CN113913501A - 一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法 - Google Patents

一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于转基因作物鉴定技术领域，本发明提供了一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法。本发明利用CTAB法提取待鉴定样品的基因组DNA，以所得待鉴定样品的基因组DNA为模板，设计引物进行RPA扩增反应，得到的扩增产物纯度较高，特异性良好，灵敏度达到6fg/μL。该鉴定方法相对于市场上普遍使用的PCR技术缩短了反应时间，降低了反应温度，且对操作人员的技术要求较低，更利于进行现场检测，为检验检疫部门提供了新的检验思路。

Description

一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法
技术领域
本发明涉及转基因作物鉴定技术领域，尤其涉及一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法。
背景技术
随着世界首例转基因玉米Bt176在1996年开始商业化，转基因玉米在全球范围内得到广泛种植，23年来累计种植7.5亿公顷(ISAAA，2019)。目前，在转基因农作物中Bt基因已被广泛应用，该基因编码的蛋白质被昆虫摄入后会导致昆虫很快死亡，但对于人类是无害的。由于其对玉米螟、棉铃虫和粘虫等效果比较明显，所以转Bt基因玉米已成为商业化种植速度最快的转基因作物之一。
聚合酶链式反应技术(Polymerase chain reaction，PCR)是分子生物学中研究的主要手段，现被广泛应用于生命科学以及环境科学等领域中。尤其是PCR技术中的荧光定量PCR技术更是成为转基因作物检测的金标准。但是基于PCR技术的一系列检测手段都有一些相同的受限之处，如检测时间长、过程复杂、高额的仪器费用以及对操作技术要求较高等等，都限制了PCR技术无法实施现场快速检测。
近些年，随着核酸分子检测技术的不断发展，为了符合市场的需求，核酸恒温扩增技术应运而生。重组酶聚合酶恒温扩增技术(Recombinase enzyme polymeraseamplification，RPA)是核酸恒温扩增技术中的一个闪光点，它可以在37～42℃的恒温条件下快速完成在体外扩增目的核酸片段。RPA反应体系中主要依赖三种酶，分别为重组酶、单链结合蛋白和链置换型DNA聚合酶，其中重组酶在常温下即可使DNA双链变性，因此不需要PCR技术中复杂的变温系统。相较于环介导等温扩增技术(Loop-mediate amplification，LAMP)在整体反应时温度过高、时间较长且需要设计复杂的引物，RPA技术更适合于现场检测。目前，市场上转基因产品越来越丰富，人们在甄选的同时对其安全性的争论也变得尤为激烈。因此，提供一种简单准确、快速便捷且适合于现场检测的检测方法对转基因产物的鉴别有重要意义。
发明内容
为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了一种简单、快速、便捷、灵敏度高、特异性强且适合于现场检测的基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法，包括如下步骤：
(1)利用CTAB法提取待鉴定样品的基因组DNA；
(2)以上述所得待鉴定样品的基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO.1所示的序列为RPA正向引物，以如SEQ ID NO.2所示的序列为RPA反向引物进行RPA扩增反应，得扩增产物；
(3)对上述所得扩增产物进行凝胶电泳检测，若出现与目的条带大小相同的条带，则说明待鉴定样品含有Bt基因；反之则说明待鉴定样品不含有Bt基因。
优选的，步骤(2)中所述RPA扩增反应的体系为：2～3μL的RPA正向引物，2～3μL的RPA反向引物，28～30μL 2×Reaction Buffer，9～10μL dNTPs，5～7μL 10×Basic E-Mix，2～4μL 20×Core Reaction，6～7μL的Mg2+和0.5～1.5μL的待鉴定样品的基因组DNA，所述RPA正向引物和RPA反向引物的浓度独立为9～11μmol/L，所述dNTPs的浓度为1～2mmol/L，所述Mg2+的浓度为250～300mM，所述待鉴定样品的基因组DNA的浓度为55～65ng/μL。
优选的，步骤(2)中所述RPA扩增反应的温度为35～40℃，所述RPA扩增反应的时间为28～32min。
优选的，还包括对步骤(2)所得扩增产物进行纯化的步骤，所述纯化是指利用漂洗液WB对扩增产物进行纯化。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明建立了一种简单、快速的基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法。本发明利用CTAB法提取待鉴定样品的基因组DNA，以所得待鉴定样品的基因组DNA为模板，设计引物进行RPA扩增反应，得到的扩增产物纯度较高，特异性良好，灵敏度达到6fg/μL。该鉴定方法相对于市场上普遍使用的PCR技术缩短了反应时间，降低了反应温度，且对操作人员的技术要求较低，更利于进行现场检测，为检验检疫部门提供了新的检验思路。
附图说明
图1为不同方法提取玉米基因组DNA的凝胶电泳图(注：M：DL15000bp DNA Marker；1：实施例2中的改进CTAB法；2：SDS法；3：植物基因组DNA快速提取试剂盒法)；
图2为不同引物扩增的凝胶电泳图(注：M：DL500bp DNA Marker；1：R1，F1；2：R2，F2；3：R3，F3；4：R4，F4)；
图3为不同RPA反应时间的凝胶电泳图(注：M：DL500bp DNA Marker；1：20min；2：25min；3：30min；4：35min；5：40min)；
图4为不同RPA反应温度的凝胶电泳图(注：M：DL500bp DNA Marker；1：37℃；2：38℃；3：39℃；4：40℃；5：41℃)；
图5为RPA反应体系特异性验证凝胶电泳图(注：M：DL500bp DNA Marker；1：转Bt基因玉米；2：转Bar玉米；3：转EPSPS玉米；4：转Badh玉米；5：阴性对照)；
图6为RPA反应体系灵敏度验证凝胶电泳图(注：M：DL500bp DNA Marker；1：60ng/μL；2：6ng/μL；3：600pg/μL；4：60pg/μL；5：6pg/μL；6：600fg/μL；7：60fg/μL；8：6fg/μL；9：阳性对照；10：阴性对照)。
具体实施方式
本发明提供了一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法，包括如下步骤：
(1)利用CTAB法提取待鉴定样品的基因组DNA；
(2)以上述所得待鉴定样品的基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO.1所示的序列为RPA正向引物，以如SEQ ID NO.2所示的序列为RPA反向引物进行RPA扩增反应，得扩增产物；
(3)对上述所得扩增产物进行凝胶电泳检测，若出现与目的条带大小相同的条带，则说明待鉴定样品含有Bt基因；反之则说明待鉴定样品不含有Bt基因。
在本发明中，步骤(1)中所述CTAB法优选为改进CTAB法，所述改进CTAB法是使用改进2×CTAB提取液提取待鉴定样品的基因组DNA，所述改进2×CTAB提取液的组分优选为：0.05～0.15g/100mL Tris-HCL、0.5～1.5mL/100mLβ-巯基乙醇、2～4g/100mL CTAB、55～65mmol/L EDTA和1～1.5mol/L NaCl，进一步优选为：0.1g/100mL Tris-HCL、1mL/100mLβ-巯基乙醇、3g/100mL CTAB、60mmol/L EDTA和1.2mol/L NaCl，所述改进2×CTAB提取液与待鉴定样品的用量比优选为3～5mL:1g，进一步优选为4mL:1g。
在本发明中，步骤(2)中所述RPA扩增反应的体系优选为：2～3μL的RPA正向引物，2～3μL的RPA反向引物，28～30μL 2×Reaction Buffer，9～10μL dNTPs，5～7μL 10×BasicE-Mix，2～4μL 20×Core Reaction，6～7μL的Mg2+和0.5～1.5μL的待鉴定样品的基因组DNA，进一步优选为2.5μL的RPA正向引物，2.5μL的RPA反向引物，29μL 2×ReactionBuffer，9.6μL dNTPs，6μL 10×Basic E-Mix，3μL 20×Core Reaction，6.4μL的Mg2+和1μL的待鉴定样品的基因组DNA，所述RPA正向引物和RPA反向引物的浓度优选独立为9～11μmol/L，进一步优选独立为10μmol/L，所述dNTPs的浓度优选为1～2mmol/L，进一步优选为1.8mmol/L，所述Mg2+的浓度优选为250～300mM，进一步优选为280mM，所述待鉴定样品的基因组DNA的浓度优选为55～65ng/μL，进一步优选为60ng/μL。
在本发明中，步骤(2)中所述RPA扩增反应的温度优选为35～40℃，进一步优选为38℃，所述RPA扩增反应的时间优选为28～32min，进一步优选为30min。
在本发明中，还优选包括对步骤(2)所得扩增产物进行纯化的步骤，所述纯化优选利用漂洗液WB对扩增产物进行纯化，所述漂洗液WB与扩增产物的体积比优选为11～13:1，进一步优选为12:1。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例和实验例中以玉米为待鉴定样品，RPA等温扩增试剂盒(TwistAmpLiquid Basic Kit)购买自英国TwistDx公司；6×Loading Buffer、DL 15000DNA Marker、DL 500DNA Marker购买自TAKARA公司；植物基因组DNA提取试剂盒、RNase(R6504)购买自天根生化科技(北京)有限公司；多功能DNA纯化回收试剂盒(DP1502)购买自北京百泰克生物技术有限公司；台式高速冷冻离心机(Centrifuge 5430R)购买自德国艾本德公司；恒温水浴锅(HH-12468)购买自常州郎越仪器制造有限公司；电泳仪(DYY-60)购买自北京六一生物科技有限公司；紫外分光光度计(BioSpec-nano)购买自日本岛津公司；高压灭菌锅(MVS-83)购买自北京冠普佳科技有限公司；凝胶成像仪(GenoSens 2000)购买自上海勤翔科学仪器有限公司。
实施例1
(1)玉米基因组DNA的提取：
1)取0.4g去除叶茎的玉米叶片，放入事先预冷过的且加了液氮的研钵中(液氮添加量占研钵体积的三分之二)研磨，过80目筛，在温度上升前装入5mL离心管中；
2)加入65℃预热并加入0.04g PVP的改进2×CTAB提取液(0.1g/100mL Tris-HCL、1mL/100mLβ-巯基乙醇、3g/100mL CTAB、60mmol/L EDTA、1.2mol/L NaCl)1.6mL，65℃的温度下温育，隔5min摇晃1次，共30min；
3)温育结束后取出，离心机设置为4℃，12000rpm，将离心管小心放入其中，避免损伤DNA，离心5min；
4)用微量移液器吸出1.4mL上清液，添加与上清液等体积的三氯甲烷和异戊醇的混合液(其中，三氯甲烷和异戊醇的体积为24:1)，轻微摇晃离心管，于4℃，12000rpm的条件下离心5min；
5)提前-20℃预冷异丙醇，离心结束后，用微量移液器吸取上层澄清液体，加入两倍上清液量的异丙醇，4℃温度下放置0.5h，使DNA充分析出；
6)充分析出后轻轻取出，离心机设置为4℃，12000rpm，小心放入其中，避免损伤DNA，离心10min，倒去上清液；
7)用微量移液器取-20℃下保存的70％乙醇0.6mL加入沉淀中，用微量移液器悬浮沉淀，离心机设置为4℃，12000rpm，将离心管小心放入其中，避免损伤DNA，离心5min，重复7)步骤一次。
8)待管中液体蒸发后加入100μL TE与2μL RNase，得玉米基因组DNA，4℃保存。
(2)以上述所得的玉米基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO.1所示的序列为RPA正向引物，以如SEQ ID NO.2所示的序列为RPA反向引物于35℃的条件下进行RPA扩增反应28min，得扩增产物，所述RPA扩增反应的体系为：2μL的RPA正向引物，2μL的RPA反向引物，28μL 2×Reaction Buffer，9μL dNTPs，5μL 10×Basic E-Mix，2μL 20×Core Reaction，6μL的Mg2+和0.5μL的玉米基因组DNA，所述RPA正向引物和RPA反向引物的浓度独立为9μmol/L，所述dNTPs的浓度为1mmol/L，所述Mg2+的浓度为250mM，所述玉米基因组DNA的浓度为55ng/μL。
(3)对上述所得扩增产物进行纯化：
1)将RPA扩增产物用蒸馏水扩大至100μL，与0.5mL结合液DB混合；
2)将上述溶液添加到收集柱内，收集管放在1.5mLPE管中，常温放置1min后，离心机设置为12000rpm，将装有收集柱的PE管小心放入其中，避免损伤DNA，离心45s，倒去上清液；
3)用微量移液器在收集柱内添加0.7mL漂洗液WB，离心机设置为12000rpm，将装有收集柱的PE管小心放入其中，避免损伤DNA，离心1min，倒去上清液；
4)用微量移液器在收集柱内添加0.5mL漂洗液WB，离心机设置为12000rpm，将装有收集柱的PE管小心放入其中，避免损伤DNA，离心1min，倒去上清液；
5)离心机设置为12000rpm，空管小心放入其中，避免损伤DNA，离心3min；
6)取出收集柱放入新的PE管内，于收集膜的正中用微量移液器滴加30μL的洗脱液(不能触碰到收集膜)，室温静置2min，离心机设置为12000rpm，将装有收集柱的PE管小心放入其中，避免损伤DNA，离心1min，得纯化后的RPA扩增产物。
(4)对纯化后的RPA扩增产物进行凝胶电泳检测，观察结果。
实施例2
(1)玉米基因组DNA的提取：
1)取0.4g去除叶茎的玉米叶片，放入事先预冷过的且加了液氮的研钵中(液氮添加量占研钵体积的三分之二)研磨，过90目筛，在温度上升前装入5mL离心管中；
2)加入65℃预热并加入0.04g PVP的改进2×CTAB提取液(0.1g/100mL Tris-HCL、1mL/100mLβ-巯基乙醇、3g/100mL CTAB、60mmol/L EDTA、1.2mol/L NaCl)1.6mL，65℃的温度下温育，隔5min摇晃1次，共30min；
3)温育结束后取出，离心机设置为4℃，12000rpm，将离心管小心放入其中，避免损伤DNA，离心8min；
4)用微量移液器吸出1.4mL上清液，添加与上清液等体积的三氯甲烷和异戊醇的混合液(其中，三氯甲烷和异戊醇的体积为24:1)，轻微摇晃离心管，于4℃，12000rpm的条件下离心8min；
5)提前-20℃预冷异丙醇，离心结束后，用微量移液器吸取上层澄清液体，加入两倍上清液量的异丙醇，4℃温度下放置0.8h，使DNA充分析出；
6)充分析出后轻轻取出，离心机设置为4℃，12000rpm，小心放入其中，避免损伤DNA，离心13min，倒去上清液；
7)用微量移液器取-20℃下保存的70％乙醇0.6mL加入沉淀中，用微量移液器悬浮沉淀，离心机设置为4℃，12000rpm，将离心管小心放入其中，避免损伤DNA，离心8min，重复7)步骤一次。
8)待管中液体蒸发后加入100μL TE与2μL RNase，得玉米基因组DNA，4℃保存。
(2)以上述所得的玉米基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO.1所示的序列为RPA正向引物，以如SEQ ID NO.2所示的序列为RPA反向引物于38℃的条件下进行RPA扩增反应30min，得扩增产物，所述RPA扩增反应的体系为：2.5μL的RPA正向引物，2.5μL的RPA反向引物，29μL 2×Reaction Buffer，9.6μL dNTPs，6μL 10×Basic E-Mix，3μL 20×CoreReaction，6.4μL的Mg2+和1μL的玉米基因组DNA，所述RPA正向引物和RPA反向引物的浓度独立为10μmol/L，所述dNTPs的浓度为1.8mmol/L，所述Mg2+的浓度为280mM，所述玉米基因组DNA的浓度为60ng/μL。
(3)对上述所得扩增产物进行纯化：
1)将RPA扩增产物用蒸馏水扩大至100μL，与0.5mL结合液DB混合；
2)将上述溶液添加到收集柱内，收集管放在1.5mLPE管中，常温放置1min后，离心机设置为12000rpm，将装有收集柱的PE管小心放入其中，避免损伤DNA，离心45s，倒去上清液；
3)用微量移液器在收集柱内添加0.7mL漂洗液WB，离心机设置为12000rpm，将装有收集柱的PE管小心放入其中，避免损伤DNA，离心1.5min，倒去上清液；
4)用微量移液器在收集柱内添加0.5mL漂洗液WB，离心机设置为12000rpm，将装有收集柱的PE管小心放入其中，避免损伤DNA，离心1.5min，倒去上清液；
5)离心机设置为12000rpm，空管小心放入其中，避免损伤DNA，离心3min；
6)取出收集柱放入新的PE管内，于收集膜的正中用微量移液器滴加30μL的洗脱液(不能触碰到收集膜)，室温静置2min，离心机设置为12000rpm，将装有收集柱的PE管小心放入其中，避免损伤DNA，离心1.5min，得纯化后的RPA扩增产物。
(4)对纯化后的RPA扩增产物进行凝胶电泳检测，观察结果。
实施例3
(1)玉米基因组DNA的提取：
1)取0.4g去除叶茎的玉米叶片，放入事先预冷过的且加了液氮的研钵中(液氮添加量占研钵体积的三分之二)研磨，过100目筛，在温度上升前装入5mL离心管中；
2)加入65℃预热并加入0.04g PVP的改进2×CTAB提取液(0.1g/100mL Tris-HCL、1mL/100mLβ-巯基乙醇、3g/100mL CTAB、60mmol/L EDTA、1.2mol/L NaCl)1.6mL，65℃的温度下温育，隔5min摇晃1次，共30min；
3)温育结束后取出，离心机设置为4℃，12000rpm，将离心管小心放入其中，避免损伤DNA，离心10min；
4)用微量移液器吸出1.4mL上清液，添加与上清液等体积的三氯甲烷和异戊醇的混合液(其中，三氯甲烷和异戊醇的体积为24:1)，轻微摇晃离心管，于4℃，12000rpm的条件下离心10min；
5)提前-20℃预冷异丙醇，离心结束后，用微量移液器吸取上层澄清液体，加入两倍上清液量的异丙醇，4℃温度下放置1h，使DNA充分析出；
6)充分析出后轻轻取出，离心机设置为4℃，12000rpm，小心放入其中，避免损伤DNA，离心15min，倒去上清液；
7)用微量移液器取-20℃下保存的70％乙醇0.6mL加入沉淀中，用微量移液器悬浮沉淀，离心机设置为4℃，12000rpm，将离心管小心放入其中，避免损伤DNA，离心10min，重复7)步骤一次。
8)待管中液体蒸发后加入100μL TE与2μL RNase，得玉米基因组DNA，4℃保存。
(2)以上述所得的玉米基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO.1所示的序列为RPA正向引物，以如SEQ ID NO.2所示的序列为RPA反向引物于40℃的条件下进行RPA扩增反应32min，得扩增产物，所述RPA扩增反应的体系为：3μL的RPA正向引物，3μL的RPA反向引物，30μL 2×Reaction Buffer，10μL dNTPs，7μL 10×Basic E-Mix，4μL 20×Core Reaction，7μL的Mg2+和1.5μL的玉米基因组DNA，所述RPA正向引物和RPA反向引物的浓度独立为11μmol/L，所述dNTPs的浓度为2mmol/L，所述Mg2+的浓度为300mM，所述玉米基因组DNA的浓度为65ng/μL。
(3)对上述所得扩增产物进行纯化：
1)将RPA扩增产物用蒸馏水扩大至100μL，与0.5mL结合液DB混合；
2)将上述溶液添加到收集柱内，收集管放在1.5mLPE管中，常温放置1min后，离心机设置为12000rpm，将装有收集柱的PE管小心放入其中，避免损伤DNA，离心45s，倒去上清液；
3)用微量移液器在收集柱内添加0.7mL漂洗液WB，离心机设置为12000rpm，将装有收集柱的PE管小心放入其中，避免损伤DNA，离心2min，倒去上清液；
4)用微量移液器在收集柱内添加0.5mL漂洗液WB，离心机设置为12000rpm，将装有收集柱的PE管小心放入其中，避免损伤DNA，离心2min，倒去上清液；
5)离心机设置为12000rpm，空管小心放入其中，避免损伤DNA，离心3min；
6)取出收集柱放入新的PE管内，于收集膜的正中用微量移液器滴加30μL的洗脱液(不能触碰到收集膜)，室温静置2min，离心机设置为12000rpm，将装有收集柱的PE管小心放入其中，避免损伤DNA，离心2min，得纯化后的RPA扩增产物。
(4)对纯化后的RPA扩增产物进行凝胶电泳检测，观察结果。
实验例1
研究玉米基因组DNA不同提取方法对鉴定结果的影响：
分别采用实施例2中改进CTAB法以及SDS法和植物基因组DNA快速提取试剂盒法提取玉米基因组DNA，将这三种方法提取的核酸，用紫外分光光度计鉴定OD值，计算所得核酸的浓度，对提取的核酸进行0.7％琼脂糖凝胶电泳(Agarose Gel Electrophoresis，AGE)鉴定，观察AGE结果。结果如表1和图1所示。
SDS法提取玉米基因组DNA：
(1)取0.4g去除叶茎的玉米叶片，放入事先预冷过的且加了液氮的研钵中，研磨过90目筛，在温度上升前装入5mL离心管中。
(2)加入SDS提取液(1％SDS；200mmol/L NaCl；50mmol/L EDTA，pH值为8.0；20mmol/L Tris-HCl，pH值为8.0)1.6mL，加入8μL RNase，56℃的温度下温育，每5min取出振荡混匀1次，共20min。
(3)温育结束，离心机设置为4℃，12000rpm，将离心管小心放入其中，避免损伤DNA，离心8min，用微量移液器吸出上层澄清液体。
(4)加入三氯甲烷和异戊醇混合液(比例为24:1)1.4mL，混匀，4℃条件下放置25min，充分去除杂质。
(5)放置结束后取出，离心机设置为4℃，12000rpm，将离心管小心放入其中，避免损伤DNA，离心8min，用微量移液器吸出上层澄清液体。
(6)用微量移液器取-20℃保存的纯乙醇2mL放入装有上清液的离心管中，颠倒离心管数次，使其融合，4℃条件下让基因组沉淀0.8h。
(7)离心机设置为4℃，12000rpm，将离心管小心放入其中，避免损伤DNA，离心5min。
(8)用微量移液器取-20℃下保存的70％乙醇0.6mL加入沉淀中，用微量移液器悬浮沉淀，离心机设置为4℃，12000rpm，将离心管小心放入其中，避免损伤DNA，离心8min，重复(7)步骤。
(9)待管中液体蒸发后加入50μL TE溶解，得玉米基因组DNA。
植物基因组DNA快速提取试剂盒法提取玉米基因组DNA：
(1)取0.4g去除叶茎的玉米叶片，放入事先预冷过的且加了液氮的研钵中，研磨过90目筛，在温度上升前装入2mL PE管。
(2)在管中加入0.8mL的缓冲液I，用涡旋混合仪混合均匀。
(3)水浴锅65℃放置30～45min，让玉米叶片充分破碎，释放出DNA。
(4)结束后用微量移液器向PE管加0.26mL的缓冲液II，振荡混匀，在4℃条件下放置8min，离心机设置为15000rpm，将离心管小心放入其中，避免损伤DNA，离心8min。
(5)用微量移液器吸出上层澄清液体0.5mL，加1.5mL的裂解液AP3/E，不断吹打，若有絮状沉淀，为实验正常现象。
(6)分多次将液体转移到收集柱内，每次离心60s。
(7)收集柱中滴加0.6mL的洗涤液，离心机设置为12000rpm，将装有收集柱的的PE管小心放入其中，避免损伤DNA，离心1.5min，倒去不要的液体，重复(7)步骤两次。
(8)离心机设置为12000rpm，空管小心放入其中，避免损伤DNA，离心1.5min，尽量将洗涤液分离干净，防止干扰后续步骤。
(9)将收集柱放入干净的2mL PE管中，放在68℃的水浴锅中，用微量移液器向PE管中滴加0.1mL EB，放置8min后取出，离心机设置为12000rpm，将装有收集柱的的PE管小心放入其中，避免损伤DNA，离心2.5min，得玉米基因组DNA。
表1不同方法提取玉米基因组DNA浓度与纯度测定
Figure BDA0003361872580000121
质量较好的DNA其OD260/280值应介于1.8～1.9之间，且OD260/230值应该大于2.0。由表1可知，三种提取方法中SDS法的OD260/280值为1.92，OD260/230值为2.04，说明DNA有少许降解或产物中RNA没有除尽。而本申请实施例2中的改进CTAB法与植物DNA提取试剂盒的提取结果纯度都较高，且其OD值都在较优范围内，但本申请实施例2中改进CTAB法较植物DNA提取试剂盒提取的DNA浓度更高，更经济实惠。
由图1可知，1泳道为本申请实施例2中的改进CTAB法提取的基因组DNA，条带最亮，且没有出现杂带，虽条带有略微拖尾，但经多次重复试验后确定，该现象系提取的DNA浓度高导致；2泳道为SDS法提取的基因组DNA，条带亮度较暗浓度最低，无杂带和弥散现象；3泳道为植物DNA提取试剂盒提取的基因组DNA，条带亮度中等，浓度较1泳道较低，但比3泳道较高，且无杂带和弥散现象。可见，本申请实施例2中的改进CTAB法为提取转Bt基因玉米基因组的最佳提取方法。
实验例2
研究不同引物对RPA扩增的影响：
以实施例2中所得玉米基因组DNA为模板，设置不同的引物对(引物设置如表2所示)。将设计的4对引物按照RPA试剂盒说明书进行扩增，扩增条件为37℃，20min。水浴后取出，依照纯化试剂盒说明对扩增产物纯化。结果做2％AGE并观察AGE结果。结果如图2所示。
表2不同RPA引物设置
Figure BDA0003361872580000122
Figure BDA0003361872580000131
由图2可知，2泳道第2对引物扩增出的条带亮度最高，1泳道第1对引物未扩增出目的基因，3泳道第3对引物条带亮度最低，4泳道第4对引物条带亮度较2泳道较低且有杂带现象。可见，本申请所用引物(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)扩增效果最好。
实验例3
研究不同RPA反应时间对RPA扩增的影响：
采用实施例2中的模板、引物以及RPA扩增反应体系，反应温度选择37℃，设置扩增时间分别为20min、25min、30min、35min、40min。反应结束后取出产物，进行纯化处理，做2％AGE，观察AGE结果。结果如图3所示。
由图3可知，所有条件得到的结果与目的条带大小一致。其中，3泳道水浴时间为30min得到的条带最亮，表明扩增出的基因浓度最高；2泳道水浴时间为25min和4泳道水浴时间为35min得到的条带亮度相似但比3泳道的亮度低；1泳道水浴时间为20min和5泳道水浴时间为40min得到的条带亮度最弱。所有条件的结果都没有出现条带弥散的情况。4、5泳道条带亮度降低是由于反应时间较长，导致目的基因发生了自然分解，1、2泳道条带亮度较低因为反应时间较短，扩增不充分。可见，3泳道即反应时间为30min时的扩增效果最好。
实验例4
研究不同RPA反应温度对RPA扩增的影响：
采用实施例2中的模板、引物以及RPA扩增反应体系，反应时间选择30min，设置反应温度分别为37℃、38℃、39℃、40℃、41℃。反应结束后取出产物，进行纯化处理，做2％AGE检测，观察AGE结果。结果如图4所示。
由图4可知，2泳道水浴温度为38℃得到的条带亮度最高，纯度最好；1泳道水浴温度为37℃和3泳道水浴温度为39℃得到的条带亮度相似但弱于2泳道；4泳道水浴温度为40℃和5泳道水浴温度为41℃条带亮度依次减弱，所有条件得到的结果与目的条带大小一致。可见，2泳道即反应温度为38℃时的扩增效果最好。
实验例5
RPA特异性验证实验：
选取转Bt基因玉米、转Bar抗草铵磷基因玉米、转EPSPS抗草甘膦基因玉米和转Badh抗旱基因玉米4种玉米，采用实施例2中的改进CTAB法提取4种玉米的基因组，并按照实施例2中的引物、反应体系以及反应条件进行扩增，扩增完成后按照实施例2中的方法进行纯化处理。以ddH2O为阴性对照，再用扩增的转Bar基因玉米DNA、转EPSPS基因玉米DNA、转Badh基因玉米DNA做特异性对照试验，结果做2％AGE，观察AGE结果。结果如图5所示。
由图5可知，1泳道是转Bt基因玉米模板扩增的结果，得到与目的条带212bp大小一致的条带，且泳道内没有出现杂带和弥散的情况；2～4泳道分别为转Bar抗草铵磷基因玉米模板扩增的结果、转EPSPS抗草甘膦基因玉米模板扩增的结果以及转Badh抗旱基因玉米模板扩增的结果，泳道内均没有目的条带，与5泳道阴性对照(ddH2O)结果相同。可见，本申请实施例2中的RPA检测方法特异性良好。
实验例6
RPA灵敏度验证实验：
以标准转Bt基因玉米DNA为模板，设置浓度梯度：60ng/μL、6ng/μL、600pg/μL、60pg/μL、6pg/μL、600fg/μL、60fg/μL、6fg/μL，将各浓度的模板做60μL的反应体系扩增。按照实施例2中的引物、反应体系及反应条件进行扩增，扩增后按照实施例2中的方法进行纯化处理。以标准转Bt基因为阳性对照，ddH2O做阴性对照，再用各不同浓度模板的扩增结果做2％AGE，观察AGE结果。结果如图6所示。
由图6可知，1～8泳道模板浓度依次减小10倍，每个泳道都出现了与目的条带212bp大小相同的条带，且各泳道内的亮度依次减弱，随着浓度不断地稀释，在8泳道处出现检出限6fg/μL。所有浓度扩增出的结果都与阳性对照一致，阴性对照没有出现条带，这说明本申请实施例2中的RPA检测方法灵敏度较高，检出限可以达到fg级别。
综上可知，本发明建立了一种简单、快速的基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法。从3种DNA提取方法中确立了改进CTAB法为最佳提取方法。在设计出的4对较高同源性引物中筛选出扩增效果最好的第二对引物，即本发明所用引物。通过对反应条件的优化，确定了38℃水浴30min为最佳反应条件，得到的扩增产物纯度较高，特异性良好，灵敏度达到6fg/μL。本发明检测方法相对于市场上普遍使用的PCR技术缩短了反应时间，降低了反应温度，且对操作人员的技术要求较低，更利于进行现场检测，为检验检疫部门提供了新的检验思路。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林农业科技学院
<120> 一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacagcatca caatctacac agacgctcac 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacggccgtc tataaagagt ggagctaagg 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccatcaactc acgctacaac gaccttactc 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cggaacctct aaaagatccg tcgaaattct 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cctcgacatt gtgagtctct ttccgaacta 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtgagcgtct gtgtagattg tgatgctgtt 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cctcgacatt gtgagtctct ttccgaacta 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcgtctgtgt agattgtgat gctgttgagt 30

Claims (4)

1.一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利用CTAB法提取待鉴定样品的基因组DNA；
(2)以上述所得待鉴定样品的基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO.1所示的序列为RPA正向引物，以如SEQ ID NO.2所示的序列为RPA反向引物进行RPA扩增反应，得扩增产物；
(3)对上述所得扩增产物进行凝胶电泳检测，若出现与目的条带大小相同的条带，则说明待鉴定样品含有Bt基因；反之则说明待鉴定样品不含有Bt基因。
2.根据权利要求1所述的一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法，其特征在于，步骤(2)中所述RPA扩增反应的体系为：2～3μL的RPA正向引物，2～3μL的RPA反向引物，28～30μL 2×Reaction Buffer，9～10μL dNTPs，5～7μL 10×Basic E-Mix，2～4μL20×Core Reaction，6～7μL的Mg2+和0.5～1.5μL的待鉴定样品的基因组DNA，所述RPA正向引物和RPA反向引物的浓度独立为9～11μmol/L，所述dNTPs的浓度为1～2mmol/L，所述Mg2+的浓度为250～300mM，所述待鉴定样品的基因组DNA的浓度为55～65ng/μL。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法，其特征在于，步骤(2)中所述RPA扩增反应的温度为35～40℃，所述RPA扩增反应的时间为28～32min。
4.根据权利要求3所述的一种基于重组酶聚合酶恒温扩增法鉴定转Bt基因的方法，其特征在于，还包括对步骤(2)所得扩增产物进行纯化的步骤，所述纯化是指利用漂洗液WB对扩增产物进行纯化。
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