CN102061308B - 一种用百草枯筛选转基因植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于百草枯抗性的转基因植物的规模化筛选的双蛋白表达的表达盒，其依次包括第一启动子、目标基因、第一表达终止序列、第二启动子、潜在的百草枯抗性基因、和第二表达终止序列。另外，本发明还提供了基于该表达盒的载体、规模化筛选百草枯抗性的转基因植物和规模化筛选百草枯抗性和非百草枯抗性的抗性的转基因植物的方法。

Description

一种用百草枯筛选转基因植物的方法

技术领域

本发明属于转基因植物技术领域，具体而言，本发明涉及用于百草枯抗性的转基因植物的规模化筛选的双蛋白表达的表达盒以及基于该表达盒的载体、规模化筛选百草枯抗性的转基因植物和规模化筛选百草枯抗性和非百草枯抗性的抗性的转基因植物的方法。

背景技术

转基因技术是现代生物技术的核心，利用转基因技术生产优质、多抗、高效、多产的作物新品种，是缓解资源束缚、保护环境安全以及拓展农业功能的重要途径。发展和完善现有转基因技术具有重要的实际应用价值。在实际基因转化操作过程中，只有小部分的植物细胞能够吸收外源DNA并整合到植物基因组上，仍有大部分植物细胞处于未转化状态，为了从数目庞大的植物细胞中筛选得到外源DNA整合的植物细胞，需要筛选标记基因的辅助。现在常用的筛选标记基因主要有抗生素类和除草剂两类。

抗生素抗性基因因具有高转化效率和方便筛选等优点而成为最常用的筛选标记。但是人们担心抗生素抗性基因会转移到微生物中，使病原菌带有抗生素抗性从而导致临床上抗生素使用失效。另一方面，抗生素的价格昂贵，作为筛选标记成本高。因此，抗生素抗性基因作为筛选标记多用于科学研究过程中。除草剂抗性基因是近几年来发展起来的一种新型的筛选标记与抗生素抗性基因相比，除草剂抗性基因具有价格低的优点，也不会产生临床抗生素失效等担忧，同时除草剂抗性基因不仅是筛选标记基因还是一种目的基因，能使转基因作物具有良好的除草剂抗性性状。现在主要使用的除草剂抗性基因有草甘膦抗性基因和草丁膦抗性基因等，因草丁膦价格相对较高使得草丁膦抗性基因作为筛选标记基因主要用于实验室研究。草甘膦抗性基因是应用比较多的一种筛选标记基因。虽然除草剂抗性基因是产业化转基因筛选的优良选择标记基因，但是其尚未得到大规模的应用。这主要由除草剂抗性基因单一造成的，目前大多数的除草剂抗性基因是草甘膦抗性基因，是在已有的5-烯醇丙酮酰-3-磷酸基因的基础上修饰得到的，新型的除草剂抗性基因的研究一直没有显著进展。研发一种新型的除草剂抗性基因是一项工作量巨大而且具有很大不确定性的工作。

百草枯(paraquat，1，1-二甲基-4，4’-联吡啶，分子量257.2)是继草甘磷之后的第二大除草剂，是一种速效触杀型除草剂，兼有一定内吸作用，主要用于果园、桑园、茶园、林带等作物的杂草，在农业种植中的广泛应用已近50年，应用在世界范围内超过100个国家，受到广泛接受与欢迎。百草枯是非选择性除草剂，植物对其吸收非常迅速，即使喷药后短期内降雨也不影响药效的发挥。百草枯具有接受广泛、广谱性、药效明显、价格低等优点，将是一种优良的植物转基因筛选剂，但是由于百草枯抗性基因的研究一直以来没有突破性的进展，使得百草枯作为筛选剂也仅仅停留在实验预想阶段。

本发明人通过漫长而艰苦的筛选实验，构建出一种双蛋白表达盒，这种双蛋白表达盒中所选取的具体调控序列及其组合，尽管是顺序表达，但是我们发现，后一个表达盒也能高效表达，可以满足同时有效表达两个蛋白的需要。根据本发明人选用的颜色辨识基因，大大方便了规模化筛选百草枯抗性基因的过程，并最终筛选得到了一个百草枯抗性基因。在此基础上，本发明人还发明了一种利用百草枯筛选转基因植物的新方法，同时获得具有百草枯抗性和非百草枯抗性的另一抗性的转基因植物，也方便了规模化筛选，同时排除了已经被要求或潜在将被要求不能出现在产业应用的抗抗生素基因的使用，具有很大的实际应用价值和市场推广前景。

发明内容

本发明提供了用于百草枯抗性的转基因植物的规模化筛选的双蛋白表达的表达盒以及基于该表达盒的载体、规模化筛选百草枯抗性的转基因植物和规模化筛选百草枯抗性和非百草枯抗性的抗性的转基因植物的方法。这些产品和方法大大方便了筛选操作，从而可以规模化应用，并且可以满足同时有效表达两个蛋白的需要，尤其是在顺序表达时后一个表达盒也能高效表达；这些产品和方法还可以排除已经被要求或潜在将被要求不能出现在产业应用的抗生素基因的使用。另外，本发明还涉及各种中间产物，如检测引物对，用于检测转基因植物中的异源蛋白。

具体而言，在第一方面，本发明提供了一种用于百草枯抗性的转基因植物的规模化筛选的双蛋白表达的表达盒，其依次包括第一启动子、目标基因、第一表达终止序列、第二启动子、潜在的百草枯抗性基因、和第二表达终止序列。优选其中，第一启动子、目标基因、和第一表达终止序列之间没有其他序列；也优选其中，第二启动子、潜在的百草枯抗性基因、和第二表达终止序列之间没有其他序列。第一表达终止序列和第二启动子之间可以有额外的序列，也可以没有额外的序列。我们发现，即使在本发明的具体实施方式中，第一表达终止序列和第二启动子之间有启动子这样的调控序列而且其方向是与第一启动子和第二启动子相反的，但是也没有干扰蛋白的表达，仍旧可以满足同时有效表达两个蛋白的需要。

优选在本发明的第一方面中，对于调控序列，第一启动子和第二启动子可以是相同的，也可以是不同的，优选是相同的，例如，可以都是CaMV35S启动子；第一表达终止序列和第二表达终止序列可以是相同的，也可以是不同的，优选是不同的，例如在本发明的具体实施方式中，第一表达终止序列是T-NOS多聚腺苷酸(简称为T-NOS polyA)以及第二表达终止序列是CaMV 3’非翻译区(简称为CaMV 3’UTR)，如来源于市售的pCAMBIA1303质粒中的CaMV 3’UTR。我们发现，优选的调控序列及其组合能够使目标基因和潜在的百草枯抗性基因同时得到有效表达，实现相应作用。

在本发明的第一方面中，特别优选的技术方案是，目标基因可以是筛选标记基因，如颜色辨识基因。由于植物体或其组织通常呈现绿色，因此优选目标基因是非绿颜色辨识基因，这样可以清晰表现出基因的表达。进一步地，目标基因优选是荧光蛋白编码基因，更优选是红色荧光蛋白编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。由于目标基因是筛选标记基因，可以用于辅助百草枯抗性基因的筛选，以显色的方式方便地从大规模筛选中辨识出在含有百草枯的培养基中生长的植物带有百草枯抗性基因，并根据颜色的深浅判断表达量。在本发明的具体实施方式中，本发明人以红色荧光蛋白编码基因作为目标基因，极大地方便了辨识，规模化筛选出特定的百草枯抗性基因。因此，更优选在本发明的第一方面中，潜在的百草枯抗性基因是百草枯抗性基因，优选是pqrK2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

以得到的百草枯抗性基因作为筛选标记基因，在本发明的第一方面中，另外优选的技术方案是，目标基因是非百草枯抗性的抗性基因，优选是非百草枯抗性的另一种农药或除草剂抗性基因，如草丁膦抗性，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。由于本发明优选的调控序列及其组合能够使目标基因和潜在的百草枯抗性基因同时得到有效表达，因此这两种抗性基因能够同时得到有效表达。根据本发明的具体实施方式，在多种有代表性的植物中，采用本发明的表达盒导入的两种抗性基因能使转基因植物有效地获得这两种抗性。

在第二方面，本发明提供了一种用于植物转化的载体，其中包含本发明第一方面所述的表达盒。本文中所采用的术语“载体”是生物学领域的常用术语，其中通常带有可在不同宿主中复制的复制起始点以及抗抗生素基因。本领域常用的用于植物转化研究的载体有许多，如市售的pCAMBIA系列载体、pBI系列载体、Pbin系列载体、以及Gateway载体，这些载体基本上需要带有抗抗生素基因。例如，pCAMBIA1300的筛选标记基因为HPT，产生潮霉素抗性；pCAMBIA2300的筛选标记基因为NPTII，产生卡那霉素抗性。抗抗生素基因在产业化(产品化)的转基因植物中的使用有着很大的技术争议，因此已经被要求或者潜在将被要求不能出现在产业化(产品化)的转基因植物中，不适合用于实际产业的植物转化。因此，优选用本发明第一方面所述的表达盒或其部分(如，潜在的百草枯抗性基因)替换用于植物转化研究的载体中的抗抗生素基因，如在本发明的具体实施方式中，pCAMBIA1300的HPT基因被置换成pqrK2基因。因此，优选在本发明的第二方面中，本发明提供了一种用于植物转化的载体，其中包含本发明第一方面所述的表达盒，而且其中不含有潮霉素抗性基因；最优选所述载体是pCAMKT1300-Asred或pCAMKT1300-bar，其质粒图谱分别如图1或图2所示。

在第三方面，本发明提供了一种规模化筛选百草枯抗性的转基因植物的方法，其包括，使用包含本发明第一方面中特别优选的技术方案所述的表达盒的用于植物转化的载体通过农杆菌介导转化植物愈伤组织或植物体，将该植物愈伤组织或植物体培养于含有百草枯的环境中，然后挑选生长呈现非绿色的植物愈伤组织或植物体，其中，所述植物愈伤组织或植物体本身呈现绿色。百草枯可以施加在培养基中。但是，更优选在本发明第三方面中，所述环境中的百草枯是用喷洒或涂抹百草枯的方式引入环境的，即将百草枯喷洒或涂抹植物愈伤组织或植物体上，可以喷洒或涂抹在植物愈伤组织或植物体的全部上，也可以喷洒或涂抹在植物愈伤组织或植物体的部分(如，叶片)上。。

在第四方面，本发明提供了一种规模化筛选百草枯抗性和非百草枯抗性的抗性的转基因植物的方法，其包括，使用包含本发明第一方面中另外优选的技术方案所述的表达盒的用于植物转化的载体通过农杆菌介导转化植物愈伤组织或植物体，将所述植物愈伤组织或植物体培养于含有百草枯的环境中，然后挑选生长的植物愈伤组织或植物体。其中，优选非百草枯抗性的抗性是草丁膦抗性。百草枯和/或草丁膦可以施加在培养基中。但是，更优选在本发明第四方面中，所述环境中的百草枯和/或草丁膦是用喷洒或涂抹百草枯的方式引入环境的，即将百草枯和/或草丁膦喷洒或涂抹植物愈伤组织或植物体上，可以喷洒或涂抹在植物愈伤组织或植物体的全部上，也可以喷洒或涂抹在植物愈伤组织或植物体的部分(如，叶片)上。

优选在本发明的第三和/或第四方面中，所述植物是双子叶植物或单子叶植物，其中双子叶植物优选是大豆、拟南芥、棉花或油菜，其中单子叶植物优选是水稻、小麦、玉米、高粱或谷子，优选所述植物是水稻。

优选在本发明的第三和/或第四方面中，所述环境中用于植物愈伤组织的百草枯的浓度为0.2～20uM，优选为1～5uM，最优选为1uM；所述环境中用于植物叶片和/或整个植株的百草枯的浓度为10～800uM，更优选为100～200uM。另外优选在本发明的第三和/或第四方面中，培养植物愈伤组织或植物体的培养基是用于植物愈伤组织培养的培养基，优选不是用于植物分化和生根阶段的培养基，优选用于植物分化和生根阶段的培养基不含百草枯。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献也是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本发明进行参考，就好像它们的全文已经在本发明说明书中重复叙述过一样。

附图说明

图1为pCAMKT1300-Asred载体示意图谱。

图2为pCAMKT1300-bar载体示意图谱。

图3为百草枯筛选-Asred水稻愈伤的结果。

图4为百草枯筛选pCAMKT1300-Asred阳性植株的PCR检测结果。其中-是野生型负对照，M是分子量标记，1～4是检测的4个株系。

图5为转pCAMKT1300-bar的T1代拟南芥对百草枯和草丁膦抗性表现。其中A代表用100uM的百草枯喷洒2天后的结果；B代表拟南芥用百草枯筛选1周后喷洒草丁膦的结果。

图6为百草枯筛选得到的pCAMKT1300-bar的T1代拟南芥的PCR检测。其中-是野生型负对照，H2O是PCR体系的负对照；M是分子量标记，1～4是检测的4个株系。

图7为用草丁膦涂抹pCAMKT1300-bar大豆T0代阳性植株的结果，该阳性植株用100uM百草枯筛选得到。其中用笔标注的黑圈为草丁膦涂抹的范围。

图8为百草枯筛选筛选得到的T0代大豆阳性株系的PCR检测结果。其中-是野生型负对照，M是分子量标记，1～4是检测的4个株系。

图9为用草丁膦涂抹pCAMKT1300-bar棉花T0代阳性植株的结果，该阳性植株用100uM百草枯筛选得到。其中用笔标注的黑圈为草丁膦涂抹的范围。

图10为百草枯筛选筛选得到的T0代棉花阳性株系的PCR检测结果。其中-是野生型负对照，M是分子量标记，1～7是检测的7个株系。

图11为用草丁膦涂抹pCAMKT1300-bar小麦T0代阳性植株的结果，该阳性植株用100uM百草枯筛选得到。其中用笔标注的地方至叶尖为草丁膦涂抹的范围。

图12为百草枯筛选得到的pCAMKT1300-bar的T0代小麦的PCR检测。其中-是野生型负对照，H2O是PCR体系的负对照；M是分子量标记，1～4是检测的4个株系。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常用分子生物学、组织培养技术和农学手册所记载的方法。具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。

实施例1：红色荧光蛋白-抗百草枯植物双价表达载体的构建

根据SEQ ID NO：1命名为pqrK2基因序列，设计引物时引入Xho I酶切位点，引物序列如下引物1和引物2所示：

引物1：5’-CTCGAG ATGAACCCTTATATTTATCTTG-3’

引物2：5’-CTCGAG TTAATGTGGTGTGCTTCG-3’

用引物1和引物2进行对pqrK2基因序列进行PCR扩增，然后用Xho I酶酶切，得到插入片段；取pCAMBIA1303(购自Cambia公司)用Xho I酶酶切，切掉潮霉素抗性基因，将酶切过的载体去磷酸化，然后用连接酶连接上述插入片段和去磷酸化的载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，经含有50mg/L卡那霉素的2×YT培养基培养筛选后挑选阳性克隆，抽取质粒后经测序选择出正向插入CaMV35S启动子后的克隆，得具有百草枯抗性的质粒，命名为pCAMKT1300。

人工合成两端分别带有HindIII和Pst I酶切位点的CaMV35S启动子序列(参见SEQ IDNO：3)，用HindIII和Pst I酶分别双酶切pCAMKT1300载体和人工合成的CaMV35S序列，将人工合成的CaMV35S片段和酶切处理好的pCAMKT1300载体连接，转化大肠杆菌DH5α菌株，经含有50mg/L卡那霉素的2×YT培养基培养筛选后挑选阳性克隆，抽取质粒后经测序无误后，命名为pCAMKT1300-35s。

同样，人工合成两端带有EcoR I和Sal I酶切位点的T-NOS ployA序列(参见SEQ IDNO：4)。用EcoR I和Sal I分别双酶切人工合成的T-NOS polyA和pCAMKT1300-35s载体，将酶切好pCAMKT1300-35s和T-NOS ployA连接，转化大肠杆菌DH5α菌株，经含有50mg/L卡那霉素的2×YT培养基培养筛选后挑选阳性克隆，抽取质粒后经测序无误后，命名为pCAMKT1300-35s-NOS。

根据荧光蛋白基因AsRED的基因序列(参见SEQ ID NO：2)设计引物3和引物4，在AsRED序列两端分别引入PstI、BamHI酶切位点，以pAsred载体(购自invitrogen公司)为模板扩增红色荧光蛋白核苷酸片段，用PstI和BamHI双酶切，同时用PstI和BamHI双酶切载体上述的pCAMKT1300-35s-NOS，琼脂糖凝胶电泳回收Asred片段和pCAMKT1300-35s-NOS载体，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，经含有50mg/L卡那霉素的2×YT培养基经筛选后挑选阳性克隆，抽取质粒后经测序插入无误后得具有红色荧光蛋白活性和百草枯抗性的质粒，命名为pCAMKT1300-Asred(pCAMKT1300-Asred图谱见附图1)。引物3和引物4的序列如下：

引物3：5’-CTGCAG ATGGCCTCTTTGCTGAAGAA-3’

引物4：5’-GGATCC TCAGTTGTGGCCCAGCT-3’

实施例2：用百草枯筛选水稻转化

1，用pCAMKT1300-Asred作为表达载体转化农杆菌AGL0，具体过程可参见《MolecularCloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，3^rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)手册。转化了pCAMKT1300-Asred的农杆菌的培养过程如下：

初步培养：在转化了pCAMKT1300-Asred的农杆菌的单菌落平板上，挑取3～6个菌落，分别置于YEB液体培养基中，200rpm/min，28℃条件下培养16～20小时，使菌液浓度达到OD600＝1.6左右。

扩大培养：取初步培养的菌液，按1∶15-1∶20的体积比例将初步培养的菌液在加好卡那霉素的YEB液体中扩大培养，培养条件为200rpm/min，28℃摇2.5-3小时左右，当OD600值在0.3-0.4即停止培养。

4℃下，3000rpm/min离心10min离心收集菌体，弃除上清液。菌体重悬于AA液(AA液的配方为：100ml AA液中加150vl生长素类似物2，4-D(2mg/ml)，10vl细胞分裂素KT(2mg/ml)及1ml乙酰丁香酮AS(2mg/ml))中。该培养后的农杆菌AGL0用于下面的水稻转化实验。

2.用百草枯为筛选剂进行水稻转化实验，其具体步骤请参见《Plant Propagation by TissueCulture》(Edwin F.George，Michael A.Hall，Geert-Jan De Klerk，Springer 2008)，因我们研究发现，百草枯影响水稻愈伤组织的分化，因此在具体步骤中的以下两个步骤有改动：

(1)将共培养后的愈伤组织放在含百草枯的筛选培养基中，筛选培养基中百草枯的使用浓度为1uM。

(2)在分化和生根阶段时，培养基中不添加百草枯。

目标载体含有pCAMKT1300-Asred目的基因红色荧光蛋白基因，其高表达会产生红色荧光，使水稻的愈伤变成红色，在用百草枯筛选水稻愈伤的过程中，经我们此后进一步检测发现，得到的所有转入pqrK2基因序列(即pqrK2阳性)的愈伤组织全部呈现为红色(见附图1)，这说明百草枯对水稻愈伤转化法具有很好的筛选效果，并且使用红色荧光蛋白基因能够容易地判断出pqrK2基因是否导入到植物中并判断是否带来了百草枯抗性以及抗性强度，该易辨识性非常适用于大规模的转化筛选。

3.水稻转基因阳性苗的进一步检测

对上述筛选得到的T0代水稻转基因苗进行PCR检测，进一步验证是否转基因成功。根据Asred基因的序列，设计PCR扩增引物，进一步验证转基因株系的阳性。每株取一片新叶用CTAB法提取植物基因组DNA。根据Asred基因的序列，设计PCR扩增引物5和6：

引物5：5’-CCAGGAGATGAAGATCGAGG-3’

引物6：5’-GCGGCCTCGTACTGCTTGTA-3’

分别利用引物5和引物6，以抗性植株基因组DNA模板，PCR扩增Asred基因片段。反应结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，可以检测到大约500bp的目的片段。我们对100个株系进行了PCR实验，结果全部呈阳性，部分检测结果见附图2。这进一步证明了我们获得的抗性植株为转基因阳性株系，用百草枯作为筛选剂并用红色荧光蛋白作为标记观察，其转基因阳性筛选率为100％。

实施例3：用百草枯筛选拟南芥转基因苗

1.抗草丁膦、抗百草枯植物双价表达载体的构建

人工合成两端带有PstI和BamHI酶切位点的bar基因序列(参见SEQ ID NO：5)，用Pst I和BamH I酶双酶切人工合成的bar和pCAMKT1300-35s-NOS载体，将酶切好pCAMKT1300-35s-NOS和bar连接，转化大肠杆菌DH5α菌株，经含有50mg/L卡那霉素的2×YT培养基培养筛选后挑选阳性克隆，抽取质粒经测序无误后，命名为pCAMKT1300-bar，作为表达载体转化农杆菌AGL0用于下面的植物转化实验。

2.pCAMKT1300-bar载体转化拟南芥

挑取转化了pCAMKT1300-bar的农杆菌单菌落接种到装有3mlYEB的培养基中。在28℃、200-220rpm速度下振荡培养使其OD值达到0.6。将培养好的农杆菌菌液按照3∶1000的比例接种到1L的YEB培养基中培养使其OD值达到0.7～0.8。

按照如下配方配制悬浮培养基，每1L培养基中加入2.15g的MS盐(购自Sigma公司)，50g的蔗糖，200ul的表面活性剂silwet。将培养好的农杆菌离心后用配置好的悬浮培养基重悬。重悬好的菌液待用。

转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透，先将浇透水用于转化的拟南芥苗的果荚全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。将悬浮菌液分装在50ml的烧杯中，把待转化拟南芥倒立在烧杯上，使其花序浸在转化液中侵染5分钟。然后将侵染好的拟南芥平放，用黑塑料布盖好，放置18-24小时。转化好的拟南芥收种得到T1代的转基因种子。

3.百草枯筛选T1代拟南芥转基因苗

因pCAMKT1300-bar载体的筛选标记基因是百草枯抗性基因pqrK2，使转基因阳性苗具百草枯抗性，所以我们用百草枯作为筛选剂对T1代的种子进行筛选。将收获的T1代转基因种子种在土中，刚刚长出两天真叶时，喷洒100uM的百草枯。2天后，未转基因的拟南芥苗枯死，转基因阳性苗生长状态良好。因pCAMKT1300-bar载体的目的基因是bar，转基因阳性苗具草丁膦抗性。为了进一步检测百草枯的筛选效率，我们将筛选得到的T1代转基因拟南芥阳性苗培养一周后，按照1∶1000的比例喷洒草丁膦，结果发现所有百草枯筛选得到的T1代转基因阳性苗均具草丁膦抗性，这说明百草枯是一种快速有效的筛选剂。结果见附图3。

4.拟南芥T1代转基因阳性苗的PCR检测

为了进一步验证上述得到的拟南芥T1代苗，我们进行了分子水平上的检测。根据bar基因的序列，设计PCR扩增引物，进一步验证转基因株系的阳性。每株取两片嫩叶，用CTAB法提取植物基因组DNA。根据bar基因的序列，设计PCR扩增引物序列如下：

引物7(上游)：5′CATCAGATCTCGGTGACGG  3′

引物8(下游)：5′TCAACTTCCGTACCGAGCCG 3′

分别利用引物7和引物8，以抗性植株基因组DNA模板，扩增bar基因片段。对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，可以检测到450bp的目的片段(结果见附图4)。我们对11个株系进行了PCR实验，结果全部呈阳性。这进一步证明了我们获得的抗性植株为转基因阳性株系，百草枯是一种快速高效的筛选剂。

实施例4：用百草枯筛选大豆转基因苗

1.pCAMKT 1300-bar载体转化大豆

挑取转化了pCAMKT1300-bar的农杆菌单菌落接种到装有3mlYEB的培养基中。在28℃、200-220rpm速度下振荡培养使其OD值达到0.6。将培养好的农杆菌菌液按照3∶1000的比例接种到1L的YEB培养基中培养使其OD值达到0.7～0.8。

按照如下配方配制悬浮培养基，每1L培养基中加入2.15g的MS盐(购自Sigma公司)，蔗糖(50g)，表面活性剂silwet(200ul)，细胞分裂素KT(0.2mg)；生长素类似物2，4-D(1mg)；二硫苏糖醇DTT(1mM)；L-半胱氨酸L-Cysteine(200～400mg)。将培养好的农杆菌离心后用配置好的悬浮培养基重悬。重悬好的菌液待用。纵切大豆的幼苗用重悬好的菌液进行转化。

2.百草枯筛选T0代大豆转基因苗

因pCAMKT1300-bar载体的筛选标记基因是百草枯抗性基因pqrK2，使转基因阳性苗具百草枯抗性，所以我们用百草枯作为筛选剂对T0代的大豆苗进行筛选。用50um的百草枯涂抹大豆苗的新生复叶，2天后，非转基因大豆叶片涂抹百草枯的部位表现为枯死，而转基因大豆的叶片生长良好。为了进一步检测百草枯的筛选效果，我们将得到的阳性植株用草丁膦进行进一步的验证。因pCAMKT1300-bar载体的目的基因是bar，转基因阳性苗具有草丁膦抗性。结果发现所有百草枯筛选得到的T0代转基因阳性苗均具草丁膦抗性，这说明百草枯是一种快速有效的筛选剂。结果见附图5。

3.大豆T0代转基因阳性苗的PCR检测

为了进一步验证上述得到的大豆T0代苗，我们进行了分子水平上的检测。根据bar基因的序列，设计PCR扩增引物，进一步验证转基因株系的阳性。每株取一片新展开的叶片采用CTAB法提取植物基因组DNA。根据bar基因的序列，设计PCR扩增引物序列如下：

引物7(上游)：5′CATCAGATCTCGGTGACGG 3′

引物8(下游)：5′TCAACTTCCGTACCGAGCCG 3′

分别利用引物7和引物8，以抗性植株基因组DNA模板，扩增bar基因片段。对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，可以检测到450bp的目的片段(结果见附图6)。我们对株系进行了PCR实验，结果全部呈阳性。这进一步证明了我们获得的抗性植株为转基因阳性株系，百草枯是一种快速高效的筛选剂。

实施例5：用百草枯筛选棉花转基因苗

1.pCAMKT1300-bar载体转化棉花

挑取转化了pCAMKT1300-bar的农杆菌单菌落接种到装有3mlYEB的培养基中。在28℃、200-220rpm速度下振荡培养使其OD值达到0.6。将培养好的农杆菌菌液按照3∶1000的比例接种到1L的YEB培养基中培养使其OD值达到0.7～0.8。

按照如下配方配制悬浮培养基，每1L培养基中加入2.15g的MS盐(购自Sigma公司)，蔗糖(50g)，表面活性剂silwet(200ul)，细胞分裂素KT(0.2mg)；生长素类似物2，4-D(1mg)；二硫苏糖醇DTT(1mM)；L-半胱氨酸L-Cysteine(200～400mg)。将培养好的农杆菌离心后用配置好的悬浮培养基重悬。重悬好的菌液待用。用重悬好的菌液转化棉花。

2.百草枯筛选T0代棉花转基因苗

因pCAMKT1300-bar载体的筛选标记基因是百草枯抗性基因pqrK2，使转基因阳性苗具百草枯抗性，所以我们用百草枯作为筛选剂对T0代的棉花苗进行筛选。用50um的百草枯涂抹棉花苗的新叶，2天后，非转基因大棉花叶片涂抹百草枯的部位表现为枯死，而转基因棉花的叶片生长良好。为了进一步检测百草枯的筛选效果，我们将得到的阳性植株用草丁膦进行进一步的验证。因pCAMKT1300-bar载体的目的基因是bar，转基因阳性苗具有草丁膦抗性。结果发现所有百草枯筛选得到的T0代转基因阳性苗均具草丁膦抗性，这说明百草枯是一种快速有效的筛选剂。结果见附图7。

3.棉花T0代转基因阳性苗的PCR检测

为了进一步验证上述得到的棉花T0代苗，我们进行了分子水平上的检测。根据bar基因的序列，设计PCR扩增引物，进一步验证转基因株系的阳性。每株取一片新展开的叶片采用CTAB法提取植物基因组DNA。根据bar基因的序列，设计PCR扩增引物序列如下：

引物7(上游)：5′CATCAGATCTCGGTGACGG 3′

引物8(下游)：5′TCAACTTCCGTACCGAGCCG 3′

分别利用引物7和引物8，以抗性植株基因组DNA模板，扩增bar基因片段。对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，可以检测到450bp的目的片段(结果见附图8)。我们对株系进行了PCR实验，结果全部呈阳性。这进一步证明了我们获得的抗性植株为转基因阳性株系，百草枯是一种快速高效的筛选剂。

实施例6：用百草枯筛选小麦转基因苗

1.pCAMKT1300-bar载体转化小麦

挑取转化了pCAMKT1300-bar的农杆菌单菌落接种到装有3mlYEB的培养基中。在28℃、200-220rpm速度下振荡培养使其OD值达到0.6。将培养好的农杆菌菌液按照3∶1000的比例接种到1L的YEB培养基中培养使其OD值达到0.7～0.8。

按照如下配方配制悬浮培养基，每1L培养基中加入2.15g的MS盐(购自Sigma公司)，蔗糖(50g)，表面活性剂silwet(200ul)，细胞分裂素KT(0.2mg)；生长素类似物2，4-D(1mg)；二硫苏糖醇DTT(1mM)；L-半胱氨酸L-Cysteine(200～400mg)。将培养好的农杆菌离心后用配置好的悬浮培养基重悬。重悬好的菌液待用。纵切小麦幼苗的叶基座，用上述的重悬菌液进行转化。

2.百草枯筛选T0代小麦转基因苗

因pCAMKT1300-bar载体的筛选标记基因是百草枯抗性基因pqrK2，使转基因阳性苗具百草枯抗性，所以我们用百草枯作为筛选剂对T0代的小麦苗进行筛选。用50um的百草枯涂抹小麦的新叶，2天后，非转基因大小麦叶片涂抹百草枯的部位表现为枯死，而转基因小麦的叶片生长良好。为了进一步检测百草枯的筛选效果，我们将得到的阳性植株用草丁膦进行进一步的验证。因pCAMKT1300-bar载体的目的基因是bar，转基因阳性苗具有草丁膦抗性。结果发现所有百草枯筛选得到的T0代转基因阳性苗均具草丁膦抗性，这说明百草枯是一种快速有效的筛选剂。结果见附图9。

3.小麦T0代转基因阳性苗的PCR检测

为了进一步验证上述得到的小麦T0代苗，我们进行了分子水平上的检测。根据bar基因的序列，设计PCR扩增引物，进一步验证转基因株系的阳性。每株取一片新展开的叶片采用CTAB法提取植物基因组DNA。根据bar基因的序列，设计PCR扩增引物序列如下：

引物7(上游)：5′CATCAGATCTCGGTGACGG 3′

引物8(下游)：5′TCAACTTCCGTACCGAGCCG 3′

分别利用引物7和引物8，以抗性植株基因组DNA模板，扩增bar基因片段。对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，可以检测到450bp的目的片段(结果见附图10)。我们对株系进行了PCR实验，结果全部呈阳性。这进一步证明了我们获得的抗性植株为转基因阳性株系，百草枯是一种快速高效的筛选剂。

Claims (15)

1.一种用于百草枯抗性的转基因植物的规模化筛选的双蛋白表达的表达盒，其依次包括第一启动子、目标基因、第一表达终止序列、第二启动子、潜在的百草枯抗性基因、和第二表达终止序列,其特征是所述潜在的百草枯抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述的表达盒，其中所述目标基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.权利要求1所述的表达盒，其中所述目标基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示。

4.一种用于植物转化的载体，其特征是其中包含权利要求1-3之任一所述的表达盒。

5.一种规模化筛选百草枯抗性的转基因植物的方法，其特征是：使用包含权利要求2所述的表达盒的用于植物转化的载体通过农杆菌介导转化植物愈伤组织或植物体，将该植物愈伤组织或植物体培养于含有百草枯的环境中，然后挑选生长呈现红色的植物愈伤组织或植物体，其中，所述植物愈伤组织或植物体本身呈现绿色。

6.一种规模化筛选百草枯抗性和非百草枯抗性的转基因植物的方法，其包括，使用包含权利要求3所述的表达盒的用于植物转化的载体通过农杆菌介导转化植物愈伤组织或植物体，将所述植物愈伤组织或植物体培养于含有百草枯的环境中，然后挑选生长的植物愈伤组织或植物体。

7.权利要求5或6所述的方法，其中所述的含有百草枯的环境中的百草枯是用喷洒或涂抹百草枯的方式引入环境的。

8.权利要求7所述的方法，其特征在于，百草枯的浓度为0.2~20uM。

9.权利要求8所述的方法，其特征在于，其中所述的百草枯的浓度为1~5uM。

10.权利要求9所述的方法，其特征在于，其中所述的百草枯的浓度为1uM。

11.权利要求5或6的方法，其特征在于，培养植物愈伤组织或植物体的培养基在植物分化和生根阶段不含百草枯。

12.权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述植物是双子叶植物或单子叶植物。

13.权利要求12所述的方法，其特征在于，所述双子叶植物为大豆、拟南芥、棉花或油菜。

14.权利要求12所述的方法，其特征在于，所述单子叶植物为水稻、小麦、玉米、高粱或谷子。

15.权利要求14所述的方法，其中所述的单子叶植物为水稻。

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