CN115852028B - 一种检测稻瘟病菌无毒基因的三重pcr引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测稻瘟病菌无毒基因的三重PCR引物组。属于基因检测技术领域。该引物组可互不影响独立进行PCR扩增，实现了一管同时检测稻瘟菌株的三种无毒基因，操作简单，快速便捷。本发明还提供了一种检测稻瘟病菌无毒基因的检测试剂盒和检测方法，采用上述引物组，配制成特定的检测试剂盒，对待测基因组DNA进行扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳，与DNAMarker凝胶电泳对比，进而判断无毒基因的有无，本方法特异性强，灵敏度高，大大提高了无毒基因的检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，更具体的说是涉及一种检测稻瘟病菌无毒基因的三重PCR引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
稻瘟病是由稻瘟病菌Magnaporthe oryzae(无性态为Pyricularia oryzae)引起的全球水稻三大病害之一，在水稻的整个生育期中都可发病，为害秧苗、叶片、穗、节，严重影响水稻产量和稻米品质。在稻瘟病的防治中，除广泛使用稻瘟灵、咪鲜胺、四霉素等杀菌剂外，种植抗病品种是最经济有效的方法。但稻瘟病菌毒性相关基因变异频率高，导致田间小种变化较快，历经多年选育出的抗病品种往往在推广种植后的三至五年后抗性减弱甚至丧失，因此，对抗病品种的无毒基因检测是实现田间小种菌源监测的关键内容。
针对已被鉴定并克隆的三种稻瘟病菌无毒基因PWL2、ACE1、AvrPiz-t、传统无毒基因检测方法，在田间采样并分离得到稻瘟单孢菌株后，为检测上述三种无毒基因的存在，需要多个PCR引物配制成多个PCR反应体系，并分装于多个PCR小管，进行单独检测，流程繁琐，成本较高。
因此，如何提供一种一管同时检测PWL2、ACE1、AvrPiz-t三种稻瘟病菌无毒基因的多重PCR引物组、试剂盒和检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种检测稻瘟病菌无毒基因的三重PCR引物组及检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测稻瘟病菌无毒基因的三重PCR引物组，包括以下引物对：
AvrPiz-t-F：5’-CGCCGGATCAAATGAACACC-3’，SEQ ID NO.1，
AvrPiz-t-R：5’-GGTCATTCCCAATCGAGCCA-3’，SEQ ID NO.2；
PWL2-F：5’-ACTTTGAACCAGTTCGGGCA-3’，SEQ ID NO.3，
PWL2-R：5’-CGGGTCCATCACCAACATGA-3’，SEQ ID NO.4；
ACE1-F：5’-CCGAGCGGCTATTTTGAAGC-3’，SEQ ID NO.5，
ACE1-R：5’-CCAGAGCAACACTGGCAAAC-3’，SEQ ID NO.6。
上述操作的有益效果为：上述三对特异性引物在PCR扩增过程中互不影响，可独立工作。
优选地，三重PCR引物组中三对引物在PCR扩增过程中退火温度相同。
上述操作的有益效果为：上述三对引物的退火温度相同，无需针对各引物调整各自退火温度，为实现一管多检打下基础。
本发明的另一目的是提供一种检测稻瘟病菌无毒基因的三重PCR检测试剂盒，包括上述引物组。
优选地，三重PCR检测试剂盒还包括2x Taq Mix和ddH2O。
优选地，检测试剂盒中2x Taq Mix、三重PCR引物和ddH2O的体积比为10：4.6：4.4。
优选地，引物组中各引物的体积比AvrPiz-t-F：AvrPiz-t-R：PWL2-F：PWL2-R：ACE1-F：ACE1-R＝1:1:1:1:0.3:0.3；各引物浓度均为10μM；待测基因组DNA的浓度为1-0.001ng/μL。
上述操作的有益效果为：通过调整各基因扩增引物的用量，使扩增条带更清晰均匀。
本发明的再一目的是提供一种检测稻瘟病菌无毒基因的检测方法，包括如下步骤：采用上述检测试剂盒，对待检测稻瘟病菌基因组DNA进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，与DNA Marker凝胶电泳对比，进而判断无毒基因的有无。
优选地，PCR扩增步骤如下：95℃3min；(95℃15s；58℃15s；72℃15s)35个循环；72℃5min。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明设计的用于检测稻瘟病菌多个无毒基因的三重PCR引物组，可精准定位于待测基因组相关结合位点，特异性高，无扩增副产物。
(2)灵敏度高，待测基因组DNA模板含量为1pg即可扩增出清晰可见的条带。
(3)三对特异性引物，互不影响可独立工作，且PCR扩增过程中各引物退火温度一致，实现了一管PCR体系同时检测一个稻瘟菌株的三个无毒基因，操作简单，快速便捷，大大提高了工作效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明检测方法PCR扩增产物凝胶电泳图，其中M:2000bp DNA Marker；1:模板含量1pg；2:模板含量10pg；3:模板含量100pg；4:模板含量1ng提供的结构示意图；
图2附图为对比文献检测方法PCR扩增产物凝胶电泳图，其中M:2000bp DNAMarker；1:模板含量1ng；2:模板含量100pg；3:模板含量10pg；4:模板含量1pg。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
稻瘟单孢菌株基因组DNA的提取
利用SPARKeasy Fungus DNA Kit(AA0403)试剂盒进行稻瘟基因组DNA提取。
(1)取新鲜真菌组织约100mg，在液氮中充分碾磨呈细粉状，并转移至1.5mL离心管。
(2)加入400μL缓冲液AP1和4μL RNaseA(10mg/mL)，涡旋振荡混匀。
(3)65℃水浴10min，期间颠倒混匀样品2-3次。
(4)加入130μL缓冲液AP2，涡旋震荡混匀，冰上放置5min，12000rpm离心10min，小心吸取上清液至新的1.5mL离心管。
(5)计算上清量，加入1.5倍体积的缓冲液AP3/E(已加入无水乙醇)，立即吹打混匀。
(6)将上一步所得混合物加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心1min，弃废液。
(7)加入600μL漂洗液WB(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃废液，重复该步骤一遍。
(8)将吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。
(9)取出吸附柱AC于干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB，室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
(10)得DNA提取液，存放在2-8℃(短期保存)或-20℃(长期保存)。
实施例2
根据三个无毒基因AvrPiz-t、PWL2、ACE1序列特征，分别设计三对特异性引物作为特征靶基因，设计合成三重PCR引物组，引物组核苷酸序列及扩增产物长度详见表1。引物由生工合成，根据引物合成订单，加ddH2O将其稀释成100μM，于-20℃保存，备用。
表1无毒基因引物信息
实施例3
三重PCR检测体系的配制
每个检测体系的体积为20μL，体系如表2所示：
表2：本发明检测体系
由于本方法灵敏度较高，基因组DNA模板可先稀释至1-0.01ng/μL浓度范围再进行PCR反应。
实施例4
(1)DNA基因组模板配制：取实施例1分离得到的稻瘟单孢菌株基因组DNA，稀释为1ng/μL、0.1ng/μL、10pg/μL和1pg/μL，四个浓度梯度，作为基因组模板DNA。
(2)检测体系配制：按实施例3的检测体系的配比关系，分别加入步骤(1)中四个浓度梯度的基因组模板DNA、实施例2的三重PCR引物组、2x Taq Mix(Sparkjade,AF0201)和ddH2O配制不同浓度三重PCR检测体系。
(3)PCR扩增过程：95℃3min；(95℃15s；58℃15s；72℃15s)35个循环；72℃5min，得PCR扩增产物。
(4)琼脂糖凝胶电泳：称取2g琼脂糖溶解于100mL 0.5X TBE缓冲溶液中，微波炉加热至完全融化，冷却至室温后加入适量核酸染料，轻轻摇匀，倒入已经插好塑料梳子的胶板中，冷却凝固后可使用。取10μL PCR扩增产物进行点样，同时点样10μL 2000bp的DNAMarker。电泳条件为100V，40min。凝胶成像仪观察扩增产物条带数量及各条带大小，试验结果如图1附图所示。
结果分析：结果表明，1pg模板含量的检测试剂盒扩增得到三条特异性较好的条带，条带大小与目标基因大小吻合，无杂带，且随着模板含量的增加，不同模板含量的试剂盒的条带越来越清晰，由此可见，本发明检测方法特异性高，无扩增副产物，灵敏度高，模板量1pg即可显示与目的基因相匹配的清晰条带。
实施例5
采用现有技术文献中记载的AvrPiz-t、PWL2、ACE1三个无毒基因的扩增引物，作为对照组和本发明方法进行对比。现有技术文献采用的引物组核苷酸序列和扩增产物长度如表3所示，以表3中三对特异性引物作为特征靶基因，设计合成三重PCR引物组，进行PCR检测试剂盒的配制，按如表4进行配制，其余过程同实施例3，进行对照试验，试验结果如图2附图所示。
表3对比实验PCR引物信息
表4：对比试验检测试剂盒
结果分析：如图2附图所示，对照组三对引物进行多重PCR扩增的效果不佳，且杂带较多，仅有AvrPiz-t扩增产物条带清晰可见，另外两基因扩增产物条带不明显，表明对照组三对特异性引物，特异性明显低于本发明，灵敏度低，在特定模板含量范围内无法对三种无毒基因同时进行检测。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种检测稻瘟病菌无毒基因的三重PCR引物组，其特征在于，包括以下引物对：
AvrPiz-t-F：5’-CGCCGGATCAAATGAACACC-3’，SEQ ID NO.1，
AvrPiz-t-R：5’-GGTCATTCCCAATCGAGCCA-3’，SEQ ID NO.2；
PWL2-F：5’-ACTTTGAACCAGTTCGGGCA-3’，SEQ ID NO.3，
PWL2-R：5’-CGGGTCCATCACCAACATGA-3’，SEQ ID NO.4；
ACE1-F：5’-CCGAGCGGCTATTTTGAAGC-3’，SEQ ID NO.5，
ACE1-R：5’-CCAGAGCAACACTGGCAAAC-3’，SEQ ID NO.6。
2.根据权利要求1所述的一种检测稻瘟病菌无毒基因三重PCR引物组，其特征在于，三重PCR引物组中三对引物在PCR扩增过程中退火温度相同。
3.一种检测稻瘟病菌无毒基因的三重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物组；所检测的无毒基因为AvrPiz、PWL2和ACE1。
4.根据权利要求3所述三重PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括2 x Taq Mix 和ddH2O。
5.根据权利要求4所述三重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中2 x TaqMix、三重PCR引物和ddH2O 的体积比为10：4.6：4.4。
6.根据权利要求4所述三重PCR检测试剂盒，其特征在于，引物组中各引物的体积比AvrPiz-t-F：AvrPiz-t-R：PWL2-F：PWL2-R：ACE1-F：ACE1-R=1:1:1:1:0.3:0.3；各引物浓度均为10μM；待测基因组DNA 的浓度为1-0.001ng/μL。
7.一种检测稻瘟病菌无毒基因的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：采用权利要求3-6任一所述检测试剂盒，对待检测稻瘟病菌基因组DNA进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，与DNA Marker凝胶电泳对比，进而判断无毒基因的有无；所检测的无毒基因为AvrPiz、PWL2和ACE1。
8.根据权利要求7所述的一种检测稻瘟病菌无毒基因的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增步骤如下：95℃ 3min；（95℃ 15s；58℃ 15s；72℃ 15s）35个循环；72℃ 5min。
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| CN202211357871.XA Active CN115852028B (zh) | 2022-11-01 | 2022-11-01 | 一种检测稻瘟病菌无毒基因的三重pcr引物组、试剂盒及检测方法 |
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| CN117165711A (zh) * | 2023-09-28 | 2023-12-05 | 江苏省农业科学院 | 检测无毒基因Avr-Piz-t的RPA-LFD引物探针组、试剂盒及其应用 |
Citations (4)
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2022
- 2022-11-01 CN CN202211357871.XA patent/CN115852028B/zh active Active
Patent Citations (4)
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