CN105349555A - 一种人工合成的Bt抗虫基因FLIa及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种人工合成的Bt抗虫基因FLIa及其制备方法和应用，属于抗虫蛋白及生物安全技术领域。该Bt抗虫基因FLIa的核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ？ID？NO:2所示。该Bt抗虫基因FLIa的制备方法为：将抗虫基因Cry1Ab的Domain？Ⅰ和Domain？Ⅱ与抗虫基因Cry1Ia的Domain？Ⅲ进行交换融合，获得重组抗虫基因MCry1I；在重组抗虫基因MCry1I的基础上，在3’端连入抗虫基因Cry1Ja1的碳末端，得到重组抗虫基因FLMCry1Ia；对重组抗虫基因FLMCry1Ia进行密码子改造，获得Bt抗虫基因FLIa。该Bt抗虫基因FLIa可在转化植物中稳定遗传和表达，且表达量高，所得转基因植物抗虫性好。该基因转化玉米、棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，以减少环境污染和生产成本。

Description

一种人工合成的Bt抗虫基因FLIa及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于抗虫蛋白及生物安全技术领域，具体涉及一种人工合成的Bt抗虫基因FLIa及其制备方法和应用。
背景技术
苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)是一种分布非常广泛的革兰氏阳性菌，属于原核生物(Procaryoticorganism)细菌纲(Bacteria)芽胞杆菌科(Bacillaceae)芽胞杆菌属(Bacillus)。
Bt在芽孢形成过程中产生一种具有高度特异性杀虫活性的伴胞结晶蛋白，称为δ-内毒素或杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalprotein，ICP)。在昆虫幼虫的中肠道内借助于蛋白酶的水解，原毒素转型为多肽分子，活化了的毒素可以与敏感昆虫肠上皮细胞表面的特异性受体相互作用，诱导细胞产生一些孔道，扰乱细胞的渗透平衡，并引起细胞肿胀甚至产生裂解，伴随着上述过程幼虫将停止进食就，最终导致死亡。Bt杀虫蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等多种昆虫具有特异性的杀虫活性。
Bt杀虫晶体蛋白分为Cry类蛋白和Crt类蛋白2大类。将具有溶胞作用的Bt杀虫蛋白归到Cyt类，其余归为Cry类，相应的基因记为Cyt和Cry。彼此之间氨基酸同源性不超过45％的Bt杀虫蛋白命名为不同的第一分类等级，采用阿拉伯数字书写，如Cry1和Cry2；氨基酸同源性在45％～78％之间为第二分类等级，用大写英文字母表示，如Cry1A和Cry1B；氨基酸同源性在78％～95％之间为第三分类等级，用小写英文字母表示，如Cry1Aa和Cry1Ab；氨基酸同源性大于95％为第四分类等级，也是最终等级，用阿拉伯数字书写，如Cry1Aa1和Cry1Aa2。目前，已经报道的Bt已增至476种，其中Cry分为58群、449种，Cyt分为2群、27种。
虫害是造成作物减产、品质下降的重要因素之一，我国每年因虫害造成水稻减产10％、小麦减产20％、玉米减产10％～50％及甘蔗减产5％～20％，故减少虫害造成的损失是增加粮食作物及经济作物产量及品质的重要途径。但是，很多禾本科作物缺乏抗虫种质资源，因此，将外源抗虫基因导入禾本科作物的研究具有更重大的生产意义。
自从转Bt杀虫蛋白基因作物问世以来至上个世纪末，世界范围内相继有二十多个国家和地区开始种植转Bt基因的农作物。而近10年来随着转Bt杀虫基因农作物的不断推出和种植面积的持续上升，除欧洲之外，几乎全球所有的陆地都种植了转Bt杀虫基因农作物。据统计2009年全球的转Bt杀虫基因农作物种植总面积超过了5亿公顷，占全部转基因农作物种植面积的36％。其中2.17亿公顷种植了只含有Bt杀虫基因的转基因农作物，2.87亿公顷种植了转抗除草剂基因和Bt杀虫基因的农作物。美国是转Bt杀虫基因作物种植面积最大的国家，其次是印度、阿根廷、巴西和中国。尽管转BtCry杀虫基因作物对环境的影响在政府和公众之间存在较大的争议，但是Bt杀虫基因农作物产生的巨大生态效益却得到了广泛的认可。通过监测农药环境影响指数发现，1996-2008年种植转基因作物共减少农药使用量35.5万吨(占总农药使用量的8.4％)。仅2008年一年就减少农药使用量3.46万吨(占总农药使用量的9.6％)，在整个生态网络中农药环境影响指数降低了18.2％。
通过转基因技术，可以将抗虫基因导入玉米品种中，进而提高转基因玉米的抗虫性，降低农药的使用量，节省人力、物力及社会资源。因此，应用新的高抗昆虫蛋白、提高杀虫蛋白的表达量以及培育新型转基因抗虫玉米是解决上述问题的最有效途径之一。美国的科学家把Cry基因转入玉米和棉花中，转基因玉米和棉花在美国成功地上市，至今未发现它们对人类有任何负面影响，这种转基因作物对于环境的贡献是巨大的。在中国，也有许多科学家在致力于转Bt基因玉米的研究。中国农业大学的王国英教授研究的转Bt基因玉米已经在国内进行了环境释放。转Bt基因玉米在中国的商业推广将给玉米生产和种植者带来极大的收益。中国自2008年国家启动《转基因生物新品种培育科技重大专项》后，在转基因抗虫玉米品种培育方面虽有些报道，但却没有能够最终商业化，这主要归结于Bt基因的抗虫效果及转化植株的稳定性。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种人工合成的Bt抗虫基因FLIa及其制备方法和应用。
本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：
本发明的一种人工合成的Bt抗虫基因FLIa，该基因的核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:1所示。
本发明还提供一种人工合成的Bt抗虫基因FLIa编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO:2所示。
本发明还提供一种植物表达载体pTF101.1-ubi-FLIa，该载体含有人工合成的Bt抗虫基因FLIa，该载体的核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:3所示。
进一步的，用EcoRI和HindIII酶切植物表达载体pCAMBIA3300，回收酶切位点间的片段ubi-nos，连入植物表达载体pTF101.1的EcoRI和HindIII位点间，构建植物表达载体pTF101.1-ubi；将人工合成的两端带有SmaI和SacI酶切位点的Bt抗虫基因FLIa，连入植物表达载体pTF101.1-ubi的SmaI和SacI位点间，构建抗虫基因FLIa的植物表达载体pTF101.1-ubi-FLIa，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
进一步的，该植物表达载体pTF101.1-ubi-FLIa包括：P35S启动子、TEV增强子、bar基因、大豆贮藏蛋白基因vsp终止子、玉米ubi启动子、FLIa基因和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因nos终止子。
本发明还提供了制备上述人工合成的Bt抗虫基因FLIa的方法，包括以下步骤：
步骤一、将抗虫基因Cry1Ab的DomainⅠ和DomainⅡ与抗虫基因Cry1Ia的DomainⅢ进行交换融合，获得重组抗虫基因MCry1I；
步骤二、在重组抗虫基因MCry1I的基础上，在3’端连入抗虫基因Cry1Ja1的碳末端，得到重组抗虫基因FLMCry1Ia；
步骤三、对重组抗虫基因FLMCry1Ia进行密码子改造，获得Bt抗虫基因FLIa，其核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:1所示。
进一步的，步骤二中，所述重组抗虫基因FLMCry1Ia与Cry基因氨基酸序列最大同源性为88％。
进一步的，步骤三中，对重组抗虫基因FLMCry1Ia进行密码子改造包括：基因编码框优化、消除稀有密码子而利用最佳化密码子、二级结构最小化、调整GC含量。
本发明提供一种提高转基因植物抗虫性的方法，将上述人工合成的Bt抗虫基因FLIa转化植物中，提高转化植物的抗虫性。
本发明提出一种人工合成的Bt抗虫基因FLIa在提高转基因植物抗虫性中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明人工合成的Bt抗虫基因FLIa可在转化植物中稳定遗传和表达，且表达量高，所得转基因植物抗虫性好。
本发明人工合成的Bt抗虫基因FLIa为抗虫性基因的推广及商业化奠定基础。此外，该基因转化玉米、棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低农药的使用量，以减少环境污染和生产成本。
本发明培育出抗虫植物的方法简便而有效，为提高植物抗虫提供了新的有效选择，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。
附图说明
图1为重组抗虫基因FLMCry1Ia的获得过程示意图。
图2为pCAMBIA3300的T-DNA区。
图3为pTF101.1的T-DNA区。
图4为pTF101.1-ubi的T-DNA区。
图5为植物表达载体pTF101.1-ubi-FLIa的图谱。
图6为PCR技术检测外源基因的结果图。图中：M为DL2000Marker；1为阳性对照(质粒)；2为阴性对照(非转基因玉米植株)；3为空白对照(水)；4为转FLIa基因玉米植株。
图7为采用Bt-Cry1Ab/Ac免疫检测试纸条检测FLIa基因的表达情况的检测结果。图中：A为非转基因玉米植株；B为转FLIa基因玉米植株。
图8为转FLIa基因玉米植株拔节期叶片室内抗虫性鉴定结果图。图中：A为非转基因玉米植株；B为转FLIa基因玉米植株。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
本发明的一种人工合成的Bt抗虫基因FLIa，该基因的核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:1所示。
本发明还提供了一种人工合成的Bt抗虫基因FLIa编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO:2所示。
对已经获得的Cry蛋白家族X-ray结构研究结果表明，Cry蛋白家族的三维结构典型特征是含有明显能区分出来的三个Domain，即DomainⅠ、DomainⅡ、DomainⅢ。DomainⅠ由7个α-螺旋构成α-螺旋束，与靶标害虫肠道表皮细胞孔洞形成有关，对DomainⅠ的改造通常会引起毒素活力的降低或维持原活力不变。DomainⅡ由3个β-片层构成，参与靶标昆虫中肠受体特异性结合；DomainⅢ为β-三明治结构，功能与受体识别和维持毒素蛋白结构稳定密切相关。对DomainⅡ、Ⅲ的改造会改变毒素与受体结合的特异性及结合能力，从而引起毒素抗虫活性的改变(升高或降低)以及抗虫谱的变化。
自然界中，由于Bt菌对靶标昆虫具有特异的毒杀作用，导致靶标昆虫为了生存而产生一些突变来抵抗Bt菌的毒杀，最终导致对Bt菌产生抗性。为了适应靶标昆虫的进化，Bt菌体内杀虫蛋白尤其是Cry蛋白家族也在不断发生突变，从而维持对靶标害虫的杀虫活性。通过Cry蛋白家族系统进化分析表明该家族成员的进化主要有两个途径：即三个结构域的独立突变和不同杀虫蛋白之间DomainⅢ的交换(Bravo，1997；deMaagd，etal.，2001)。三个结构域的独立突变主要是不同的结构域内部发生氨基酸突变，不同结构域之间的突变互不影响，该途径突变最终导致新杀虫蛋白不断的产生，是新杀虫蛋白不断的产生地主要途径。DomainⅢ是Cry蛋白与受体蛋白的识别区域，是决定靶标的主要功能区域，不同杀虫谱Cry蛋白之间通过交换DomainⅢ结构域可以增加杀虫蛋白的杀虫谱。天然存在的不同杀虫蛋白之间DomainⅢ的交换，发生交换的杀虫蛋白DomainIII的氨基酸序列具有高度的相似性。此外，据报道通过人工交换不同杀虫蛋白之间DomainⅢ构建的融合Cry蛋白可以提高杀虫蛋白的杀虫效率。通过交换不同杀虫蛋白之间的DomainⅢ可以扩大杀虫谱，将Cry3Aa的DomainⅠ和Ⅱ与Cry1Ab的DomainⅢ融合获得的新蛋白能够对玉米根萤叶甲产生毒杀作用，而Cry3Aa和Cry1Ab对其没有活性。
本发明提供了上述人工合成的Bt抗虫基因FLIa的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将抗虫基因Cry1Ab的DomainⅠ和DomainⅡ与抗虫基因Cry1Ia的DomainⅢ进行交换融合，获得重组抗虫基因MCry1I。
步骤二、在重组抗虫基因MCry1I的基础上，在3’端连入抗虫基因Cry1Ja1的碳末端，得到重组抗虫基因FLMCry1Ia；所述重组抗虫基因FLMCry1Ia与Cry基因氨基酸序列最大同源性为88％。
步骤三、对重组抗虫基因FLMCry1Ia进行密码子改造，获得Bt抗虫基因FLIa，其核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:1所示。对重组抗虫基因FLMCry1Ia进行密码子改造包括：基因编码框优化、消除稀有密码子而利用最佳化密码子、二级结构最小化、调整GC含量。改造后的Bt抗虫基因FLIa与已报道的核苷酸序列最大同源性为77％。
本发明还提供一种植物表达载体pTF101.1-ubi-FLIa，该载体含有人工合成的Bt抗虫基因FLIa，该载体的核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:3所示。
本发明的植物表达载体pTF101.1-ubi-FLIa的构建方法为：用EcoRI和HindIII酶切植物表达载体pCAMBIA3300，回收酶切位点间的片段ubi-nos，连入植物表达载体pTF101.1的EcoRI和HindIII位点间，构建植物表达载体pTF101.1-ubi；将人工合成的两端带有SmaI和SacI酶切位点的Bt抗虫基因FLIa，连入植物表达载体pTF101.1-ubi的SmaI和SacI位点间，构建抗虫基因FLIa的植物表达载体pTF101.1-ubi-FLIa，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
本发明的植物表达载体pTF101.1-ubi-FLIa主要包括：P35S启动子、TEV增强子、bar基因、大豆贮藏蛋白基因vsp终止子、玉米ubi启动子、FLIa基因和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因nos终止子。
本发明提供了一种提高转基因植物抗虫性的方法，将上述人工合成的Bt抗虫基因FLIa转化植物中，提高转化植物的抗虫性。
本发明还提供了一种人工合成的Bt抗虫基因FLIa在提高转基因植物抗虫性中的应用，转化玉米、棉花、水稻、蔬菜等农作物，提高提抗虫性。
实施例1新型抗虫基因FLIa的获得
DomainⅢ是Cry蛋白与受体蛋白的识别区域，是决定靶标的主要功能区域，不同杀虫谱Cry蛋白之间通过交换DomainⅢ结构域可以增加杀虫蛋白的杀虫谱。
如图1所示，本发明将抗虫基因Cry1Ab的DomainⅠ和DomainⅡ与抗虫基因Cry1Ia的DomainⅢ进行交换融合，获得重组抗虫基因MCry1I。为了增加基因表达的稳定性，在重组抗虫基因MCry1I的基础上，在3’端连入了抗虫基因Cry1Ja1的碳末端，得到重组抗虫基因FLMCry1Ia，该重组抗虫基因FLMCry1Ia与已报道的Cry基因氨基酸序列最大同源性为88％。
为进一步提高重组抗虫蛋白的抗虫活力或扩大抗虫谱，按照单子叶植物编码特征对重组抗虫基因FLMCry1Ia进行基因编码框优化、消除稀有密码子而利用最佳化密码子、二级结构最小化、调整GC含量等方法进行密码子改造，最终获得FLIa基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。改造后的新型抗虫基因FLIa与已报道的核苷酸序列最大同源性为77％。
实施例2新型抗虫基因FLIa植物表达载体的构建
如图2所示，用EcoRI和HindIII酶切植物表达载体pCAMBIA3300，回收酶切位点间的片段ubi-nos，连入植物表达载体pTF101.1的EcoRI和HindIII位点间(如图3所示)，构建植物表达载体pTF101.1-ubi(如图4所示)。将人工合成的两端带有SmaI和SacI酶切位点的Bt抗虫基因FLIa，连入植物表达载体pTF101.1-ubi的SmaI和SacI位点间，构建抗虫基因FLIa的植物表达载体(如图5所示)，将该植物表达载体命名为pTF101.1-ubi-FLIa，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
构建好的植物表达载体pTF101.1-ubi-FLIa包括：P35S启动子、TEV增强子、bar基因、大豆贮藏蛋白基因vsp终止子、玉米ubi启动子、FLIa基因和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因nos终止子，具体如表1所示。
表1植物表达载体pTF101.1-ubi-FLIa主要元件信息及功能
实施例3转FLIa基因玉米植株的获得
采用农杆菌介导的玉米遗传转化法，具体步骤如下：
1、含有植物表达载体pTF101.1-ubi-FLIa的农杆菌EHA105在YEP固体培养基上涂布，28℃下暗培养1～3天；将培养好的农杆菌从平板上刮下重悬，调OD550至0.3，制成侵染液。
2、取授粉9～12d的玉米HiⅡ幼穗，剥取幼胚于侵染液中侵染5min；侵染结束后，幼胚盾片朝上接种于共培养基中，20℃暗培养3天，再转至静息培养基中，28℃暗培养7天。
3、将正常发育的幼胚转至含有1.5mg/L双丙氨膦的选择培养基Ⅰ中，28℃暗培养2周；将诱导的初始愈伤组织转至含有3mg/L双丙氨膦的筛选培养基Ⅱ中，28℃暗培养2周，以后每两周更换一次筛选培养基Ⅱ。
4、当筛选得到的抗性愈伤组织增殖至直径2cm左右时，将其转至暗分化培养基中，25℃暗培养2～3周；将分化得到的胚芽鞘转至光分化培养基中，25℃光下培养2周；待胚芽鞘形成完整的茎、叶和根后，将植株转入培养瓶中促根壮苗10天。
5、将植株移栽入营养钵，人工气候室中培养；待植株长出1～2片新叶后移入大花盆，转移至温室。
6、当植株生长至4～6叶期，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，PCR鉴定中所用引物及反应条件如表2所示，植株开花后套袋授粉自交结实；种子播种在大田，植株长至4～6叶期时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因，PCR鉴定中所用引物及反应条件如表2所示。
如图6所示，PCR检测结果表明，FLIa基因已经转移并整合入玉米植物基因组中，由此证明，已经成功获得了转FLIa基因玉米植株。
表2
实施例4检测FLIa基因在转化玉米植物中的表达
采用Bt-Cry1Ab/Ac免疫检测试纸条检测FLIa基因的表达情况，具体步骤如下：
1、取约0.3g新鲜幼嫩叶片(来自实施例3制备的转FLIa基因玉米植株)放在2ml的离心管中；然后将放有叶子的管插在冰盒中，以保持新鲜度。
2、取液氮，将材料速冻，用钻头将材料研磨成粉，向管中迅速加入500μL-lmLSEB4样品提取缓冲液。
3、取出检测试纸条，手持检测试纸条顶端，做好检测标记，不要去掉保护膜；保持检测试纸条垂直，将末端插入至离心管中，插入部分不要超过0.5cm，在检测过程中始终保持插入状态。
4、3-5分钟内出现反应条带。
阳性结果：在检测试纸条上出现两条红色条带，一条检测线(红色)和一条质控线(红色)。
阴性结果：在检测试纸条上仅出现一条红色质控线。
试纸条检测结果如图7所示：FLIa基因在转FLIa基因玉米植株中得到了很好的表达。
实施例5转FLIa基因玉米植株拔节期叶片室内抗虫性鉴定
转FLIa基因玉米植株拔节期取叶片分别放入不同平皿中，每个平皿接5只初孵玉米螟幼虫，3次重复；接虫4天后观察叶片损伤情况。结果如图8所示：非转基因植株叶片被玉米螟蛀蚀出很多虫孔，表现为感虫；转FLIa基因玉米植株叶片没有虫孔，表现为抗虫。

Claims (10)

1.一种人工合成的Bt抗虫基因FLIa，其特征在于，该基因的核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:1所示。
2.如权利要求1所述的一种人工合成的Bt抗虫基因FLIa编码的蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO:2所示。
3.植物表达载体pTF101.1-ubi-FLIa，其特征在于，该载体含有人工合成的Bt抗虫基因FLIa，该载体的核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:3所示。
4.根据权利要求3所述的植物表达载体pTF101.1-ubi-FLIa，其特征在于，用EcoRI和HindIII酶切植物表达载体pCAMBIA3300，回收酶切位点间的片段ubi-nos，连入植物表达载体pTF101.1的EcoRI和HindIII位点间，构建植物表达载体pTF101.1-ubi；将人工合成的两端带有SmaI和SacI酶切位点的Bt抗虫基因FLIa，连入植物表达载体pTF101.1-ubi的SmaI和SacI位点间，构建抗虫基因FLIa的植物表达载体pTF101.1-ubi-FLIa，其核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
5.根据权利要求3或4所述的植物表达载体pTF101.1-ubi-FLIa，其特征在于，该载体包括：P35S启动子、TEV增强子、bar基因、大豆贮藏蛋白基因vsp终止子、玉米ubi启动子、FLIa基因和根癌农杆菌胭脂碱合成酶基因nos终止子。
6.制备权利要求1所述的人工合成的Bt抗虫基因FLIa的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将抗虫基因Cry1Ab的DomainⅠ和DomainⅡ与抗虫基因Cry1Ia的DomainⅢ进行交换融合，获得重组抗虫基因MCry1I；
步骤二、在重组抗虫基因MCry1I的基础上，在3’端连入抗虫基因Cry1Ja1的碳末端，得到重组抗虫基因FLMCry1Ia；
步骤三、对重组抗虫基因FLMCry1Ia进行密码子改造，获得Bt抗虫基因FLIa，其核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:1所示。
7.根据权利要求6所述的人工合成的Bt抗虫基因FLIa的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述重组抗虫基因FLMCry1Ia与Cry基因氨基酸序列最大同源性为88％。
8.根据权利要求6所述的人工合成的Bt抗虫基因FLIa的制备方法，其特征在于，步骤三中，对重组抗虫基因FLMCry1Ia进行密码子改造包括：基因编码框优化、消除稀有密码子而利用最佳化密码子、二级结构最小化、调整GC含量。
9.一种提高转基因植物抗虫性的方法，其特征在于，将人工合成的Bt抗虫基因FLIa转化植物中，提高转化植物的抗虫性。
10.一种人工合成的Bt抗虫基因FLIa在提高转基因植物抗虫性中的应用。
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