地说，简并密码子取代可通过形成序列，使序列中一个或多个所选(或所有)密码子的第三个位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代来实现的。(Batzer等,(1991)Nucleic Acid Res.19:5081；Ohtsuka等,(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；Cassol等(1992)；Rossolini等,(1994)Mol.Cell.Probes 8:91-98)。术语核酸可与基因、cDNA和基因编码的mRNA互换使用。
“基因衍生的核酸”指这样一种核酸，其合成最终以基因或其亚序列作为模板。因此，mRNA、反转录自mRNA的cDNA、转录自cDNA的RNA、从cDNA扩增的DNA、转录自扩增DNA的RNA等均衍生自该基因，这些衍生产物的检测表明样品中存在和/或富含最初的基因和/或基因转录物。
当一核酸被置于与另一核酸序列有功能关系的位置时，核酸是“操作性相连的”。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。操作性相连指连接的DNA序列通常是毗邻的，且当需要连接两个蛋白编码序列时，是毗邻的并在读框内。然而，由于增强子通常在与启动子分开数千碱基时仍起作用，且内含序列可以是变化的长度，因此，一些多核苷酸元件可以操作性相连但不毗邻。
两个分子(例如配体和受体)之间的特异性结合亲和力指一个分子与分子混合物中的另一分子优先结合。如果结合亲和力在约1×10-4至1×10-6之间或更高，则认为分子的结合是特异性的。
术语“重组”用于细胞时是指该细胞复制异源核酸，或表达由异源核酸编码的肽或蛋白。重组细胞可含有在细胞天然(非重组)形式中未见到的基因。重组细胞还含有在天然形式的细胞中见到的基因，其中这些基因经人工方式修饰并重新导入细胞内。该术语还包括含有内源核酸的细胞，该细胞经过修饰但没有从细胞中除去核酸；这些修饰包括通过基因置换、定点突变和有关技术获得的那些。
“重组表达盒”(或简称“表达盒”)是用重组或合成方法产生的核酸构建物，其具有的核酸元件能实现结构基因在与这些序列相容的宿主中表达。表达盒至少包括启动子，以及任选的转录终止信号。通常，重组表达盒包括待转录的核酸(例如编码所需多肽的核酸)以及启动子。在实现表达中所需的或有帮助的其它因子也可如本文所述那样使用。例如，表达盒还可包括编码引导被表达蛋白分泌出宿主细胞的信号序列的核苷酸序列。转录终止信号、增强子以及影响基因表达的其它核酸序列也可包括在表达盒内。
在两个或多个核酸或多肽序列的情况下，术语“相同”或“相同性”百分数是指，当比较和排列对比以获得最大一致性(用下列序列对比算法之一或观察来测定)时，两个或多个序列或亚序列相同，或具有指定百分数的氨基酸残基或核苷酸是相同的。
在两个核酸或多肽情况下，术语“基本上相同”是指，当比较和排列对比以获得最大一致性(用下列序列对比算法之一或观察来测定)时，两个或多个序列或亚序列具有至少60％、较佳的80％、最佳的90-95％的核苷酸或氨基酸残基相同性。较佳的，基本相同性存在于至少长约50个残基的序列区域内，更佳在至少约100个残基的区域内，最佳的是序列在至少约150个残基内基本上相同。在一个最佳的实施方案中，序列在编码区的整个长度内基本上相同。
为了比较序列，通常将一个序列作为参比序列与测试序列比较。当用序列对比算法时，将测试和参比序列输入计算机内，指定亚序列坐标，如果需要，指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列与参比序列的序列相同性百分数。
序列比较的最优序列排列对比可采用例如Smith和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)中的局部同源性算法、Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)中的同源性排列算法、Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci(USA)85:2444(1988)中的相似性搜寻方法、这些算法的计算机化操作(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Wisconsin Genetics软件包，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)、或目测(见Ausubel等人，下文)。
适合测定序列相同性和序列相似性百分数的算法一个例子是Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中描述的BLAST算法。公众可通过National Center forBiotechnology Information获得进行BLAST分析的软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。该算法包括首先确定高的评分序列对(HSP)，方法是确定询问序列中长度为W的短词，该单词在与数据库序列中长度相同的单词对比时与一些阳性值临界评分T匹配或满足。T指相邻单词评分临界值(Altschul等人，同上)。这些初始的相邻单词命中物作为启动搜索以发现含有它们的较长HSP的种子。然后沿每一序列两个方向延伸该单词命中物，只要累积对比评分能够增加。对于核苷酸序列，用参数M(一对匹配残基的奖励分；始终大于0)和N(不匹配残基的罚分；始终小于0)计算累积分。对于氨基酸序列，用评分矩阵来计算累积分。当累积对比分从其实现的最大值下降X量时；由于一个或多个负分残基对比的积累，累积分变为0或低于0：或到达序列的任一末端时，停止单词命中物在每个方向上的延伸。BLAST算法参数W、T和X确定了序列对比的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)采用的空缺单词长度(W)为11，期望值(E)为10，截断值为100,M=5,N=-4，是两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序采用的默认值单词长度(W)为3，期望值(E)为10，和BLOSUM62评分矩阵(见Henikoff & Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)。
除了计算序列相同性百分数外，BLSAT算法还统计分析两个序列之间的相似性(例如参见，Karlin & Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性测定方法是最小总和可能性(P(N))，它表示两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配发生的可能性。例如，如果测试核酸和参比核酸比较中的最小总和可能性小于约0.1，更佳的小于约0.01，最佳的小于约0.001，则认为核酸与参比序列相似。
两个核酸序列基本上相同的另一个暗示是两个分子在严谨条件下相互杂交。术语“与…特异性杂交”指，当其序列存在于一个DNA或RNA复杂混合物中(例如总细胞)时，该分子在严谨条件下只与一特定的核苷酸序列结合、形成双链或杂交。“基本结合”指探针核酸与靶核酸之间的互补性杂交，并包括通过降低杂交培养基的严谨度可容纳的微量错配，而实现对寡核苷酸靶序列如所希望的检测。
在核酸杂交实验(如Southern和Northern杂交)中，“严谨的杂交条件”和“严谨的杂交洗涤条件”取决于序列，而且在不同的环境参数下不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。在Tijssen(1993)《生物化学和分子生物学的实验室技术一与核酸探针的杂交》第2章第1部分(杂交以及核酸探针试验的原理综述”，Elsevier,NewYork)中有关于核酸杂交的广泛的指导。通常，选择高度严谨的杂交和洗涤条件使得比在确定的离子强度和pH下特定核酸序列的解链温度(Tm)低大约5℃。通常，在“严谨条件”下，探针将与其靶亚序列杂交，但不与其它序列杂交。
Tm是在确定的离子强度和pH下，50％的靶序列与最佳匹配的探针杂交时的温度。选择非常严谨的条件，使其等于特定探针的Tm。在Southern或Northern印迹中滤膜上具有100个以上互补残基的互补性核酸杂交的严谨杂交条件实例是，42℃下50％甲酰胺和1毫克肝素，杂交过夜。高度严谨的洗涤条件实例是72℃ 0.15M NaCl洗涤约15分钟。严谨洗涤条件的实例是65℃ 0.2×SSC洗涤15分钟(参见Sambrook,下文，关于SSC缓冲液的描述)。通常，高严谨度的洗涤前有低严谨度的洗涤，以除去本底探针信号。例如，超过100个核苷酸的双链体的中等严谨洗涤是1×SSC 45℃洗涤15分钟。超过100个核苷酸的双链体的低严谨度洗涤条件是4-6×SSC 40℃洗涤15分钟。对于短探针(例如约10-50核苷酸)，严谨条件通常包括在pH 7.0-8.3下，盐浓度低于约1.0M钠离子，通常约0.01-1.0M的钠离子浓度(或其它盐)，温度通常至少约30℃。严谨条件还可通过加入去稳定剂如甲酰胺来实现。通常，在特定的杂交试验中，信噪比为不相关探针所测得信噪比的2倍(或更高)，就表明检测到有特异性杂交。如果核酸编码的多肽是基本相同的话，则在严谨条件下不相互杂交的核酸仍是基本相同的。例如，当用基因密码所允许的最大密码子简并性来生成一个核酸的拷贝时，会发生这种现象。
进一步表明两个核酸序列或多肽基本上相同的是第一个核酸编码的多肽与第二个核酸编码的多肽发生免疫学交叉反应或特异性结合。因此，例如，当两种肽的不同只在于保守性取代时，一个多肽通常与第二多肽基本上相同。
术语“特异性(或选择性)与抗体结合”或“发生特异性(或选择性)免疫反应”在指蛋白质或肽时，是指在大量异源蛋白质和其它生物制品存在下可测定其蛋白质存在的结合反应。因此，在指定的免疫试验条件下，特定的抗体与特定的蛋白质结合，而不会与样品中其它蛋白质大量结合。在这样的条件下与抗体的特异性结合可能需要选择对特定蛋白质有特异性的抗体。例如，可选择针对具有本发明任一多核苷酸所编码氨基酸序列的蛋白质的抗体，来获得与该蛋白特异性免疫反应但不与其它蛋白质(除非是多形性变体)结合的抗体。可用各种免疫试验形式来选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，通常用固相ELISA免疫试验、Western印迹或免疫组织化学来选择与某蛋白质发生特异性免疫反应的单克隆抗体。参见Harlow和Lane(1988)《抗体：实验室手册》，Cold Spring Harbor Publications,New York(“Harlowand Lane”)关于可用来测定特异性免疫反应活性的免疫试验形式和条件部分。通常，特异性或选择性反应的信号至少是本底信号或噪扰的两倍，更通常的比本底大10倍-100倍以上。
特定多核苷酸序列的“保守性修饰变化”指那些多核苷酸，它们编码相同或基本相同的氨基酸序列，或当多核苷酸不编码氨基酸序列时，具有基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，许多功能相同的核酸编码了一给定多肽。例如，密码子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG均编码氨基酸精氨酸。因此，在精氨酸由密码子指定的每个位置，密码子可以变成上述相应密码子的任一个而不改变编码的多肽。这种核酸变化是“沉默变化”，它是“保守性修饰变化”中的一种。本文描述的编码多肽的每个多核苷酸序列也描述了每种可能的沉默变化，除非另有所述。本领域技术人员会认识到，核酸中的每个密码子(除AUG外，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子)均可用标准技术来修饰，产生功能相同的分子。因此，每一描述的序列含蓄地包括了编码多肽的核酸的“沉默变化”。
另外，本领域技术人员也会认识到，当某改变导致一个氨基酸置换成化学相似的一个氨基酸时，个别置换、缺失或增加而使编码序列改变、增加或缺失单个氨基酸或少数氨基酸(通常低于5％，更通常地低于1％)是“保守性修饰变化”。提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸：脂族：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(V)、异亮氨酸(I)；芳族：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。另见Creighton(1984)Proteins,W.H.Freeman and Company。另外，在编码序列中改变、增加或缺失单个氨基酸或少数氨基酸的个别置换、缺失或增加也是“保守性修饰变化”。
当两个核酸具有相同的序列，或当一个核酸是另一个核酸的亚序列，或当一个序列是通过天然或人工操作从另一个序列衍生获得时，两个核酸是“对应的”。当一核酸编码一蛋白质或此蛋白质的大部分片段(通常是蛋白质至少约5％的片段)时，此核酸对应于此蛋白质。
“亚序列”指核酸或氨基酸的一种序列，该序列分别含有此核酸或氨基酸较长的序列(例如肽)的一部分。
当附加的核苷酸(或其它类似分子)掺入某核酸时，该核酸是“伸长的”。最常见的是，这是用聚合酶(例如DNA聚合酶)来进行的，该聚合酶在此核酸3′端加上一序列。
当两个核酸每一个的序列合并在一子代核酸中后，这两个核酸被“重组”。当两个核酸是重组底物时，两个序列被“直接”重组。当两序列用一中间序列(如交换寡核苷酸)来重组时，这两个序列被“间接”重组。对于间接重组，不会有一个以上序列是重组的实际底物，在一些情况下，两个序列均不是重组底物。
                            发明详述
Ⅰ．引言
本发明提供一种进化(即修饰)核酸以取得或改进用来赋予植物对害虫(包括但不局限于昆虫、线虫、真菌和蛛形动物)抗性的性能或特性的方法。该方法包括用DNA改组来获得重组害虫抗性基因，当该基因存在于植物内时，它能增强植物对害虫的抵抗力。本发明提供了明显超过以前用来优化害虫抗性基因方法的优点。例如，DNA改组可导致所需性能优化，甚至是在不详细了解其特定性能的介导机制的情况下。序列重组可用许多不同形式和置换形式来实现，如下文所详细描述的。这些形式具有一些共同的原理。
用于这种修饰或进化的底物在不同申请书中随待取得或改进的性能而不同。用来取得或改进某性能的候选底物例子包括编码杀虫蛋白的基因。该方法需要初始底物有至少两种变体形式。候选底物的变体形式可能具有基本的序列或二级结构的彼此相似性，但是它们也应在至少两处不同。各形式之间的初始差异可能是自然变异的结果，例如从不同的个体或生物体菌株(包括地理变体)或相同生物体的组成相关序列(例如等位基因变异)获得不同的变体形式(同系物)。另外，初始差异可以诱导，例如第二变体形式可能因第一变体形式的易错转录(如易错PCR或采用缺少校正活性的聚合酶(见Liao(1990)Gene 88:107-111))，或第一形式在增变菌株中复制(增变宿主细胞在下文有更详细的描述)而产生。在随后的重组步骤中，底物之间的初始差异大大增加。
有待取得或改进的性能或特性的范围很广，这当然取决于底物的选择。例如，对于害虫抗性基因，可改善的性能包括但不局限于，增加特定抗性基因有效的害虫范围，增加对害虫的效力、延迟或消除害虫产生对基因产物抗性的能力、增加抗性基因的表达水平、增加对蛋白酶降解和不稳定条件(或低或高pH)的抵抗力，和减少对宿主植物的毒性。将能赋予害虫抗性的核酸的至少两种变体形式重组成重组害虫抗性基因文库。然后筛选该文库，确定对感兴趣的特定性能优化的至少一个重组害虫抗性基因。候选害虫抗性基因的变体形式相互之间具有实质上的序列或二级结构相似性，但是它们也应当有至少两处不同。各形式之间的初始差异可能是自然变异的结果，例如从不同的个体或生物体菌株(包括地理变体；称为“家族改组”)或相同生物体的组成相关序列(例如等位基因变异)获得不同的变体形式(同系物)。另外，初始差异可以诱导，例如第二变体形式可以通过第一变体形式的易错转录(如易错PCR或采用缺少校正活性的聚合酶(见Liao(1990)Gene 88:107-111))，或第一形式在增变菌株中复制(增变宿主细胞在下文有更详细的描述)而产生。
通常，在一个回合的重组和选择后可得到改进。然而，可采用递推序列重组来实现所需性能的进一步改进。递推序列重组需要连续多轮重组以产生分子差异。即，产生一个核酸分子家族，该家族显示出相互之间的一些序列相同性，但是在所存在的突变上不同。在任一给定轮次中，重组可以在体内或体外、胞内或胞外发生。另外，在任一轮次中，通过将现有的诱变方法(例如易错PCR或盒诱变)应用于重组的底物或产物上，可增加重组产生的差异。在一些例子中，当用某序列不同的变体形式(如不同个体或生物菌株的同系物)或相同生物体的有关序列(如等位基因变异)时，在仅仅一轮体内或体外重组后，就可能获得新的或改善的性能或特性。
重组循环之后通常是至少一轮筛选或选择具有所需性能或特性的分子。如果重组循环在体外进行，则有时在筛选步骤前将重组产物(即重组片段)导入细胞。重组片段还可在筛选前与合适的载体或其它调控序列相连。另外，体外产生的重组产物有时在筛选前被包装成病毒。如果重组在体内进行，则有时可在发生重组的细胞内筛选重组产物。在其它的应用中，从细胞中抽提出重组片段，并在筛选前任选地包装成病毒。
要筛选或选择的特性取决于要取得或试图改进何种性能或特性，下文讨论了许多实施例。通常，不需要了解特定重组产物(重组片段)相对于起始底物所获得的新的或改进的性能或特性所依靠的分子基础。例如，害虫抗性基因可能有多个组分序列，每个序列具有不同的作用(例如编码序列、调控序列、靶序列、赋予稳定性的序列和影响整合的序列)。这些组分序列的每一个可以同时变化和重组。然后可以筛选/选择具有增加赋予植物对害虫抗性的能力的重组片段，而不需要将这些改进归因于载体的任一个别组分序列。
根据用于所需性能的特定筛选方法，初轮筛选有时可采用细菌细胞来进行，因为细菌细胞转染效率高，易培养。后几轮以及不适合在细菌细胞中筛选的其它类型的筛选可在植物细胞中进行，以优化重组片段在接近应用的环境中应用。最后几轮筛选可在将要应用的确切细胞类型(例如植物中的细胞)中进行。在一些方法中，重组害虫抗性基因的应用本身可作为一轮筛选。就是说，将被目的靶细胞成功吸收和/或表达的重组害虫抗性基因从那些靶细胞中回收，并用来赋予其它植物抗性。从第一靶细胞回收的重组害虫抗性基因富集了已经进化的基因，即基因通过递推序列重组得到改进，向基因特异性摄取和整合抗害虫有效性、稳定性等改进的或新的性能或特性发展。
筛选或选择步骤鉴定一个重组片段亚群，这些片段经过进化获得了赋予植物对害虫抗性的新的或改进的所需性能。根据筛选，重组片段可以细胞组分、病毒组分或游离形式被确定。在每回合重组后，可以进行一轮以上的筛选或选择。
如果希望进一步改善性能，对第一轮筛选/选择后存下的至少一个且通常是一组重组片段进行再一轮重组。这些重组片段可以相互重组，或与代表最初底物或其进一步变体的外源片段重组。同样，重组可在体外或体内进行。如果前一筛选步骤确定所需的重组片段为细胞组分，则该组分可在体内进行进一步的重组，或可在体外经历进一步的重组，或可在进行一个回合的体外重组前分离。相反，如果前一筛选步骤确定了所需重组片段为裸露形式或是病毒组分，则可将这些片段导入细胞中，进行一个回合的体内重组。第二回合重组无论怎样进行，均产生了进一步的重组片段，它包括除前一回合在重组片段内产生的多样性之外的附加多样性。
根据上述第一回合的原理，第二回合重组后可以进行下一轮筛选/选择。各轮之间的筛选/选择严谨度可以增加。另外，如果希望一个以上的性能有所改善，或希望获得一个以上的新性能，则各轮之间的筛选性质和要筛选的性能可以不同。然后，可以进行附加回合的重组和筛选，直至重组片段充分地进化，获得了所需的新的或改善的性能或功能。
本发明的实施包括重组核酸的构建以及转染宿主细胞中的基因表达。实现这些目的的分子克隆技术是本领域中已知的。适用于构建重组核酸(如表达载体)的各种克隆和体外扩增方法是本领域技术人员熟知的。这些足以指导本领域技术人员进行许多克隆练习的技术和说明书例子可在下列文献中找到：Sambrook等人，(1989)《分子克隆实验手册》第2版，卷1-3,Cold Spring Harbor Laboratory(＂Sambrook＂)；Berger和Kimmel，《分子克隆技术指南，酶学方法》152卷,Academic Press,Inc.,San Diego,CA(＂Berger＂)；和《当代分子生物学方法》，F.M.Ausubel等编，Current Protocols(GreenPublishing Associate,Inc.和John Wiley & Sons,Inc.,的合资企业)(1994增补本)(＂Ausubel＂)。
Ⅱ．序列重组的形式
本发明方法需要进行重组(“改组”)和筛选或选择来“进化”个别基因、全质粒或病毒、多基因簇或甚至全基因组(Stemmer(1995)Bio/Technology 13:549-533)。可进行反复多轮的重组和筛选/选择，以进一步进化感兴趣的核酸。这些技术不需要常规多肽工程改造方法所需要的大量分析和计算。与天然的成对重组活动(在有性复制中发生的)相反，改组能在少数选择轮中重组大量突变。因此，本文描述的序列重组技术提供的特别优点是，它们提供了在任何或所有这些突变之间的重组，从而提供了一种非常快速地寻找能影响所需结果的不同突变组合的方法。然而，在一些情况下，可获得结构和/或功能信息(虽然不是序列重组所必需的)为技术改进提供机会。
本发明者及同事的以下许多出版物描述了DNA改组：Stemmer等人，(1994)＂蛋白质的快速进化＂Nature 370:389-391；Stemmer(1994)＂通过随机片段化和重装配来DNA改组：用于分子进化的体外重组＂，Proc.Natl.Acad.USA 91:10474-10751；Stemmer，美国专利5,603,793“体外重组方法”；Stemmer等人，美国专利No 5,830,721“通过随机片段化和重装配进行DNA诱变”和Stemmer等人，美国专利No.5,811,238“通过重复选择和重组来产生具有所需特性的多核苷酸的方法”，它们描述了例如通过反复多轮诱变、改组和选择进行体外蛋白质改组的方法，和产生展示的肽和抗体文库的各种方法，以及DNA片段化后的各种DNA重装配技术，以及它们在体外和体内诱变中的应用。
本发明者及同事还发展了DNA改组技术的应用。除了上述出版物外，Minshull等人，美国专利No.5,837,458“用于细胞和代谢工程改造的方法和组合物”通过递推改组技术提供了新代谢途径的进化和生物加工的增强。Crameri等人，(1996)＂通过DNA改组构建并进化抗体噬菌体文库＂Nature Medicine 2(1):100-103描述了用于抗体噬菌体文库的抗体改组。关于DNA改组的其它详细情况可另见WO95/22625、WO97/20078、WO96/33207、WO97/33957、WO98/27230、WO97/35966、WO98/31837、WO98/13487、WO98/13485和WO989/42832。
本发明者及同事的许多出版物以及本领域中其它研究人员还描述了促进DNA改组的技术，例如通从基因的小片段或甚至是编码基因片段的寡核苷酸重装配基因。例如，除了上述出版物，Stemmer等人(1998)在美国专利No.5,834,252“末端互补聚合酶反应”中描述了扩增并检测靶序列(例如在核酸混合物中)的方法，以及从片段装配大的多核苷酸的方法。
重组文库的产生
本发明包括产生多核苷酸的重组文库，然后筛选来鉴定表现出所需性能(例如编码杀虫活性)的那些文库成员。重组文库可以用本文各种方法的任一种以及本领域技术人员明了的其它许多方法产生。
获得重组多核苷酸和/或如下所述在用作DNA改组底物的核酸中获得多样性的方法包括，例如，同源重组(PCT/US98/05223；公布号WO98/42727)；寡核苷酸定向诱变(综述见Smith,Ann.Rev.Genet.19:423-462(1985)；Botstein和Shortle,Science229:1193-1201(1985)；Carter,Biochem.J.237:1-7(1986)；Kunkel,＂寡核苷酸定向诱变的效率＂，Nucleic Acids & Molecular Biology,Eckstein和Lilley编辑，Springer Verlag,Berlin(1987))。这些方法中包括寡核苷酸定向诱变(Zoller和Smith,Nucl.Acids Res.10:6487-6500(1982),Methods in Enzymol.100:468-500(1983)，和Methods in Enzymol.154:329-350(1987))、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变(Taylor等人，Nucl.Acids Res.13:8749-8764(1985)；Taylor等人，Nucl.Acids Res.13:8765-8787(1985)；Nakamaye和Eckstein,Nucl.Acids Res.14:9679-96987(1986)；Sayers Nucl.Acids Res.16:791-802(1988)；Sayers等人，Nucl.Acids Res.16:803-814(1988))，采用含有尿嘧啶的模板的诱变(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492(1985)和Kunkel等人，Methodsin Enzymol.154:367-382))；采用有缺口的双链体DNA的诱变(Kramer等人，Nucl.Acids Res.12:9441-9456(1984)；Kramer和Fritz,Methods in Enzymol.154:350-367(1987)；Kramer等人，Nucl.Acids Res.16:7207(1988))；和Fritz等人，Nucl.AcidsRes.16:6987-6999(1988))。其它合适的方法包括点错配修复(Kramer等人，Cell38:879-887(1984))，采用修复缺陷宿主菌株的诱变(Carter等人，Nucl.Acids Res.13:4431-4443(1985)；Carter,Methods in Enzymol.154:382-403(1987))，缺失诱变(Eghtedarzadeh和Henikoff,Nucl.Acids Res.14:5115(1986))，限制性选择和限制性纯化(Wells等人，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317:415-423(1986))，总基因合成诱变(Nambiar等人，Science 223:1299-1301(1984)；Sakamar和Khorana,Nucl.Acids Res.14:6361-6372(1988)；Wells等人，Gene 34:315-323(1985)；和Grundstrom等人，Nucl.Acids Res.13:3305-3316(1985)。诱变试剂盒是市售的(例如Bio-Rad,AmershamInternational,Anglian Biotechnology)。
在目前的较佳实施方案中，用DNA改组来制备重组文库。改组和筛选或选择可用来“进化”个别基因、整个质粒或病毒、多基因簇或者甚至是整个基因组(Stemmer(1995)Bio/Technology 13:549-553)。
可反复多轮进行重组和筛选/选择，以进一步进化感兴趣的核酸。这些技术不需要常规多肽工程改造方法所需那样进行大量分析和计算。与传统的成对重组活动相反，改组能在最少的选择轮次中重组大量突变。因此，本文描述的序列重组技术提供的特别优点是，它们提供了在任何或所有这些突变之间的重组，从而提供了一种非常快速地寻找能影响所需结果的不同突变组合的方法。然而，在一些情况下，可获得结构和/或功能信息(虽然不是序列重组所必需的)为技术改进提供机会。
本发明者及同事已经在下列待批美国专利申请中描述了序列重组(有时称为DNA改组、进化或分子繁殖)的典型形式和例子：1994年2月17日提交的No.08/198,431,1995年2月17日提交的PCT/US95/02126、1995年4月18日提交的No.08/425,684、1995年10月30日提交的No.08/537,874、1995年11月30日提交的No.08/564,955、1996年3月25日提交的No.08/621,859、1996年3月25日提交的No.08/621,430、1996年4月18日提交的PCT/US96/05480、1996年5月20日提交的No.08/650,400、1996年7月3日提交的08/675,502、1996年9月27日提交的No.08/721,824、1997年9月26日提交的PCT/US97/17300、1997年12月17日提交的PCT/US97/24239；Stemmer,Science 270:1510(1995)；Stemmer等人，Gene 164:49-53(1995)；Stemmer,Bio/Technology 13:549-553(1995)；Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751(1994)；Stemmer,Nature 370:389-391(1994)；Crameri等人，NatureMedicine 2(1):1-3(1996)；Crameri等人，Nature Biotechnology 14:315-319(1996)，这些文献均出于所有目的纳入本文作参考。
其它改组形式信息
本发明方法需要进行重组(“改组”)和筛选或选择来“进化”个别基因、全质粒或病毒、多基因簇或甚至全基因组(Stemmer(1995)Bio/Technology 13:549-533)。可反复多轮进行重组和筛选/选择，以进一步进化感兴趣的核酸。这些技术不需要多肽工程常规改造方法所需那样进行大量分析和计算。与传统的成对重组活动相反，改组能在最少的选择轮次中重组大量突变。因此，本文描述的序列重组技术提供的特别优点是，它们提供了在任何或所有这些突变之间的重组，从而提供了一种非常快速地寻找能影响所需结果的不同突变组合的方法。然而，在一些情况下，可获得结构和/或功能信息(虽然不是序列重组所必需的)为技术改进提供机会。
本发明者及同事已经在下列专利和专利申请中描述了序列重组(有时称为DNA改组、进化或分子繁殖)的典型形式和例子：美国专利No.5.605,793、1995年2月17日提交的PCT申请WO95/22625(申请号PCT/US95/02126)、1995年4月18日提交的No.08/425,684、1996年3月25日提交的No.08/621,859、1996年4月18日提交的PCT申请WO97/20078(PCT/US96/05480)、1997年3月20日提交的PCT申请WO97/35966、1996年7月3日提交的08/675,502、1996年9月27日提交的No.08/721,824、1997年9月26日提交的PCT申请WO98/13487；Stemmer等人Science270:15l0(1995)；Stemmer等人，Gene 164:49-53(1995)；Stemmer等，Bio/Technology13:549-553(1995)；Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751(1994)；Stemmer,Nature 370:389-391(1994)；Crameri等人，Nature Medicine 2(1):1-3(1996)；Crameri等人，Nature Biotechnology 14:315-319(1996)，这些文献均出于所有目的纳入本文作参考。
繁殖过程从至少两个底物开始，这两个底物通常显示出相互间序列基本相同(即至少约30％、50％、70％、80％或90％的序列相同性)，但是在某些位置处彼此不同。差别可以是任何类型的突变，例如置换、插入和缺失。通常，不同的片段相互间可能有5-20处不同。为了重组而产生相对于起始物更多的多样性，诸起始物必需在至少两个核苷酸位置上互不相同。即，如果只有两个底物，则应当有至少两个分歧位置。例如，如果有三个底物，则一个底物可与第二个在一处不同，第二个可与第三个在另一处不同。起始DNA片段可以是相互的天然变体，例如等位基因或种类变体。片段也可以来自非等位基因，显示出一定程度的结构和常常是功能相关性(例如，诸如苏云金芽孢杆菌毒素家族的超家族内的不同基因)。起始DNA片段也可以是相互的诱导变体。例如，一个DNA片段可以通过另一个的易错PCR产生，或通过置换一个诱变盒而产生。诱导突变体还可通过一个(或两个)片段在诱变菌株中繁殖来制备。在这些情况下，严格地说，第二个DNA片段不是单单一个的片段，而是相关片段的大家族。形成初始物的不同片段通常具有相同的长度或长度基本上相同。然而，情况不一定如此；例如，一个片段可以是另一个的亚序列。各片段可以较大分子(如载体)的一部分的形式或分离形式存在。
用本文提供的任何序列重组形式来重组初始的DNA片段，以产生重组DNA片段的多样性文库。该文库的大小可有很大不同，从少于10个到多于105、109或1012个成员。在一些实施方案中，起始片段和产生的重组文库将包括表达所需要的全长编码序列和任何必需的调控序列，如启动子和聚腺苷酸化序列。在其它实施方案中，文库中的重组DNA片段可在进行筛选/选择前插入提供表达所必需序列的常见载体中。
A．用限制性酶位点来重组突变
在一些场合下，利用核酸内限制酶位点来指导感兴趣核酸序列中的突变重组是有利的。这些技术特别适用于进化那些因存在DNA重复序列或其它有问题的一级序列基序而不易用已有方法改组的片段。这些场合还包括最好保留某些序列不突变的重组形式。限制酶位点的使用对于大片段(通常大于10kb，如因其大小不易改组和“PCR扩增”的基因簇)的改组是较佳的。虽然已经报道用PCR扩增了高达50kb的片段(Bames,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2216-2220(1994))，但是对于10kb以上的片段可能是成问题的，因此在10-50kb范围内及该范围外的其它改组方法是较佳的。限制性内切核酸酶宜为Ⅱ型(Sambrook等人，《分子克隆》，Cold Spring Harbor Press,1987)，其中较佳的是产生非回文粘性伸出末端的那些，例如AlwnⅠ,SfiⅠ或BstⅪ。这些酶产生了非回文的末端，从而允许用DNA连接酶进行有效的有序装配。限制酶(或内切核酸酶)位点通常可用常规的限制酶作图技术(Sambrook等人，同上)、分析该基因的序列信息、或通过合成将所需限制性位点导入核酸序列(即插入沉默突变)来鉴定。
待消化的DNA底物分子可以来自体内复制性DNA(如质粒制备物)，或来自携带感兴趣限制酶识别位点(较佳的靠近片段末端)的PCR扩增的核酸片段。通常，用经过确定在感兴趣核酸序列内切割的至少一种限制酶来消化感兴趣基因的至少两个变体(每个变体具有一个或多个突变)。然后，用DNA连接酶连接限制性片段，产生具有改组区域的全长基因。改组区域数取决于在感兴趣核酸序列内切割的数目。可将改组分子如上所述导入细胞内，并如本文所述筛选或选择所需的性能。然后从具有所需性能的合并物(文库)或克隆中分离核酸，并进行相同的程序直至获得所需程度的改进。
在一些实施方案中，分离至少一个DNA底物分子或其片段，并进行诱变。在一些实施方案中，在重复消化-连接过程前，对重新连接的限制性片段的合并物或文库进行诱变。本文所用的“诱变”包含这些本领域已知的技术，如PCR诱变、寡核苷酸定向诱变、定点诱变等，以及本文所述的任何技术的递推序列重组。
B．重装配PCR
核酸序列中的重组性突变的另一个技术采用“重装配PCR”。该方法可用来装配已被分开进化成全长核酸模板(如基因)的多个片段。当从前面的工作已经知道或鉴定出有利突变体的合并物时，采用该技术，其中鉴定方法是筛选用诸如PCR诱变、盒式诱变、掺杂寡聚物诱变、化学诱变或在增变菌株中体内繁殖DNA模板等本领域已知的诱变技术产生的突变体。确定感兴趣核酸序列片段的边界宜在基因间区域、内含子、或不可能具有感兴趣突变的基因区域内。较佳的，合成寡核苷酸引物(oligo)，用于感兴趣核酸序列片段的PCR扩增，从而使寡核苷酸序列重叠两个片段的接头。重叠区长度通常约为10-100个核苷酸。每个片段用一套这样的引物来扩增。然后，按照装配程序(如本文所述装配随机片段化基因的程序)“重装配”PCR产物。简言之，在装配程序中，首先通过凝胶电泳或大小排阻层析纯化除去PCR产物中的引物。混合纯化产物，在存在聚合酶和三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)以及合适缓冲盐、不存在附加引物(“自身引导”)下进行约1-10轮的变性、重新退火和延伸。随后用侧接基因的引物进行PCR，以扩增完全装配并改组的基因的产量。
在一些实施方案中，在重复该方法前对所得重装配的基因进行诱变。
在另一个实施方案中，如下所述，利用感兴趣核酸序列片段扩增所用的PCR引物，将变异导入感兴趣的基因内。通过筛选或选择，以及核酸序列同源性测序等方法，确定在核酸序列中感兴趣部位的突变。然后合成在感兴趣部位编码野生型或突变体信息的寡核苷酸PCR引物。然后，将这些引物用于PCR诱变，以产生在指定部位编码野生型和突变型信息置换的全长基因的文库。当筛选或选择过程相对于感兴趣突变基因的测序以及合成致突变寡核苷酸的成本而言费用高、麻烦或不切实际时，该技术通常是有利的。
C．用编码同源突变的寡核苷酸进行定点透变(SDM)然后改组
在本发明的一些实施方案中，在给定的感兴趣“亲本”序列中增加一个或多个底物序列的序列信息，随后在筛选或选择回合之间重组。通常，这可用本领域熟知的定点诱变(Sambrook等人，同上)技术来进行，采用一个底物作为模板，和编码其它底物序列(如同源基因)的单个或多个突变的寡核苷酸。在筛选或选择感兴趣的改善的表型后，可用本文描述的RSR技术进一步进化所选重组体。在筛选或选择后，可用另一群编码同源突变的寡核苷酸再次进行定点诱变,重复上述过程直至获得所需性能。
当两个同系物之间的差别是在一个密码子内的一个或多个单点突变时，可用编码两个同系物中的序列的简并寡核苷酸。一个寡核苷酸可包括许多这样的简并密码子，并且还允许在该序列模块内穷尽搜索所有排列。
当同源序列空间非常大时，将搜寻限制在某些变体是有益的。因此，例如可采用计算机模型工具(Lathrop等人，(1996)J.Mol.Biol.255:641-655)在靶蛋白上模拟各同源突变，并弃去预计会严重破坏结构和功能的任何突变。
D．体外DNA改组形式
图1中描述了DNA序列体外改组的一个实施方案。重组的最初底物是相关序列的合并物，例如不同的变体形式(如不同个体、菌株或生物种类的同系物)，或相同生物体的相关序列(如等位基因变异)。图1组A中的X显示了序列的不同之处。序列可以是DNA或RNA，并可以是各种长度，这取决于待重组或重装配的基因或DNA片段的大小。较佳的，序列为50碱基对(bP)至50千碱基(kb)。
如图1组B所示，将相关底物的合并物转变成例如约5bp至5kb或更多的重叠片段。例如，片段大小通常在约10bp至1000bp之间，有时DNA片段的大小在100bp至500bp之间。转变可用许多不同的方法来实现，例如DNA酶或RNA酶消化，随机剪切或部分限制酶消化。关于核酸的分离、操作、酶消化等程序的讨论，例如参见Sambrook等人和Ausubel(同上)。特定长度和序列的核酸片段的浓度通常低于总核酸重量的0.1％或1％。混合物中不同的特异性核酸片段数目通常至少约100、500或1000。
用各种技术，例如包括加热、化学变性、采用DNA结合蛋白等，将核酸片段混合物转变成至少部分单链形式。转变可通过加热至大约80-100℃、更佳的90-96℃来实现，从而形成单链核酸片段，然后退火。转变还可通过用单链DNA结合蛋白(见Wold(1997)Annu.Rev.Biochem.66:61-92)或recA蛋白(例如参见，Kiianitsa(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:7837-7840)处理来实现。然后，可通过冷却至20-75℃，较佳的40-65℃，使具有序列相同性区域的单链核酸片段与其它单链核酸片段重新退火。通过加入聚乙二醇(PEG)、其它体积排斥试剂或盐可以促进复性。盐浓度宜在0-200mM之间，更佳的盐浓度在10-100mM之间。盐可以是KCl或NaCl。PEG的浓度宜在0-20％之间，更佳的在5-10％之间。如图l组C所示，重新退火的片段可以来自不同底物。在核酸聚合酶如Taq或Klenow以及dNTP(即dATP,dCTP,dGTP和dTTP)存在下，培育退火的核酸片段。如果序列相同的区域很大，则Taq聚合酶可以和45-65℃之间的退火温度一起使用。如果相同的区域小，则Klenow聚合酶可以和20-30℃之间的退火温度一起使用。聚合酶可在退火之前、同时或之后加入随机的核酸片段中。
重叠片段在聚合酶存在下变性、复性和培育以产生一群含有这些片段不同置换的多核苷酸的过程有时称为核酸的体外改组。重复该回合至所需次数。该回合宜重复2-100次，更佳的是重复该回合10-40次。如图1组D所示，所得核酸是约50bp-100kb、较佳的为500bp-50kb的双链多核苷酸家族。该群体代表了显示与初始底物序列基本相同但是在数处有分歧的初始底物变体。该群体的成员比初始底物多许多。在任选地克隆到载体中后，用改组产生的片段群转化宿主细胞。
在一个采用体外改组的实施方案中，在产生实质组分(通常为至少20％或更多)不完全延伸扩增产物的条件下扩增全长序列，可产生重组底物的亚序列。另一个实施方案采用随机引物来引导整个模板DNA，以产生少于全长的扩增产物。使扩增产物(包括不完全延伸的扩增产物)变性，并进行至少附加一轮的重新退火和扩增。这种变化称为“打滑”，其中至少一轮次的重新退火和扩增提供了一实质性组分的不完全延伸产物。在随后的扩增回合中，部分延伸的(少于全长)产物重新退火且引物延伸到不同的序列相关模板种类上。在另一个实施方案中，底物转变成片段可通过底物的部分PCR扩增来实现。
在另一个实施方案中，在片段混合物中掺入一个或多个寡核苷酸。可设计寡核苷酸使其包括野生型序列的预先确定的突变，或个体之间或种类之间的天然变异部位。寡核苷酸还包括侧接这些突变或变异的充足的序列或结构同源性，以允许和野生型片段退火。退火温度可以根据同源序列长度来调节。
在另一个实施方案中，通过模板切换(例如衍生自一个模板的DNA片段在相关但不同的模板的同源位置上引导时)，重组发生在至少一个回合中。模板切换可通过在扩增混合物中加recA(见Kiianitsa(1997)同上)，rad51(见Namsaraev(1997)Mol.Cell.Biol.17:5359-5368),rad55(见Cleve(1997)EMBO J.16:2535-2544),rad57(见Sung(1997)Genes Dev.11:1111-1121)或其它聚合酶(例如病毒聚合酶、逆转录酶)来诱导。模板切换还可通过增加DNA模板浓度来增强。
另一个实施方案采用至少一轮扩增，它可用一群具有相关序列和不同长度的重叠的单链DNA片段来进行。片段可用单链标准DNA噬菌体如M13(见，Wang(1997)Biochemistry 36:9486-9492)制得。每个片段可以和群体中的第二片段杂交，并引导第二片段多核苷酸链延伸，从而形成序列重组的多核苷酸。在另一种变化中，可以用pfu,Taq,Vent,Deep Vent,UiTma DNA聚合酶或其它DNA聚合酶在第一DNA模板上从一个引物产生长度可变的ssDNA片段(见Cline(1996)Nucl.Acids Res.24:3546-3551)。该单链DNA片段被用作第二个由含尿嘧啶环状ssDNA组成的Kunkel型模板的引物。这导致第一模板多处置换成第二模板。见Levichkin(1995)Mol.Biology29:572-577；Jung(1992)Gene 121:171-24。
在本发明的一些实施方案中，将用本发明递推重组方法获得的改组核酸置于细胞和/或生物体中进行筛选。例如，可将改组的昆虫抗性基因导入细菌细胞、酵母细胞或植物细胞中用于初始筛选。芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌)和大肠杆菌是可以插入并表达改组昆虫抗性基因的两个合适的细菌细胞例子。可将改组基因整合入染色体DNA或作为质粒导入细菌或酵母细胞中。还可将改组基因导入植物细胞用于筛选目的。因此，可用本发明的体外递推序列重组方法改进感兴趣的转基因，并重新插入细胞用于体内原位选择新的或改进的性能。
E．体内DNA改组形式
在本发明的一些实施方案中，将DNA底物分子导入细胞中，其中细胞机制指导其重组。例如，构建突变体文库，用本文描述的任一技术筛选或选择具有改进表型的突变体。用本文描述的任一技术回收编码最佳候选物的DNA底物分子，然后片段化，用于转染植物宿主并筛选或选择改进的功能。如果需要进一步的改进，则通过例如PCR从植物宿主细胞中回收DNA底物分子，重复该过程直至获得所需水平的改进。在一些实施方案中，在转染前使片段变性并重新退火，用重组刺激蛋白(如recA)包覆，或和可选择标记物(如NeoR)共同转染，以选择接受了所述基因重组版的阳性细胞。体内改组的方法在例如PCT申请WO98/13487中有所描述。
体内改组的效果可通过增加宿主细胞中感兴趣的基因拷贝数来增强。在丰富培养基中生长的静止期培养物中的大多数细菌细胞含有两个、四个或八个基因组。在最低极限培养基中，细胞含有一个或两个基因组。因此，当细胞进入静止期时，每个细菌细胞中的基因组数取决于细胞生长速度。这是因为迅速生长的细胞含有多个复制岔路，导致终止后细胞中有数个基因组。基因组数目取决于菌株，但是测试的所有菌株在静止期均具有一个以上的基因组。静止期细胞中的基因组数目随时间而减少。看来这与哺乳动物细胞的凋亡类似，是由于整个染色体的片段化和降解而引起的。在含有多个基因组拷贝数的细胞中，基因组的这种片段化导致大量重组和突变。在这些细胞中多个基因组拷贝的存在导致在这些细胞中同源重组(在细胞中不同基因组中的基因拷贝之间，以及在细胞基因组与转染片段之间)的频率更高。这种增加的重组频率使得基因能更迅速的进化，以获得优化的特性。
实际上，一个细胞类型中存在多个基因组拷贝通常并不有利，因为维持该拷贝数需要更多的营养需求。然而，可以设计人造的条件，来选出高拷贝数。使具有重组基因组的修饰的细胞在丰富培养基中生长(在该条件下，多拷贝数不应是缺点)并接触单独或组合诱变剂(如紫外或γ辐射或化学诱变剂如丝裂霉素、亚硝酸、光敏化的补骨脂素)，诱导DNA断裂，通过重组修复。由于突变可能被切下的效率较高，因此这些条件选出了具有多拷贝数的细胞。在接触诱变剂后存活的修饰细胞富含了多个基因组拷贝。如果需要，可个别分析所选细胞的基因拷贝数(例如通过与合适对照的定量杂交)。例如，可用细胞分拣器分拣出含有较多DNA的那些细胞，例如采用DNA特异性荧光化合物，或用光分散分拣出的较大的细胞。测试选择后幸存的一些或全部细胞组中是否存在所需性能经过优化的基因。
F．全基因组改组
在一个实施方案中，本文的选择方法采用“全基因组改组”形式。关于许多全基因组改组形式的深入指导可在本发明者及同事的题目为＂用递推序列重组进化全细胞和生物体＂的开拓性申请(1995年7月15由del Cardayre等人提交，代理人案卷号018097-020720US)中找到。
简言之，全基因组改组在哪些核酸可能赋予所需性能方面没有作任何推测。而是在细胞中对整个基因组(例如来自基因组文库或分离自生物体)改组并将选择方案应用于细胞。
将递推性全基因组改组应用于植物细胞及其衍生的转基因植物的进化，以获得所需的杀虫蛋白产生性能。重组底物例如可以是含有已知或怀疑赋予对上述试剂之一耐受性的基因变体的全基因组文库、其片段或聚焦的文库。通常，从与待进化植物不同种的植物获得文库片段。不管采用何种精确的改组方法，均可进行上述用来选择杀虫蛋白的选择方法，包括选出本文所述的任何所需性状。
用标准方法将DNA片段导入植物组织、培养的植物细胞或植物原生质体中，这些方法包括电穿孔(From等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,5824(1985))、病毒载体(如花椰菜叶病毒，CaMV)感染(Hohn等人，Molecular Biology of Plant Tumors,(Academic Press,New York,1982)549-560页；Howell,US 4,407,956)、用小珠或颗粒基质中或表面上带有核酸的小颗粒高速轰击穿透(Klein等人，Nature 327,70-73(1987))、用花粉作为载体(WO85/01856)、或用其中携带了克隆的DNA片段的T-DNA质粒的根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌。在根癌土壤杆菌感染时，T-DNA质粒输送给植物细胞，将其一部分稳定整合入植物基因组中(Horsch等人，Science 233,496-498(1984)；Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80,4803(1983))。
多样性还可通过植物原生质体之间的基因交换而产生。植物原生质体的形成和融合程序已在Takahashi等人US4,677,066；Akagi等人，US 5,360,725；Shimamoto等人，US 5,250,433；Cheney等人，US 5,426,040中有所描述。
在培养合适的时间使重组发生且重组基因表达后，对植物细胞的杀虫蛋白作测试，收集合适的植物细胞。一些或所有这些植物细胞可进行一轮的重组和筛选。最后，获得具有所需杀虫活性程度的植物细胞。
然后可将这些细胞培育成转基因植物。从培养的原生质体再生植物的方法在Evans等人，＂原生质体分离和培养＂，《植物细胞培养手册》1,124-176(MacMillanPublishing Co.,New Yokr,1983)；Davey,＂植物原生质体的培养和再生的最新进展＂，Protoplasts,(1983)12-29页(Birkhauser,Basal 1983)；Dale,＂谷物和其它不顺从作物的原生质体培养和植物再生＂，Protoplasts,(1983)31-41页(Birkhauser,Basel 1983)；Binding,＂植物的再生＂，Plant Protoplast,21-73页，(CRC Press,Boca Raton,1985)和本领域技术人员可获得的其它文献中有所描述。关于从细胞再生植物的其它细节内容也可在下文找到。
在上述方法的变化方法中，可按照用于植物细胞所述的相同通用策略那样，在细菌细胞中进行一轮或多轮初步的重组和筛选。在细菌细胞中可以实现更迅速的进化，因为它们的生长速度较快，这些细胞中能导入DNA的效率更高。在一轮或多轮重组/筛选后，从细菌回收DNA片段文库，并转染到植物中。该文库可以是完整的文库或聚焦的文库。聚焦文库可通过从对植物序列(尤其是已知或怀疑具有赋予昆虫抗性或相关性能作用的植物序列)有特异性的引物扩增而产生。
植物基因组改组使得递推回合可用于赋予所需种类植物性能改善的基因或通道的导入和重组。任何表现出所需性状(如昆虫抗性)的植物种类(包括杂草和野生的种植物)可用作导入作物或园艺宿主植物种类的DNA源。
使从植物源制得的基因组DNA片段化(例如用DNA酶1，限制酶或机械方式)，并克隆到适合制备植物基因组文库的载体(如pGA482)中(An.G.,1995,Methods Mol.Biol.44:47-58)。该载体含有基因转移到植物细胞中所需的根癌土壤杆菌左右边界以及用于在大肠杆菌、土壤杆菌和植物细胞中选择的抗生素标记。它具有多个克隆位点用于插入基因组片段。存在一种cos序列用于将DNA有效包装到噬菌体λ头部内以便使原代文库转染到大肠杆菌中。该载体接受25-40kb的DNA片段。
原代文库还可以直接电穿孔进入用来感染并转化宿主植物细胞的根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌菌株中(Main,GD等人，1995,Methods Mol.Biol.44:405-412)。或者，DNA可以通过电穿孔或PEG介导的摄取(Bilang等人，(1994)Plant Mol.Biol.Manual,Kluwer Academic Publishers,A1:1-16)或细胞或组织的颗粒轰击(Christou，同上，A2:1-15)导入植物受体的原生质体中。如需要，可以除去T-DNA区的抗生素标记(只要可能选择性状)，这样最终植物产物将不含抗生素基因。
在固体或液体培养基上选出获得某性状的稳定转化的全细胞。如果不能直接选出感兴趣的性状，则可用抗生素来选择转化细胞，使其形成胼胝体或再生成全植物，然后筛选所需性能。
第二以及更多的轮次包括从每个转基因系分离出基因组DNA，并导入一个或多个其它的转基因系中。在每一轮中，选出或筛选出转化细胞(通常以递增的方式，如增加剂量等)。为了加速多轮转化的过程，可以除去植物再生，直至最后一轮。从原生质体或转化组织产生的胼胝体组织可作为基因组DNA和新的宿主细胞的来源。在最后一轮，再生出能生育的植物，并选出插入了DNA纯合的子代。最后，产生一种携带多个插入物的植物，这些插入物附加或协同组合而提供了高水平的所需性状。
另外，可追踪赋予所需性状的导入的DNA，因为它侧接了载体中的已知序列。PCR或质粒拯救可用来分离序列并对它们作更详细地特性分析。用T-DNA边界序列为引物，采用合适的试剂和技术，进行全部25-40kb插入物的长PCR(Foord,OS和Rose,EA,1995,《PCR引物：实验室指南》，Cold Spring Harbor Laboratory Press,63-77页)。如果载体经改进在T-DNA边界之间含有大肠杆菌复制起点和抗生素标记，则用一种仅在插入的DNA两末端切割的稀少的切割限制酶(如NotⅠ或SfiⅠ)产生含有植物DNA源的片段，然后使其自身连接并转化到大肠杆菌中以质粒形式复制。负责被转移性状的总DNA或其亚片段可通过DNA改组来进行体外进化。然后将改组文库导入宿主植物细胞中，并筛选性状的改善。这样，单个和多个基因性状可以从一个种类转移到另一种类，并优化之以获得更高表达或更高活性，而导致整个生物改善。
G．寡核苷酸和计算机(in silico)改组形式
除了上述的改组形式外，其它至少两种相关的形式可用来实施本发明。第一种称为“计算机”改组，它采用计算机算法，利用计算机中的遗传操纵子来进行病毒改组。如应用于本发明的那样，在计算机系统中重新组合对应于昆虫抗性的基因序列串，通过(例如)合成寡核苷酸的重装配PCR制得所需的产物。“计算机”改组在Selifonov和Stemmer于1999年2月5日提交的题目为＂具有所需特性的特征串、多核苷酸和多肽的制备方法＂的USSN 60/118854中有详细的描述。
第二种有用的形式称为“寡核苷酸介导的改组”，其中将对应于相关的同源核酸家族(如应用于本发明的，昆虫抗性核酸的中间或等位基因变体)的寡核苷酸重组产生可选择的核酸。该形式在Crameri等人1999年2月5日提交的“寡核苷酸介导的核酸重组”USSN 60/118,813中有详细的描述。
简言之，首先用可获得的计算机软件对同源核酸序列家族作序列对比，选出相同/相似区域以及有差异的区域。合成对应于至少一个差异区域的多个(例如2、5、10、20、50、75或100或更多)寡核苷酸。这些寡核苷酸可以直接改组，或可以和一个或多个核酸家族重组。可有几种方法来改组同源核酸，例如用DNA酶消化核酸，使重组发生，然后重新产生全长模板，即如Stemmer(1998)的美国专利5,830,721(＂通过随机片段化和重装配进行DNA诱变＂)中所述。因此，在一个实施方案中，提供了与至少一个同源核酸相同或同源的全长核酸，用DNA酶切割，使得到的核酸片段系列与多个家族基因改组寡核苷酸重组。
还通过寡核苷酸改组来提供家族基因改组寡核苷酸的文库。例如，用上述序列对比程序(如BLAST)对感兴趣的同源基因作对比。注意对应的同系物之间氨基酸差异的核苷酸。设计用于合成基因改组的寡核苷酸，它含有一个(或多个)核苷酸与对比的同源序列之一不同，即，设计寡核苷酸，它与第一核酸相同，但是在对应于与第一核酸同源但不相同的某核酸残基位置插入了一个残基。
通常，制得具有选定长度(例如约20、30、40、50、60、70、80、90或100或更多核苷酸)的寡核苷酸的一些或全部，这些寡核苷酸包括了所有可能的核酸变体。这包括每X个序列变异的X个寡核苷酸，其中X是在一基因座有所不同的序列数目。X寡核苷酸的序列大部分相同，除代表变异核苷酸的核苷酸外。由于这种相似性，可以有利地利用平行的或合并的合成策略，其中使用一种合成反应或一组试剂来制备各个寡核苷酸的共同部分。这可用例如熟知的固相核酸合成技术或阵列为基础的寡核苷酸合成方法来进行。
最佳的，寡核苷酸与变异区任意一侧有至少约10个碱基的序列相同性，以确保合理有效的重组。然而，碱基相同的侧接区域可具有较少的相同碱基(例如5、6、7、8或9)，当然也可具有较大的相同区域(例如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、50或更多)。
如本文所述的和本领域技术人员已知的，在基因装配期间，可用各种聚合酶介导的重装配方法来一起培育寡核苷酸，然后重新装配。所选寡核苷酸可以任何选定浓度“掺入”重组混合物中，从而导致优先插入所需的修饰。
Ⅲ．用于作物植物的优化基因进化的底物
本发明提供了获得害虫抗性基因的方法，该基因赋予植物对害虫抵抗力的能力有所增强。该方法包括用DNA改组来开发重组害虫抗性基因的文库，筛选这些文库以鉴定表现出所需改进性能的那些重组基因。该方法适用于存在于植物内或植物上能赋予害虫抗性的任何核酸。本文讨论了这些核酸的几个例子，这些及其它例子在例如Advances in insect control:The role of transgenic plants,Carozzi和Koziel，编者Taylor&Francis,New York,1997中有所描述。本发明还提供了获得其它基因的方法，这些基因赋予植物有益效能的能力得到优化。这些基因例如包括涉及除草剂选择性和固氮的基因。
A．杆菌毒素和有关的多肽
本发明提供了获得优化的重组Bt毒素的方法。革兰阳性土壤菌芽孢杆菌的某些种类可产生对昆虫、蛛类动物和线虫有毒性的蛋白。这些蛋白包括晶体蛋白，其称为“Bt毒素”，由苏云金芽孢杆菌和其它种类芽孢杆菌产生。Bt毒素通常是约130kDa-140kDa或约70kDa(它含有60+/-10kDa的毒性片段)的多肽(Hofte和Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53:242-255)。Bt毒素是高度特异性的，对人和其它动物和植物没有毒性。Bt毒素的综述例如见Kumar等人(1996)Adv.Appl.Microbiol.42:1-43和Peferoen(1996)AdvancesinInsect Control，同上，第2章，21-48页。
不同种类芽孢杆菌产生的Bt毒素可以根据核酸以及氨基酸序列的相似性，以及那些毒素对害虫有效来进行分类(Hofte和Whiteley,同上；Ogiwara等人，(1995)Curr.Microbio1.30:227-235）。例如，杀虫性Bt毒素对鳞翅目、双翅目、鞘翅目或虱目中的一种或多种有杀虫活性(Kumar等人，同上)。Bt基因已被分为至少主要6类：cryⅠ(鳞翅目特异性)，cryⅡ(鳞翅目和双翅目特异性)，cryⅢ(鞘翅目特异性)，cryⅣ(双翅目特异性)，cryⅤ和cryⅥ(Hofte和Whiteley,同上；Feitelson等人，(1992)Biotechnol.10:271-276)。也已提议根据杀虫谱的不同分成亚组，如cryⅠC,cryⅡA和cryⅡB(Kumar等人，同上)。另一种分类根据的是Bt毒素基因全长产物的氨基酸相同性(Crickmore等人(1996)Genes Microbiol.Res.；Kumar等人，同上)。根据该方案，Bt毒素被分为几个同源组，Cry1、-3、-4、-7、-8、-9和-10形成最大的组，Cry2、Cry11和Cry18形成第二个组，Cry5、-12、-13和-14形成第三组，Cyt蛋白为第四组。Cry 6、-15和-16是该分类方案中独特的蛋白。Bt晶体蛋白基因的分类，包括显示进化关系的树状图，在Yamamoto和Powell(1993)Advanced Engineered Pesticide,Kim编者，MarcelDekker,3-42页中也有描述。
本发明的方法包括，用编码Bt毒素的核酸作为底物，进行DNA改组。编码Bt毒素的众多核酸序列已被鉴定。例如参见，美国专利No.5,683,691,5,633,446,5,651,965,5,635,480,4,766,203,4,448,885,4,467,036,4,797,276,4,853,331,4,918,006,4,849,217,5,151,363,4,948,734和4,771,131；以及欧洲专利出版物0,149,162,0,213,818和193259。GenBank和其它数据库提供了其它许多Bt毒素基因。至少一些Bt毒素由质粒携带的基因编码(Stahly等人，(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.84:581-588；Debaboc等人，(1997)Genetika 13:496-501)。
用DNA改组制备重组Bt毒素基因的文库。在较佳的实施方案中，从Bt毒素家族衍生获得DNA改组的底物。图2提供了显示许多Bt毒素基因之间关系的树状图。表1中提供了Bt全型毒素及其数据库登录号的清单。表2提供了这些和其它Bt毒素基因的清单。
                     表1苏云金芽孢杆菌全型毒素的清单
  名称  旧的名称  登录号
 cry1Aa  cryⅠA(a)  M11250
 cry1Ab  cryⅠA(b)  M13898
 cry1Ac  cryⅠA(c)  M11068
 cry1Ad  cryⅠA(d)  M73250
 cry1Ae  cryⅠA(e)  M65252
 cry1Af  icp  U82003
 cry1Ag  AF081248
 cry1Ba  cryⅠB  X06711
 cry1Bb  ET5  L32020
 cry1Bc  PEG5  Z46442
 cry1Bd  cryE1  U70726
 cry1Ca  cryⅠC  X07518
 cry1Cb  cryⅠC(b)  M97880
 crt1Da  cryⅠD  X54160
 cry1Db  PrtB  Z22511
 cry1Ea  ctyⅠE  X53985
 cry1be  cryⅠE(b)  M73253
 cry1Fa  cryⅠF  M63897
 cry1Fb  PrtD  Z22512
 cry1Ga  PrtA  Z22510
 cry1Gb  cryH2  U70725
  名称  旧的名称  登录号
 cry1Ha  PrtC  Z22513
 cry1Hb  U35780
 cry1Ib  cryV  X62821
 cry1Ic  AF056933
 cry1Ib  CryV465  U07642
 cry1Ja  ET4  L32019
 cry1Jb  ET1  U31527
 cry1Jc  190730
 cry1Ka  U28801
 cry2Aa  cryⅡA  M31738
 cry2Ab  cryⅡB  M23724
 cry2Ac  cryⅡC  X57252
 cry3Aa  cryⅡLA  M22472
 cry3Ba  CryⅢB2  X17123
 cry3Bb  cryⅢBb  M89794
 cry3Ca  cryⅢD  X59797
 cry4Aa  cryⅣA  Y00423
 cry4Ba  cryⅣB  X07423
 cry5Aa  cryⅤA(a)  L07025
 cry5Ab  cryⅤA(b)  L07026
 cry5Ac  I34543
 cry5Ba  U19725
 cry6Aa  cryⅥA  L07022
 cry6Ba  cryⅥB  L07024
 cry7Aa  cryⅢC  M64478
 cry7Ab  cryⅢCb  U04367
 cry8Aa  cryⅢE  U04364
 cry8Ba  cryⅢG  U04365
 cry8Ca  cryⅢF  U04366
 cry9Aa  cryⅠG  X58120
 cry9Ba  cryⅨ  X75019
 cry9Ca  cryⅠH  Z37527
 cry9Da  D85560
 cry9Ea  AB011496
 cry10Aa  cryⅣC  M12662
 cry11Aa  cryⅣD  M31737
 cry11Ba  Jeg80  X86902
 cry11Bb  AF017416
 cry12Aa  cryⅤB  L07027
 cry13Aa  cryⅤC  L07023
 cry14Aa  cryⅤD  U13955
 cry15Aa  34KDa  M76442
 cry16Aa  cbm71  X94146
  名称  旧的名称  登录号
 cry17Aa  cbm72  X99478
 cry18Aa  cryBP1  X99049
 cry19Aa  Je965  Y07603
 cry20Aa  U82518
 cry21Aa  I32932
 cry22Aa  I34547
 cry23Aa  AF03048
 cry24Aa  Jeg72  U88188
 cry25Aa  Jeg74  U88189
 cry26Aa  AF122897
 cry27Aa  AB023293
 cry28Aa  AF132928
 cyt1Aa  cytA  X03182
 cyt1Ab  cytM  X98793
 cyt1Ba  U37196
 cyt2Aa  cytB  Z14147
 cyt2Ba  cytB  U52043
 cyt2Bb  U82519
                                        表2:Bt毒素基因
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 cry1Aa1  M11250  Schnepf等人 1985  JBC 260:6264-6272  527-4054
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改组基因的表达可在大肠杆菌或任何芽孢杆菌中通过采用合适的表达载体来实现。大多数(如果不是全部)与cry基因连接的Bt毒素启动子将在大肠杆菌和芽孢杆菌中起作用。用于大肠杆菌宿主细胞的合适载体例子在Sasaki等人，(1996)Curr.Microbiol.31:195-200中有所描述。为了在大肠杆菌中高表达，从Sasaki等人描述的载体中除去ApaⅠ和NdeⅠ位点之间的cry启动子部分。在本文的较佳实施方案中，载体还包括编码序列，当其与改组基因的编码序列读框连接时，它编码了容易检测和/或固定的尾序列(例如多个His残基)。
cry基因可以截短，以产生预先激活的Cry蛋白。发现在许多情况下截短的基因产生对大肠杆菌有很强毒性的一种蛋白质。然而，在较佳的实施方案中，截短的cry基因在芽孢杆菌(如蜡状芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌)中表达。cry基因中可加入引导序列，这样蛋白质可被分泌入培养基。这种方法使蛋白质的分离过程耗时较少。
如本文所述，鉴定编码一个或多个所需性能有所改进的Bt毒素的那些重组体基因。筛选这些性能中某些的方法在Kumar等人(同上)中有所描述。
优化的重组Bt毒素基因可用来产生杀害虫蛋白而直接应用于植物，可以在定居于植物的微生物中表达，或可以导入转基因植物内。Bt基因已经在至少26种不同种的植物中表达(Schuler等人，(1998)Tibtech 16:168-175)。下面将详细描述这些给予方法的每一种。
B．蛋白酶和α淀粉酶抑制剂
可用本发明方法优化的其它害虫抗性基因是编码蛋白酶抑制剂的那些基因。蛋白酶抑制剂能抑制昆虫发育(综述例如参见Reeck等人(1997)Advances in Pest Control，同上，第10章，157-183页；Ryan(1990)Annu.Rev.Phytopatho1.28:0425-449)，通常能杀死昆虫和线虫(见，Jongsma(1997)J.Insect Physiol.43:88-895)。在植物组织中发现的蛋白酶抑制剂被认为是抵御昆虫和线虫攻击的植物防御机制的一部分。用于防治昆虫的蛋白酶抑制剂的一个问题是昆虫可能变得对抑制剂有抗性。Jongsma和Bolter(1997)J.Insect.Physiol.43,885-895中描述道，昆虫在食入抑制剂后在其消化道内改变该蛋白酶的组成。寻找/产生抑制各种昆虫蛋白酶的抑制剂是非常重要的。在本实施例中，我们试图通过DNA改组来改进植物的半胱氨酸抑制剂。
可用于改组的蛋白酶抑制剂基因包括来自所有生物学来源(包括植物、动物和微生物)的那些基因。已知道蛋白酶抑制剂的几种非同源家族(Laskowski等人，(1980)Annu.Rev.Biochem.49:593-626)，包括植物中的至少10个家族(大豆胰蛋白酶抑制剂(Kunitz),Bowman-Birk抑制剂、土豆抑制剂Ⅰ、土豆抑制剂Ⅱ、南瓜抑制剂、Ragil-2/玉米双功能抑制剂、羧基肽酶A、B抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(抑半胱氨酸蛋白酶蛋白)、天冬氨酰蛋白酶抑制剂和大麦胰蛋白酶抑制剂)(例如参见，Ignacimuthu,《昆虫化学生态学中的生物技术前景》，T.Ananthakrishnan编，Science Publishers,Inc.,277-283页)。四种蛋白水解酶(丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金属蛋白酶)每种的抑制剂家族均是已知的(Ryan，同上)。半胱氨酸蛋白酶抑制剂的序列在例如Reddy等人，(1975)J.Biol.Chem.250:1741-1750以及Abe等人，(1987)J.Biol.Chem.262:16793-16797中有所描述。丝氨酸蛋白酶抑制剂在例如美国专利5,151,509中有所描述。
编码α-淀粉酶抑制剂的核酸，有些还是双功能的蛋白酶抑制剂，也是适合用本发明的DNA改组方法来进行优化的合适候选物。许多α-淀粉酶抑制剂表现出与植物的四个蛋白酶抑制剂家族(即Kunitz、大麦、Bowman-Birk和Ragi/玉米双功能抑制剂家族)(例如参见，Ryan等人，同上)的氨基酸相似性。Ragi α-淀粉酶/蛋白酶抑制剂序列在例如Shivaraj等人(1981)Biochem.J.193:29-36和Svendsen等人(1986)CarlsbergRes.Commun.51:43-50中有所描述。另见Schuler等人，同上。
已被工程改造入其它种类植物的植物来源的蛋白酶抑制剂综述例如参见Schuler等人，(1998)Tibtech 16:168-175；Hilder等人，(1993)《转基因植物》卷1,Kung和Wu编辑，Academic Press,317-338页。携带Manduca sexta蛋白酶抑制剂的转基因植物在美国专利No.5,436,392中有所描述。美国专利No.5,494,813中描述了用蛋白酶抑制剂防治线虫。
为了鉴定编码性能改善的蛋白酶抑制剂的重组基因用作植物中的害虫抗性基因，可采用本文描述的那些试验。一种合适的试验涉及通过噬菌体展示来表达重组基因文库，然后用蛋白酶底物进行淘选。例如参见Jongsma等人(1995)MolecularBreeding 1:181-191。
C．胆固醇氧化酶
编码多酚氧化酶、包括胆固醇氧化酶的基因是用于本发明方法的另一合适的底物。胆固醇氧化酶在以下文献中有所描述，例如，Shen等人(1997)Arch.InsectBiochem.Physiol.34:429-442和Purcell(1997)Advances in Insect Control，第6章95-108页，美国专利No.5,665,560和5,602,017以及PCT申请WO9425603、Genbank登录号164550、E07692、E07691、E03850、E03828、E03827、U13981和D00712中有所描述。
D．杀虫蛋白酶
用本发明的DNA改组方法来优化的其它靶标是编码杀虫蛋白酶的基因。
E．植物性杀虫蛋白
本发明的DNA改组方法还可用于编码植物性杀虫蛋白(VIP)的多核苷酸。VIP由一些芽孢杆菌属(包括苏云金芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌)在植物生长期间产生的。例如参见，Warren(1997)Advances in Insect Control，同上，第7章，109-121页。VIP与苏云金芽孢杆菌产生的δ-内毒素不相似。
对重要的玉米害虫(如玉米根虫)有效的VIP例如包括，Vip1A(a)和Vip2A(a)(Warren，同上)。Vip3A对广谱的鳞翅目昆虫有效(Estruch等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5389-5394；Yu等人，(1997)Appl.Environ.Microbiol.63:532-36)。
F．杀虫剂通道
本发明还提供了用DNA改组来获得基因的方法，该基因编码了参与抗害虫活性天然产物生物合成的通道。
(1)聚酮化合物
一种特别适用于通道(如参与杀虫剂生物合成的那些通道)改组的方法包括用限制性位点来重组突变。聚酮化合物簇如针枝属黄酮苷(spinosin)(Khosla等人，TIBTECH 14,1996年9月)其长度通常为10-100kb，具体指装配成非常大的多酶复合物的多个大的多肽。鉴于这些复合物以及生物合成通道的调谐性质，可在不同的聚酮化合物簇之间交换编码蛋白组件的核酸，以产生新的有功能的嵌合聚酮化合物。在多肽之间或在多肽中经工程改造的内含子中非必需位点内引入稀有的限制性内切核酸酶位点如SfiI(8个识别碱基，非回文突出端)，将提供“手柄”，利用该手柄采用上述技术来操作核酸片段间的交换。
(2)其它天然产物
已知几种天然产物是强效杀虫剂。这些产物由微生物、真菌或植物产生。杀虫性天然植物和微生物产物有几个例子。可改组参与这些产物生物合成的基因来提高化合物产量。参与针对各种天然产物的生物合成通道的基因数目因产物性质而异。DNA改组可应用于编码产生这些天然产物的生物化学通道的酶的整个基因系列。结果，这些产物有许多可以非常高的浓度在发酵罐(对于微生物)或植物中产生。在其它实施方案中，选出具有其它改善性能的改组基因，这些性能例如包括毒性和/或宿主范围增加。可将这些改组基因导入植物内以保护植物抵御昆虫。
G．杆状病毒
适合作为DNA改组底物来产生重组核酸赋予害虫抗性的还有衍生自杀虫性病毒(包括杆状病毒)的基因和基因组。杆状病毒作为杀虫剂的应用，以及编码杀虫蛋白的杆状病毒基因的鉴定在以下文献中有所描述：例如美国专利No.5,662,897；另见，Miller,L.K.(1981)《植物科学中的基因工程》，Panopoulous(编辑)，Praeger Publ.,NewYork,203-224页；Carstens,(1980)Trends Biochem.Sci.52:107-110；Harraph和Payne(1979)Advances in Virus Research,25卷，Lawfer等人(编辑)，Academic Press,New York,273-355页：《杆状病毒生物学》卷Ⅰ和Ⅱ,Granados和Fedenci(编者)，CRCPress,Boca Raton,Fla.,1986。
本发明的DNA改组和筛选方法可用来获得性能有所改进的杀虫病毒，这些性能包括，但不局限于，稳定性增加(包括UV稳定性)、传染性和宿主范围更大，毒性更高，杀死害虫的时间减少。杆状病毒摄食到昆虫死亡之间的时间间隔长度有时限制了杆状病毒作为杀虫剂的效果，因为在施用杀虫剂至昆虫死亡期间昆虫继续摄食并破坏作物。利用本文描述的DNA改组和筛选，就可获得能比天然存在的杆状病毒更迅速地杀死昆虫的杆状病毒。测定杆状病毒毒力和传染性的生物试验在美国专利No.5,662,897中有所描述。
已知杆状病毒在体内重组。例如，Croizier等人((1980)C.R.Acad.Sci.Paris Ser.D290:579-582)报道了AcNPV和大蜡螟Galleria mellonella病毒在蜡螟幼虫中重组。最近，Kondo和Maeda((1991)J.Virol.65:3625-3632)报道，通过在昆虫细胞内的重组来拓宽NPV的宿主特异性。DNA改组可扩大和加速该过程。例如，在具有不同宿主特异性的数个NPV种类之间进行病毒基因组改组可用来增加宿主谱。这是通过获得NPV(如苜蓿丫纹夜蛾、草地夜蛾和烟芽夜蛾)并从病毒中分离出DNA来实现的。混合这些DNA样品并进行改组。用改组的和重新装配的DNA转染Sf9细胞，分离重组病毒。然后测试分离的病毒样品对昆虫(如粉纹夜蛾、烟芽夜蛾和甜菜夜蛾)的传染性。用野生型病毒对其原始或有关的宿主(例如，AcNPV对粉纹夜蛾，SfNPV对甜菜夜蛾)来确定亚致死剂量，并采用该亚致死剂量。
用本发明方法获得的杀虫性病毒可用于施加到植物上。配制和施加方法是本领域技术人员已知的，例如参见，Couch和Ignoffo(1981)《害虫和植物疾病的微生物防治》1970-1980,Burges(编者)，第34章，621-634页；Corke和Rishbeth,Id.39章，717-732页；Brockwell(1980)《评价固氮的方法》Bergersen(编)417-488页；Burton(1982)《热带农业的生物固氮技术》，Graham和Harris(编)105-114页：和Roughley(1982)Id.115-127页。
Ⅳ．性能改善的害虫抗性基因和筛选方法
对用本文描述的DNA改组方法产生的重组害虫抗性基因文库进行筛选，鉴定出具有改善的性能可用来保护植物抵御害虫的那些基因。适用于本发明方法来获得改善的害虫抗性基因的性能如下。通过选择合适的筛选策略，可以同时或依次获得多种性能经过优化的基因。例如，用编码高效毒素的基因作为一个底物基因，不易因靶害虫对基因产物产生抗性而失效的基因作为另一底物基因，进行改组，就可获得具有高效和不易产生靶害虫抗性这两种性能组合起来的优化的基因。
因此，本发明提供了赋予农业生物对昆虫抗性的改组的多核苷酸序列，还提供了用多核苷酸序列改组方法产生的改进的农业生物本身。所述产生的多核苷酸序列和改进的农业生物的确切结构最易通过参考其产生方法来定义。因此，本发明包括一种或多种用本文描述的方法产生的能赋予所需表型的改组的多核苷酸序列。凭借它们非典型的改进的或新的表型(通常不存在于天然存在的农业生物群体中)，这样产生的改组的多核苷酸容易与天然存在的基因组序列区分开。参比序列数据库和出版的序列数据，该改组的多核苷酸序列可以与天然存在的植物、动物或微生物基因组序列进一步区分开，其中改组的多核苷酸与参照数据系列相比通常含有一群突变，本领域技术人员将会认识到，该多核苷酸序列基本上不可能通过自然进化或传统的繁殖而进化得到。
A．对靶害虫的效力增加
本发明方法可用来获得表现出对靶害虫效力增加的害虫抗性基因。对上述制得的改组的昆虫抗性基因筛选高杀虫活性。这些基因可以这样来鉴定，例如，表达改组基因文库中的成员，以确定编码EC50(导致昆虫生长减少50％的浓度)和/或LC50(导致50％昆虫死亡的浓度)增加的多肽的基因。
在一些实施方案中，本发明涉及用具有高细胞毒性的另一毒素基因来改组编码具有所需特异性、但细胞毒性较低的毒素基因。一个示范性例子是日本甲虫芽孢杆菌，它对诸如日本甲虫的金龟子科甲虫有致病性，并产生称为Cry18Aa的杀虫蛋白(Zhang等人，(1997)J.Bact.179:4336-4341)。然而，该蛋白的杀虫活性并不高得足以用来保护植物抵御甲虫侵染。为了改善Cry18Aa的细胞毒性，用来自另一芽孢杆菌属的一种或多种同源基因对编码该毒素的基因进行克隆和改组。例如，可用编码Cry2的苏云金芽孢杆菌基因来改组编码cry18Aa的基因。与cry18Aa同源的其它基因也可用cry18Aa来克隆和改组。例如，可以用克隆的cry18Aa基因作为杂交探针，来筛选数种苏云金芽孢杆菌和日本甲虫芽孢杆菌菌株的基因组文库。
一旦完成改组，就筛选所得的改组毒素基因文库，以鉴定表现出杀虫活性增强的那些基因。进行这种筛选的一种方法是将改组基因(例如在PCR扩增后)的蛋白编码区克隆到表达载体中，该表达载体适合在所选的宿主细胞(如大肠杆菌)中表达基因。在本发明的较佳的实施方案中，载体包括编码序列，当该编码序列与改组基因的编码序列读框相连时，它编码了易检测和/或固定的尾序列(例如多个His残基)。载体可以导入大肠杆菌以及其它宿主细胞(如苏云金芽孢杆菌的cry菌株)中。如果需要，可对转化体进行初步筛选(例如通过免疫试验)，以鉴定出产生杀虫蛋白的那些转化体。然后在功能性筛选中测试初步筛选中的阳性转化体，鉴定出编码具有所需活性增加的毒素的改组基因。
全害虫试验(通常称为体内试验)可用来测定毒性。在这些试验中，将改组基因表达的毒素多肽置于害虫食物中，使其被目标害虫食用。较佳的，改组的多肽在筛选前是部分纯化的。例如，当用大肠杆菌作为改组多肽表达的宿主细胞时，多肽通常以包涵体形式产生。包涵体可用本领域技术人员已知的方法来释放。例如，可用洗涤剂如B-PER细菌蛋白抽提剂(Pierce)按照生产商说明书来解离大肠杆菌细胞。洗涤剂例如可过滤除去，将包涵体溶于0.02N NaOH中。然后加入100mM Tris-HCl,pH8，中和溶液pH。在本文的较佳实施方案中，纯化改组基因编码的杀虫蛋白。方便地，这可用96孔或更多孔的含有亲和试剂(如适用于具有组氨酸尾序列的多肽的Ni-NTA琼脂糖(Qiagen))的滤板来进行。较佳的，抽提足量的宿主细胞，确保通过滤膜的多肽量超过亲和试剂的容量，不论特定多肽的表达水平如何。在从亲和试剂解离下来后，每份样品将含有大致等量的蛋白质。
用于每次全害虫测试的多肽量是亚致死量，由用于改组的毒素基因所编码的野生型多肽来确定。观察害虫的死亡率，以评价每份多肽样品的活性水平。为了增加筛选试验的效率，可以合并样品并测试活性。将表现出某些害虫死亡的合并样品分离成该合并物的各组分，以鉴定出引起死亡率的那样样品。选出阳性样品待用，或用于第二轮改组。
然而，在较佳的实施方案中，以更易进行高产量筛选的形式进行检测细胞死亡或细胞生长的试验。例如，可采用体外试验。这些试验通常涉及采用对待筛选的特定毒素敏感的培养昆虫细胞，和/或天然表达或由异源基因表达特定毒素受体的细胞。因此，除了昆虫细胞，哺乳动物(如CHO细胞)、细菌和酵母细胞也可用于体外试验。测定对培养昆虫细胞毒性的体外生物试验在例如Johnson(1994)J.Invertebr.Pathol.63:123-9中有所描述。在典型的形式中，采用96孔或更多孔的平板。在孔中加入改组基因文库表达的毒素，测定其对细胞存活和/或增殖的作用。
一种这样的试验包括检测被DNA改组所得优化毒素杀死的细胞释放出的ATP酶。可以非常高的灵敏度来测定毒素释放出的ATP酶水平，例如采用萤光素酶试验。
另一试验涉及检测因吸收水而引起的细胞形态的变化。例如，当昆虫细胞中了Bt Cry蛋白的毒，细胞形态会因吸收水而发生很大变化。由于Cry蛋白使得细胞高度可渗透，因此当细胞置于低渗溶液中时吸收了大量的水。形态变化可用光散射来检测。
用于检测细胞死亡或细胞生长的染料和标记是本领域技术人员已知的。在这些试验中，细胞与(例如)微量滴定板孔内的毒素接触，随后洗涤细胞，用平板读数仪或平板闪烁计数仪测定染料或标记的吸收或滞留。合适的染料包括，但不局限于下列物质：
Alamar蓝：Alamar蓝试验中加入了以检测代谢活性为基础的荧光测定/比色测定生长指示剂。该系统中加入了氧化-还原(Redox)指示剂，两者在对细胞生长导致的生长培养基的化学还原反应中产生荧光和颜色变化。培养至少8小时后，在每个孔中加入Alamar蓝等份(例如20微升)。然后测定平板的吸光度(O.D 570/600)或荧光。
3H-胸苷掺入：该程序通过测定3H-胸苷掺入细胞DNA来测定细胞增殖作为终点。在培养的最后4-24小时，加入一份放射活性标记物(例如1μCi)。然后，可用半自动化的细胞收获装置用水裂解细胞，将标记的DNA沉淀在玻璃纤维滤膜上。然后干燥滤垫，用标准的液体闪烁计数技术来计数。
中性红：中性红是用来对细胞的细胞质颗粒染色的阳离子吖嗪。例如，在培养的最后，每个孔内加入一等份(例如100微升含0.5％(w/v)中性红的1∶500稀释液(SigmaChemical,St.Louis MO))。然后在5％CO2中37℃培育细胞2-4小时。减去50％甲醇(和1％乙酸)的颜色，在540波长下测定吸光度。
细胞存活的台盼蓝测试：用染料排斥测试来测定细胞悬液中的活细胞数。其根据的原理是活细胞具有完整的细胞膜而排斥某些染料，而死细胞不会。在该测试中，使细胞悬液与染料简单地混合，然后用肉眼检查确定细胞是吸收还是排斥染料。活细胞具有透明的细胞质，而死细胞具有蓝色细胞质。该试验可这样进行，例如，100xg离心细胞悬液等份5分钟，弃去上清液。将细胞颗粒重悬于1毫升PBS或无血清培养基中。使一份0.4％台盼蓝与一份细胞悬液(细胞稀释液)混合。室温下培育混合物大约3分钟。然后在血细胞计数板中加1滴台盼蓝/细胞混合物，用双筒显微镜观察。
采用培养昆虫细胞的一个合适的体外试验例子是Bt Cry1C蛋白。采用Sf9(草地夜蛾)细胞是因为该细胞系对Cry1C蛋白敏感。其它昆虫细胞系，如实夜蛾属和粉夜蛾属也可用于Cry1C。Sf9对Cry1A蛋白不是高度敏感。在Cry1A和相关蛋白如Cry1F和Cry1G的情况下，可采用CF1(枞色卷蛾)细胞。CF1细胞对Cry1A型蛋白高度敏感。当激活的Cry1C蛋白与Sf9细胞混合后，Cry蛋白使细胞膜对小分子(如水)高渗透性。当将染料如台盼蓝加入细胞悬液后，被Cry蛋白杀死的那些细胞被染料染色。因此，用图象分析测定杀虫活性水平。
附加的体外试验包括使用特定毒素的受体。昆虫中几个杀虫蛋白(包括Bt Cry蛋白)的目标部位是中肠上皮细胞。毒素蛋白寻找细胞上的受体，并形成特异性的受体-Cry蛋白复合物。在结合受体后，Cry蛋白进入细胞膜并形成了使细胞膜高度可渗透的孔。这样，细胞丧失渗透亚调节，并最终被杀死。看来受体结合步骤、或Cry蛋白对其受体的亲和力是杀虫活性水平的关键。Cry突变体对受体的高亲和力意味着高的杀虫活性。因此，也可根据特异性受体对毒素的亲和力来鉴定编码抗害虫效力增强毒素的改组基因。
在此类筛选试验的一个例子中，采用刷状缘膜泡囊(BBMV：例如参见，Lee等人(1995)Appl.Environ.Microbiol.61:3836-42)。从昆虫或分离的中肠组织或昆虫整体分离出含有高浓度水平受体的BBMV。用BBMV的一个优点是它们可从任何感兴趣的昆虫制得。BBMV通常通过整个昆虫简单匀浆和重复差速离心(例如在3000和12000rpm之间)来制得。由于BBMV组分比其它组分重，因此它易通过离心来分离。在此类筛选方法的一个实施方案中，通过碘化制得有放射活性的改组的毒素蛋白。然后使放射活性蛋白与96孔板中的BBMV混合，并使其结合。过滤洗涤BBMV，除去游离的未结合的蛋白。用相同的样品组制备两组平板。一组平板培育10分钟，另一组培育2小时，然后加入100X未标记的野生型蛋白。短的反应时间是为了测定可逆性受体结合的程度(即测定受体结合)，长的培育时间是为了测定膜插入，这是不可逆的。因此，利用两个不同的培育时间，就可确定蛋白的作用方式。当改组蛋白并非高度活性时，过量的冷的野生型蛋白排斥改组蛋白与BBMV结合。然后，过滤BBMV以除去上清液，测定存在的标记量。这样就测定了留在BBMV上的改组蛋白的量。
竞争性结合试验是用来鉴定改组基因(其所编码的毒素对受体的亲和力增加)的合适形式。例如，使标记的(例如放射性核素标记的)、非突变(野生型)毒素蛋白与固定的受体(如与BBMV结合的受体)结合。在洗去过量(未结合)蛋白后，用上述从DNA改组突变体合并物分离出的冷的(未标记的)毒素蛋白来竞争结合未突变的毒素蛋白。当突变的毒素蛋白对受体的亲和性高于未突变的蛋白时，突变体取代了受体结合的未突变蛋白。因此，与受体连接的标记量减少。通过测定与过滤后的BBMV连接的标记量，鉴定出对受体有更高亲和性的突变体。具有高受体亲和性的那些突变体可被确认为在上述全昆虫试验或细胞试验中具有升高的杀虫活性。
上述受体结合试验适用于昆虫细胞。Keeton和Bulla((1997)Appl.Environ.Microbiol.63:3419-3425)指出，表达“Bt毒素受体”的哺乳动物细胞系对称为Cry1A的一类Cry蛋白敏感。据说，Keeton和Bulla采用的“受体”基因与钙粘着蛋白相似，并且具有非常有限的应用，因为已知只有选出的少数Cry蛋白结合该受体。已鉴定出Bt Cry蛋白的其它受体。据报道，它们中的大多数是氨基肽酶。然而，氨基肽酶N也只有有限的用途，因为它对Cry蛋白的特异性很窄。例如，Cry1C不识别该受体蛋白。然而，通过将DNA改组研究出的一种Cry蛋白特异性受体基因克隆到细胞系中，可以发展一个特异性的结合试验方法。许多Bt毒素的受体已被鉴定(来自烟草天蛾Manduca sexta(Keeton等人，(1997)Appl.Environ.Microbiol.63:3419-25；Knight等人，(1994)Mol.Microbiol.11:429-36；Knight等人，(1995)J.Biol.Chem.270:17765-70；Masson等人，(1995)J.Biol.Chem.270:20309-15；Vadlamudi等人(1995)J.Biol.Chem.270:5490-4)、舞毒蛾(Lymantria dispar)(Rajamohan等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:25,14338-43)、烟芽夜蛾(Luo等人，(1997)Insect Biochem.Mol.Biol.27:35-43和Gill等人(1995)J.Biol.Chem.270:27277-82)的Cry 1A毒素受体)。对于Bt毒素，结合试验中也可使用生物素化的蛋白(Du等人，(1996)Appl.Environ.Microbiol.62:2932-9)。Bt Cry蛋白在激活后能在磷脂和染料或放射活性同位素制成的脂质体上形成孔。Cry蛋白形成的孔可通过监测渗漏的染料或放射性同位素来测定。
在其它实施方案中，通过将重组害虫抗性基因以展示在(例如)噬菌体或其它可复制基因包装表面上的融合蛋白形式表达，来进行筛选。用噬菌体展示技术来产生和筛选能结合所选靶标的多肽文库已有描述。例如参见，Cwirla等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6378-6382；Devlin等人(1990)Science 249:404-406；Scott&Smith(1990)Science 249:386-388；Ladner等人，美国专利No.5,571,698。噬菌体外的可复制基因包装(如真核病毒和细菌)也可展示重组害虫抗性基因的文库。在Marzari等人(1997)FEBS Lett.411:27-31中讨论了Bt CryⅠA(a)杀虫蛋白的噬菌体展示。噬菌体展示文库例如可这样来筛选，鉴定出展示重组多肽的那些噬菌体，该重组多肽对昆虫中肠或结合该毒素的受体多肽的亲和性有所增强。
在另一个实施方案中，让靶昆虫食用噬菌体展示文库。然后，从因食用噬菌体而死亡的个别昆虫扩增编码重组害虫抗性基因的DNA。例如，可采用在侧接插入的重组害虫抗性基因的位置上与表达载体杂交的两个寡核苷酸作为引物，进行聚合酶链反应。
另一筛选方法包括使用发根土壤杆菌产生的转基因“发根”。该细菌通过将其Ri(根诱导)质粒的部分DNA转移到受感染的植物细胞中而在许多植物中引起发根疾病(zambryski等人，(1989)Cell 56:193-201)。转移DNA(T-DNA)中的基因改变了植物细胞的激素平衡，使它们产生根。与正常的植物根不同，发根很容易在简单的培养基(如Murashige和Skoog(MS:(1962)Physiol.Plant.15:473-497))中无限培养。发根也可被诱导再生成全植物(Tepfer(1984)Cell 37:959-967)。T-DNA的大小没有要求，因此可以插入任何感兴趣的基因并将其转移到植物细胞中。该系统能迅速产生数百或数千个转基因根，这些转基因根表达出经过体外改组产生的基因。根组织特别适用于筛选线虫抗性和根虫抗性。
图4显示了该筛选过程的示意图。如上所述产生改组毒素基因的文库，并连接入含有抗生素抗性基因(如卡那霉素)、大肠杆菌复制起点(用来维持)和Ri T-DNA区的质粒中(Tepfer和Casse-Delbart(1987)Microbiol.Sci.4:24-28)。可通过电穿孔将质粒文库导入发根土壤杆菌细胞(Main等人，(1995)Methods Mol.Biol.44:405-412)，将细胞接种到合适的培养基(例如，含有25-200微克/毫升卡那霉素或其它选择剂的MYA培养基(8.0克/升甘露醇，5.0克/升酵母抽提物，2.0克/升硫酸铵，0.5克/升酪蛋白氨基酸和5.0克/升氯化钠，pH 6.6))上，28℃培育数天。只有通过T-DNA区中同源重组而整合入内源Ri质粒的细胞在选择中存活，因为质粒不能在发根土壤杆菌中游离性复制。从板上洗下所有菌落，合并作为植物组织上的接种物。
然后用菌落接种植物组织。许多不同的双子叶和单子叶植物，包括大豆(Glycinemax)可被发根土壤杆菌诱导形成发根(De Cleene和De Ley(1981)Bot.Rev.47:147-194)。通常对植物组织(例如种子)进行表面消毒，然后切下下胚轴片段，将顶端向下插入24孔或48孔板的固体MS培养基中。将一滴发根土壤杆菌接种物施加在组织切片的末端，平板于暗处26-28℃培育至出现根(1-4周)。未转化的植物细胞不会在MS培养基上产生根。因此，假定形成的根是转化的，不需进行抗生素选择。然而，较佳的是通过从叶柄取下根并将其栽培在添加了500微克/毫升羧苄青霉素或氨噻肟头孢菌素的MS培养基上将发根土壤杆菌杀死。培养的发根迅速生长，并可再分裂数次，以提供用于筛选实验的复制品。
用线虫感染独立转化的根系，测定包囊和线虫死亡，或使幼虫长至第二或第三虫龄，然后筛选杀虫活性(幼虫的死亡)。选出在线虫或昆虫攻击后存活的最佳的根系，重新分离毒素基因，方法例如用与插入的改组基因的克隆位点周围的质粒序列相匹配的引物进行PCR。在较佳的实施方案中，混合这些基因，用DNA酶处理，重新装配并改组。进行第二轮导入发根土壤杆菌和感染植物组织。可重复这些回合直至获得所需水平的害虫抗性。分离出最终的进化毒素基因，并用于以有助于再生能繁育的商品活植株方式转化所需的植物品系。
该系统还可用来鉴定编码以前未知的毒素、或基因还未得到的毒素的基因。当第一轮筛选的目的是鉴定以前未知的毒素基因时，可在Ri质粒中制备生物源的基因组文库。为了便于克隆，在基因组片段中加入含有以不常见方式切割的限制位点(如NotⅠ)的接头，并克隆到大肠杆菌载体中来输送入发根土壤杆菌。试验的其余部分如上所述，只是最初从存活的根回收基因之后是鉴定基因和所有或部分基因组序列的改组。
希望从中获得毒素基因的昆虫病原体包括例如，微生物如苏云金芽孢杆菌*(各种昆虫)、球形芽孢杆菌*(蚊子)、日本甲虫芽孢杆菌*(甲虫)、缓死芽孢杆菌(甲虫)、幼虫类芽孢杆菌(蜜蜂)、蜡状芽孢杆菌(家蝇)、变短梭菌*(毛虫)、天幕虫梭菌*(毛虫)、绿脓杆菌(各种昆虫，包括蚱蜢)、阴沟肠杆菌(蝗虫)、产气肠杆菌、粘质沙雷菌(各种昆虫)、嗜虫沙雷菌(甲虫)、液化沙雷菌(各种昆虫)、普通变形菌(蚱蜢)、嗜线虫致病杆菌*(甲虫)、粪链球菌(各种昆虫)、日本甲虫立克次小体*(甲虫)、金龟子立克次小体*(甲虫、毛虫)、和枝原体属/螺原体属(*表示现在已知产生杀虫蛋白的病原体，其它可能也产生毒素)。
病毒病原体例如包括，杆状病毒(包括核形多角体病毒，颗粒病毒和非闭合性病毒)、多DNA病毒(包括Ichnovirus和Bracovirus)、痘病毒、Ascovirus、虹色病毒、野田村病毒、小核糖核酸病毒、四病毒、呼肠病毒(包括细胞质多面体病毒和Muscareovirus)、双RNA病毒、弹状病毒、外衣病毒、黄病毒和布尼亚病毒。
真菌昆虫病原体包括例如，虫草属、Strongwellsea属、Zoophthora anuiensis、Beauveria bassiana、Beauveria brongniartii、玫瑰色拟青霉(Paecilomycesfumosoroseus)、乳菇轮枝孢(Verticillium lecanii)、Metarhizium flavoviride、绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、Lagenidium gigantum、Nomuraea rileyi、Nomuraeacylindrosporae、Pandora neoaphidis、Pandora delphacis、Neozygites floridana、Hirsutellathompsonii、Nilaparvata lugens、Erynia neoaphidis和团孢霉属。
对昆虫有致病性的线虫包括例如，Tetradonema plicans(苍蝇)、Mermisnigrescens(蚱蜢)、Romanomermis culicivorax(蚊子)、Agramermis decaudata(蚱蜢)、Rhabditis insectivora(甲虫)、Steinernema属(甲虫、毛虫)(这些线虫(如Xenorhabdus/Photorhabdus属)的共生菌产生毒素)、Steinernema carpocapsae、Steinernema glaseri、Steinernema kusidai、Eudiplogaster aphodii(甲虫)、Deladenussiricidicola(isp)、Contortylenchus属(甲虫)、Heterotylenchus autumnalis(苍蝇)和Sphaerularia bombi(蜜蜂)。
改组文库转化的根系的其它应用包括摄取和利用溶质、营养物或化学物质(Tepfer等人，(1989)Plant Mol.Biol.13:259-302)。用发根还可筛选真菌感染、根瘤菌形成根瘤以及次级代谢物的形成(Tepfer和Casse-Delbart(1987)Microbiol.Sci.4:24-28；Saito等人，(1992)J.Nat.Prod.55:149-162)。
本文所述的转基因植物组织筛选方法中有几种可能的变化。首先，比发根土壤杆菌使用更广泛的根癌土壤杆菌能输送改组的基因文库。两个菌株的去枝(disarmed)的二元版本(Walkerpeach和Velton(1994)Plant Molecular Biology Manual,B1:1-19)允许基因在缺乏导致天然T-DNA疾病的基因时与抗生素标记一起转移，以便根据所研究害虫将攻击的组织类型，来选择能诱导形成胼胝、根、幼苗或全植物的转化细胞。对于产生谷物的各类植物，可用其它植物转化方法，如颗粒枪轰击(Barcelo和Lazzari(1995)Methods Mol.Biol.49:113-123)来产生用于筛选的转基因组织。
B．增加靶范围
本发明还提供了用DNA改组来获得害虫抗性基因的方法，该害虫抗性基因抗昆虫、线虫或其它害虫的范围比天然存在的基因更广。例如可对编码具有不同靶特异性的毒素的基因家族进行DNA改组，然后筛选筛选出对靶害虫(天然存在的基因编码的毒素对该害虫的效果低)有毒性的那些。可改组获得增加靶范围的基因的具体例子包括，但不局限于：
(ⅰ)可对Bt毒素基因改组，以获得更高的对抗玉米根虫和其它鞘翅目害虫的活性。
(ⅱ)还可对Bt毒素基因改组，以增强对属于不同目的其它具体害虫(如鳞翅目和双翅目)的活性。
(ⅲ)还可对Bt毒素基因家族进行改组，以获得对那些已对现有毒素产生抗性的昆虫害虫的新活性(Nature Biotech,1997年9月，816页。
(ⅳ)对编码毒素如胆固醇氧化酶、蛋白酶抑制剂、凝集素等的其它基因(《农业生长报道-用于害虫防治的基因工程》，Len Copping,2.1-2.4章)改组，以增加效果和杀虫谱。
鉴定编码毒性范围增加的毒素的改组基因文库成员的筛选方法包括上述的体内和体外试验形式。同样，体外试验通常是较佳的，因为它们更易进行高产量的筛选。杀虫谱试验采用昆虫幼虫中肠(例如参见，Van Rie等人，(1989)Eur.J.Biochem.186:239-47)。可如上所述那样，使用在细胞系中表达的或BBMV形式的毒素受体。
通常，选出不易或较弱地结合天然存在的感兴趣毒素的细胞或受体用于试验。测试重组毒素文库，以鉴定对靶细胞有活性的那些，和/或表现出对靶受体高亲和性的那些毒素。
C．降低害虫产生抗性的敏感性
在使用生物杀虫剂时通常观察到的一个问题是，由于对害虫群体的选择压力，靶害虫对杀虫剂产生抗性(例如参见Kumar等人，同上)。本发明提供了获得比天然存在的基因更不易产生抗性的重组害虫抗性基因的方法。
选择不易使害虫产生抗性的优化的重组昆虫抗性基因的方法例如可包括，给饲养的昆虫群体喂不同的食(例如改组基因文库的成员)，并测定每个克隆产生抗性有多少迅速。另一种方法是采用2种或多种Bt毒素，较佳的是不同的Bt毒素，这样就难以获得对两者的抗性。如上所述，对不同的基因组合作试验，以确定对两种基因产生抗性的难易程度。
获得不易产生抗性的Bt毒素的一个方案例子如下。菜蛾易对Cry1A(一种强效的广泛使用的Bt毒素)产生抗性。这些有抗性的菜蛾对Cry1C仍然敏感，因为Cry1C结合的受体与Cry1A的不同，但是Cry1C的效力比Cry1A低得多。人们可用本文描述的DNA改组来增强Cry1C的效力，从而使其对抗性昆虫更有效。这些筛选测试可以在草地夜蛾Sf9昆虫细胞中进行，因为Sf9细胞对Cry1C敏感但对Cry1A不敏感。试验可在转染了CryⅠC受体基因的未修饰的Sf9细胞或其它昆虫细胞系(如实夜蛾属、粉纹夜蛾或叶甲属(玉米根虫))上进行(例如参见，de Maagd等人，(1996)Appl.Environ.Microbiol.62:2753-7)。
D．增加的表达水平
在另一实施方案中，本发明提供了增加害虫抗性基因表达水平的方法。这可通过优化基因本身来实现，例如将基因的GC含量变成与植物的更密切匹配，或通过用本发明的DNA改组方法来改进密码子的用途。
另外，可用DNA改组获得改进的启动子和其它基因表达控制信号来增加表达。通常，害虫抗性基因与另一序列(如调控序列)操作性相连，以确保其表达。这些调控序列可包括下列的一个或多个：增强子、启动子、信号肽序列、内含子和/或聚腺苷酸化序列。害虫抗性基因的效果通常取决于植物或其它宿主的基因产物的表达水平。优化的启动子和/或其它控制序列可能导致害虫抗性改进。另外，有时希望控制表达基因的细胞类型和/或害虫抗性基因的表达时间。例如，利用可诱导的或能指导抗性基因不连续表达的启动子，可以延迟或消除对害虫抗性基因产生抗性。本发明的方法提供了对受启动子和其它控制序列影响的这些和其它因素的优化。
可用各种方式来有效地改进表达，包括增加表达产物的产生速度，降低表达产物的降解速度，或改善表达产物发挥其预计功能的能力。这些方法包括对涉及控制基因表达的多核苷酸进行DNA改组。如上所述，重组至少第一和第二形式的含有控制序列的核酸，这些形式相互间在两个或多个核苷酸处有所不同。筛选得到的重组对照序列文库，以鉴定表现出强度、可诱导性或特异性增强的至少一种优化的重组控制序列。
重组底物可以是全长载体或其片段，该片段包括编码序列和/或与编码序列操作性相连的调控序列。底物可包括载体中的任何调控序列和/或编码序列的变体。如果重组在片段水平上进行，则应在筛选前将重组片段重新插入载体。如果重组在体外进行，通常在筛选前将含有重组片段的载体导入细胞。
含有重组片段的细胞可通过检测选择标记编码的基因表达来筛选。为了选择和/或筛选，载体表达的基因产物有时是一种容易检测到的标记，而不是具有真实治疗目的的产物，例如绿色荧光蛋白(见，Crameri(1996)Nature Biotechnol.14:315-319)或细胞表面蛋白。例如，如果该标记是绿色荧光蛋白，则可用流式细胞计数器为基础的细胞分拣方法来鉴定表达水平最高的细胞。如果标记是细胞表面蛋白，则可用对该蛋白有亲和性的试剂(如抗体)染色细胞，并再次用流式细胞计数器为基础的细胞分拣方法进行分析。药物抗性基因也提供了可选择的标记。另外，基因产物可以是含有检测和选择标记之组合的融合蛋白。内参比标记基因可包含在载体内，以检测和补偿拷贝数或插入位点中的变化。
如果需要其它改进，标记基因表达水平最高的细胞中的重组片段可用作下一轮重组和筛选中的一些或全部底物。然后，优化的控制序列可用于转基因植物中或施加到感兴趣植物上的微生物(包括可群集于植物中的微生物)中的害虫抗性基因的表达。
E．增加对蛋白酶降解的抗性
昆虫中肠体液含有蛋白酶，因此对蛋白酶降解的抵抗力是害虫抗性基因产物所希望的性能。本发明提供了获得下述重组害虫抗性基因的方法，即该基因编码的多肽表现出对蛋白酶的抗性增加。通常这样来筛选重组基因文库，即，表达并测试基因产物，鉴定出置于蛋白酶时能重新恢复完整性并获得杀虫活性的那些产物。例如，可以表达改组基因的合并物，在昆虫中肠体液或含有相关蛋白酶的其它介质存在下培育该基因产物。多肽的完整性例如可用凝胶电泳或合适的生物试验来测定。可对含有蛋白酶抗性基因产物的那些合并物进行细分，并重新测试以鉴定出编码蛋白酶-抗性基因产物的那些文库成员。
F．在环境条件下的稳定性增加
需要改进的另一性能是害虫抗性基因产物抵抗靶害虫中作用部位处占优势的极端pH以及其它条件的能力。例如，鞘翅目和半翅目的中肠液通常处在较低的pH(约pH3-6)下，而大多数其它昆虫的中肠液在较高的pH(约pH8-11)下。因接触紫外光而失活是限制昆虫病原性病毒制剂(例如可喷雾的杀虫剂)用途的一个主要问题。在将杀虫剂喷到作物上以保护它们防御昆虫伤害时，病毒被日光(尤其是UV光)迅速灭活。
这些优化的改组基因的筛选可以类似的方式进行，以便如上所述测试蛋白酶抗性。例如，将害虫抗性基因产物置于其作用部位的条件下，经鉴定获得在测试条件下能编码产生稳定性增加的基因产物的那些文库成员。
为了增加获得所编码多肽UV光敏感性减少的基因的可能性，可在改组反应中加入这样的寡核苷酸，它所含密码子编码的氨基酸对UV光不很敏感。筛选UV抗性病原性病毒制剂的一种合适方法如下：就苜蓿丫纹夜蛾核多面体病毒(AcNPV)而言，对整个病毒基因组进行改组。首先，使AcNPV接触UV，该UV剂量设定为仅仅5％的病毒存活的水平。在Sf9(草地夜蛾)细胞上噬斑纯化UV处理后存活的病毒，在粉纹夜蛾中繁殖，并进行第二次UV处理。重复该过程数次。从UV下传数代后存活的群体合并物中分离出病毒基因组。使UV抗性病毒DNA与野生型病毒DNA混合并改组。用重装配DNA转染Sf9细胞，分离病毒。在该UV-选择轮后，获得数个病毒克隆，这些克隆是UV抗性的，并没有表现出有其它明显的表型(如感染率和杀伤速度)变化。
G．对宿主植物的毒性降低
还可筛选用本发明DNA改组方法制得的改组基因，以鉴定获得与天然存在的基因相比对宿主植物毒性降低的那些改组基因。可将这些基因导入植物或植物细胞中，以鉴定得到相对没有毒性的那些基因，或测定基因产物对植物或植物细胞的毒性。
V．优化的害虫抗性基因的用途
用本发明方法产生的优化的害虫抗性基因可用于体外和体内。例如，抗害虫活性改善的基因可用于体外，以研究保护植物抵御害虫的机理，并用来生产可施加于植物上的杀虫剂。优化的害虫抗性基因可导入群集于植物表面上的微生物体内，或可导入植物本身。在每种情况下，害虫抗性基因的表达能赋予植物抗害虫的能力。
A．杀虫剂的产生
优化的害虫抗性基因可用来重组生产用作杀虫剂的多肽。通常，将一优化的基因导入在所需宿主细胞内高水平表达的一表达盒内。典型的表达盒含有启动子以及与其操作性相连的所需DNA序列。通过将多个转录盒置于单个表达载体内，或构建编码多个害虫抗性基因组成的融合蛋白的基因，或是对克隆策略中采用的各表达载体使用不同的可选择标记，可在单个原核细胞中表达多个优化的害虫抗性基因。
本发明的优化的害虫抗性基因可在各种宿主细胞中表达，这些宿主包括大肠杆菌、其它细菌宿主、酵母和各种高等真核细胞，如COS、CHO以及HeLa细胞系和骨髓瘤细胞系。有用的细菌例子包括，但不局限于，埃希菌属、肠杆菌属、固氮菌属、欧文菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、克雷伯菌属、变形杆菌、沙门菌属、沙雷菌属、志贺菌属、根瘤菌属、透明颤菌属和副球菌属。重组基因将与每种宿主的合适的表达控制序列操作性相连。对于大肠杆菌，其包括启动子如T7、trp或λ启动子，核糖体结合位点和较佳的核酸转录终止信号。对于真核细胞，控制序列将包括启动子，较佳的有衍生自免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等的增强子，以及聚腺苷酸化信号，并可包括剪接供体和受体序列。
在较佳的实施方案中，表达盒用来在原核宿主细胞中表达害虫抗性基因。常用的原核细胞控制序列，在本文确定为包括启动转录的启动子、任选的和操纵子、以及核糖体结合位点序列，该序列包括以下这些常用的启动子，如β内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Change等人，Nature(1997)198:1056)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等人，Nucl.Acids Res.(1980)8:4057)、tac启动子(DeBoer,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:21-25)；以及λ衍生的PL启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake等人，Nature(1981)292:128)。特定的启动子系统对本发明并不关键，可采用在原核生物中起作用的任何可获得的启动子。
在本发明中可采用组成型或调控型启动子。调控型启动子有优点，因为宿主细胞在诱导表达害虫抗性多肽前可以生长至高密度。在一些情况下，异源蛋白的高水平表达减慢了细胞生长。特别适用于大肠杆菌的调控型启动子包括噬菌体λPL启动子，杂交的trp-lac启动子(Amann等人，Gene(1983)25:167；de Boer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:21，以及噬菌体T7启动子(Studier等人，J.Mol.Biol.(1986)；Tabor等人，(1985))。这些启动子及其用途在Sambrook等人(同上)的文献中有所讨论。
为了在大肠杆菌之外的原核细胞中表达害虫抗性多肽，需要在特定的原核生物中起作用的启动子。这些启动子可从克隆自该生物的基因获得，或可采用异源启动子。例如，杂交的trp-lac启动子在除大肠杆菌之外的芽孢杆菌中起作用。适用于真核宿主细胞的启动子是本领域技术人员所熟知的。
在欲用于原核宿主细胞的本发明表达盒中可方便地加入核糖体结合位点(RBS)。例如，大肠杆菌中的RBS由在起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的核苷酸序列组成(Shine和Dalgamo,Nature(1975)254:34；Steiz，《生物调控和发展：基因表达》(R.F.Goldberger编者)卷1,349页，1979,Plenum Publishing,NY)。
可用翻译偶联来增强表达。该策略采用一个衍生自翻译系统天然高表达基因的短的上游开放读框，将其置于启动子下游，在数个氨基酸密码子后是核糖体结合位点，然后是终止密码子。紧靠终止密码子之前是第二个核糖体结合位点，在终止密码子后是翻译起始的起始密码子。该系统解除了RNA中的二级结构，允许翻译的有效启动。见Squires等人，(1988),J.Biol.Chem.263:16297-16302。
害虫抗性多肽可在细胞内表达，或分泌出细胞。胞内表达通常导致高产。如果需要，可进行重新折叠程序来增加可溶的有活性的害虫抗性多肽的量(例如参见，Sambrook等人，同上；Marston等人，Bio/Technology(1984)2:800；Schoner等人，Bio/Technology(1985)3:151)。在害虫抗性多肽从细胞分泌入周质或胞外培养基的实施方案中，DNA序列与可切割的信号肽序列相连。该信号序列指导害虫抗性多肽转运经过细胞膜。用于大肠杆菌的含有启动子-信号序列的合适载体例子是pTA1529，它具有大肠杆菌phoA启动子和信号序列(例如参见，Sambrook等人同上；Oka等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:7212；Talmadge等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77:3988；Takahara等人，J.Biol.Chem.(1985)260:270)。
本发明的害虫抗性多肽还可以融合蛋白形式产生。该方法通常导致高产，因为由正常的原核控制序列指导转录和翻译。在大肠杆菌中，通常用lacZ融合物来表达异源蛋白。合适的载体是容易获得的，如pUR、pEX和pMR100系列(例如参见Sambrook等人，同上)。对于某些应用，可能希望在纯化后从融合蛋白中切下非害虫抗性多肽氨基酸。这可用本领域已知的几种方法中任一种来实现，这些方法包括用溴化氰、蛋白酶或因子Xa切割(例如参见Sambrook等人，同上；Itakura等人，Science(1977)198:1065；Goeddel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1979)76:106；Nagai等人，Nature(1984)309:810；Sung等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83:561)。在融合蛋白基因中理想的切割位点处可经工程改造加入切割位点。
Miller等人(1989)Biotechnology 7:698-704已描述了从大肠杆菌获得其N端维持完整性的重组蛋白的合适系统。在该系统中，产生的感兴趣基因以C端融合于含有肽酶切割位点的酵母遍在蛋白基因前76个残基。在两部分接头处切割断裂导致产生具有完整可靠的N-端残基的蛋白质。
本发明的表达载体可用熟知的方法转移入所选宿主细胞内，对于大肠杆菌例如是氯化钙转化法，对于哺乳动物细胞为磷酸钙处理或电穿孔。利用质粒所含基因赋予的抗生素(如amp,gpt,neo和hyg基因)抗性，选择质粒转化的细胞。
一旦表达，就可用本领域的标准程序纯化重组害虫抗性多肽，这些程序包括硫酸铵沉淀、亲和柱层析、柱层析、凝胶电泳等(通常见R.Scopes，《蛋白质纯化》，Springer-Verlag,N.Y(1982),Deutscher,《酶学方法182卷：蛋白质纯化指南》，AcademicPress,Inc.N.Y(1990))。至少约90-95％均一性的基本纯的组分是较佳的，98-99％或更高的均一性是最佳的。多肽一旦如所希望的那样部分纯化或纯化至均一，就可使用(例如用作产生抗体的免疫原)。
技术人员将认识到，可对害虫抗性多肽进行修改，而不消除其生物活性。可进行一些修饰，以便于克隆、表达或将靶分子插入融合蛋白中。这些修饰是本领域技术人员所熟知的，例如包括，在氨基端加入甲硫氨酸来提供起始位点，或在任一端放置附加的氨基酸(如聚His)来方便地产生定位的限制位点或终止密码子或纯化序列。
可以将优化的害虫抗性基因编码的多肽配成制剂施用于植物，这些是本领域技术人员已知的。例如，对于Bt毒素，可配制一种或多种形式的毒素(如晶体、晶体蛋白、前毒素、毒素和毒素的有效杀虫蛋白)施用于植物，或用于杀虫活性的测定。活性害虫抗性多肽可以和合适的载体、稀释剂、乳化剂和/或分散剂一起配制。该杀虫组合物可以配制成多种形式，例如可润湿的粉末、颗粒、团粒或粉尘，或与水性或非水性溶剂一起配制成液体制剂(如泡沫、凝胶、悬液、浓缩液等)。该组合物中活性组分的浓度取决于制剂性质及其预计的使用方式。为了延长保护作用(例如整个生长季节)，可定期施加增加量的该组合物。
杀虫多肽可配制成干的固体单位剂型，如含有所需量活性化合物的胶囊剂、丸剂或片剂。将活性组分与合适的稀释剂、填充剂、崩解剂和/或粘合剂(如淀粉、乳糖、滑石、硬脂酸镁、植物胶等)混合，制得这些剂型。这些单位剂型的配制可以根据其总重量和杀虫剂含量而异，这取决于诸如待处理植物种类以及侵染严重程度和类型等因素。
B．用表达优化害虫抗性基因的微生物处理植物
将优化的昆虫抗性基因或其有效杀虫蛋白导入群集于植物的微生物中。害虫消化其上存在微生物的植物，结果害虫抗性基因产物导致害虫死亡。能定居于植物圈的微生物在例如美国专利No.5,281,532和欧洲专利申请0 200 344中有所描述。将基因导入微生物并表达的方法在本文中有所描述，这些是本领域技术人员所熟知的(例如参见美国专利No.5,135,867)。
选出已知占据一种或多种感兴趣作物的“植物圈”的微生物宿主。选择这些微生物，以便能成功地在特定环境(作物和其它昆虫栖息地)与野生型微生物竞争，使表达多肽杀虫剂的基因稳定的维持并表达，并改善该多肽的保护以防环境降解和灭活。特别感兴趣的宿主微生物包括原核生物和低等真核生物，如真菌。用于说明的革兰阴性和革栏阳性原核生物包括：肠杆菌科，如埃希菌属、欧文菌属、志贺菌属、沙门菌属和变形杆菌；根瘤菌科，如根瘤菌属；螺菌科(包括发光杆菌)、发酵单胞菌属、沙雷菌属、气单胞菌属、弧菌属、脱硫弧菌、螺菌属；乳杆菌科；假单胞菌科，如假单胞菌属和醋杆菌属；固氮菌科和硝化杆菌科。真核生物中有真菌，如藻菌和子囊菌，其中包括酵母，如酵母属和裂殖酵母属；和担子菌纲酵母，如红酵母属、短梗霉属、掷孢酵母属等。
将转化了优化的害虫抗性基因的微生物施加到植物上可采用本领域技术人员已知的方法(例如参见美国专利No.5,281,532)。通常，将转化的微生物施加到其自然栖息地上，如待保护以抵御害虫的植物的根围或叶面上。该微生物在其自然栖息地上生长，并产生害虫抗性基因编码的杀虫剂。该杀虫剂被幼虫或成虫吸收和/或消化，或对虫卵有毒性。该微生物的持续存在提供了对植物的长期保护作用，但是可能需要不时地反复给药。重组生物可以通过喷雾、浸泡、注射入土壤，涂覆在种子上，涂覆或喷雾在幼苗上等来施加。当在田间给药时，生物的浓度通常为106-1010细胞/毫升，每公顷施加的体积通常在大约0.1盎司至2磅之间或更多。当施用于植物的一部分时，生物的浓度通常在103至106个细胞/平方厘米之间。
C．将昆虫抗性基因导入植物细胞
在另一个实施方案中，将如本文所述产生的优化的重组害虫抗性基因导入植物细胞(包括完整植物或植物部分上的植物细胞)。然后，重组抗性基因的表达赋予植物或植物部分抗性。
本发明提供了用于在植物中表达害虫抗性基因的表达盒。除了优化的害虫抗性基因外，表达盒还包括起指导基因表达作用的多核苷酸序列。该表达盒通常包括合适的转录起始调控区，即启动子序列、内含子、感兴趣宿主植物中识别的聚腺苷酸化位点区域，所有这些均以允许编码序列和亚序列在细胞核中加工的方式来连接。这些序列可以从任何来源，如病毒、植物或细菌基因衍生获得。转录启动子和终止子的较佳来源的一个例子是植物病毒，例如，花椰菜叶病毒(CaMV)，其在Hohn等人(1982)Curr.Topics Microbiol.Immunol.96:194-220以及附录A至G中有所描述。CaMV具有至少两个在植物中起作用的启动子，即导致CaMV的基因Ⅵ转录的19S启动子，以及35S转录物的启动子。CaMV 35S或19S启动子可用Kay等人(1987)Science 236:1299-1302中描述的方法来增强。
来自植物基因的启动子和其它控制序列也适用于用本发明方法制得的害虫抗性基因的表达。例子包括来自编码核酮糖二磷酸羧基酶小亚基的基因，以及编码叶绿素a/b结合蛋白的基因的那些。例如参见，Morelli等人(1985)Nature 315:200-204。其它合适的启动子包括Figwort花叶病毒的全长转录启动子，遍在蛋白启动子、肌动蛋白启动子、组蛋白启动子、微管蛋白启动子或甘露氨酸合成酶启动子(MAS)。可采用导致在特定组织(如叶、茎、根或分生组织)中优先表达的启动子，或启动子可用光、热应激、水应激或施加的或植物产生的化学物质来诱导。典型的绿色组织特异性启动子包括玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)启动子、小亚基核酮糖二羧化酶启动子(ssRUBISCO)和叶绿素a/b结合蛋白启动子。启动子还可以是木髓特异性启动子，如国际公开号WO93/07278中描述的自植物TrpA基因分离出的启动子。
在植物中表达细菌基因是合适的控制区域的另一来源。这些包括在土壤杆菌质粒(如根癌土壤杆菌的Ti质粒和发根土壤杆菌的Ri质粒)的T-DNA区中存在的那些启动子。特别佳的用于优化的害虫抗性基因表达的土壤杆菌启动子以及5′和3′非翻译区，例如包括编码章鱼(肉)碱合成酶和胭脂碱合成酶的基因的那些启动子。例如参见，Bevan等人(1993)Nature 304:184-187。
用来将基因导入植物细胞并获得基因表达的各种技术是本领域中已知的。异源基因导入单子叶和双子叶植物并表达的方法是已知的。除了Berger、Ausubel和Sambrook，关于植物细胞克隆、培养和再生的常见文献包括Payne等人，(1992)《液体系统中的植物细胞和组织培养》，John Wiley & Sons,Inc.New York,NY(Payne)；和Gamborg和Phillips(编者)(1995)《植物细胞、组织和器官培养；基本方法》Springer LabManual,Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)(Gamborg)。细胞培养基在Atlas和Parks(编者)《微生物培养基手册》(1993)CRC Press,Boca Raton,FL(Atlas)中有所描述。其它信息可在市售的文献如Sigma-Aldrich,Inc(St.Louis,MO)的Life ScienceResearch Cell Culture目录(1998)(Sigrna-LSRCCC)，以及同样是Sigma-Aldrich(St Louis,MO)的Plant Culture目录和增补本(1997)(Sigma-PCCS)中找到。另见，例如，美国专利5,633,446,5,317,096,5,689,052,5,159,135和5,679,558；Weising等人，(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477。合适的方法例子包括根癌土壤杆菌介导的转化，将基因直接转移到原生质体中，微粒轰击，注射入原生质体，培养的细胞和组织或分生组织，以及电穿孔。显微注射技术是本领域中已知的，并在科学和专利文献中有详细的描述。用聚乙二醇沉淀来导入DNA构建物在Paszkowski等人(1984)EMBO J.3:2712-2722中有所描述。电穿孔技术在Fromm等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5824中有所描述。轰击转化技术在Klein等人(1987)Nature 327:70-73中有所描述，这些方法包括用带有核酸(在小珠或颗粒的基质中，或在表面上)的小颗粒穿透细胞。尽管通常只需要一次导入新的核酸片段，但是该方法特别提供了多次导入。已知可用各种技术来转化单子叶植物，这些技术包括电穿孔(例如Shimamoto等人(1992)Nature338:274-276)，粒子轰击(biolistics)(例如欧洲专利申请270,356)；和土壤杆菌(例如，Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5345-5349)。
根癌土壤杆菌介导的转化技术在科学文献中有所描述。例如参见，Horsch等人，(1984)Science 233:496-498和Fraley等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:4803。在这些方法中，用转化了该片段的根癌土壤杆菌感染植物细胞、移植物、分生组织或种子。在本领域已知的合适条件下，使转化的植物细胞生长形成茎干、根，并进一步发育成植物。昆虫抗性基因可导入合适的植物细胞中，例如利用含有T-DNA的根癌土壤杆菌Ti质粒。土壤杆菌的T-DNA常被用作将异源DNA导入植物的载体。二元和插入载体均是已知的。例如参见，欧洲专利0 120 516,Hoekema(1985)《二元植物载体系统》，Offset-drukkerij Kanters B.V.,Alblasserdam，第5章；Fraley等人，Crit.Rev.Plant Sci.4:1-46；An等人(1985)EMBO J.4:277-287。在根癌土壤杆菌感染时，Ti质粒被输送给植物细胞，并稳定地整合入植物基因组(Horsch等人，(1984)Science 233:496-498；Fraley等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803)。
通常，用来将昆虫抗性基因导入植物的载体将包括选择标记。选择标记赋予转化的植物细胞对杀生物剂或抗生素(如卡那霉素，G418，博来霉素，潮霉素或氯霉素)抗性，或除草剂抗性(如对嗪磺隆或草丁膦的抗性)。可选择标记的编码序列的合适例子是：编码新霉素磷酸转移酶的neo基因，它赋予抗卡那霉素的抗性(Beck等人(1982)Gene19:327)；编码潮霉素磷酸转移酶的hyg基因，它赋予抗潮霉素的抗性(Gritz和Davies(1983)Gene 25:179)；以及编码膦基毛发蛋白(phosphinothricin)乙酰转移酶的bar基因(EP242236)，它赋予对除草化合物phosphinothricin和双丙氨膦的抗性。
害虫的病原体也可用于将优化的害虫抗性基因导入靶害虫中。例如，使外源基因在杆状病毒(感染昆虫的病毒)中表达，以改善作为喷雾杀虫剂的病毒性能。在一个例子中，表达昆虫利尿激素基因的重组家蚕核多面体病毒(BmNPV)有效地干扰了昆虫幼虫体液的代谢，导致比原BmNPV引起更早死亡(Maeda(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.165:1177-1183)。可将编码导致昆虫宿主死亡的任何蛋白的改组基因导入杆状病毒。靶害虫的任何病原体，不仅是病毒，还有细菌、真菌、线虫等，也可用来将改组的杀虫蛋白基因导入害虫，以增强它们的病原性。
作为一个例子，使用改组的Bt杀虫蛋白基因。将称为“结构域I”的Bt晶体蛋白的跨膜部分从数个cry1型基因通过PCR予以克隆(用合适的引物组)。混合这些扩增的基因并改组。然后将改组基因克隆入杆状病毒(AcNPV)表达载体中，这些载体包括含有早期启动子(如p10,gp64)或晚期启动子(如多面体)以及病毒基因组DNA。当单独使用载体构建物来与病毒DNA(它在载体整合位点处切开)共转染Sf9细胞时，获得重组病毒。在T.ni中测试Sf9细胞繁殖的病毒的杀伤速度。在早期启动子下含有改组Bt cry1结构域Ⅰ的一组克隆显示出杀伤速度明显改善。
还用线虫来输送杀虫蛋白。Sterinernema属特别适合该用途，因为它们含有革兰阴性共生菌。实际上，这些共生菌确实产生其自身的杀虫蛋白系列(Bowen等人(1998)Science,280:2129-2132)。可改组Photorhabdus luminescens的杀虫基因，以改善其特异活性和/或宿主特异性。当携带共生菌的线虫侵入昆虫幼虫后，它将细菌释放到昆虫体腔内。然后细菌在昆虫中生长并产生杀虫蛋白。
用优化的害虫抗性基因转化的植物细胞可以再生，获得含有转化细胞的完整的植物。例如参见，欧洲专利公开号0,116,718和0,270,822,PCT出版物WO 84/02,913和欧洲专利申请87/400,544.0。植物可形成胚细胞并将害虫抗性基因传给子代植物，该子代植物可以正常方式生长并与其它植物杂交。这些再生技术通常依靠在组织生长培养基中某些植物激素的控制，通常依靠的是与改组的核苷酸序列一同导入的杀生物剂和/或除草剂标记。植物从培养的原生质体再生在Evans等人，《原生质体分离和培养，植物细胞培养手册》，124-176页，MacMillan Publishing Company,New York,1983；Binding《植物再生，植物原生质体》，21-73页，CRC Press,Boca Raton,1985中有所描述。还可从植物胼胝体、移植物、器官或其部分再生植物。这些再生技术在Klee等人，(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38:467-487中有所描述。为了获得改善基因为纯合的植物，可以重新产生植物，并测试其子代对特定病原体的抗性。
本发明包括含有用本文所述方法制得的优化害虫抗性基因的植物、植物部分和植物细胞。这些植物的子代和其它后代也在本发明范围内。
D．将害虫抗性基因导入昆虫病毒
用本文所述方法获得的优化的害虫抗性基因也可导入感染害虫的病毒内。将害虫抗性基因导入病毒可增强该病毒的病原性。感染昆虫的病毒例如包括，杆状病毒和昆虫痘病毒。将基因插入昆虫病毒的方法是本领域技术人员熟知且容易实施的(例如参见，Merryweather等人，(1990)J.Gen.Virol.71:1535-1544和Martens等人(1990)Appl.Environ.Microbiol.56:2764-2770)。
菌株改进和集成系统的自动化
菌株改善的一个目的是进行一个试验，该试验能可靠地用来在产物产量或昆虫抗性/毒性活性上有潜在的细微增加的数千突变体中鉴定出几个突变体。许多试验形式中的限制因素是文库细胞(或病毒)生长的均一性。这种差异是后续试验中基线差异的来源。接种物体积和培养环境(温度/湿度)是细胞生长差异的来源。在建立初始培养物以及新式的控温和控湿培养箱的所有方面实行自动化可减少差异。
一方面，在固体培养基上分离文库成员(如细胞、病毒噬斑、孢子等)，以产生单个菌落(或噬斑)。用自动挑菌器(如Q-bot,Genetix,UK.)，鉴定并挑选菌落，将10000个不同的突变体接种到每孔含有两个3毫米玻璃球的96孔微量滴定平皿内。Q-bot并不是挑取整个菌落，而是将针尖插入通过菌落中央，离开使携带了少量细胞(或菌丝)和孢子(或在噬斑应用中为病毒)样品。针在菌落中的时间，接种到培养基中的浸入次数，以及针尖在该培养基中的时间均对接种物体积有影响，而且均能加以控制和优化。Q-bot的均一过程减少手工操作的误差，提高了建立培养物的速度(4小时约10000个)。然后在控温控湿的培养箱中振摇这些培养物。微量滴定板中的玻璃球作用是促进细胞均匀通气以及菌丝体片段均匀分散，类似于发酵罐搅拌桨。
从复杂的生物学基质检测分析物分子的高产方法是如Sun Ai Raillard 1999年2月11日提交的USSN 60/119,766“高通量质谱法”中描述的电喷射串联质谱法。在′766申请中，利用离线平行样品纯化和快速注射流体分析的方法通常将分析时间减少至每份样品30-40秒。
通常，从细胞挑取、细胞生长、样品制备和分析开始的所有步骤均是自动化的，可由不同的机器人工作站过夜进行。也已开发出许多熟知的机器人系统用于试验系统的液相化学。这些系统包括自动化工作站，如Takeda ChemicalIndustries,LTD(Osaka,Japan)开发的自动化合成装置，以及利用机器臂的许多机器人系统(Zymate Ⅱ,ZymarkCorporation,Hopkinton,Mass.；Orca,Hewlett-Packard,Palo Alto,Calif.)，这些系统模拟了科学家进行的手工合成操作。上述任一装置均适用于本发明，例如对本文描述的各种寡核苷酸系列装配成的分子进行高通量筛选。对这些装置的性能和操作进行改进(如果有的话)以使它们能如本文所讨论的集成系统那样进行工作，这些改进对于相关技术领域的技术人员来说是显然懂得的。
高通量筛选系统是市售的(例如参见，Zymark Corp.,Hopkinton,MA；Air TechnicalIndustries,Mentor,OH；BeckmanInstruments,Inc.Fullerton,CA；Precision Systems,Inc.,Natick,MA等)。这些系统的整个程序通常是自动化的，包括所有样品和试剂的移液，液体分散、定时培育以及最后在适合该试验的检测仪中读取微量板的读数。这些可设置的系统提供了高通量和迅速启动，以及高度的灵活性和用户化。这些系统的生产商提供了关于各种高通量的详细方法。因此，例如，Zymark Corp.提供的技术公报描述了用于检测基因转录、配体结合等调节的筛选系统。各种市售的外围设备和软件可用PC(Intel X86或奔腾芯片兼容的DOSTM、OS2TM WINDOWSTM、WINDOWSNTTM或WINDOWS95-98TM为平台的机器)、MACINTOSHTM、LINUX或UNIX为系统(如SUNTM工作站)计算机来使数据数字化、储藏和分析数据。
本发明中试验分析所用的集成系统通常包括例如带有高通量液体控制软件、数据数字化软件、数据解读软件的数字计算机，与数字计算机操作性相连的用于将溶液从源头转移至目的地的液体控制机器转子、用于向数字计算机输入数据以控制液体控制机器转子高通量液体转移的输入装置(如计算机键盘)、用于将试验组分的信号数字化的图象扫描仪等。
当然，这些试验系统还可包括用于筛选的核酸选择元件(如计算机、具有感兴趣核酸序列的数据库、序列对比软件等)的集成系统。另外，该软件包括的元件可用来命令所选寡核苷酸(如用于害虫抗性基因寡核苷酸介导的改组)，和/或指导操作性相连的寡核苷酸合成仪合成寡核苷酸或基因。因此，本发明的集成系统元件任选地包括上述任一组件来促进高通量重组和选择。应当理解，这些高通量重组元件可以在与进行选择试验的系统分开的系统中，或两个系统可以集成在一起。
在本发明的高通量试验中，可以在一天内筛选数千个不同的改组变体。特别是，微量滴定板的每个孔可用来进行一个分开的试验，或如果要观察浓度或培育时间的影响，每5-10个孔可测试一个变体。因此，一个标准的微量滴定板可测试约100(例如96)个反应。如果用1536个孔板，则一个板可测定约100至1500个不同的反应。每天可以测定数个不同的板；用本发明的集成系统可以试验筛选高达约6000-20000个不同的试验(即涉及不同的核酸、编码蛋白、浓度等)。例如CaliperTechnologies(Mountain View,CA)最近已开发出试剂操作的微流体方法。
                            实施例
提供下列实施例的目的仅仅是为了描述，而不是限制或限定本发明。
实施例1：用DNA改组优化CRYl毒素
用包括其自身启动子(5′区到-260核苷酸)的cry1C基因作为DNA改组的底物。DNA改组后，将蛋白质编码区克隆到表达载体内，转化大肠杆菌细胞。在细菌培养基(营养型肉汤)中30℃培育转化细胞72小时，随后细胞形成由Cry1C蛋白组成的包涵体。然后离心或过滤收获细胞，用溶菌酶裂解，释放游离的包涵体。或者，可通过洗涤剂处理、超声处理或本领域技术人员已知的其它方法来实现裂解。离心或过滤收集包涵体，然后接触含有或不含二硫键还原剂(如2-巯基乙醇)的碱溶液(pH10.5)。然后用胰蛋白酶活化溶于碱溶液中的Cry 1C蛋白。胰蛋白酶将Cry 1C蛋白消化至66kDa的核心。用DEAE离子交换树脂纯化该胰蛋白酶消化得到的核心，该核心是Cry1型Bt杀虫蛋白(如Cry1C)的活性形式。将激活的Cry1C蛋白吸附到DEAE离子交换柱(pH10.5)上，然后用盐(如氯化钠或乙酸铵)洗脱。特别希望采用乙酸铵，因为它能在随后的浓缩过程中蒸发。然后在真空下通过冻干或蒸发来浓缩激活的蛋白，并用于筛选。上述所有蛋白分离过程是在96孔板中以利用机器人的高通量形式来进行的。对设计用于DNA/RNA分离的机器人进行改进用于此目的。
用与cry 1C同源的其它cry基因对cry1C基因进行改组。为了获得同源基因，根据含有核糖体结合位点以及胰蛋白酶激活位点的Cry1C5′区(Cry1C蛋白编码区内的约1800个核苷酸)合成两个寡核苷酸引物。用这些引物从苏云金芽孢杆菌分离物中扩增以前未知的cry基因的毒性部分。通常，苏云金芽孢杆菌含有多个cry基因(多达7个或更多)，这些基因通常与cry1C在序列上合理地相似。从一个苏云金芽孢杆菌分离物中扩增得到四个cry基因。将扩增的克隆克隆到大肠杆菌中，用限制性图测试所选克隆的序列差异。酶切作图采用具有4bp识别序列的限制酶(如Sau3A)。选出具有与cry1C相似但本质上不同的限制性图谱的那些克隆的基因，与cry1C改组。或者，如Kalman等人(1983)Appl.Environ.Microbiol.59:1131-1137中所述的那样，用多引物PCR分析来分析克隆的cry基因的多样性。
DNA改组后，宿主细胞(大肠杆菌或芽胞杆菌)有时不能产生全长Cry蛋白。这是因为不希望的突变使得Cry蛋白甚至在大肠杆菌细胞中不稳定。Cry蛋白的不稳定突变体通常在昆虫中没有活性，因为昆虫能将蛋白消化成无活性的片段。因此，需要预先选出那些不稳定的突变体。为了找出那些不能产生Cry蛋白的突变体，进行免疫试验(例如ELISA)。采用针对Cry蛋白C端部分制得的抗血清。当Cry蛋白没有形成全长稳定的蛋白质(即，135kDa)时，则针对Cry蛋白C端的抗血清不能与之反应。针对C端部分的抗血清可通过用C端缺失的截短型Cry蛋白吸附针对全长Cry蛋白的抗血清来制得。或者，可用常用的标记(如组氨酸残基)给C端加尾。另一种分析方法包括对Cry蛋白突变体进行SDS-PAGE。
实施例2：日本甲虫芽孢杆菌的杀虫毒素基因的改组
已知日本甲虫芽孢杆菌是金龟子甲虫(如日本甲虫)的病原体，它产生称为Cry18Aa的杀虫蛋白(Zhang等人(1997)J.Bacteriol.179:4336-4341)。然而，该蛋白的杀虫活性并不高得足以大规模地用于防止甲虫侵袭引起的作物损害。本实施例描述了通过对日本甲虫芽孢杆菌的cry18Aa基因和其苏云金芽孢杆菌同源基因cry2进行改组来优化Cry18Aa。
用两个引物从日本甲虫芽孢杆菌通过聚合酶链反应(PCR)扩增得到cry18Aa基因，这两个引物根据出版的序列(GenBank登录号：X99049)来设计。正向引物(5′-gaaggaggctattggCCatgGac-3’)根据的是核糖体结合位点以及翻译起始信号周围的序列。如大写字母所示修改该序列，从而在翻译起始位点引入NcoⅠ位点。反义引物(5′-ATATGGATCCTTAGTGATGGTGATGGTGATGataaagaggagtgtcatctgc-3′)根据的是翻译终止周围的序列。该引物包括cry18Aa蛋白编码区末端的BamHⅠ限制位点和6个组成型组氨酸残基的编码序列(大写字母)。该His尾序列后来用于纯化蛋白质含有改组基因的大肠杆菌细胞所产生的。如下文cry2基因中所述，用标准的PCR方法从裂解的日本甲虫芽孢杆菌细胞进行扩增。
通过克隆的cry18Aa基因和其同源基因之间的DNA改组，产生数个不同的基因文库。已知苏云金芽孢杆菌的cry2基因与日本甲虫芽孢杆菌的cry18Aa基因同源。用PCR从数个苏云金芽孢杆菌菌株(如Bt库尔斯塔克亚种HD1菌株)扩增已知的cry2基因。在PCR管中100℃裂解苏云金芽孢杆菌细胞，用作模板。用标准的PCR程序和根据出版的cry2A序列(例如GenBank登录号：N31738,M23724,X57252等)设计的合适引物PCR扩增cry2基因。克隆与cry18Aa同源的其它基因，并用cry18Aa改组。用克隆的cry18Aa基因通过Southern杂交筛选数个苏云金芽孢杆菌和日本甲虫芽孢杆菌菌株的基因组文库。为了制得基因组文库，用Sau3A部分消化苏云金芽孢杆菌和日本甲虫芽孢杆菌的DNA，产生1-10kb的片段。用凝胶电泳分离约4kb(3-5kb的范围)的片段，克隆到pBluescript(Stratagene)中。从各种日本甲虫芽孢杆菌分离物和苏云金芽孢杆菌菌株(如Bt库尔斯塔克亚种，Bt肯尼亚亚种和Bt多窝亚种)克隆出数个cry18Aa-同源基因。
如Sasaki等人((1996)Curr.Microbiol.31,195-200)所述的那样，用PCR扩增改组基因的蛋白编码区，并克隆到表达载体中。为了在大肠杆菌中高表达，如Sasaki等人所述的那样，从原始的载体中取出ApaⅠ和NdeⅠ位点之间的一部分cry启动子，并用含有改组基因的载体转化大肠杆菌和cry-苏云金芽孢杆菌。用抗-6X-His抗血清进行免疫试验，以筛选产生杀虫蛋白的转化体，留下阳性克隆用于下述筛选。
当改组的cry基因在大肠杆菌中表达后，细胞通常以包涵体形式产生毒素多肽。按照生产商说明书，用诸如B-PER细菌蛋白抽提试剂(Pierce)的洗涤剂解散大肠杆菌细胞，释放出包涵体。过滤除去洗涤剂，将包涵体溶于0.02N NaOH。用100mMTris-HCl(pH8)中和溶液pH后，在96孔过滤板中用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)纯化改组基因编码的杀虫蛋白。用足量的大肠杆菌细胞产生一定量的杀虫蛋白，不论表达水平如何，该量始终超过Ni-NTA琼脂糖的容量。这样从每个96孔获得大致等量的该蛋白。
将改组基因产生的蛋白置于昆虫食物内，使其被黄瓜甲虫食用。观察死亡率以评价每份蛋白样品的活性水平。为了提高筛选效率，合并10份蛋白样品测试活性。将每一试验的蛋白用量减少至亚致死量，该剂量用野生型Cry18Aa蛋白来确定。将显示出一定昆虫死亡率的合并样品分成10个单独的组分，以指出导致该死亡率的一份或数份样品。选出阳性样品用于第二轮改组。
进行数轮改组，从而大大提高了日本甲虫芽孢杆菌Cry18Aa杀虫蛋白的效力。
实施例3：从编码杀虫蛋白的昆虫病原体克隆以前未知的基因
从数种昆虫病原体(如绿脓杆菌和嗜虫沙雷菌)制备基因组DNA。用包括NotⅠ、BamHⅠ和SphⅠ的数种酶消化DNA样品。根据大小对这些酶产生的片段分级，并根据大小克隆到粘粒载体(如Supercos(Stratagene))或λ载体(如λZAP(Stratagene))中。然后用西红柿角虫和黄瓜甲虫来筛选含有昆虫病原体DNA的大肠杆菌文库的杀虫活性。在LB肉汤中30℃培养大肠杆菌细胞48小时，并离心收获。将沉淀的细胞重悬于最少量的水中并置于昆虫食物上。使昆虫食用该食物3天。鉴定出显示出杀虫活性的数个粘粒克隆，并分离DNA。
用Sau3A部分消化具有杀虫活性的那些细胞的粘粒DNA，获得约4kb的片段。用Klenow末端修复这些片段并克隆到pBluescript(Stratagene)的SmaⅠ位点内。在从一个昆虫病原体中筛选出约4000pBlueseript的亚克隆后，通常获得显示出杀虫活性的数个克隆。用这些阳性克隆作为探针，通过Southern杂交来筛选寻找同一属中的同源性杀虫基因。
将假单胞菌和沙雷菌的显示出杀虫活性的同源基因合并成两组，并如本发明所述那样改组以获得更高的活性。将改组的基因克隆到大肠杆菌中，并如实施例中日本甲虫芽孢杆菌Cry18Aa所述的那样，选出更高的杀虫活性。
实施例4：DNA改组获得对玉米根虫活性改善的毒素
本实施例描述了对同源基因家族进行改组以获得对玉米根虫活性有所改进的毒素的方法。改组得到数组Bt cry基因。据说有许多Bt Cry蛋白对甲虫有活性(例如cry3Ba,cry3Bb,cry3Aa,cry3Ca,cry1Ia,cry1Ib,cry1Bc,cry1Bb,cry1Ba,cry1Ka,cry7Aa,cry7Ab,cry8Aa,cry8Ba,cry8Ca,cry9Da,cry2Aa,cry2Ab,cry18Aa和cry14Aa)。不幸的是，已知这些基因编码的毒素对玉米根虫没有活性或活性很弱，因此表明它们是DNA改组的良好候选物。在比较它们的序列，我们发现它们可通过序列同源性分成4个家族。家族1包括cry3Ba、cry3Bb、cry3Aa和cry3Ca；家族2包括cry1Ia,cry1Ib,cry1Bc,cry1Bb,cry1Ba和cry1Ka；家族3包括cry7Aa,cry7Ab,cry8Aa,cry8Ba,cry8Ca和cry9Da；和家族4包括cry2Aa,cry 2Ab,cry18Aa和cry14Aa。这些基因可通过PCR从合适的Bt菌株扩增得到。或者，可通过Southern印迹用根据这些公开序列的任一序列合成的DNA探针筛选Bt分离物来克隆出未公开的新基因。
对每个家族分别改组。由于它们对甲虫均有活性，而一些(例如cry3Bb)对玉米根虫有活性，因此可鉴定出编码对玉米根虫活性有所改善的毒素的改组基因。改组、基因表达和蛋白质分离以及筛选基本上按照本文所述的方法进行。
实施例5：对线虫活性有所改善的毒素
在本实施例中，改组一系列cry基因以获得编码对线虫活性有所改善的毒素的基因。改组的基因包括Bt cry5Aa,cry5Ab,cry5Ac,cry6Aa,cry6Ba,cry12Aa,cry13Aa和cry21Aa。可以如上所述对它们进行分组和改组。测试改组基因编码的毒素对靶线虫的活性。
实施例6：利用线虫将优化基因导入害虫
本实施例描述了一种用线虫将改组基因导入昆虫的方法。对Bt的Cyt基因改组以获得更佳的溶细胞活性。已知Bt的Cyt蛋白识别昆虫细胞上的特异性磷脂，并将该分子插入细胞膜以破坏膜的功能。其作用方式与Cry蛋白以及Bt有很大不同。cyt基因家族中有数个类似物(例如cyt1Aa,cyt1Ab,cyt1Ba,cyt2Aa,cyt2Ba和cyt2Bb)。用本文所述的PCR技术，从合适的Bt宿主中克隆得到这些基因中的一些(包括cyt1Aa,cyt1Ba和cyt2Ba)。混合克隆的基因并改组。如Sasaki等人((1996)Curr.Microbiol.31:195-200)所述的那样，将改组基因克隆到芽孢杆菌表达载体中，并用来转化cyr阴性Bt菌株。用Sf9细胞测试Bt中表达的cyt蛋白的细胞毒性。
可将表现出细胞毒性改善的那些克隆导入发光致病杆菌(杀虫性线虫的共生菌）。用根据载体部分制得的引物从显示出细胞毒性有所改善的Bt克隆中扩增Cyt基因，用一个或多个合适的限制酶切割扩增的基因，以释放编码区域和侧接区域部分。将该片段以及与Bt(苏云金芽孢杆菌)以色列亚种中的cyt1A相连的20kDa蛋白基因一起克隆到pTZ19R中，并用来转化发光致病杆菌。该20kDa蛋白保留了宿主细胞的活力，并促进改组Cyt基因的表达(Wu等人(1993)J.Bacteriol.175:5276-5280)。使重组的发光致病杆菌与线虫Steinernema glaseri共培育。在对金龟子甲虫进行测试时，发现携带重组发光致病杆菌的线虫杀死昆虫所需的剂量比没有重组发光致病杆菌的线虫低得多。
实施例7：蛋白酶抑制剂基因的优化
用报道的DNA序列(GenBank:D38130)从玉米c-DNA PCR扩增得到半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因。在水稻、高粱、豇豆、大豆、卷心菜、土豆等中找到了许多同源基因。合成编码水稻、大豆和卷心菜半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因一部分(25-100aa)的DNA。使这些合成的基因与玉米抑制剂基因混合并改组。然后将改组的基因克隆到大肠杆菌表达系统(pQE-60，购自Qiagen)中。然后表达改组基因，在96孔板中用Ni-NTA琼脂糖纯化蛋白质。然后用从白色蛴螬制得的半胱氨酸蛋白酶粗制物测试纯化蛋白的蛋白酶活性。在田间收集活跃进食的白色蛴螬，并匀浆。离心除去细胞碎片后，不作进一步纯化，用上清液作为蛋白酶制备物。使蛴螬蛋白酶制备物与改组的抑制剂混合并培育20分钟。用购自Molecular Probe的Enzchek通过荧光试验来测定蛋白酶活性。Enzchek采用荧光染料标记的蛋白质，其中染料分子的排列方式使得荧光被淬灭。当蛋白酶消化该蛋白时，染料开始显出荧光。用蛋白酶试验鉴定出大量有活性的改组的抑制剂克隆。用本发明所述的发根土壤杆菌方法筛选那些活性克隆的杀虫活性。
实施例8：细胞毒性试验
包括本发明所述那些蛋白在内的杀虫蛋白通常有细胞毒性。例如，已知Bt Cry和Cyt蛋白在适当地激活后能杀死培养的昆虫细胞。在下面的实施例中，我们描述了用来筛选改组杀虫基因产物的方法。
当被杀虫蛋白破坏后，昆虫细胞释放出大量的ATP酶。上清液中的ATP酶活性可用作杀虫蛋白细胞毒性的指示剂。如上所述，用Ni-NTA琼脂糖纯化已有6X-His标记尾的改组的Bt Cry蛋白。然后用1/100体积(w/w)胰蛋白酶消化纯化的蛋白质30分钟，以激活此蛋白质。采用几种鳞翅目昆虫细胞系，如Sf9和TN368(粉纹夜蛾)。使胰蛋白酶激活的Cry蛋白以0.1至1ppm与96孔板中的细胞混合，并培育60分钟。培育后，过滤除去细胞，用萤光素酶-萤光素试验(Sigma)测定ATP酶活性。与其它方法如染料排斥试验(其中用诸如台盼蓝染料染色来确定细胞死亡)相比，该ATP酶方法更为灵敏。死细胞会被台盼蓝染色，而活细胞不会。
实施例9：改组BT CRY基因
为了增加改组基因文库的多样性，用合成寡核苷酸改组来改组Bt cry基因(称为原代基因)(见Crameri等人＂寡核苷酸介导的核酸重组＂1999年2月5日提交，USSN60/118,813)。简言之，首先用可获得的计算机软件对一个同源昆虫抗性核酸序列的家族作序列对比，以选出相同/相似的区域以及差异的区域。合成对应于至少一个差异区域的多个(例如2、5、10、20、50、75或100或更多)寡核苷酸。这些寡核苷酸可以直接改组得到，或可用核酸家族的一个或多个来重组得到。
寡核苷酸序列可以从称为二级基因的其它基因得到。二级基因与原代基因有一定程度的同源性。选择用于寡核苷酸合成的二级基因的诸部分有几种方法。例如，可以随机选择二级基因的诸部分。DNA改组方法将选出能掺入改组基因的那些寡核苷酸。所选部分可以是任何长度，只要它们适合合成。寡核苷酸还可根据原代基因与二级基因之间的同源性来设计。改组期间在DNA片段之间发生交换必需有一定程度的同源性。同时，改组基因文库的多样性也希望有高的不均一性。另外，根据对蛋白质序列与功能关系的知识，可以选出二级基因的特异性部分用于寡核苷酸合成。许多报道(广泛引用的综述文章“苏云金芽孢杆菌及其杀虫晶体蛋白”，Schnepf,E.等人，1998,Microbiology and Molecular Biology Reviews,62卷，775页)指出，“结构域Ⅱ”(通常是完全激活的Bt晶体蛋白的中间部分)对于Bt活性很重要。
就Cry1A型蛋白而言，结构域Ⅱ从约第200个氨基酸残基处开始，在约第410个残基处结束。发现该结构域对Bt毒素的昆虫特异性很重要。在本发明用DNA改组技术修饰了其昆虫特异性后，可以选择二级基因核苷酸序列的结构域Ⅱ部分作为合成用于寡核苷酸改组程序的寡核苷酸的靶区域。
结构域Ⅰ，是完全激活的Bt晶体蛋白中毗邻结构域Ⅱ的N端部分，参与了Cry的跨膜功能(见Schnepf等人)。由于Bt晶体蛋白的杀昆虫活性至少部分取决于该功能，因此可以选择二级基因的结构域Ⅰ部分用于寡核苷酸改组来增强杀昆虫活性。结构域Ⅲ，是完全激活的Bt晶体蛋白中结构域Ⅱ之后的C端部分，也可选择用于寡核苷酸合成。该结构域有时参与昆虫的特异性(见Schnepf等人)。
一方面，用根据二级cry2Ac基因序列合成的数个寡核苷酸来改组原代cry2Aa和cry2Ab基因。Cry2Aa和Cry2Ab高度同源，但是ery2Ae与这些基因却有很大的不同(例如见图3)。因此，理想的是改组cry2Ac和cry2Aa以及cry2Ab，以增加所得改组重组核酸的多样性。选出与cry2Aa和cry2Ab的对应部分有很大不同的cry2Ac序列诸部分，合成覆盖这些部分的一系列50聚寡核苷酸。用ery2Aa和cry2Ab的蛋白编码区改组这些寡核苷酸。当从改组基因文库选出一定数量的克隆并通过限制性酶切作图检查多样性时，观察到有良好的多样性。该多样性多于通常单用cry2Aa和cry2Ab改组所预计的多样性。
另外，可通过PCR扩增获得一部分二级基因。PCR扩增的DNA可用原代基因来改组。上述针对寡核苷酸的选择标准可应用于PCR扩增。待扩增的部分可以随机选择。或者，可以根据序列同源性和异质性来进行选择。另外，可根据序列和功能关系来选择。PCR扩增的部分可以是结构域Ⅰ(用来获得更高的杀虫活性)或结构域Ⅱ/Ⅲ(用来获得不同的昆虫特异性)。象合成的寡核苷酸一样，二级基因的PCR扩增部分可用原代基因改组。
实施例10：杀虫活性的高通量筛选
本实施例提供了一种获得新的杀虫基因和蛋白的高通量方法例子。首先，重组获得所选的核酸(如Bt基因或基因片段)。将所得重组核酸转化入以活性蛋白形式表达重组核酸的苏云金芽孢杆菌菌株。如上所述用Q-bot挑取菌落。任选地，使转化细胞的合并物在每个孔中生长，以增加在首轮筛选中被筛选的菌落数。例如，在10000孔中每个孔内筛选100个菌落提供了106个菌落的筛选量。
在标准的96(或更多)孔形式的板中诱导孢子形成。在每个孔内加入数个幼虫。用透气膜覆盖平板，以使幼虫留在所放置的孔内。给幼虫进食，直至它们接受致死剂量的表达杀虫蛋白的孢子。将幼虫移至培育室内，使其长大成昆虫。用化学引诱物或化学排斥物迫使成熟昆虫飞离。收获所有死幼虫。幼虫含有杀虫孢子(在这一阶段通常有一些因实验操作而非杀虫蛋白引起幼虫死亡的假阳性结果)。从幼虫回收DNA，通过PCR回收改组基因。重新克隆这些基因并重复该过程(例如通过有限稀释不同阳性克隆)来进一步使杀虫蛋白更丰富。构建该杀虫活性丰富的这些基因的文库。该文库可用本文讨论的任何技术来筛选、改组或操作。
因此，本实施例利用了编码改组Bt基因的孢子团杀死幼虫的能力。富集的根据是将死亡的幼虫与摄入无毒的改组Bt毒素的幼虫分开。回收Bt基因，重复该过程。
在有关的方面，可用改组基因感染细菌或真菌并用例如FACS从死亡细胞中分离出活细胞来使该试验适用于杀细菌或杀真菌蛋白。
在不背离权利要求所要求的本发明精神或范围内，对可上述方法和材料作改进，本发明可用于不同的用途，它们包括：
集成系统测试改组DNA的昆虫抗性的用途，包括一个重复的过程。该集成系统典型地包括如上所述用于评价昆虫抗性或毒性试验的计算机，带有指导流体和细胞操作的软件。
利用上述选择策略、材料、组分、方法或底物任一项的试验、试剂盒或系统。试剂盒任选地还可包含实施所述方法或试验的说明书，包装材料，含有试验、装置或系统组件等的一个或多个容器。
另一方面，本发明提供了包含本文方法和装置的试剂盒。本发明的试剂盒任选地含有一种或多种以下物质：(1)本文所述的改组组分；(2)实施本文所述方法和/或进行本文的选择程序的说明书；(3)一种或多种昆虫抗性或毒性试验组分；(4)盛放杀虫蛋白、核酸、植物、昆虫、细胞等的容器；(5)包装材料。
另一方面，本发明提供了本文的任一组分或试剂盒用于实施本文任一方法或试验的用途和/或任一装置、组合物、文库或试剂盒用于实施本文任一试验或方法的用途。
尽管出于清楚和明了的目的已经描述前述发明的一些细节，但本领域技术人员在阅读了本文公开的内容后显然能作出不脱离本发明真实范围的形式上和细节上的各种变动。例如，上述所有技术和材料可以各种组合方式使用。本申请中引用的所有出版物和专利文献均出于所有目的全部纳入本文作参考，正如每份出版物或专利文献单独表示出的那样。

Claims (33)

1．一种获得优化的重组害虫抗性基因的方法，该方法能赋予表达该基因的植物对抗害虫的抗性，该方法包括：
(1)重组多种形式的核酸，这些核酸含有衍生自能赋予植物对害虫抗性的基因的片段，其中多种形式的核酸相互之间有两个或多个核苷酸不同，从而产生重组害虫抗性基因的文库；和
(2)筛选该文库，鉴定出至少一种与非重组害虫抗性基因相比表现出抗害虫能力有所改进的优化的重组害虫抗性基因。
2．根据权利要求1所述的方法，其中该方法还包括：
(3)将至少一种优化的重组害虫抗性基因与另一种形式的害虫抗性基因重组，后者与(1)中多种核酸形式中的一种或多种相同或不同，从而产生重组害虫抗性基因的进一步文库；
(4)筛选该进一步的文库，鉴定出至少一种与非重组害虫抗性基因相比表现出抗害虫能力进一步改善的进一步优化的重组害虫抗性基因；和
(5)按需重复(3)和(4)，直至与非重组害虫抗性基因相比，进一步优化的重组载体组件表现出抗害虫能力有进一步改善。
3．根据权利要求1所述的方法，其中抗害虫能力的改善包括抵御害虫的效力增强。
4．根据权利要求1所述的方法，其中多种形式的核酸包含衍生自或对应于下列一种或多种核酸的一种或多种：cry1Aa,cry1Ab,cry1Ac,cry1Ad,cry1Ae,cry1Af,cry1Ag,cry1Ba,cry1Bb,cry1Bc,cry1Bd,cry1Ca,cry1Cb,cry1Da,cry1Db,cry1Ea,cry1be,cry1Fa,cry1Fb,cry1Ga,cry1Gb,cry1Ha,cry1Hb,cry1Ia,cry1Ib,cry1Ic,cry1Ja,cry1Jb,cry1Ka,cry1Jc,cry2Aa,cry2Ab,cry2Ac,cry3Aa,cry3Ba,cry3Bb,cry3Ca,cry4Aa,cry4Ba,cry5Aa,cry5Ab,cry5Ac,cry5Ba,cry6Aa,cry6Ba,cry7Aa,cry7Ab,cry8Aa,cry8Ba,cry8Ca,cry9Aa,cry9Ba,cry9Ca,cry9Da,cry9Ea,cry10Aa,cry11Aa,cry11Ba,cry11bb,cry12Aa,cry13Aa,cry14Aa,cry15Aa,cry16Aa,cry17Aa,cry18Aa,cry19Aa,cry20Aa,cry21Aa,cry22Aa,cry23Aa,cry24Aa,cry25Aa,cry26Aa,cry27Aa,cry28Aa,cyt1Aa,cyt1Ab,cyt1Ba,cyt2Aa,cyt2Ba,cyt2Bb.
5．根据权利要求1所述的方法，其中核酸包含选自下列的一种或多种核酸：cry1Aa1,cry1Aa2,cry1Aa3,cry1Aa4,cry1Aa5,cry1Aa6,cry1Ab1,cry1Ab2,cry1Ab3,cry1Ab4,cry1Ab5,cry1Ab6,cry1Ab7,cry1Ab8,cry1Ab9,cry1Ab10,cry1Ac1,cry1Ac2,cry1Ac3,cry1Ac4,cry1Ac5,cry1Ac6,cry1Ac7,cry1Ac8,cry1Ac9,cry1Ac10,cry1Ad1,cry1Ae1,cry1Af1,cry1Ba1,cry1Ba2,cry1Bb1,cry1Bc1,cry1Bd1,cry1Ca1,cry1Ca2,cry1Ca3,cry1Ca4,cry1Ca5,cry1Ca6,cry1Ca7,cry1Cb1,cry1Da1,cry1Db1,cry1Ea1,cry1Ea2,cry1Ea3,cry1Ea4,cry1Eb1,cry1Fa1,cry1Fa2,cry1Fb1,cry1Fb2,cry1Ga1,cry1Ga2,cry1Gb1,cry1Ha1,cry1Hb1,cry1Ia1,cry1Ia2,cry1Ia3,cry1Ia4,cry1Ia5,cry1Ib1,cry1Ic1,cry1Ja1,cry1Jb1,cry1Ka1,cry2Aa1,cry2Aa2,cry2Aa3,cry2Aa4,cry2Ab1,cry2Ab2,cry2Ac1,cry3Aa1,cry3Aa2,cry3Aa3,cry3Aa4,cry3Aa5,cry3Aa6,cry3Ba1,cry3Ba2,cry3Bb1,cry3Bb2,cry3Ca1,cry4Aa1,cry4Aa2,cry4Ba1,cry4Ba2,cry4Ba3,cry4Ba4,cry5Aa1,cry5Ab1,cry5Ac1,cry5Ba1,cry6Aa1,cry6Ba1,cry7Aa1,cry7Ab1,cry7Ab2,cry8Aa1,cry8Ba1,cry8Ca1,cry9Aa1,cry9Aa2,cry9Ba1,cry9Ca1,cry9Da1,cry9Da2,cry9Ea1,cry10Aa1,cry11Aa1,cry11Aa2,cry11Ba1,cry11Bb1,cry11Bb1,cry12Aa1,cry13Aa1,cry14Aa1,cry15Aa1,cry16Aa1,cry17Aa1,cry18Aa1,cry19Aa1,Cry19Ba1, cry20Aa1,cry21Aa1,cry22Aa1,cry24Aa1,cry25Aa1,cry26Aa1,cry28Aa1,cyt1Aa1,cyt1Aa2,cyt1Aa3,cyt1Aa4,cyt1Ab1,cyt1Ba1,cyt2Aa1,cyt2Ba1,cyt2Ba2,cyt2Ba3,cyt2Ba4,cyt2Ba5,cyt2Ba6,cyt2Bb1,40kDa,cryC35,cryTDK,cryC53,vip1A,vip2A,vip3A(a),vip3A(b),和p21med.
6．根据权利要求1所述的方法，其中所述抗害虫能力的改善包括对害虫抗性基因敏感的害虫范围的增加。
7．根据权利要求1所述的方法，其中抗害虫能力的改善包括害虫群体对害虫抗性基因产生抗性的能力减小。
8．根据权利要求1所述的方法，其中抗害虫能力的改善包括害虫抗性基因编码的多肽的表达水平提高。
9．根据权利要求8所述的方法，其中优化的重组害虫抗性基因包含比害虫抗性基因的天然存在形式的G-C含量有所增加。
10．根据权利要求1所述的方法，其中抗害虫能力的改善包括害虫抗性基因编码的多肽对蛋白酶切割或高或低pH水平的敏感性降低。
11．根据权利要求1所述的方法，其中抗害虫能力的改善包括害虫抗性基因编码的多肽对宿主植物的毒性降低。
12．根据权利要求1所述的方法，其中害虫选自线虫、病毒和细菌。
13．根据权利要求1所述的方法，其中害虫是昆虫。
14．根据权利要求13所述的方法，其中昆虫是幼虫。
15．根据权利要求13所述的方法，其中多种形式的核酸衍生自编码芽孢杆菌毒素的基因。
16．根据权利要求15所述的方法，其中芽孢杆菌是苏云金芽孢杆菌。
17．根据权利要求15所述的方法，其中苏云金芽孢杆菌毒素是δ-内毒素。
18．根据权利要求1所述的方法，其中多种形式的核酸包含衍生自编码蛋白酶抑制剂、多酚氧化酶、杀虫蛋白酶、植物性杀虫蛋白、凝集素或杀虫剂生物合成通道的一种或多种基因的片段。
19．根据权利要求18所述的方法，其中基因编码芽孢杆菌属的植物性杀虫蛋白。
20．根据权利要求19所述的方法，其中芽孢杆菌属选自蜡状芽孢杆菌、日本甲虫芽孢杆菌、球形芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌。
21．根据权利要求18所述的方法，其中害虫抗性基因编码胆固醇氧化酶。
22．一个文库，它含有多个重组的害虫抗性基因，其中每个重组的害虫抗性基因含有能赋予植物害虫抗性的基因片段的不同交换。
23．根据权利要求22所述的文库，其中该文库含有多个重组害虫抗性基因，经筛选的这些基因与非重组害虫抗性基相比能赋予植物改进的抗害虫抵抗能力。
24．根据权利要求23所述的文库，其中该文库是噬菌体展示文库。
25．根据权利要求24所述的文库，其中通过鉴定含有重组害虫抗性基因的文库成员来进行筛选，其中该基因编码的多肽与多肽受体的结合有所增强。
26．根据权利要求24所述的文库，其中通过鉴定含有重组害虫抗性基因的文库成员来进行筛选，其中该基因编码的多肽与昆虫中肠的结合有所增强。
27．根据权利要求26所述的文库，其中中肠被倒置。
28．根据权利要求24所述的文库，其中如下进行筛选：使昆虫消耗噬菌体，用能与含有重组害虫抗性基因表达载体杂交的一对寡核苷酸作为引物，扩增从死亡昆虫获得的DNA。
29．根据权利要求23所述的文库，其中筛选文库是通过使昆虫细胞与文库成员接触并鉴定对昆虫细胞有毒性的那些文库成员。
30．根据权利要求22所述的文库，其中文库用下述方法制得，该方法包括：
(1)重组多种形式的衍生自能赋予植物对害虫抗性的基因的核酸，其中多种形式的核酸相互之间有两个或多个核苷酸不同，从而产生重组害虫抗性基因的文库；和
(2)筛选该文库，鉴定至少一种与非重组害虫抗性基因相比表现出抗害虫能力改进的优化的重组害虫抗性基因。
31．一种获得植物害虫的病原体的生物的方法，该方法包括下列步骤：
(1)重组多种形式的衍生自多种生物的分离物的基因组核酸，其中多种形式的基因组核酸相互之间有两个或多个核苷酸不同，从而产生重组基因组的文库；
(2)将基因组文库导入植物害虫内；和
(3)鉴定至少一种与非重组病原体基因组核酸相比表现出致病活性改进的优化的重组基因组。
32．根据权利要求31所述的方法，其中生物是病毒。
33．根据权利要求32所述的方法，其中病毒是杆状病毒，生物是昆虫。
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